CN115772513A - D-氨甲酰水解酶突变体、基因、表达载体及其应用 - Google Patents

D-氨甲酰水解酶突变体、基因、表达载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种D‑氨甲酰水解酶突变体、基因、表达载体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明通过蛋白质工程改造的方法提高了D‑氨甲酰水解酶的催化活性，突变体的催化效率相对于野生型至少提高了2.6倍，从而减少酶的添加量，在级联反应催化L‑吲哚甲基海因中，在酶的添加量较低的情况下仍能实现90％以上的得率，远远高于野生型的79.3％，具有良好的工业应用前景。

Description

D-氨甲酰水解酶突变体、基因、表达载体及其应用
本申请是申请号为：202010382460.0，申请日为：2020年5月8日，申请名称为：D-氨甲酰水解酶突变体及其在D-芳香族氨基酸合成中的应用的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种D-氨甲酰水解酶突变体、基因、表达载体及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
D-氨基酸作为一种非天然的氨基酸，常被用来合成各种医药中间体，例如D-对羟基苯甘氨酸常被用来合成头孢菌素的前体(Syldatk C.,Advances in BiochemicalEngineering Biotechnology,1990,29–75)；D-色氨酸(D-Trp)可用于合成奥曲肽Octreotide和他达拉非Cialis，它们是治疗肢端肥大症和勃起功能障碍的重要药物；D-Trp还可用于合成治疗皮炎的肽类药物，包括：Tyrocidines C(D-Phe-Pro-Trp-D-Trp-Asn-Gln-Tyr-Val-Orn-Leu)和Thymodepressin(γ-D-Glu-D-Trp)等(Martínez-Rodríguez etal.,Chem.Biodivers,2010,7,1531–1548)，同时，还可以用作非营养型甜味剂，在食品行业倍受欢迎。
D-N-氨甲酰水解酶是属于腈水解酶超家族的第6类，它可以将D-N-氨甲酰氨基酸水解得到的D-氨基酸，常被用来与海因消旋酶和海因酶构成级联反应制备光学纯的D-氨基酸。
近年来关于D-芳香族氨基酸的合成研究主要是D-色氨酸和D-对羟基苯甘氨酸，例如，1998年Yamamoto等人，利用D-N-酰胺酶选择性地水解D-色氨酰胺之后通过化学水解得到D-Trp(EP0853128A1)。类似于酰胺酶方法，1957年Greenstein，等人利用L-氨基酰化酶制备D-Trp，其中只有N-乙酰基-DL-色氨酰胺中的L-对映异构体被水解，剩余的对映异构体可通过化学法脱乙酰化形成D-Trp(Greenstein,J.P.,Methods In Enzymology,1957,3:554–570)。1995年，Yamamoto H等人报道可以D-色氨酸酶从DL-Trp外消旋体中降解L-Trp产生D-Trp，但是该反应的副产物丙酮酸和吲哚可抑制色氨酸酶的活性，因而需要去除(Kawasakiet al.Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1995,59:1938–1943)。目前报道的这些方法都存在理论产率为50％，过程复杂，产率低和对映选择性等缺点。尽管在1949年，Eadie G等人报道可以由D-氨基酸转氨酶使得底物吲哚丙酮酸和D-丙氨酸反应的方法来制备光学纯D-Trp，该方法理论产率为100％，但是活性低，而最终的产率仅为13％(Eadie Get al.Journal of Biological Chemistry,1949,181:449–458)。海因酶过程是一个由海因消旋酶，海因酶和氨甲酰水解酶组成的三酶级联反应，由于其可以打破传统的50％转化率的限制，因而拥有较高的得率，一直以来被认为是高效经济制备光学纯D-氨基酸的方法。