CN111454933B - D-氨甲酰水解酶突变体及其在d-芳香族氨基酸合成中的应用 - Google Patents

D-氨甲酰水解酶突变体及其在d-芳香族氨基酸合成中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111454933B
CN111454933B CN202010382460.0A CN202010382460A CN111454933B CN 111454933 B CN111454933 B CN 111454933B CN 202010382460 A CN202010382460 A CN 202010382460A CN 111454933 B CN111454933 B CN 111454933B
Authority
CN
China
Prior art keywords
replaced
alanine
amino acid
mutant
glycine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010382460.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111454933A (zh
Inventor
倪晔
刘亚菲
许国超
韩瑞枝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202010382460.0A priority Critical patent/CN111454933B/zh
Priority to CN202211021214.8A priority patent/CN115772513A/zh
Publication of CN111454933A publication Critical patent/CN111454933A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111454933B publication Critical patent/CN111454933B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/001—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by metabolizing one of the enantiomers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01077—N-Carbamoyl-D-amino-acid hydrolase (3.5.1.77)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种D‑氨甲酰水解酶突变体及其在D‑芳香族氨基酸合成中的应用，属于基因工程技术领域。本发明的D‑氨甲酰水解酶突变对多种N‑氨甲酰氨基酸具有较高的活力，可以催化多种脂肪族或芳基取代的氨基酸底物，尤其是空间位阻较大的D‑N‑氨甲酰氨基酸底物。将这些突变体用于海因酶过程级联反应进行催化500mM L‑吲哚甲基海因的验证，其中五突变体A200N/R211G/D187N/S207A/E138W在反应12h时产物得率已经达到81.7％，相比WT(40.1％)，产物得率提升2倍，且反应时间大大缩短，仅需12h。本发明所获得的D‑氨甲酰水解酶突变体特别适用于海因酶过程级联反应制备光学纯的D‑氨基酸，具有良好的工业应用前景。

Description

D-氨甲酰水解酶突变体及其在D-芳香族氨基酸合成中的应用
技术领域
本发明涉及一种D-氨甲酰水解酶突变体及其在D-芳香族氨基酸合成中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
D-氨基酸作为一种非天然的氨基酸，常被用来合成各种医药中间体，例如D-对羟基苯甘氨酸常被用来合成头孢菌素的前体(Syldatk C.,Advances in BiochemicalEngineering Biotechnology,1990,29–75)；D-色氨酸(D-Trp)可用于合成奥曲肽Octreotide和他达拉非Cialis，它们是治疗肢端肥大症和勃起功能障碍的重要药物；D-Trp还可用于合成治疗皮炎的肽类药物，包括：TyrocidinesC(D-Phe-Pro-Trp-D-Trp-Asn-Gln-Tyr-Val-Orn-Leu)和Thymodepressin(γ-D-Glu-D-Trp)等(Martínez-Rodríguez et al.,Chem.Biodivers,2010,7,1531–1548)，同时，还可以用作非营养型甜味剂，在食品行业倍受欢迎。
D-N-氨甲酰水解酶是属于腈水解酶超家族的第6类，它可以将D-N-氨甲酰氨基酸水解得到的D-氨基酸，常被用来与海因消旋酶和海因酶构成级联反应制备光学纯的D-氨基酸。
近年来关于D-芳香族氨基酸的合成研究主要是D-色氨酸和D-对羟基苯甘氨酸，例如，1998年Yamamoto等人，利用D-N-酰胺酶选择性地水解D-色氨酰胺之后通过化学水解得到D-Trp(EP0853128A1)。类似于酰胺酶方法，1957年Greenstein，等人利用L-氨基酰化酶制备D-Trp，其中只有N-乙酰基-DL-色氨酰胺中的L-对映异构体被水解，剩余的对映异构体可通过化学法脱乙酰化形成D-Trp(Greenstein,J.P.,Methods In Enzymology,1957,3:554–570)。1995年，Yamamoto H等人报道可以D-色氨酸酶从DL-Trp外消旋体中降解L-Trp产生D-Trp，但是该反应的副产物丙酮酸和吲哚可抑制色氨酸酶的活性，因而需要去除(Kawasakiet al.Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1995,59:1938–1943)。目前报道的这些方法都存在理论产率为50％，过程复杂，产率低和对映选择性等缺点。尽管在1949年，Eadie G等人报道可以由D-氨基酸转氨酶使得底物吲哚丙酮酸和D-丙氨酸反应的方法来制备光学纯D-Trp，该方法理论产率为100％，但是活性低，而最终的产率仅为13％(Eadie Get al.Journal of Biological Chemistry,1949,181:449–458)。海因酶过程是一个由海因消旋酶，海因酶和氨甲酰水解酶组成的三酶级联反应，由于其可以打破传统的50％转化率的限制，因而拥有较高的得率，一直以来被认为是高效经济制备光学纯D-氨基酸的方法。