TWI615471B - 提升耐熱性的植酸酶 - Google Patents

Abstract

本案係關於一種提升耐熱性的植酸酶，其胺基酸序列係為將序列編號2進行突變組合A至D其中之一之序列，其中突變組合A係將序列編號2第143個胺基酸和第262個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)，突變組合B係將序列編號2第259個胺基酸和第312個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)，突變組合C係將序列編號2第205個胺基酸和第257個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)，以及突變組合D係將序列編號2第264個胺基酸和第309個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)。

Description

提升耐熱性的植酸酶

本案係關於一種植酸酶，尤指一種提升耐熱性的植酸酶。

植酸(phytic acid)又稱為肌醇六磷酸(myo-inositol (1,2,3,4,5,6) hexakisphosphate)，為植物中儲存磷的主要形式，在種子中含量尤其豐富，而種子如穀類及豆類是動物飼料的主要原料。雖然種子中的植酸可成為飼養動物所需磷的重要來源，但只有反芻動物才能代謝植酸以利用其中的磷；對於非反芻動物，不能被消化代謝的植酸反而被視為抗營養物質，是因為植酸帶有豐富的負電，易與帶有正電的離子，如鈣離子、鎂離子、鋅離子、錳離子、銅離子、鐵離子螯合，再與蛋白質及澱粉形成複合物，阻礙消化酵素代謝，影響營養物質及金屬離子的消化吸收。此類無法代謝植酸的非反芻動物須在飲食中添加無機磷或添加植酸酶。但添加無機磷的方式不僅成本高，動物排泄物中未被代謝的植酸也會造成水質汙染，破壞生態平衡。經由植酸酶在飼料中的添加，則可增加動物對飼料中磷的可利用性達到60%，降低磷酸的抗營養現象，除了提高營養吸收，也能降低磷的排出達50%。

植酸酶是能夠從植酸中水解出磷酸根的酵素泛稱，在動物、植物、微生物中皆可找到植酸酶基因的存在，植酸酶能夠將植酸上的六個磷酸根依序水解出來，不同植酸酶的水解最終程度不一，水解機制也不同，若依此做為分類，植酸酶可分為組氨酸酸性磷酸酶(histidine acid phophatase)、紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphatase)、β 螺旋槳植酸酶(β-propeller phytase)，以及半胱氨酸磷酸酶(cysteine phytase)，其中組氨酸酸性磷酸酶因為其最適pH值及作用條件較適合用於飼料添加，因此被廣泛的研究。組氨酸酸性磷酸酶催化機制是藉由酸鹼反應，將連接肌醇環及磷酸根的磷酸單脂鍵進行水解作用，釋放出磷酸根；水解步驟分為兩個階段，首先組氨酸酸性磷酸酶會利用活性區的組氨酸攻擊植酸中的一個磷酸單脂鍵，形成磷酸-組氨酸中間體，再由活性區的天冬氨酸利用一個水分子提供質子給磷酸-組氨酸中間體中磷酸根的氧離子，釋放出一個磷酸根。

儘管植酸酶於飼料添加在動物飼養已顯示增加生產力，且使用500-1000單位活性的植酸酶可代替1克的的無機磷添加及減少30-50%磷的排出，但在工業上如何使占有飼料市場60%的植酸酶能具有經濟效益，為酵素改造持續的目標及需求。植酸酶在飼料工業的製程及應用上，必須具有在 pH 2 - 6.5高活性，抗酸性及抗胃蛋白酶及抗胰蛋白酶分解的特性，產品製粒時的耐熱性，提高酵素作用時的活性才能降低生產成本。

酵素改造的策略可分為兩種，一是利用定向進化，一是利用理論性的設計。定向進化包括兩個步驟，一是製造具有豐富多樣性的突變基因庫，其次再從基因庫中篩選具有特定優化特性的突變株。突變基因庫的製造方法常用的有易錯聚合酶鏈式反應(error-prone PCR)及DNA重組反應(DNA shuffling)，但龐大的突變基因庫需要有大量篩選的方法，否則對於篩選上是相當耗費人力及時間的。近年來，隨著可利用的蛋白質結構及序列增加，還有電腦計算軟體技術的發展，蛋白質中與底物結合、活性區域、穩定結構的胺基酸可被識別出，因此以此理論基礎建立的突變基因庫能更有效地篩選出優化的酵素特性。