本人在前期的研究中已经筛选到一支来源于成晶节杆菌中的D-氨甲酰水解酶，专利号(201711097767.0)，其能够催化300mM L-吲哚甲基海因基本完全转化生成相应的D-色氨酸，该酶用于级联反应虽然可以实现300mM底物的转化，但是需要添加大量的酶(50kU/LAaHyuA,25kU/L AtHyuH,50kU/L AcHyuC)，而且在前期研究中发现由于D-氨甲酰水解酶的酶活力较前两步反应明显偏低，当继续提高底物浓度时，需要进一步加入大量的D-氨甲酰水解酶来完成转化，使得这一过程失去了原有的经济性，因此在前期的研究中，本课题组通过基因挖掘的方法获得了一支来源于印度洋硝酸盐还原菌Nitratireductor indicusC115的D-氨甲酰水解酶，命名为NiHyuC,该酶可以实现对1M L-吲哚甲基海因的完全转化，但同样存在着D-氨甲酰水解酶低，酶载量多(50kU/L AaHyuA,25kU/L AtHyuH,50kU/LNiHyuC)的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明通过蛋白质工程改造的方法提高了D-氨甲酰水解酶的催化活性，从而减少酶的添加量，这对于应用海因酶过程高效制备D-氨基酸是至关重要的。
本发明的第一个目的是提供一种D-氨甲酰水解酶突变体，所述的D-氨甲酰水解酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的D-氨甲酰水解酶的第200位丙氨酸突变为丝氨酸(A200S)，或将第200位丙氨酸突变为天冬酰胺(A200N)，或将第200位丙氨酸突变为谷氨酸(A200E)，或将第200位丙氨酸突变为组氨酸(A200H)。具体地，SEQ ID NO.1所示氨基酸序列如下：
MTRRIRIGGAQMGAISRSDSKKEIVDRLIALLRQASEKGCELVVFPELALSTFFPRWYAERDGMDGYFEDGMPNAATLPLFEEARRLGIGFSLGYAELVQEDGRVRRFNTTVLVERNGEIVGKYRKIHLPGHAEYEPERSHQHLEKRYFEVGNTGFQVWDAFGGRVGMAICNDRRWVETYRVMGLQDVELILIGYNTPVADSLSGESETLRMFHNHLTMQAGAYQNSTWVVGVAKAGVEDGHRLMGGSVIVAPTGEIVAQAMTEGDELIVADCDLDRCRYYKSHIFNFAAHRRPEFYQRITSQTGVE。
本发明的第二个目的是提供编码所述D-氨甲酰水解酶突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供携带所述编码D-氨甲酰水解酶突变体的基因的表达载体。
本发明的第四个目的是提供表达所述D-氨甲酰水解酶突变体的细胞。
进一步地，所述细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
进一步地，当宿主细胞为细菌时，重组菌的构建方法：将编码所述D-氨甲酰水解酶突变体的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到宿主菌中，得到重组菌。
进一步地，所述重组菌的宿主为大肠杆菌(Escherichia coli)，所述质粒为pET28a(+)。
进一步地，所述重组菌的宿主为E.coli BL21(DE3)。
本发明的第五个目的是提供所述的重组菌生产D-氨甲酰水解酶的方法，具体步骤如下：将重组菌接种至含有40-60μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，30～40℃，100～200rpm摇床培养，培养液的吸光度OD600达到0.5～1.0时，加入0.05～1.0mM的IPTG进行诱导，诱导温度为16～30℃，诱导5～12h即可获得重组D-氨甲酰水解酶。
本发明的第六个目的时提供所述的D-氨甲酰水解酶突变体在制备光学纯D-氨基酸中的应用。
进一步地，所述的应用是以所述的D-氨甲酰水解酶突变体为催化剂，催化底物生成D-氨基酸，所述的底物为DL-N-氨甲酰色氨酸，DL-N-氨甲酰苯丙氨酸和DL-N-氨甲酰苯甘氨酸，DL-N-氨甲酰甲硫氨酸,DL-N-氨甲酰-色氨酸,DL-N-氨甲酰邻氯苯甘氨酸，DL-N-氨甲酰亮氨酸或DL-N-氨甲酰异亮氨酸。
进一步地，所述的应用具体包括如下步骤：构建反应体系，L-吲哚甲基浓度为10mM～1M，所述D-氨甲酰水解酶突变体用量为1～10kU/L，磷酸盐缓冲液的浓度为0.05～0.15M；在30～35℃，pH 6～8的条件下反应1～24h。
本发明的有益效果：
本发明的D-氨甲酰水解酶突变体对多种N-氨甲酰氨基酸具有较高的活力，可以催化多种脂肪族或芳基取代的氨基酸底物，尤其是空间位阻较大的D-N-氨甲酰氨基酸底物。本发明的D-氨甲酰水解酶突变体的催化效率相对于野生型至少提高了2.6倍，在级联反应催化L-吲哚甲基海因中，在酶的添加量较低的情况下仍能实现90％以上的得率，远远高于野生型的79.3％。可见，本发明所获得的D-氨甲酰水解酶突变体特别适用于海因酶过程级联反应制备光学纯的D-氨基酸，具有良好的工业应用前景。