本人在前期的研究中已经筛选到一支来源于成晶节杆菌中的D-氨甲酰水解酶，专利号(201711097767.0)，其能够催化300mM L-吲哚甲基海因基本完全转化生成相应的D-色氨酸，该酶用于级联反应虽然可以实现300mM底物的转化，但是需要添加大量的酶(50kU/LAaHyuA,25kU/L AtHyuH,50kU/LAcHyuC)，而且在前期研究中发现由于D-氨甲酰水解酶的酶活力较前两步反应明显偏低，当继续提高底物浓度时，需要进一步加入大量的D-氨甲酰水解酶来完成转化，使得这一过程失去了原有的经济性，因此在前期的研究中，本课题组通过基因挖掘的方法获得了一支来源于印度洋硝酸盐还原菌Nitratireductor indicus C115的D-氨甲酰水解酶，命名为NiHyuC,该酶可以实现对1M L-吲哚甲基海因的完全转化，但同样存在着D-氨甲酰水解酶低，酶载量多(50kU/L AaHyuA,25kU/L AtHyuH,50kU/L NiHyuC)的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明通过蛋白质工程改造的方法提高了D-氨甲酰水解酶的催化活性，从而减少酶的添加量，这对于应用海因酶过程高效制备D-氨基酸是至关重要的。
本发明的第一个目的是提供一种D-氨甲酰水解酶突变体，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第138位点谷氨酸、第187位点天冬氨酸、第200位点丙氨酸、第207位点丝氨酸、第211位精氨酸中的一个或多个位点进行突变。
进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第138位点谷氨酸突变为色氨酸(E138W)；或将第187位天冬氨酸替换为天冬酰胺(D187N)；或将第200位丙氨酸替换为丝氨酸(A200S)；或将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺(A200N)；或将第200位丙氨酸替换为谷氨酸(A200E)；或将第207位丝氨酸替换为丙氨酸(S207A)；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸(R211G)。
进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第138位点谷氨酸突变为色氨酸(E138W/R211G)；或同时将第200位丙氨酸替换为丝氨酸(A200S/R211G)；或同时将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺(A200N/R211G)；或同时将第200位丙氨酸替换为谷氨酸(A200E/R211G)；或同时将第207位丝氨酸替换为丙氨酸(S207A/R211G)。
进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第211位精氨酸替换为甘氨酸，第200位丙氨酸替换为天冬酰胺，同时将第187位点的天冬氨酸替换成天冬酰胺(R211G/A200N/D187N)；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第138位谷氨酸替换为色氨酸，第207位点的丝氨酸替换成丙氨酸(R211G/E138W/S207A)；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺，第207位点的丝氨酸替换成丙氨酸(R211G/A200N/S207A)；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第207位点的丝氨酸替换成丙氨酸，第187位点的天冬氨酸替换成天冬酰胺(R211G/S207A/D187N)。
进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺，第187位点的天冬氨酸替换成天冬酰胺，第207位点的丝氨酸替换成丙氨酸(R211G/A200N/D187N/S207A)；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺，第187位点的天冬氨酸替换成天冬酰胺，第138位谷氨酸替换为色氨酸(R211G/A200N/D187N/E138W)。
进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺，第187位点的天冬氨酸替换成天冬酰胺，第207位点的丝氨酸替换成丙氨酸，第138位谷氨酸替换为色氨酸(R211G/A200N/D187N/S207A/E138W)。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供携带所述基因的表达载体。
本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的重组菌。
进一步地，所述重组菌的构建方法：将编码所述突变体的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到宿主菌中，得到重组菌。
进一步地，所述重组菌的宿主为大肠杆菌(Escherichia coli)，所述质粒为pET28a(+)。
进一步地，所述重组菌的宿主为E.coli BL21(DE3)。
本发明的第五个目的是提供所述的重组菌生产D-氨甲酰水解酶的方法，具体步骤如下：将重组菌接种至含有40-60μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，30～40℃，100～200rpm摇床培养，培养液的吸光度OD600达到0.5～1.0时，加入0.05～1.0mM的IPTG进行诱导，诱导温度为16～30℃，诱导5～12h即可获得重组D-氨甲酰水解酶。
本发明的第六个目的时提供所述的D-氨甲酰水解酶突变体在制备光学纯D-氨基酸中的应用。
进一步地，所述的应用是以所述的D-氨甲酰水解酶突变体为催化剂，催化底物生成D-氨基酸，所述的底物为DL-N-氨甲酰色氨酸，DL-N-氨甲酰苯丙氨酸和DL-N-氨甲酰苯甘氨酸，DL-N-氨甲酰甲硫氨酸,DL-N-氨甲酰-色氨酸,DL-N-氨甲酰邻氯苯甘氨酸，DL-N-氨甲酰亮氨酸或DL-N-氨甲酰异亮氨酸。
进一步地，所述的应用具体包括如下步骤：构建反应体系，L-吲哚甲基浓度为10mM～1M，所述D-氨甲酰水解酶突变体用量为1～10kU/L，磷酸盐缓冲液的浓度为0.05～0.15M；在30～35℃，pH 6～8的条件下反应1～24h。