在比較耐熱性蛋白質和適溫性蛋白質結構的研究，可觀察酵素結構與耐熱性的關係，耐熱性蛋白質有較多的胺基酸側鏈和側鏈間氫鍵及鹽橋的鍵結。另外，藉由一連串於T4溶解酵素(T4 lysozyme)做的突變蛋白質結構與特性分析，發現增加疏水核心的穩定性、加強局部氫鍵及鹽橋的連結、使用雙硫鍵穩定結構等可增加蛋白質耐熱性。越來越多的研究運用電腦軟體模擬計算以提高蛋白質的耐熱性，突變蛋白質結構可藉由電腦軟體分析建立起一套參數，再將參數運用在增加其他目標蛋白質的耐熱性，縮小篩選穩定結構的改造點及鍵結的範圍。

因此，本案欲藉由改造基因以增加植酸酶之雙硫鍵鍵接，藉此提升植酸酶對於溫度的耐受性，以有效增加植酸酶在工業上應用的產業價值。

本案之目的在於改造現有植酸酶，利用結構分析及定點突變技術，增加植酸酶之雙硫鍵鍵接，以有效提升植酸酶之耐熱性，進而增加植酸酶之工業應用價值。

為達上述目的，本案之一較廣義實施態樣為提供一種植酸酶，其胺基酸序列係為將序列編號2進行突變組合A至D其中之一之序列，其中突變組合A係將序列編號2第143個胺基酸和第262個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)，突變組合B係將序列編號2第259個胺基酸和第312個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)，突變組合C係將序列編號2第205個胺基酸和第257個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)，以及突變組合D係將序列編號2第264個胺基酸和第309個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)。編碼該序列編號2之基因係從大腸桿菌(Escherichia coli )所分離出來並經優化的AppA基因，且該植酸酶係為組氨酸酸性磷酸酶。

在一實施例中，該植酸酶之胺基酸序列如序列編號24所示。

在一實施例中，該植酸酶之胺基酸序列如序列編號26所示。

在一實施例中，該植酸酶之胺基酸序列如序列編號28所示。

在一實施例中，該植酸酶之胺基酸序列如序列編號30所示。

本案之另一較廣義實施態樣為提供一種植酸酶，其胺基酸序列係為將序列編號2進行突變組合A以及合併突變組合B及D其中之一之序列，其中突變組合A係將序列編號2第143個胺基酸和第262個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)，突變組合B係將序列編號2第259個胺基酸和第312個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)，以及突變組合D係將序列編號2第264個胺基酸和第309個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)。

在一實施例中，該植酸酶之胺基酸序列如序列編號32所示。

在一實施例中，該植酸酶之胺基酸序列如序列編號34所示。

體現本案特徵與優點的一些典型實施例將在後段的說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上具有各種的變化，其皆不脫離本案的範圍，且其中的說明及圖式在本質上係當作說明之用，而非用以限制本案。

本案中的植酸酶基因(EcAppA)是從大腸桿菌(Escherichia coli )所篩選出來的，其所表現的蛋白酶為組氨酸酸性磷酸酶。EcAppA有許多符合工業應用的特質如：高活性、高度底物專一性、最適作用pH範圍、以及在工業生產菌株畢赤酵母(Pichia pastoris )中表達量高等。為提高飼料製粒後的植酸酶活性，需提高EcAppA的耐熱性，以提高EcAppA的產業應用價值。由於EcAppA已解出蛋白質結構，因此EcAppA是相當好做為進一步酵素改良的目標。