附图说明
图1为D-氨甲酰水解酶突变体全质粒PCR核酸电泳图；
图2为D-氨甲酰水解酶突变体催化D-N-氨甲酰色氨酸手性液相色谱图；
图3为D-氨甲酰水解酶突变体催化D-N-氨甲酰对羟基苯丙氨酸手性液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
测定D-N-氨甲酰水解酶对底物DL-N-氨甲酰色氨酸的酶活力。测定体系为：适量酶液、10mmol·L-1DL-N-氨甲酰色氨酸。于30℃静置反应10min。反应结束后，取样进行液相检测。液相检测条件：色谱柱为Diamonsil Plus C18(25cm×4.6mm,5μm)，流动相为乙腈：磷酸二氢钾(25：75)，流速为0.2～1mL·min-1,检测波长为210nm。
酶活力单位定义(U)：
在30℃下，D-N-氨甲酰水解酶催化底物DL-N-氨甲酰色氨酸生成1μmol的D-色氨酸所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(U)
实施例1：D-氨甲酰水解酶突变体基因和重组表达转化体的构建
采用全质粒PCR方法对Ala200的氨基酸残基进行定点饱和突变，其引物设计如表1所示(均按5’-3’方向描述)，下划线代表突变位点。
表1定点饱和突变引物设计表
Figure BDA0003814257820000051
PCR反应体系为：PCR反应体系(50μL)包括KOD酶(2.5U/mL)l.0μL，模板(5-50ng)l.0μL，dNTP 4.0μL，10×reaction buffer 5.0μL，上下游引物各1.0μL，ddH2O补足至50μL。
PCR扩增程序为：(1)94℃变性3min，(2)94℃变性30sec，(3)54℃退火30sec，(4)72℃延伸150sec，重复步骤(2)～(4)进行10-15个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存PCR扩增产物。
PCR结束后，添加DpnI限制性内切酶于反应混合物中并置于37℃孵育1h，用CaCl2热转化法将10μL消化后PCR反应液转入50μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养12h。
实施例2：D-氨甲酰水解酶及其突变体的表达及纯化
将含有突变质粒的重组大肠杆菌按2％的转接量接种至含有硫酸卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中，37℃，200rpm摇床培养，培养液的吸光度OD600达到0.8时，加入0.2mM的IPTG进行诱导，诱导温度为25℃，诱导12h后，8000rpm离心5min获得高效表达重组D-氨甲酰水解酶突变体的菌体，将收集的菌体悬浮于Tris-HCl缓冲液(100mM，pH 8.0)中，超声破碎。
纯化所使用的柱子为镍亲和柱HisTrap HP 5mL，利用重组蛋白上的组氨酸标签进行亲和层析来完成。首先使用A液将镍柱平衡，粗酶液上样，继续使用A液(25mM Tris，500mMNaCl,20mM咪唑，pH 7.4)将穿透峰洗脱下来，待平衡后用B液(25mM Tris，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋白洗脱下来，获得重组D-氨甲酰水解酶突变体。对纯化后的蛋白进行活力测定及SDS-PAGE分析。镍柱纯化后，在38kDa左右显示单条带，且杂蛋白较少，说明柱纯化效果较好。之后使用His Trap Desalting脱盐柱(GE Healthcare)将纯化后的D-氨甲酰水解酶蛋白置换到Tris-HCl(l00 mM，pH 8.0)缓冲液中。
实施例3：D-氨甲酰水解酶突变体的动力学参数和级联反应转化效果分析
测定NiHyuC及突变体对底物DL-N-氨甲酰-色氨酸的动力学参数。动力学参数测定体系列举如下：Tris-HCl缓冲液(100mmol·L-1，pH 8.0)，DL-N-氨甲酰-色氨酸(0～20mmol·L-1)。通过计算比酶活力来表征反应速率，从而计算动力学参数。
由于目前关于氨甲酰水解酶酶活力改造的文献报道较少，没有可供参考的突变位点，本专利通过以来源Agrobacterium radiobacter的D-氨甲酰水解酶(PDB号：1fo6)为模板使用EasyModeller进行同源建模，之后进行模型的验证和评价。