本发明的有益效果：
本发明的D-氨甲酰水解酶突变对多种N-氨甲酰氨基酸具有较高的活力，可以催化多种脂肪族或芳基取代的氨基酸底物，尤其是空间位阻较大的D-N-氨甲酰氨基酸底物。将这些突变体用于海因酶过程级联反应进行催化500mM L-吲哚甲基海因的验证，其中五突变体A200N/R211G/D187N/S207A/E138W在反应12h时产物得率已经达到81.7％，相比WT(40.1％)，产物得率提升2倍，且反应时间大大缩短，仅需12h。本发明所获得的D-氨甲酰水解酶突变体特别适用于海因酶过程级联反应制备光学纯的D-氨基酸，具有良好的工业应用前景。
附图说明
图1为D-氨甲酰水解酶突变体全质粒PCR核酸电泳图；
图2为D-氨甲酰水解酶最优五突变体表达及纯化结果的SDS-PAGE电泳图；泳道1：粗酶液，2：Marker；3：纯酶
图3为D-氨甲酰水解酶突变体催化D-N-氨甲酰色氨酸手性液相色谱图；
图4为D-氨甲酰水解酶突变体催化D-N-氨甲酰对羟基苯丙氨酸手性液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
测定D-N-氨甲酰水解酶对底物DL-N-氨甲酰色氨酸的酶活力。测定体系为：适量酶液、10mmol·L-1 DL-N-氨甲酰色氨酸。于30℃静置反应10min。反应结束后，取样进行液相检测。液相检测条件：色谱柱为Diamonsil Plus C18(25cm×4.6mm,5μm)，流动相为乙腈：磷酸二氢钾(25：75)，流速为0.2～1mL·min-1,检测波长为210nm。
酶活力单位定义(U)：
在30℃下，D-N-氨甲酰水解酶催化底物DL-N-氨甲酰色氨酸生成1μmol的D-色氨酸所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(U)
实施例1：D-氨甲酰水解酶突变体基因和重组表达转化体的构建
采用全质粒PCR方法对Phe53，Pro130，His143，Glu145，Asn172，Arg174，Arg175，Thr195，Asn196，Thr197，Pro198，Ala200，Asp201，Ser204，Arg211的氨基酸残基进行定点饱和突变，其引物设计如表1所示(均按5’-3’方向描述)，下划线代表突变位点。
表1定点饱和突变引物设计表
Figure BDA0002482676330000061
采用全质粒PCR方法对Ala49，Arg61，Tyr67，Ser92，Glu138，Arg139，His141，Ala169，Val177，Asp187，Leu192，Ser202，Leu203，Gly205，Ser207，Met212，Ser227，Thr301的氨基酸残基进行定点突变，其引物设计如表2(均按5’-3’方向描述)，下划线代表突变位点：
表2定点突变引物设计表
Figure BDA0002482676330000071
PCR反应体系为：PCR反应体系(50μL)包括KOD酶(2.5U/mL)l.0μL，模板(5-50ng)l.0μL，dNTP 4.0μL，10×reaction buffer 5.0μL，上下游引物各1.0μL，ddH2O补足至50μL。
PCR扩增程序为：(1)94℃变性3min，(2)94℃变性30sec，(3)54℃退火30sec，(4)72℃延伸150sec，重复步骤(2)～(4)进行10-15个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存PCR扩增产物。
PCR结束后，添加DpnI限制性内切酶于反应混合物中并置于37℃孵育1h，用CaCl2热转化法将10μL消化后PCR反应液转入50μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养12h。
实施例2：D-氨甲酰水解酶及其突变体的表达及纯化
将含有突变质粒的重组大肠杆菌按2％的转接量接种至含有硫酸卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中，37℃，200rpm摇床培养，培养液的吸光度OD600达到0.8时，加入0.2mM的IPTG进行诱导，诱导温度为25℃，诱导12h后，8000rpm离心5min获得高效表达重组D-氨甲酰水解酶突变体的菌体，将收集的菌体悬浮于Tris-HCl缓冲液(100mM，pH 8.0)中，超声破碎。
纯化所使用的柱子为镍亲和柱HisTrap HP 5mL，利用重组蛋白上的组氨酸标签进行亲和层析来完成。首先使用A液将镍柱平衡，粗酶液上样，继续使用A液(25mM Tris，500mMNaCl,20mM咪唑，pH 7.4)将穿透峰洗脱下来，待平衡后用B液(25mM Tris，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋白洗脱下来，获得重组D-氨甲酰水解酶突变体。对纯化后的蛋白进行活力测定及SDS-PAGE分析。镍柱纯化后，在38kDa左右显示单条带，且杂蛋白较少，说明柱纯化效果较好。之后使用His Trap Desalting脱盐柱(GE Healthcare)将纯化后的D-氨甲酰水解酶蛋白置换到Tris-HCl(l00mM，pH 8.0)缓冲液中。
实施例3：D-氨甲酰水解酶突变体的动力学参数和级联反应转化效果分析
测定NiHyuC及突变体对底物DL-N-氨甲酰-色氨酸的动力学参数。动力学参数测定体系列举如下：Tris-HCl缓冲液(100mmol·L-1，pH 8.0)，DL-N-氨甲酰-色氨酸(0～20mmol·L-1)。通过计算比酶活力来表征反应速率，从而计算动力学参数。
由于目前关于氨甲酰水解酶酶活力改造的文献报道较少，没有可供参考的突变位点，本专利通过以来源Agrobacterium radiobacter的D-氨甲酰水解酶(PDB号：1fo6)为模板使用EasyModeller进行同源建模，之后进行模型的验证和评价。
在获得蛋白质的结构后使用分子对接，将底物D-N-氨甲酰色氨酸与模型蛋白质结构实现对接，之后选择了底物
Figure BDA0002482676330000091
