CN102296079A - 耐热型甲酸脱氢酶基因及其编码的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐热型甲酸脱氢酶基因及其编码的多肽和制备方法，本发明以Bacillussp.为基础，克隆分离了耐热型甲酸脱氢酶基因，该基因对于制备用于生产耐热型甲酸脱氢酶的转基因微生物或动植物，并回收获得该基因编码的酶有用。另外，本发明还提供了具有耐热型甲酸脱氢酶活性的多肽的氨基酸序列及功能等同体。同时，本发明还提供了制备，分离，纯化具有耐热型甲酸脱氢酶活性的多肽的方法。

Description

耐热型甲酸脱氢酶基因及其编码的多肽

技术领域

本发明涉及一种甲酸脱氢酶，尤其涉及一种耐热型甲酸脱氢酶基因及其编码的多肽和制备方法。

背景技术

甲酸脱氢酶 (formate dehydrogenase，FDH，EC1. 2. 1. 2) 催化甲酸生成CO₂和H₂O，同时将NAD⁺还原为NADH。细菌来源的NAD⁺依赖型甲酸脱氢酶由2个相同的亚基组成，对甲酸和NAD⁺具有高度的专一性。甲酸脱氢酶主要应用于辅酶NADH的酶耦联法再生系统中。甲酸/甲酸脱氢酶再生体系具有以下优点：1) 作为再生底物的甲酸价格低廉；2) 甲酸脱氢酶来源分布较广，在细菌、真菌、植物中均有分布；3) 甲酸脱氢酶的催化产物CO₂易于从体系中去除，不会干扰目标产物的分离；4) 反应体系中低浓度甲酸不会影响其他酶活性。但是目前也存在着活性较低，热稳定性不好，酶价格昂贵等缺点，限制了其使用范围。工业界唯一一例大规模生产过程中用到甲酸脱氢酶的即是德国Degussa公司利用来源于Candida boidinii的FDH 生产 L-亮氨酸。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种耐热型甲酸脱氢酶基因及其编码的多肽和制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种耐热型甲酸脱氢酶基因，它具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列以及它的突变形式，所述突变类型包括：缺失、无义、插入、错义。

一种上述耐热型甲酸脱氢酶基因编码的多肽，它具有SEQ ID No.2中的氨基酸序列。

本发明的有益效果是，本发明涉及Bacillus sp.的耐热型甲酸脱氢酶基因的分离及表达。以甲酸脱氢酶保守序列为基础，克隆分离了耐热型甲酸脱氢酶基因。该基因对于制备用于生产耐热型甲酸脱氢酶的转基因微生物或动植物，并回收获得该基因编码的酶有用。

Bacillus sp.保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号：CGMCC No.4271，分类命名：芽孢杆菌（Bacillus sp.）。

具体实施方式

首先，本发明提供了分离的，编码耐热型甲酸脱氢酶活性的多肽的多聚核苷酸分子，该核苷酸分子是从Bacillus sp.中分离到的，具有SEQ. ID NO.1的核苷酸序列，它编码具有401个氨基酸的多肽，推测分子量为44.07 kDa。

本发明还涉及一种重组载体，该载体包含本发明的分离的核苷酸分子，以及包含有重组载体的宿主细胞。同时，本发明包括构建该重组载体和宿主细胞的方法，以及用重组工程技术生产耐热型甲酸脱氢酶的方法。

本发明进一步地提供了一种分离的耐热型甲酸脱氢酶或多肽，具有SEQ. ID NO.2氨基酸序列，或至少70%相似，更佳地，至少具有90%，95%，99%的相同。

在本发明中，“分离的”DNA是指该DNA或片断已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片断已经与天然状态下伴随核酸的组份分开而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，“耐热型甲酸脱氢酶基因”指编码具有耐热型甲酸脱氢酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ. ID NO.1的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指该序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于公知的密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。该术语还包括能在中度严谨条件下，更佳地在高度严谨条件下与SEQ ID NO.1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1核苷酸序列同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。