本案利用雙硫鍵來提升蛋白質結構穩定性，及降低高溫造成的不可逆蛋白質結構延展，成功的提升EcAppA的耐熱性。雙硫鍵選定的位置為技術關鍵，本案使用理智設計(rational design)篩選出雙硫鍵的突變位點來提升EcAppA的耐熱性。基於雙硫鍵的形成不影響整體蛋白質結構的前提，選擇雙硫鍵的突變點為EcAppA的蛋白質結構相近處，以胺基酸側鏈和側鏈間 β-碳原子距離4.0 Å、4.5 Å、5.0 Å、5.5 Å內做篩選參數；且在較穩定的蛋白質二級結構表面添加雙硫鍵，以增加雙硫鍵帶來的結構穩定效果；去除篩選出的二級結構本身轉彎處的無效雙硫鍵，得到的雙硫鍵組合再以實驗方式加以篩選其提升耐熱性的功效。

以下將詳述本案改造植酸酶之方法及其所得到之改良植酸酶。

本案係運用定點突變(site-directed mutagenesis)技術進行突變改造，並使用工業生產菌株畢赤酵母系統進行表達。首先，將EcAppA序列合成優化為畢赤酵母易表達的序列AppA，其核苷酸序列以及胺基酸序列如第1圖所示，其中，AppA表達序列包含1236個鹼基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號1標示)以及410個胺基酸(胺基酸序列以序列編號2標示)。利用Eco RI 與Not I 限制酶切位，構築到 pPICZaA 載體中，接著進行定點突變。

第2圖顯示植酸酶AppA的蛋白質立體結構及改造點的位置，其中，植酸酶AppA蛋白質結構(PDB: 1DKQ)及肌醇六磷酸(inositol hexaphosphate)以灰色顯示，雙硫鍵突變組合的位置A (143-262)、B (259-312)、C (205-257)、D (264-309)以黑色標示。如前所述，本案係以胺基酸側鏈和側鏈間 β-碳原子距離4.0 Å、4.5 Å、5.0 Å、5.5 Å內做篩選參數在蛋白質二級結構表面挑選出的位點，去除在二級結構轉彎處的雙硫鍵突變點，此方法篩選出增加耐熱的雙硫鍵突變AppA-A、AppA-B、AppA-C、AppA-D，其中，雙硫鍵突變AppA-A係將第143個胺基酸和第262個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)以形成雙硫鍵，雙硫鍵突變AppA-B係將第259個胺基酸和第312個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)以形成雙硫鍵，雙硫鍵突變AppA-C係將第205個胺基酸和第257個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)以形成雙硫鍵，雙硫鍵突變AppA-D係將第264個胺基酸和第309個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)以形成雙硫鍵。前述四組雙硫鍵突變位點其胺基酸側鏈和側鏈間 β-碳原子距離分別為4.0 Å、4.1 Å (因第312個胺基酸為無胺基酸側鏈的甘胺酸，此為甘胺酸的 α-碳原子和第259個胺基酸側鏈的 β-碳原子間的距離)、5.1 Å、4.3 Å。

定點突變所用的引子如第3圖所示，引子序列分別以序列編號3至 22標示，其中F為順向引子，R為逆向引子，且突變的位置以底線標示。如前所述，雙硫鍵突變AppA-A、AppA-B、AppA-C、AppA-D的雙硫鍵突變組合分別為A (143-262)、B (259-312)、C (205-257)、D (264-309)。A1和 A2分別為雙硫鍵突變組合A (143-262)中第143個胺基酸的位置和第262個胺基酸的位置突變用引子；B1和 B2分別為雙硫鍵突變組合B (259-312)中第259個胺基酸的位置和第312個胺基酸的位置突變用引子；C1和 C2分別為雙硫鍵突變組合C (205-257)中第205個胺基酸的位置和第257個胺基酸的位置突變用引子；D1和 D2分別為雙硫鍵突變組合D (264-309)中第264個胺基酸的位置和第309個胺基酸的位置突變用引子。另外，本案亦進行AppA-A+B及AppA-A+D合併雙硫鍵突變的改造，其合併雙硫鍵突變組合分別為A+B (143-262、259-312) 及A+D (143-262、264-309)，其中，合併雙硫鍵突變組合A+B突變用引子包括A1、A2+B1、及B2等三組引子，而合併雙硫鍵突變組合A+D突變用引子則包括A1、A2+D1、及D2等三組引子。