范围内的位点进行饱和突变文库的构建和筛选。所涉及到突变位点为：Phe53，Pro130，His143，Glu145，Asn172，Arg174，Arg175，Thr195，Asn196，Thr197，Pro198，Ala200，Asp201，Ser204，Arg211，初筛获得的优突变体进行摇瓶复筛，对复筛活性提高的突变体进行蛋白质纯化和动力学参数的测定。结果如表3所示，筛选获得了R211G，R211S，A200E，A200N，A200S，A200H六个突变体，其中动力学参数显著提高的突变体分别为R211G，其kcat/Km为87.0min-1·mM-1，为WT(kcat/Km为25.7min-1·mM-1)的3.4倍；A200E，其kcat/Km为96.4min-1·mM-1，为WT的3.8倍；A200N，其kcat/Km为88.0min-1·mM-1，为WT的3.4倍；A200S，其kcat/Km为109min-1·mM-1，为WT的4.2倍；A200H，其kcat/Km为67.7min-1·mM-1，为WT的2.6倍。之后对kcat/Km较WT提高的单点突变体进行了级联反应催化200mM L-吲哚甲基海因的转化的验证，三个酶的酶添加量分别为15kU/L AaHyuA,20kU/L AtHyuH,5kU/L NiHyuC，其产物的得率分别为97.7％，97.8％，92.7％，94.2％，85.6％，其中WT的得率为79.3％。
之后根据同家族氨基酸序列的多序列比对结果的进化保守性分析，选定了Ala49，Arg61，Tyr67，Ser92，Glu138，Arg139，His141，Ala169，Val177，Asp187，Leu192，Ser202，Leu203，Gly205，Ser207，Met212，Ser227，Thr301位点进行相应的定点突变，粗酶活力测定，对粗酶活力较WT提高的突变体进行蛋白质纯化和动力学参数测定。结果如表3所示：其中与WT相比，kcat/Km显著提高的突变体为R61Q，Y67F，E138W，E138Q，R139A，A169C，D187N，L192M，S202A，G205P，S207T，S207A，S227A，M212W，其中R61Q的kcat/Km为106min-1·mM-1，为WT的4.1倍；Y67F的kcat/Km为93.3min-1·mM-1，为WT的3.6倍；E138W的kcat/Km为113min-1·mM-1，为WT的4.4倍；E138Q的kcat/Km为68.7min-1·mM-1，为WT的2.7倍；R139A的kcat/Km为70.5min-1·mM-1，为WT的2.7倍；A169C的kcat/Km为91.3min-1·mM-1，为WT的3.6倍；D187N的kcat/Km为121min-1·mM-1，为WT的4.7倍；L192M的kcat/Km为130min-1·mM-1，为WT的5.1倍；S202A的kcat/Km为82.8min-1·mM-1，为WT的3.2倍；G205P的kcat/Km为55.8min-1·mM-1，为WT的2.2倍；S207T的kcat/Km为123min-1·mM-1，为WT的4.8倍；S207A的kcat/Km为62.3min-1·mM-1，为WT的2.4倍；M212W的kcat/Km为79.8min-1·mM-1，为WT的3.1倍；S227A的kcat/Km为81.1min-1·mM-1，为WT的3.2倍。
之后同样对kcat/Km较WT提高的突变体进行了级联反应催化200mM L-吲哚甲基海因的转化的验证，三个酶的酶添加量分别为15kU/L AaHyuA,20kU/LAtHyuH,5kU/L NiHyuC，发现这些突变体中产物得率高于WT(79.3％)的分别有：Y67F 89.2％，E138W 93.8％，A169C82.7％，D187N 94.9％，S202A 82.8％，G205P 89.5％，S207A 92.4％，S227A 89.3％，低于或等于WT的分别有：R61Q 77.1％，E138Q 74.2％，R139A 79％，L192M 72.1％，S207T77.7％，M212W 79.3％。之后对级联反应转化效果提升不明显的突变体进行舍弃，最终选取产物得率高于WT 10％以上的单点突变体(R211G，A200E，A200N，A200S，Y67F，E138W，D187N，G205P，S207A，S227A)进行后续的随机组合突变。
表3 D-氨甲酰水解酶单点突变体动力学参数及催化200mM底物级联反应验证
Figure BDA0002482676330000111
将上述选取的这些单点突变体进行随机组合突变库的构建和筛选，对获得的多突变体进行后续的摇瓶培养和复筛酶活力的测定，对酶活力较单点突变体提高的多突变体进行蛋白纯化，动力参数的测定，结果如表4所示，获得的双突变体A200S/R211G，A200N/R211G，A200E/R211G，E138W/R211G，D187N/R211G，S207A/R211G的催化效率较单点突变体和WT均有了很大程度的提高，其kcat/Km分别为160min-1·mM-1，246min-1·mM-1，191min-1·mM-1，286min-1·mM-1，193min-1·mM-1，275min-1·mM-1，分别为WT的6.2倍，9.6倍，7.4倍，11.1倍，7.5倍，10.7倍，筛选结果中三突变体有A200N/R211G/D187N，A200N/R211G/E138W，A200N/R211G/S207A，E138W/R211G/S207A，E138W/R211G/D187N，S207A/R211G/D187N，其中相比双突变和WT催化效率均提高较为明显的仅有A200N/R211G/D187N，A200N/R211G/S207A，E138W/R211G/S207A，S207A/R211G/D187N，其kcat/Km分别为631min-1·mM-1，808min-1·mM-1，600min-1·mM-1，638min-1·mM-1，分别为WT的24.6倍，31.4倍，23.3倍，24.8倍。筛选获得的四突变体有A200N/R211G/D187N/S207A，A200N/R211G/D187N/E138W，A200N/R211G/S207A/E138W，其kcat/Km相比WT和三突变提高较为明显的只有A200N/R211G/D187N/S207A，为1135min-1·mM-1，为WT的44.2倍，筛选获得的最优的突变体为五突变体，A200N/R211G/D187N/S207A/E138W，其kcat/Km为1820min-1·mM-1，为WT的70.8倍。同样为了验证这些多突变体的转化效果，我们也进行了级联反应转化效果的验证实验。由于之前单点突变体R211G和A200E已经完成对200mM L-吲哚甲基海因的完全转化，因此在进行多突变体的验证实验时我们提升底物L-吲哚甲基海因浓度为500mM，其中三个酶的酶添加量分别为15kU/LAaHyuA,20kU/L AtHyuH,5kU/L NiHyuC。结果如表4所示，其中五突变体A200N/R211G/D187N/S207A/E138W在反应12h时产物得率已经达到81.7％，相比WT(40.1％)，产物得率提升2倍，且反应时间大大缩短，仅需12h。对于其他的多突变体，四突变体A200N/R211G/D187N/S207A在反应24h时的产物得率为79.3％，三突变体A200N/R211G/D187N，A200N/R211G/S207A，E138W/R211G/S207A，S207A/R211G/D187N在24h的产物得率分别为76.4％，79.8％，75.3％，78.4％，双突变体A200S/R211G，A200N/R211G，A200E/R211G，E138W/R211G，D187N/R211G，S207A/R211G的产物得率分别为67.2％，65.0％，65.7％，70.7％，66.4％，均比WT有了较大程度的提高。