在本发明中，“分离的”蛋白的多肽是指其至少占样品总物质的至少20%，较佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析，PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。分离的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组份。

在本发明中，“耐热型甲酸脱氢酶”指具有耐热型甲酸脱氢酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括SEQ ID NO.2序列的变异体，这些变异体具有与天然甲酸脱氢酶相同的功能。这些变异体包括（但不限于）若干个氨基酸的缺失，插入和／或取代，以及在C末段和／或N末端添加一个或数个氨基酸，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异。例如，为本领域所公知的，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末段和／或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括耐热型甲酸脱氢酶的活性片断和活性衍生物。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒，粘粒，噬菌体及反转录病毒等。在生产本发明的耐热型甲酸脱氢酶时，可以将耐热型甲酸脱氢酶基因序列可操作低连于表达调控序列，从而形成耐热型甲酸脱氢酶表达载体。表达载体含有复制起始点和表达调控序列，启动子，增强子和必要的加工信息位点。表达载体还必须含有可供选择的标记基因，如a）提供对抗生素或其它毒性物质（氨苄青霉素，卡那霉素，氨甲蝶呤等）的抗性的蛋白质或b）互补营养缺陷型蛋白质或c）提供复合培养基中没有的必需营养成分的蛋白质。各种不同宿主的合适标记基因是本领域中所熟知或生产厂商说明书著名的。这些表达载体可以用本领域技术人员公知的重组DNA技术制备，如可参考Sambrook等人，1989或Ausubel等人，1992。

重组表达载体可以用本领域熟知的方法引入宿主细胞，这些方法包括：电转化法，氯化钙法，基因枪法等。将外源重组载体导入宿主细胞的过程称为“转化”。通过培养宿主细胞，诱导所需蛋白的表达，并通过本领域所熟知的蛋白分离技术，如柱层析等得到所需的蛋白质。也可采用固相技术等人工合成该蛋白质。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核细胞如大肠杆菌，枯草杆菌等。常用的真核细胞如酵母细胞，或各种动植物细胞。

本发明的耐热型甲酸脱氢酶基因全长序列或其片断通常可以用PCR扩增法，重组法，或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，用本领域技术人员已知的常规方法制备的Bacillus sp. 的DNA为模极，扩增而得到有关序列。一旦获得了有关序列，就可以将其克隆入有关载体，再转入宿主细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到大批量的有关序列。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：耐热型甲酸脱氢酶基因的克隆

耐热型甲酸脱氢酶基因的克隆采用简并PCR和TAIL-PCR进行。首先培养Bacillus sp.，使用LB培养基于30度培养24小时后收集菌体，提取总DNA。根据GenBank中公布的已知细菌来源的NAD⁺依赖型甲酸脱氢酶同源基因序列设计其保守区之间的简并引物，以提取的总DNA为模版，进行简并PCR。将简并PCR获得的约350 bp DNA进行测序。以此350 bp DNA序列为基础，设计TAIL-PCR引物。随后以Bacillus sp.基因组DNA为模板，分别对上下游进行三轮TAIL-PCR，以获得甲酸脱氢酶基因全长。将简并PCR和TAIL-PCR获得的序列通过Vector NTI 9.0中的 Contig Express进行拼接，得到甲酸脱氢酶基因的全长序列(SEQ ID NO.1)。

实施例2：耐热型甲酸脱氢酶表达载体的构建

根据实施例中基因注释得到的甲酸脱氢酶全长编码序列(SEQ ID NO.1)，设计能扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点，以便构建表达载体。以Bacillus sp.的DNA为模板，扩增耐热型甲酸脱氢酶基因全长。在保证阅读框正确的前提下重组至表达载体pET28a（Novagen）中，再将重组载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中（转化方法为CaCl₂法或电转化法），以抗生素标记法筛选（本例中为卡那霉素抗性）阳性的重组菌DH5α-pET28a-FDH。挑取单菌落的工程菌DH5α-pET28a-FDH于4 ml含30 μg/ml卡那霉素的LB培养基中振摇培养37°C过夜，提取重组质粒后转化至表达载体大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，以抗生素标记法筛选（本例中为卡那霉素抗性）阳性的重组高效表达菌BL21-pET28a-FDH。

