CN101544969B - D-氨甲酰水解酶的突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了D-氨甲酰水解酶的突变体及其在生产D-对羟基苯甘氨酸中的应用。通过定向进化技术获得的一个突变体在D-氨甲酰水解酶的第12位的谷氨酰胺突变为非极性氨基酸，另一突变体在D-氨甲酰水解酶的第263位的苏氨酸突变为甲硫氨酸，第三个突变体在D-氨甲酰水解酶的第263位的苏氨酸突变为丝氨酸，第四个突变体在D-氨甲酰水解酶的第12位的谷氨酰胺突变为苏氨酸，且第263位的苏氨酸突变为丝氨酸。所述突变体酶在D-对羟基苯甘氨酸的生产中表现出更高的热稳定性和酶活力，表明采用定向进化技术改造工业用酶是一个十分有效的手段。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体内容涉及D-氨甲酰水解酶的突变体及其在生产D-对羟基苯甘氨酸中的应用。
背景技术
D-对羟基苯甘氨酸(D-p-hydroxyphenylglycine，DHPG)是合成羟氨苄青霉素和羟氨苄头孢霉素等β-半合成内酰胺类抗生素的关键手性中间体。目前的全球市场需求在22000吨左右，折合人民币约17亿元。以有机合成消旋对羟基苯甘氨酸再手性拆分曾是生产DHPG的主要方法，80年代以后D-海因酶(D-hydantoinase，Dhase)/D-氨甲酰水解酶(D-carbamoylase，Dcase)两步不对称水解混旋对羟基苯海因生产DHPG的方法逐渐为国外大公司所采用，其原理如下：
酶法的技术原理是：用D-乙内酰脲酶(也称为D-海因酶)将DL-对羟基苯海因不对称水解成N-氨甲酰基D-对羟基苯甘氨酸，然后在N-氨甲酰-D-氨基酸水解酶(也称为D-氨甲酰水解酶，简称Dcase)的作用下，将N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸不可逆水解转变成DHPG。
两种酶中，DCase的热稳定性相对较差，这对于只使用一次的全细胞转化影响不太大，但对于固定化酶的使用方式却相当不利，不能被长时间反复使用。因此，提高DCase热稳定性是固定化酶的研发重点。
获得热稳定的酶，一种方法是从自然界筛选天然耐热的酶，日本钟渊株式会社从土壤中筛选到一株能产生耐热DCase的Pseudomonas sp.KNK003(Ikenaka，Y.，et al.，BioscienceBiotechnology and Biochemistry，1998.62(5)：p.882-886.)，但是与来源于Agrobacterium sp.KNK712的不耐热DCase相比，其比活力要低很多。
因此，钟渊株式会社选择了另一种获得耐热酶的方法，对来源于KNK712的DCase基因进行随机突变，随后通过筛选大量突变体。钟渊株式会社首先以羟胺对来源于KNK712的DCase基因进行正链随机突变，筛选27,000株突变体库获得热稳定性提高约5℃的突变酶，测序结果显示57位的组氨酸突变为酪氨酸；随后，钟渊又对KNK712来源的DCase基因片段的正链用亚硝酸钠处理，而负链用羟胺处理后分别获得突变体库，筛选得到耐热突变体，测序结果显示203位的脯氨酸突变为亮氨酸或丝氨酸可提高KNK712DCase的热稳定性，236位的缬氨酸突变为丙氨酸可提高热稳定性10℃。进一步对上述3个位点进行定点突变发现：57位的组氨酸变为亮氨酸；203位的脯氨酸突变为天冬酰胺，谷氨酸，丙氨酸，异亮氨酸，组氨酸或苏氨酸；236位的缬氨酸突变为苏氨酸或丝氨酸后，酶的热稳定性均可提高。三突变酶455M(H57Y、P203E、V236A)的热稳定性比野生型酶提高了19℃，这些突变点申请了专利(池中康裕，et al.，Editor.1993)(注：钟渊对氨基酸序列的编号与其他文献不同，不计入第一位的甲硫氨酸，因此这3个突变点对应后面的58，204和237位氨基酸残基)。Giuliano等将来源于Agrobacterium tumefaciens NRRLB11291来源的DCase的243，250，279位的半胱氨酸残基定点突变，发现243和279位突变为丙氨酸后，酶稳定性可以提高6倍，这些突变申请了欧美日等国专利(Giuliano，G.，et al.，1995，Eniricerche Spa(Enie).p.677584-B1)。韩国Hak-Sung Kim实验室则通过DNA混组技术，提高了来源于Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291的DCase的热稳定性和抗氧化能力。研究表明：四个点突变(Q23L、H58Y、M184L和T262A)导致酶的热稳定性和抗氧化性都增强，其中T262A表现出最强的影响力(Oh，K.H.，et al.，Biotechnol Prog，2002.18(3)：p.413-7.；Oh，K.H.，et al.，Protein Eng，2002.15(8)：p.689-95.)。