表4 D-氨甲酰水解酶组合突变体动力学参数及催化500mM底物级联反应验证
Figure BDA0002482676330000131
实施例4：D-氨甲酰水解酶突变体用于级联反应制备D-色氨酸的时间进程
取5kU/L所得的重组D-N-氨甲酰水解酶(野生型)和15kU/L的海因消旋酶(AaHyuA)、20kU/L D-海因酶(AtHyuH)于Tris-HCl缓冲液(pH 6～8,100mmol·L-1)中，加入20％PEG400，500mmol·L-1 L-吲哚甲基海因，反应液总体积为10mL。将反应置于30℃下，取样检测转化过程，条件如下：Diamonsil Plus C18色谱柱(25cm×4.6mm,5μm)，检测波长为210nm，流动相为乙腈：磷酸二氢钾(10～30：90～70)，流速为0.5～1mL/min。
同时以同样的方法建立突变体R211G,E138W/R211G,A200N/R211G/D187N,A200N/R211G/D187N/S207A,A200N/R211G/S207A/D187N/E138W和底物L-吲哚甲基海因6个反应。在30℃和200rpm条件下反应24h，恒定pH 8.0。反应过程的时间进程见表5和表6，由表可知，野生型氨甲酰水解酶反应缓慢，在24h时，其最终的底物转化率为49.4％(表5)，得率为40％(表6)，而突变体R211G在6h时，其转化率已经超过60％(表5)，在反应后期其转化率缓慢上升，24h时达到70％，产物得率为55.8％(表6)；双突变体E138W/R211G相比单突变R211G，其反应速率更是有所增加，在反应3h时，底物的转化率已经达到61.4％，产物得率54.3％，在24h时底物的转化率达到85.8％，产物得率为70.6％；三突变体A200N/R211G/D187N的反应速率相比双突变体更进一步提高，在反应3h时，底物的转化率已经达到88.5％，产物得率75.1％，随着反应时间的进行，24h时底物转化率94.7％，产物得率76.4％,四突变A200N/R211G/D187N/S207A与三突变的反应速率有所降低，但是最终24h的底物转化率可以达到94.5％,产物得率79.2％，五突变体A200N/R211G/D187N/S207A/E138W与四突变体相比，在最终的底物转化率上没有进一步提升，为94.5％，产物得率为81.7％，但是它的反应初始速率相比四突变体提升了2倍，在反应5min时其底物转化率由14.2％(四突变体)提升到25.2％(五突变体)，综上可知，单突变体或者多突变体相比WT，无论在转化率还是在反应速率上都有了较明显的提高,在催化500mM的底物转化时，酶的装载量也大大降低，仅为15kU/L AaHyuA,20kU/L AtHyuH,5kU/LNiHyuC。
表5野生型和不同突变体催化500mM L-吲哚甲基海因的转化率的进程
Conversion/％ 5min 3h 6h 12h 24h
WT 2.3 31.7 39.9 46.5 49.4
R211G 5.4 53.3 58.8 62.5 67.3
E138W/R211G 4.9 61.4 64.2 73.0 85.8
A200N/R211G/D187N 16.7 88.5 88.5 91.9 94.7
A200N/R211G/D187N/S207A 14.2 84.5 94.6 94.3 94.5
A200N/R211G/D187N/S207A/E138W 25.2 88.0 93.5 93.5 94.5
表6野生型和不同突变体催化500mM L-吲哚甲基海因的产物得率的进程
Yield/％ 5min 3h 6h 12h 24h
WT 1.0 26.9 35.0 40.2 40.2
R211G 3.6 46.6 52.0 54.7 55.8
E138W/R211G 4.0 54.3 57.0 63.8 65.7
A200N/R211G/D187N 15.9 75.1 75.6 76.3 76.4
A200N/R211G/D187N/S207A 13.5 76.4 78.8 79.1 79.3
A200N/R211G/D187N/S207A/E138W 23.5 79.2 79.4 80.6 81.7
实施例5：D-氨甲酰水解酶突变体应用于级联反应制备D-对羟基苯丙氨酸的时间进程
取10kU/L所得的重组D-N-氨甲酰水解酶(野生型)和15kU/L的海因消旋酶(AaHyuA)、20kU/L D-海因酶(AtHyuH)于Tris-HCl缓冲液(pH 6～8,100mmol·L-1)中，加入5-10％PEG400，500mmol·L-1 L-对羟基苯海因，反应液总体积为10mL。将反应置于30℃下，取样检测转化过程，条件如下：Diamonsil Plus C18色谱柱(25cm×4.6mm,5μm)，检测波长为210nm，流动相为乙腈：磷酸二氢钾(10～30：90～70)，流速为0.5～1mL/min。