在获得蛋白质的结构后使用分子对接，将底物D-N-氨甲酰色氨酸与模型蛋白质结构实现对接，之后选择了底物
Figure BDA0003814257820000061
范围内的位点进行饱和突变文库的构建和筛选。所涉及到突变位点包括Ala200，初筛获得的优突变体进行摇瓶复筛，对复筛活性提高的突变体进行蛋白质纯化和动力学参数的测定。结果如表2所示，筛选获得了A200E，A200N，A200S，A200H四个突变体，其中，各突变体的动力学参数分别为：A200E，其kcat/Km为96.4min-1·mM-1，为WT(kcat/Km为25.7min-1·mM-1)的3.8倍；A200N，其kcat/Km为88.0min-1·mM-1，为WT的3.4倍；A200S，其kcat/Km为109min-1·mM-1，为WT的4.2倍；A200H，其kcat/Km为67.7min-1·mM-1，为WT的2.6倍。之后对kcat/Km较WT提高的单点突变体进行了级联反应催化200mM L-吲哚甲基海因的转化的验证，三个酶的酶添加量分别为15kU/L AaHyuA,20kU/L AtHyuH,5kU/LNiHyuC，其产物的得率分别为97.8％，92.7％，94.2％，85.6％，其中WT的得率为79.3％。
表2D-氨甲酰水解酶单点突变体动力学参数及催化200mM底物级联反应验证
Figure BDA0003814257820000071
实施例4：D-氨甲酰水解酶突变体用于级联反应制备D-色氨酸的时间进程
取5kU/L D-N-氨甲酰水解酶突变体和15kU/L的海因消旋酶(AaHyuA)、20kU/L D-海因酶(AtHyuH)于Tris-HCl缓冲液(pH 6～8,100mmol·L-1)中，加入20％PEG400，500mmol·L-1L-吲哚甲基海因，反应液总体积为10mL。将反应置于30℃下，取样检测转化过程，条件如下：Diamonsil Plus C18色谱柱(25cm×4.6mm,5μm)，检测波长为210nm，流动相为乙腈：磷酸二氢钾(10～30：90～70)，流速为0.5～1mL/min。
实施例5：D-氨甲酰水解酶突变体应用于级联反应制备D-对羟基苯丙氨酸的时间进程
取10kU/L D-N-氨甲酰水解酶突变体和15kU/L的海因消旋酶(AaHyuA)、20kU/L D-海因酶(AtHyuH)于Tris-HCl缓冲液(pH 6～8,100mmol·L-1)中，加入5-10％PEG400，500mmol·L-1L-对羟基苯海因，反应液总体积为10mL。将反应置于30℃下，取样检测转化过程，条件如下：Diamonsil Plus C18色谱柱(25cm×4.6mm,5μm)，检测波长为210nm，流动相为乙腈：磷酸二氢钾(10～30：90～70)，流速为0.5～1mL/min。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种D-氨甲酰水解酶突变体，其特征在于：所述的D-氨甲酰水解酶突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的D-氨甲酰水解酶的第200位点丙氨酸突变为丝氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或组氨酸得到。
2.一种编码权利要求1所述D-氨甲酰水解酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的表达载体。
4.表达权利要求1所述D-氨甲酰水解酶突变体的细胞。
5.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于：所述细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于：所述细菌为大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于：所述大肠杆菌包括E.coli BL21(DE3)。
8.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于：所述细菌以pET28a(+)为表达载体。
9.权利要求1所述的D-氨甲酰水解酶突变体在制备光学纯D-氨基酸中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的应用是以所述的D-氨甲酰水解酶突变体为催化剂，催化底物生成D-氨基酸。
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