许祯等从一株能将DL-对羟基苯海因转化为D-对羟基苯甘氨酸的菌株(皮氏罗雷斯顿菌CGMCC 1596)中，克隆出DCase基因，Genebank登陆号为：AF320814(许祯等，生物工程学报，2002，18(2)：149-54)。在将DCase基因构建入pET表达系统，转化大肠杆菌细胞过量表达后，对目的蛋白的活性和SDS-PAGE进行分析，结果显示：大肠杆菌可以大量表达出重组蛋白，但是70-80％左右的重组蛋白是以包涵体的形式存在。姜世民等利用一种蛋白质可溶性监测系统(W.Christian Wigley etc.2001 Nature Biotechnology 19，131-136)检测重组蛋白的可溶性，通过随机突变，获得了3个重组蛋白可溶性表达增加的突变体，分别为A18T，Y30N和K34E(Jiang，S.，et al.，Biochem J，2007.402(3)：p.429-37)。然而，虽然这三个突变体的蛋白质可溶性表达得到了很大的提高，其热稳定性仍然没有得到提高。但运用分子定向进化技术比如易错PCR技术(error-prone PCR)，DNA改组(DNA shuffling)技术和定点突变技术等对微生物来源的酶进行分子改性和人工进化在近些年中取得了令人瞩目的进展，使进一步改善该3个重组蛋白可溶性表达增加的突变体，使其热稳定性的性状得以改善成为可能。
发明内容
本发明的首要目的就在于通过定向进化技术对目的基因进行随机突变，并用高通量的筛选方法，获得热稳定性提高的D-氨甲酰水解酶突变体。
本发明的第二个目的在于提供D-氨甲酰水解酶突变体的DNA序列。
本发明的第三个目的在于提供一种重组表达质粒。
本发明的第四个目的在于提供一种基因工程菌。
本发明的第五个目的在于提供所述D-氨甲酰水解酶突变体在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。
本发明的第六个目的在于提供所述D-氨甲酰水解酶突变体的编码基因在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。
本发明的第七个目的在于提供所述重组表达质粒在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。
本发明的第八个目的在于提供所述基因工程菌在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。
为达到上述目的，本发明使用易错PCR技术，以可溶性表达得到提高的三突变DCase基因作为出发基因，进行随机突变。D-氨甲酰水解酶的Genebank登陆号为：AF320814，由304个氨基酸组成，其编码DNA序列包括915bp。
本发明将反应使体系的pH升高引起指示剂颜色变化作为筛选指标将正突变检出。氨甲酰水解酶催化反应后，使反应体系的pH得到提高，而该方法使用的酚红指示剂能在pH大于6.3时由黄色变为红色。
通过上述方法，本发明人筛选得到了数个重组蛋白热稳定性提高的突变体，所获得的突变体与出发基因的区别分别为：
1、D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第12位的谷氨酰胺突变为非极性氨基酸；
2、D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第263位的苏氨酸突变为甲硫氨酸；
3、D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第263位的苏氨酸突变为丝氨酸；
4、D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第12位的谷氨酰胺突变为苏氨酸，且第263位的苏氨酸突变为丝氨酸。
根据本发明，所述非极性氨基酸为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
根据本发明，所述D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示的D-氨甲酰水解酶-M3序列具有80％以上的同源性，优选的是与SEQ ID NO.2所示的D-氨甲酰水解酶-M3序列具有90％以上的同源性，更优选的是与SEQ ID NO.2所示的D-氨甲酰水解酶-M3序列具有95％以上的同源性，更优选的是与SEQ ID NO.2所示的D-氨甲酰水解酶-M3序列具有98％以上的同源性，最好的是具有SEQ ID NO.2所示的D-氨甲酰水解酶-M3序列。