同时以同样的方法建立突变体R211G,E138W/R211G,A200N/R211G/D187N,A200N/R211G/D187N/S207A,A200N/R211G/S207A/D187N/E138W和底物L-对羟基苯海因6个反应。在30℃和200rpm条件下反应24h，恒定pH 8.0。反应过程的时间进程见表7和表8，由表可知，野生型氨甲酰水解酶反应缓慢，在24h时，其最终的底物转化率为49.4％(表7)，得率为33.2％(表8)，而突变体R211G在6h时，其转化率55.8％(表7)，在反应后期其转化率缓慢上升，24h时达到63.3％，产物得率为43.8％(表8)；双突变体E138W/R211G相比单突变R211G，其反应速率更是有所增加，在反应3h时，底物的转化率已经达到61.1％，产物得率41.1％，在24h时底物的转化率达到75.8％，产物得率为51.7％；三突变体A200N/R211G/D187N的反应速率相比双突变体更进一步提高，在反应3h时，底物的转化率已经达到71.5％，产物得率65.1％，随着反应时间的进行，24h时底物转化率83.7％，产物得率66.4％，四突变A200N/R211G/D187N/S207A最终24h的底物转化率可以达到89.5％，产物得率79.1％，五突变体A200N/R211G/D187N/S207A/E138W与四突变体相比，在最终的底物转化率上进一步提升，为94.1％，产物得率为81.0％，综上可知，单突变体或者多突变体相比WT，无论在转化率还是在反应速率上都有了较明显的提高,在催化500mM的底物转化时，酶的装载量也大大降低，仅为15kU/LAaHyuA,20kU/L AtHyuH,10kU/L NiHyuC。
表7野生型和不同突变体催化500mM L-对羟基苯海因的转化率的进程
Conversion/％ 5min 3h 6h 12h 24h
WT 1.3 31.2 35.9 46.2 49.4
R211G 3.4 50.3 55.8 60.5 63.3
E138W/R211G 4.2 61.1 64.2 71.1 75.8
A200N/R211G/D187N 15.7 71.5 78.5 81.9 83.7
A200N/R211G/D187N/S207A 18.3 80.5 84.6 87.3 89.5
A200N/R211G/D187N/S207A/E138W 21.2 82.1 91.5 93.1 94.1
表8野生型和不同突变体催化500mM L-对羟基苯海因的产物得率的进程
Yield/％ 5min 3h 6h 12h 24h
WT 1.0 22.9 31.1 33.2 33.2
R211G 2.6 34.6 42.2 43.7 43.8
E138W/R211G 4.0 41.1 47.0 50.8 51.7
A200N/R211G/D187N 12.9 65.1 65.6 66.3 66.4
A200N/R211G/D187N/S207A 13.1 70.4 78.8 79.0 79.1
A200N/R211G/D187N/S207A/E138W 19.5 79.0 79.4 80.1 81.0
由此可知，本发明所述D-氨甲酰水解酶突变体不仅对在D-氨甲酰色氨酸的高效、高立体选择性催化方面具有非常好的性能，并且对其他芳香族D-N-氨甲酰氨基酸底物也具有较高的催化效率和高立体选择性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> D-氨甲酰水解酶突变体及其在D-芳香族氨基酸合成中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 924
<212> DNA
<213> Nitratireductor indicus C115
<400> 1
atgacgcggc gcataaggat cggcggtgcc cagatggggg caatatcgag atccgacagc 60
aagaaggaaa tcgtcgaccg cctgattgcg ctgcttcggc aagccagtga aaagggctgc 120
gaactggtcg tcttccccga actggcgctc agcaccttct tcccgcgctg gtatgccgag 180
cgcgacggta tggacggcta tttcgaagac ggaatgccca atgccgctac gctgcccctt 240
ttcgaggaag cgcgccggct gggcatcggc ttcagccttg gctatgcgga gcttgtccag 300
gaagatgggc gggttcggcg tttcaacacc accgtgctcg tggagcgcaa tggcgaaatc 360
gtcggcaaat accggaagat tcacctgccg ggccatgccg aatatgagcc tgagcgcagt 420
caccagcatc tggaaaaacg ctatttcgag gtgggcaata cgggctttca ggtttgggat 480
gcctttggcg gtcgtgtggg catggcgatc tgcaatgacc ggcgctgggt cgagacctat 540
cgcgtgatgg ggcttcagga tgtggagttg atcctgattg gctacaacac gccggtggcc 600
gattcccttt caggggaaag cgagacgctg cgcatgttcc acaatcacct tacgatgcag 660
gcgggggctt atcagaactc gacctgggtg gtgggggttg cgaaggcagg cgtcgaagac 720
gggcatcgcc tgatgggagg cagtgtcatc gtcgcgccga cgggcgaaat tgtagcgcag 780
gcgatgacgg aaggggacga actcatcgtt gccgattgcg atctcgatcg ctgccgctac 840
tacaaatccc acatcttcaa tttcgcggcg catcgccgtc ccgaattcta tcagcggata 900
acttcacaga ccggtgtgga gtga 924
<210> 2
<211> 307
<212> PRT
<213> Nitratireductor indicus C115
<400> 2
Met Thr Arg Arg Ile Arg Ile Gly Gly Ala Gln Met Gly Ala Ile Ser
1 5 10 15
Arg Ser Asp Ser Lys Lys Glu Ile Val Asp Arg Leu Ile Ala Leu Leu
20 25 30
Arg Gln Ala Ser Glu Lys Gly Cys Glu Leu Val Val Phe Pro Glu Leu
35 40 45
Ala Leu Ser Thr Phe Phe Pro Arg Trp Tyr Ala Glu Arg Asp Gly Met
50 55 60
Asp Gly Tyr Phe Glu Asp Gly Met Pro Asn Ala Ala Thr Leu Pro Leu
65 70 75 80
Phe Glu Glu Ala Arg Arg Leu Gly Ile Gly Phe Ser Leu Gly Tyr Ala