实施例3：重组耐热型甲酸脱氢酶的表达和纯化

挑取单菌落的工程菌BL21-pET28a-FDH于4 ml含30 μg/ml卡那霉素的LB培养基中振摇培养37°C过夜，按l：100的浓度吸取培养液于新的LB培养基（含30μg/ml卡那霉素）中培养约3小时，至OD600达0.5后，加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，继续于37°C分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1 ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液（2×SDS上样缓冲液50 μl，蒸馏水45 μl，二巯基乙醇5 μl），悬浮细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，l2000 rpm离心1分钟，上清加入12% SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达所需蛋白的工程菌。

按上述方法诱导表达所需蛋白的工程菌后，将细菌离心沉淀，按每100 ml菌加入8 ml Binding Buffer，超声破碎后，15000 rpm离心30分钟后取上清，加入2 ml Ni-NTA树脂（Invitrogen），30°C振摇结合30分钟，静置沉淀，弃上清，沉淀用10 ml Wash Buffer 洗涤2次后，上2 ml层析柱，然后用Elution Buffer 洗脱目的蛋白，以1 ml为单位分管收集，合并酶活最高的几管。洗脱的上清添加50%的甘油后保存于-80°C，并进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。在45 kDa处的蛋白质条带即为甲酸脱氢酶。

实施例4：重组耐热型甲酸脱氢酶性质的测定

将纯化后的甲酸脱氢酶分别测定其最适反应温度、最适反应pH、温度稳定性、pH稳定性、底物谱和动力学研究。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  浙江大学

 

<120>  耐热型甲酸脱氢酶基因及其编码的多肽

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1206

<212>  DNA

<213>  Bacillus sp.

 

<400>  1

atggccaaga ttgtttgtgt actgtacgac gaccccgtta ccggctaccc gaagacttat       60

 

gcccgcgacg atctgccgaa gatcgagtgc taccccgatg gccagacgct gcccacgccg      120

 

cgtgccatcg acttccagcc gggcgcgttg ctcggtagcg tgtcgggcga actgggcctg      180

 

cgcaagtacc tcgaatcgaa cggccacgaa ctcgttgtga cgtcgagcaa ggacggcgac      240

 

aacagtgtgc tcgaccgcga actggccgac gccgaaatcg tgatctcgca accgttctgg      300

 

cccgcctaca tgacggccga gcgcatcaag cgtgcaaaga agctcaagat gatcgtgacc      360

 

gcgggcatcg gctcggatca caccgatctg caagccgcca tggagcacgg catcaccgtc      420

 

gcagaagtca cgtactgcaa cagcaacagc gtggccgagc acgtgatgat gacgacgctg      480

 

gcgctcgtgc gtaactacct gccgtcgtat caatgggtgc tcaagggcgg ctggaacatc      540

 

gccgactgcg tcgagcgttc atacgatctg gaaggcatgc atgtgggcac ggtggcggca      600

 

gggcgtatcg gcctgcgcgt gctgcgcctg atgaagccgt tcggcacgca tttgcactac      660

 

ctcgatcgtc accgtctgcc ggaatcggtc gagaaggaac tcaacctcac gcatcacacg      720

 

agccttgaga gcctcgccaa ggtgtgcgac gtcgttacgc tgaactgccc gctgcacccg      780

 

gaaacggagc acatgatcaa cgccgacagc ctgaagcact tcaagcgcgg cgcgtacctg      840

 

atcaacacgg cgcgcggcaa gctgtgcgac cgcgacgccg ttgcggcggc gctcgaaagc      900

 

ggtcagctcg cgggctacgg tggcgatgta tggttcccgc aaccggcacc ggccgatcac      960

 

ccgtggcgca gcatgccgca ccacggcatg accccgcaca tctcgggcac gagcctgtcg     1020

 

gcgcagacgc gctacgccgc cggtacgcgt gaaattctgg agtgctactt cgagaaccgt     1080

 

ccgatccgca acgagtacct gatcgtgcag aacggcaagc tcgccggtgt gggcgcgcac     1140

 

tcgtacagcg caggcaacgc cacgggcggt tcggaagaag ccgctcgctt caagaagtcg     1200

 

gcctga                                                                1206

 

 

<210>  2

<211>  401

<212>  PRT

<213>  Bacillus sp.

 

<400>  2

 

Met Ala Lys Ile Val Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Thr Gly Tyr

1               5                   10                  15     

 

 

Pro Lys Thr Tyr Ala Arg Asp Asp Leu Pro Lys Ile Glu Cys Tyr Pro

            20                  25                  30         

 

 

Asp Gly Gln Thr Leu Pro Thr Pro Arg Ala Ile Asp Phe Gln Pro Gly

        35                  40                  45             

 

 

Ala Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Ser Asn Gly His Glu Leu Val Val Thr Ser Ser Lys Asp Gly Asp

65                  70                  75                  80 

 

 

Asn Ser Val Leu Asp Arg Glu Leu Ala Asp Ala Glu Ile Val Ile Ser

                85                  90                  95     

 

 

Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Met Thr Ala Glu Arg Ile Lys Arg Ala

            100                 105                 110        

 

 

Lys Lys Leu Lys Met Ile Val Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Thr

        115                 120                 125            

 

 

Asp Leu Gln Ala Ala Met Glu His Gly Ile Thr Val Ala Glu Val Thr

    130                 135                 140                

 

 

Tyr Cys Asn Ser Asn Ser Val Ala Glu His Val Met Met Thr Thr Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Ala Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser Tyr Gln Trp Val Leu Lys Gly

                165                 170                 175    

 

 

Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Glu Gly

            180                 185                 190        

 

 

Met His Val Gly Thr Val Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Arg Val Leu

        195                 200                 205            

 

 

Arg Leu Met Lys Pro Phe Gly Thr His Leu His Tyr Leu Asp Arg His

    210                 215                 220                

 

 

Arg Leu Pro Glu Ser Val Glu Lys Glu Leu Asn Leu Thr His His Thr

225                 230                 235                 240

 

 

Ser Leu Glu Ser Leu Ala Lys Val Cys Asp Val Val Thr Leu Asn Cys

                245                 250                 255    

 

 

Pro Leu His Pro Glu Thr Glu His Met Ile Asn Ala Asp Ser Leu Lys

            260                 265                 270        

 

 

His Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Leu Ile Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu

        275                 280                 285            

 

 

Cys Asp Arg Asp Ala Val Ala Ala Ala Leu Glu Ser Gly Gln Leu Ala

    290                 295                 300                

 

 

Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Ala Asp His

305                 310                 315                 320

 

 

Pro Trp Arg Ser Met Pro His His Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly

                325                 330                 335    

 

 

Thr Ser Leu Ser Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile

            340                 345                 350        

 

 

Leu Glu Cys Tyr Phe Glu Asn Arg Pro Ile Arg Asn Glu Tyr Leu Ile

        355                 360                 365            

 

 

Val Gln Asn Gly Lys Leu Ala Gly Val Gly Ala His Ser Tyr Ser Ala

    370                 375                 380                

 

 

Gly Asn Ala Thr Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ala Arg Phe Lys Lys Ser

385                 390                 395                 400

 

 

Ala

Claims (2)

1.一种耐热型甲酸脱氢酶基因，其特征在于：它具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列以及它的突变形式，所述突变类型包括：缺失、无义、插入、错义。

2.一种权利要求1所述耐热型甲酸脱氢酶基因编码的多肽，其特征在于：它具有SEQ ID No.2中的氨基酸序列。