根据本发明的一个优选实施例，本发明的突变体在67度保温10min后，其剩余活力比出发基因编码的DCase-M3均上升，热稳定性得到了显著提高，表明采用定向进化技术改造工业用酶是一个十分有效的手段。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
DCase Genebank登陆号为：AF320814，由304个氨基酸组成，其编码DNA序列包括915bp。以下实施例中，所使用的三突变体出发基因——DCase-M3基因，是指可溶性表达得到提高的三突变DCase基因，其序列及编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和2所示，其与该DCase基因的区别分别为：
1、A18T的第18位氨基酸由丙氨酸突变为苏氨酸，相对应地，其编码DNA序列中52-54bp的GCG变为ACG；
2、Y30N的第30位的氨基酸由酪氨酸突变为天冬酰胺，相对应地，其编码DNA序列中88-90bp的TAC变为AAC；
3、K34E的第34位的氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸，相对应地，其编码DNA序列中100-102bp的AAA变为GAA。
实施例1、DCase-M3基因的克隆
1.1、PCR扩增
设计一对引物：
5’-GCTTTCAGAGTTCCGCGATCA-3’；和
5’-TATGACACGTCAGATGATACTTGC-3’。
以pET28b-Dcase-M3(Jiang，S.，et al.，Biochem J，2007.402(3)：p.429-37)为模板，进行PCR扩增。
PCR体系：重蒸水17.75μl，2.5μl PCR buffer，1μl MgCl2(25mM)，1.5μl dNTP(2.5mM)，0.5μl上述两条引物，上述模板15ng，2个单位的Taq酶(上海sangon公司)。
PCR条件：94℃变性10min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共进行30循环，最后72℃充分延伸10min。
1.2、含DCase-M3基因的质粒构建
PCR扩增结束后，先使用1％的琼脂糖凝胶进行电压为100伏的核苷酸电泳，割胶后，用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收900bp左右的DNA片段，接着按照宝生物公司(网址：www.takara.com.cn)2005-2006产品目录说明书描述的方法，将所获得的DNA片段和载体pTrc99A(Invitrogen公司，含有氨苄霉素抗性基因)用限制性内切酶BamH I和HindIII进行双酶切。
酶切产物再次进行电压为100伏的核苷酸电泳，回收相应大小分别为900bp、4100bp左右的片段和载体，最后将载体和片段按1∶3的比例混合后，加入1个单位的T4连接酶，16℃连接10小时以上。
连接产物(重组质粒)转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含氨苄霉素抗生素的LB平板上筛选，挑取重组子，经过BamH I和HindIII双酶切和DNA测序验证，其DNA序列及对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和2所示，证明克隆的基因序列为正确，将其命名为DCase-M3。
1.3、表达DCase-M3的基因工程菌株构建
用常规方法(郝福英等编著，分子生物学实验技术，北京大学出版社，1998，第12-15页)将含DCase-M3的重组质粒转化入E.coli DH10B(Invitrogen公司)，即获得DCase-M3基因的大肠杆菌表达菌株。
实施例2、DCase-M3基因的随机突变
引物对：
5’-GCTTTCAGAGTTCCGCGATCA-3’；和
5’-TATGACACGTCAGATGATACTTGC-3’。
易错PCR反应体系(50μl)：20ng的模板pET28b-Dcase-M3(Jiang，S.，et al.，Biochem J，2007.402(3)：p.429-37)，各30pmol的一对引物，7mM MgCl2，50mM KCl，10mMTris-HCl(pH8.3)，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，0.05mM MnCl2，和5个单位的Taq酶(上海sangon公司)。
PCR反应条件：94℃变性10min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共进行30循环，最后72℃充分延伸10min。
PCR扩增结束后，先使用1％的琼脂糖凝胶进行电压为100伏的核苷酸电泳，割胶后，用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收900bp左右的DNA目的片段。
以回收纯化的DNA片段作为引物，重组质粒DCase-M3作为模板，进行PCR扩增，具体如下：
反应体系：20ng的DNA模板，引物10μl，2.5mM dNTP 8μl，和2个单位的KOD聚合酶(toyobo公司)。
PCR反应条件：95℃变性8min后，95℃变性45sec，58℃退火45sec，68℃延伸5.5min，共进行25循环，最后68℃充分延伸10min。
最终的PCR产物用Dpn I酶于37℃消化1小时去除DNA模板，后经65℃10min处理使Dpn I失活，得到了超过2×104个克隆的突变体库。
实施例3、突变体库的筛选
3.1、突变体转化
通过电击方法将实施例2中构建得到的突变体转化到E.coli DH10B(Invitrogen公司)中。转化细胞涂布于含氨苄抗生素的LB平板(蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、氯化钠1％、琼脂2％)上，37℃培养。
3.2、突变体筛选与鉴定
菌体生长12h后，挑取单菌落至加入300μl/孔的96孔细胞培养板中，1单菌落/孔，37℃，220rpm摇床培养。2小时后对菌体进行1mMIPTG诱导，继续培养18h。
取100μl/孔培养后菌液至96孔酶标板中，将其整体置于-70℃环境中，1.5h后转放至37℃环境中复苏，复苏时间30min左右。
将复苏后的菌液与反应液(5％NCHPG，1mM EDTA，0.01％酚红，pH6.3)混合于96孔酶标板中，置于37℃下反应3小时后观察，检出反应体系中由黄色转变为红色的突变株。
3.3、筛选结果
通过上述筛选步骤，从突变体库中筛选获得到了筛选获得到了2个重组蛋白稳定性提高的突变体，它们分别是Q12L、T263S。
3.4、突变体测序
经对2个突变体的氨基酸序列和基因序列进行测定，发现与出发基因DCase-M3编码的D-氨甲酰水解酶相比，分别是2个位置的氨基酸发生了变化，相应的编码DNA也发生了改变，具体如表1所示：
表1、两个DCase突变体的氨基酸序列和基因序列变化结果
| 编号 | 氨基酸位置 | 氨基酸变化 | 核苷酸位置 | 核苷酸变化 |
| Q12L | 12 | 谷氨酰胺→亮氨酸 | 34-36bp | CAA→CTA |
| T263S | 263 | 苏氨酸→丝氨酸 | 787-789bp | ACG→TCG |
实施例4、DCase-M3酶和突变体酶热稳定性的比较
4.1、菌体(粗酶)制备
分别取实施例3.2中发酵培养的菌体各1ml，加入1.5ml的离心管中，离心，弃上清。用0.1mM，pH 8.0的磷酸钠缓冲液重悬，于超声波破碎仪中超声破碎细胞，5瓦的功率，超声5秒后停止，15秒作为一个循环，进行15个循环后停止。将得到的粗酶液于4℃下12000转/min离心10min。取上清，置于4℃下备用。
4.2、粗酶液的热处理
将4.1所得的粗酶液置于65℃水浴中，在放置0min、10min、30min、60min、90min后取出，置于冰上备用。
4.3、酶促水解反应
将4.2热处理过的粗酶液400μl加入400μl的100mM的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸底物，进行水解反应。在40℃的水浴摇床，以150转/分钟的速度振荡。反应30min后，加入800μl的10％盐酸中止反应。
4.4、酶活测定
将4.3所述的反应物稀释5倍后，13000转/分钟离心5min，取上清进行HPLC测定。
HPLC测定D-氨甲酰水解酶的方法是：以含磷酸2.25mM，磷酸二氢钾20mM，pH5.0的甲醇与水为流动相，其比例是20∶80，流速为1.0ml/min，在210nm处检测不同含量物质以及相同物质的不同峰高和保留值，绘制出标准曲线，然后根据测定的样品数值确定在标准曲线中的位置，从而得到测定样品酶活的绝对数值。
1U酶活定义为每分钟产生1微摩尔D-对羟基苯甘氨酸所需的酶量。
酶活力的计算公示＝A×5×2×0.8×2.5×1000/(167.2×30)，其中A为HPLC测定得到的数值。
剩余酶活力的计算公示＝酶经高温处理后的酶活÷酶在零度保温后的酶活×100％。
4.5、菌体酶活比较
酶活测定结果见表2：
表2、经过65℃热处理后DCase-M3酶和突变体酶的酶活情况比较
| 65℃保温时间(min) | DCase-M3(U/ml) | Q12L(U/ml) | T263S(U/ml) |
| 0 | 0.31 | 0.337 | 0.384 |
| 10 | 0.018 | 0.221 | 0.240 |
| 30 | 0 | 0.160 | 0.131 |
| 60 | 0 | 0.1176 | 0.047 |
| 90 | 0 | 0.065 | 0.052 |
由表2结果可知，突变体酶Q12L和T263S在65℃保温10min后，其剩余活力为初始酶活的65.6％和62.5％。而出发基因编码的酶Dcase-M3在65度保温10min后，其剩余活力为初始酶活的5％，上述Q12L和T263S两个突变体的热稳定性得到了提高。
出发基因编码的酶DCase-M3，在65℃保温30min以后酶活力丧失，而突变体酶Q12L和T263S单位菌体的酶活在30min时达到0.160U/ml、0.131U/ml，直至90min酶活仍达到0.065U/ml、0.052U/ml，2个突变体酶在热稳定性方面明显优于出发基因编码的酶DCase-M3。
4.6、DCase-M3在12位点和263位点氨基酸的饱和突变
为了考察12位点和263位点除亮氨酸和其他氨基酸的突变对其热稳定性的影响，对该两个位点进行了饱和突变。其对应的碱基突变情况如表3所示。
表3、DCase12位和263位氨基酸饱和突变基因序列变化结果
4.5、菌体酶活比较
对上述饱和突变得到的各种突变体的酶活测定结果见表4：
表4、经过67℃、10min热处理后各突变体酶的酶活情况
由表4结果可知，第12位的谷氨酰胺Gln在突变为非极性氨基酸之后，其稳定性都得到了不同程度的提高，其中以突变为亮氨酸为最高(Q12L)，其剩余活力从12.3％上升到47.2％。在将其突变为极性不带电荷的氨基酸之后，绝大部分突变体表现出与出发菌株DCase-M3相似的耐热性能；而将其突变为极性带电荷的4种氨基酸之后，其耐热性能都下降了。此结果表明：第12位的非极性氨基酸有利于该蛋白的热稳定性，而极性带电荷的氨基酸起了相反的效果。
另外，对于第263位的苏氨酸来说，在突变为不带电荷的甲硫氨酸和丝氨酸后，其稳定性得到了最大程度的提高，热稳定性较出发菌株DCase-M3的12.3％分别上升到26.0％和25.0％。
实施例5、DCase-M3在12位点和263位点氨基酸的同时突变
为了考察12位点和263位点同时突变对热稳定性的影响，对目标基因进行兼并引物扩增，在12位点和263位点同时引入随机突变，生成突变体库，进行筛选。
5.1、PCR扩增
设计一对兼并引物：
5’-TGCAGTGGGACAANNKGGTCCGATCGCG-3’；和
5’-CTTCCAGCGTNNKAGTGAGAGCGACG-3’。
其中N表示AGCT，K表示TG。
以pET28b-Dcase-M3(Jiang，S.，et al.，Biochem J，2007.402(3)：p.429-37)为模板，进行PCR扩增。
PCR反应体系(50μl)：20ng的模板，各30pmol上述两条引物，1.5mM MgCl2，50mMKCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，0.2mM dNTP和2单位的KOD聚合酶(toyobo公司)。
PCR反应条件：94℃变性10min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共进行30循环，最后72℃充分延伸10min。
PCR扩增结束后，先使用1％的琼脂糖凝胶进行电压为100伏的核苷酸电泳，割胶后，用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收900bp左右的DNA目的片段。
以回收纯化的DNA片段作为引物，重组质粒DCase-M3作为模板，进行PCR扩增，具体如下：
反应体系：20ng的DNA模板，引物10μl，2.5mM dNTP 8μl，和2个单位的KOD聚合酶(toyobo公司)。
PCR反应条件：95℃变性8min后，95℃变性45sec，58℃退火45sec，68℃延伸5.5min，共进行25循环，最后68℃充分延伸10min。
最终的PCR产物用Dpn I酶于37℃消化1小时去除DNA模板，后经65℃10min处理使Dpn I失活，得到了超过8×103个克隆的突变体库。
5.2、突变体库的筛选
按实施例3所述方法进行筛选，得到一株比出发菌热稳定性有明显提高的突变株A11，并按实施例4所述方法对其酶活力进行测定，具体见表5：
表5、DCase-M3在12位点和263位点氨基酸的同时突变
| 样品 | 核苷酸位置 | 核苷酸变化 | 氨基酸位置 | 氨基酸变化 | 68度处理10分钟剩余活力％ |
| 出发菌DCase-M3 | - | - | - | - | 7.14±1.2 |
| 双突变体A11 | 34-36bp787-789bp | CAA→ACTACG→AGT | 12263 | 谷氨酰胺→苏氨酸苏氨酸→丝氨酸 | 33.15±2.85 |
由表5结果可知，DCase-M3在12位点和263位点氨基酸的同时突变后，其热稳定性比出发菌株DCase-M3有很大程度的提高。
本发明用定向进化技术改造DCase-M3，通过筛选手段，获得热稳定性得到提高的突变体，表明采用定向进化技术改造工业用酶是一个十分有效的手段。
虽然以上筛选获得的稳定性获得提高的突变体是以DCase-M3为出发基因的，但是从筛选获得的突变体来看，其关键位点在于DCase-M3的第12位和263位氨基酸，对于本领域的技术人员来说，根据本说明书的提示，采用与本发明的出发基因具有较高同源性的其它基因，例如同源性达到80％，优选的是90％，更好的是95％，最好的是98％以上的其它基因，同样可以获得稳定性得到提高的突变体，这是显而易见的，因此同样应当包括在本申请的保护范围之内。
Claims (15)
1.一种D-氨甲酰水解酶的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列由以下任一项所述的氨基酸序列组成：
A：D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第12位的谷氨酰胺突变为非极性氨基酸，所述非极性氨基酸为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或色氨酸；
B：D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第263位的苏氨酸突变为甲硫氨酸；
C：D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第263位的苏氨酸突变为丝氨酸；
D：D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第12位的谷氨酰胺突变为苏氨酸，且第263位的苏氨酸突变为丝氨酸；
其中，所述D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列为如SEQ ID NO.2所示的D-氨甲酰水解酶-M3序列。
2.一种编码权利要求1所述的D-氨甲酰水解酶突变体的DNA序列。
3.如权利要求2所述的DNA序列，其特征在于，由以下任一项所述的DNA序列组成：
A、SEQ ID NO.1所示的D-氨甲酰水解酶-M3的基因序列中第34-36bp的CAA突变为GTA、CTA、ATA、TTC或TGG；
B、SEQ ID NO.1所示的D-氨甲酰水解酶-M3的基因序列中第787-789bp的ACG突变为ATG；
C、SEQ ID NO.1所示的D-氨甲酰水解酶-M3的基因序列中第787-789bp的ACG突变为TCG；
D：SEQ ID NO.1所示的D-氨甲酰水解酶-M3的基因序列中第34-36bp的CAA突变为ACT，且第787-789bp的ACG突变为AGT。
4.如权利要求2所述的D-氨甲酰水解酶突变体的DNA序列，其特征在于，所述D-氨甲酰水解酶-M3的基因序列中第52-54bp为ACG，第88-90bp为AAC，且第100-102bp为GAA。
5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒克隆有如权利要求1所述的D-氨甲酰水解酶的突变体的编码序列。
6.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是将权利要求5所述的重组质粒转化入宿主细胞而获得。
7.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌。
8.如权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌是大肠杆菌E.coliDH10B。
9.如权利要求1所述的D-氨甲酰水解酶突变体在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。
10.如权利要求2所述的D-氨甲酰水解酶突变体的编码基因在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，将如权利要求2所述的DNA序列克隆入宿主细胞，并将该宿主细胞的发酵菌体用于D-对羟基苯甘氨酸的生产。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌是大肠杆菌E.coli DH10B。
14.如权利要求5所述的重组质粒在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。
15.如权利要求6所述的基因工程菌在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。
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