85 90 95
Glu Leu Val Gln Glu Asp Gly Arg Val Arg Arg Phe Asn Thr Thr Val
100 105 110
Leu Val Glu Arg Asn Gly Glu Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile His
115 120 125
Leu Pro Gly His Ala Glu Tyr Glu Pro Glu Arg Ser His Gln His Leu
130 135 140
Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Val Gly Asn Thr Gly Phe Gln Val Trp Asp
145 150 155 160
Ala Phe Gly Gly Arg Val Gly Met Ala Ile Cys Asn Asp Arg Arg Trp
165 170 175
Val Glu Thr Tyr Arg Val Met Gly Leu Gln Asp Val Glu Leu Ile Leu
180 185 190
Ile Gly Tyr Asn Thr Pro Val Ala Asp Ser Leu Ser Gly Glu Ser Glu
195 200 205
Thr Leu Arg Met Phe His Asn His Leu Thr Met Gln Ala Gly Ala Tyr
210 215 220
Gln Asn Ser Thr Trp Val Val Gly Val Ala Lys Ala Gly Val Glu Asp
225 230 235 240
Gly His Arg Leu Met Gly Gly Ser Val Ile Val Ala Pro Thr Gly Glu
245 250 255
Ile Val Ala Gln Ala Met Thr Glu Gly Asp Glu Leu Ile Val Ala Asp
260 265 270
Cys Asp Leu Asp Arg Cys Arg Tyr Tyr Lys Ser His Ile Phe Asn Phe
275 280 285
Ala Ala His Arg Arg Pro Glu Phe Tyr Gln Arg Ile Thr Ser Gln Thr
290 295 300
Gly Val Glu
305

Claims (5)

1.一种D-氨甲酰水解酶突变体，其特征在于，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第211位精氨酸替换为甘氨酸；或
将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第138位点谷氨酸突变为色氨酸；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第200位丙氨酸替换为丝氨酸；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第200位丙氨酸替换为谷氨酸；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第207位丝氨酸替换为丙氨酸；或
将第211位精氨酸替换为甘氨酸，第200位丙氨酸替换为天冬酰胺，同时将第187位点的天冬氨酸替换成天冬酰胺；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第138位谷氨酸替换为色氨酸，第207位点的丝氨酸替换成丙氨酸；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺，第207位点的丝氨酸替换成丙氨酸；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第207位点的丝氨酸替换成丙氨酸，第187位点的天冬氨酸替换成天冬酰胺；或
将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺，第187位点的天冬氨酸替换成天冬酰胺，第207位点的丝氨酸替换成丙氨酸；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺，第187位点的天冬氨酸替换成天冬酰胺，第138位谷氨酸替换为色氨酸；或
将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺，第187位点的天冬氨酸替换成天冬酰胺，第207位点的丝氨酸替换成丙氨酸，第138位谷氨酸替换为色氨酸。
2.一种编码权利要求1所述的D-氨甲酰水解酶突变体的基因。
3.一种携带权利要求2所述的基因的表达载体。
4.一种表达权利要求1所述的D-氨甲酰水解酶突变体的重组菌。
5.权利要求1所述的D-氨甲酰水解酶突变体在制备光学纯D-氨基酸中的应用。
CN202010382460.0A 2020-05-08 2020-05-08 D-氨甲酰水解酶突变体及其在d-芳香族氨基酸合成中的应用 Active CN111454933B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010382460.0A CN111454933B (zh) 2020-05-08 2020-05-08 D-氨甲酰水解酶突变体及其在d-芳香族氨基酸合成中的应用
CN202211021214.8A CN115772513A (zh) 2020-05-08 2020-05-08 D-氨甲酰水解酶突变体、基因、表达载体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010382460.0A CN111454933B (zh) 2020-05-08 2020-05-08 D-氨甲酰水解酶突变体及其在d-芳香族氨基酸合成中的应用

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211021214.8A Division CN115772513A (zh) 2020-05-08 2020-05-08 D-氨甲酰水解酶突变体、基因、表达载体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111454933A CN111454933A (zh) 2020-07-28