定點突變方法為利用突變引子進行聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)，接著在PCR反應產物中加入限制酶Dpn I 於37^o C下作用，將原始模板去除。再把含有突變的質體送入大腸桿菌XL1B勝任細胞中，將菌液塗於含有50 µg/ml Zeocin抗生素的LB培養基於37^o C下進行培養一天。再挑選菌落，藉由定序步驟確認成功突變基因序列。

第4圖顯示改造後之AppA-A植酸酶的核苷酸序列以及胺基酸序列，其中，AppA-A植酸酶基因包含1236個鹼基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號23標示)以及410個胺基酸(胺基酸序列以序列編號24標示)，且第143個胺基酸和第262個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)。

第5圖顯示改造後之AppA-B植酸酶的核苷酸序列以及胺基酸序列，其中，AppA-B植酸酶基因包含1236個鹼基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號25標示)以及410個胺基酸(胺基酸序列以序列編號26標示)，且第259個胺基酸和第312個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)。

第6圖顯示改造後之AppA-C植酸酶的核苷酸序列以及胺基酸序列，其中，AppA-C植酸酶基因包含1236個鹼基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號27標示)以及410個胺基酸(胺基酸序列以序列編號28標示)，且第205個胺基酸和第257個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)。

第7圖顯示改造後之AppA-D植酸酶的核苷酸序列以及胺基酸序列，其中，AppA-D植酸酶基因包含1236個鹼基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號29標示)以及410個胺基酸(胺基酸序列以序列編號30標示)，且第264個胺基酸和第309個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)。

第8圖顯示改造後之AppA-A+B植酸酶的核苷酸序列以及胺基酸序列，其中，AppA-A+B植酸酶基因包含1236個鹼基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號31標示)以及410個胺基酸(胺基酸序列以序列編號32標示)，且第143個胺基酸、第259個胺基酸、第262個胺基酸和第312個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)。

第9圖顯示改造後之AppA-A+D植酸酶的核苷酸序列以及胺基酸序列，其中，AppA-A+D植酸酶基因包含1236個鹼基(含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號33標示)以及410個胺基酸(胺基酸序列以序列編號34標示)，且第143個胺基酸、第262個胺基酸、第264個胺基酸和第309個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)。

將突變成功的AppA基因使用限制酶Pm eI 把DNA質體進行線性化之後，藉由電轉步驟將DNA送入畢赤酵母內。接著將菌液塗於含有100 µg/ml Zeocin抗生素的YPD培養皿於30^o C下進行培養兩天。挑選菌落並接種到1 ml YPD於30^o C下培養一天後，取最終OD600濃度為0.2的體積接種到5 ml BMGY培養基中於30^o C下培養至隔天。接著，將培養基換成含有0.5%甲醇的2 ml BMMY以誘導蛋白表現，培養於30^o C下2~3天後，取菌液進行離心並收集上清液，進而檢測植酸酶活性及耐熱性。

植酸酶蛋白的活性測試方式是將4 ml的7.5 mM肌醇六磷酸鈉與0.2 ml酶蛋白(酶蛋白的緩衝液為0.05% Triton X-100、0.05% BSA、及0.25 M乙酸鈉，緩衝液為pH 5.5)及1.8 ml的反應緩衝液0.25 M乙酸鈉，pH為5.5，在 37^o C之下作用30分鐘。接著加入4 ml的終止顯色液( 水:硝酸溶液:10%鉬酸胺:0.2 M偏釩酸胺=4:2:1:1)，在OD415波長測定吸光值，再換算成酶活性單位(unit)。其中酶活性的標準曲線是由磷酸二氫鉀標準溶液0 - 25 µmol/ml之間制定。而 1 unit 的定義為每分鐘從濃度5 mM植酸鈉溶液中釋放1 µmole 無機磷。

植酸酶蛋白的耐熱測試方式，是將不同突變點的上清液依活性稀釋為相同活性後，以聚合酶鏈鎖反應機器進行耐熱測試，耐熱條件為85^o C反應兩分鐘後立即降溫到25^o C。耐熱性是以沒有進行耐熱測試的上清液活性當成100%來計算，以百分比表示。

第10圖顯示AppA與AppA加上不同雙硫鍵突變組合的耐熱分析測試。由第10圖結果可知，AppA在85^o C反應2分鐘下，相較於AppA的21.7%的活性殘留，AppA-A、AppA-B、AppA-C、AppA-D活性殘留可提升為70.9%、68.5%、35.4%、37.4%。又，合併雙硫鍵突變AppA-A+B及AppA-A+D亦可提高AppA在85^o C反應2分鐘下活性殘留至80.5%及60.6%。換言之，本案藉由添加雙硫鍵來穩定植酸酶AppA的結構，使得AppA-A、AppA-B、AppA-C、AppA-D、AppA-A+B及AppA-A+D等突變蛋白在85^o C下處理2分鐘後的殘留活性皆高於野生型AppA，故本案改良後的植酸酶具有較高的耐熱性，可有效運用在提升AppA製粒時的耐熱性，及降低生產成本，因此具有較大潛力的工業應用價值。

綜上所述，為了增加植酸酶的工業應用價值，本案使用理智設計篩選出雙硫鍵的突變位點，以藉由添加雙硫鍵來穩定植酸酶的結構，進而提升植酸酶的耐熱性。本案篩選出四組突變位點，AppA-A係於第143個胺基酸和第262個胺基酸之間形成雙硫鍵、AppA-B係於第259個胺基酸和第312個胺基酸之間形成雙硫鍵，AppA-C係於第205個胺基酸和第257個胺基酸之間形成雙硫鍵，AppA-D係於第264個胺基酸和第309個胺基酸之間形成雙硫鍵。另外，本案亦進行合併雙硫鍵突變的改造，包括AppA-A+B及AppA-A+D。根據耐熱分析測試結果可知，AppA-A、AppA-B、AppA-C、AppA-D、AppA-A+B及AppA-A+D等突變蛋白在85^o C下處理2分鐘後的殘留活性皆高於野生型AppA，故本案改良後的植酸酶具有較高的耐熱性。換言之，本案之雙硫鍵選定的技術不僅有效篩選出耐熱提升的蛋白質突變，且有效提高篩選效率，而本案所篩選到的雙硫鍵突變組合皆明顯提升植酸酶的耐熱性，可有效運用在提升植酸酶製粒時的耐熱性，及降低生產成本，因此具有較大潛力的工業應用價值。

縱使本發明已由上述實施例詳細敘述而可由熟悉本技藝人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。

無

第1圖顯示植酸酶AppA的核苷酸序列以及胺基酸序列。 第2圖顯示植酸酶AppA的蛋白質立體結構及改造點的位置。 第3圖顯示定點突變所用的引子。 第4圖顯示改造後之AppA-A植酸酶的核苷酸序列以及胺基酸序列。 第5圖顯示改造後之AppA-B植酸酶的核苷酸序列以及胺基酸序列。 第6圖顯示改造後之AppA-C植酸酶的核苷酸序列以及胺基酸序列。 第7圖顯示改造後之AppA-D植酸酶的核苷酸序列以及胺基酸序列。 第8圖顯示改造後之AppA-A+B植酸酶的核苷酸序列以及胺基酸序列。 第9圖顯示改造後之AppA-A+D植酸酶的核苷酸序列以及胺基酸序列。 第10圖顯示AppA與AppA加上不同雙硫鍵突變組合的耐熱分析測試。

Claims (4)

1. 一種植酸酶，其胺基酸序列係為將序列編號2第264個胺基酸和第309個胺基酸突變成半胱氨酸(Cysteine)之序列。
2. 如申請專利範圍第1項所述之植酸酶，其中編碼該序列編號2之基因係從大腸桿菌(Escherichia coli )所分離出來並經優化的AppA基因。
3. 如申請專利範圍第1項所述之植酸酶，其中該植酸酶係為組氨酸酸性磷酸酶。
4. 如申請專利範圍第1項所述之植酸酶，其中該植酸酶之胺基酸序列如序列編號30所示。