CN111454933B true CN111454933B (zh) 2022-08-16

Family

ID=71675085

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010382460.0A Active CN111454933B (zh) 2020-05-08 2020-05-08 D-氨甲酰水解酶突变体及其在d-芳香族氨基酸合成中的应用
CN202211021214.8A Pending CN115772513A (zh) 2020-05-08 2020-05-08 D-氨甲酰水解酶突变体、基因、表达载体及其应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211021214.8A Pending CN115772513A (zh) 2020-05-08 2020-05-08 D-氨甲酰水解酶突变体、基因、表达载体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN111454933B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110699396A (zh) * 2019-11-15 2020-01-17 江南大学 一种级联反应制备d-芳香族氨基酸的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1269321B (it) * 1994-04-15 1997-03-26 Eniricerche Spa Mutanti stabili della d-n- -carbamilasi
IT1277125B1 (it) * 1995-12-21 1997-11-04 Eniricerche Spa Mutanti termostabili della d-n-alfa-carbamilasi
CN100447240C (zh) * 2006-01-06 2008-12-31 中国科学院上海生命科学研究院 D-氨甲酰水解酶的突变体及其应用
CN101544969B (zh) * 2008-03-25 2012-07-18 中国科学院上海生命科学研究院 D-氨甲酰水解酶的突变体及其应用
CN102146365B (zh) * 2010-02-08 2013-07-10 中国科学院上海生命科学研究院 D-氨甲酰水解酶突变体
CN102747060B (zh) * 2011-04-22 2014-06-04 中国科学院上海生命科学研究院 D-氨甲酰水解酶的突变体及其制备方法和应用
CN106011117B (zh) * 2015-07-30 2019-06-18 重庆桑禾动物药业有限公司 N-氨甲酰-d-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体及其工程菌的构建

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110699396A (zh) * 2019-11-15 2020-01-17 江南大学 一种级联反应制备d-芳香族氨基酸的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chain A, N-carbamoyl-D-amino-acid hydrolase, PDB: 6LCG_A;Liu,Y.F. et al.;《GenBank》;20201229;第1-2页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111454933A (zh) 2020-07-28
CN115772513A (zh) 2023-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4641100B2 (ja) 改善された特性を有するヒダントイナーゼ変異体及びそのアミノ酸の製造のための使用
CN111621482B (zh) 一种草铵膦脱氢酶突变体、基因工程菌及一锅法多酶同步定向进化方法
CN112662638B (zh) 一种r-选择性苯乙烯单加氧酶的功能
CN108342378B (zh) 一种谷氨酸脱羧酶突变体及其编码基因与应用
CN112877307B (zh) 一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用
JP6279478B2 (ja) ヒダントイナーゼの突然変異体
CN114317507A (zh) 腈水合酶突变体及其应用
CN118291419A (zh) 一种热稳定转氨酶的突变体及其应用
CN109072215A (zh) 一种头孢菌素c酰化酶突变体及其应用
JP4501689B2 (ja) ペプチドを生成する新規酵素およびこれを生産する微生物およびこれらを用いるジペプチドの製造方法
CN110699396B (zh) 一种级联反应制备d-芳香族氨基酸的方法
CN111454933B (zh) D-氨甲酰水解酶突变体及其在d-芳香族氨基酸合成中的应用
CN108034646B (zh) 一种催化活性和对映归一性提高的PvEH3突变体
CN116083406A (zh) 酰胺酶突变体及其应用
CN112481320B (zh) 一种催化效率高的制备(-)γ-内酰胺的方法
CN112226422B (zh) 一种活性提高的EstWY酶突变体
CN109402188B (zh) 一种来自短小芽孢杆菌的ω-转氨酶及在生物胺化中的应用
CN114214308A (zh) 一种经半理性改造提升活性的腈水解酶突变体
CN110699345A (zh) 一种卤醇脱卤酶突变体及其应用
Nanduri et al. Cloning and expression of a novel enantioselective N-carbobenzyloxy-cleaving enzyme
CN114196659B (zh) 酰胺酶突变体、编码基因、工程菌及其应用
CN112481229B (zh) 一种ω转氨酶及其突变体、重组质粒、基因工程菌及其应用
CN116875582B (zh) 一种核苷水解酶突变体、基因、表达载体、细胞及其应用
CN116855483A (zh) 一种酰亚胺水解酶突变体及其应用
CN114574468A (zh) 一种高活性高热稳定性的蛋白酶突变体及其制备、应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant