CN114164198B - 一种(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸合成蛋白及其突变体与应用 - Google Patents

一种(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸合成蛋白及其突变体与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种(R)‑(‑)‑3‑(氨甲酰甲基)‑5‑甲基己酸合成蛋白及其突变体与应用。本发明公开的(R)‑(‑)‑3‑(氨甲酰甲基)‑5‑甲基己酸合成蛋白，为SEQ ID No.1的第37‑508位氨基酸的蛋白质，该蛋白可以催化3‑异丁基戊二酰亚胺生成单一手性(R)‑(‑)‑3‑(氨甲酰甲基)‑5‑甲基己酸的酰胺水解酶，同时可以利用点突变技术获得具有可以催化合成高纯度R型产物的突变体，通过生物法实现环亚胺到R‑单酰胺的专一转化，从而减少化学反应步骤，最后可利用本发明制备的R‑单酰胺进一步最终获得高光学纯度的S‑普瑞巴林。本发明对于高光学纯度的S‑普瑞巴林生产具有重要意义。

Description

一种(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸合成蛋白及其突 变体与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸合成 蛋白及其突变体与应用。
背景技术
普瑞巴林(pregabalin，PGB)是一种新型γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA) 受体激动剂，能有效阻断电压依赖性钙通道，减少神经递质的释放，具有良好的抗焦虑和治疗神经痛的效果。广泛应用于癫痫以及外周神经痛等方面的治疗。
普瑞巴林是一种手性药物，不同构型的药理活性差异很大，S-型异构体的药理活性是R-型异构体的10倍，因此光学纯的S-普瑞巴林可有效增强药物疗效、减少不良 反应的发生及避免潜在的健康危害。目前已知报道多条普瑞巴林合成路径，且各有利 弊。普瑞巴林合成路线反应条件温和，反应时间短，目的产物纯度高，适用于大规模 制备普瑞巴林。获得高光学纯度的(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸(以下简称R-单 酰胺)是合成S-普瑞巴林的关键步骤。
与化学合成相比，生物催化法具有很多优点，比如温和的反应条件、高度的立体选择性、环境友好等特点。环酰胺水解酶(Cyclic amide hydrolase，EC.3.5.2)家族， 是水解多肽和蛋白之外的有机环中酰胺键的水解酶，广泛存在于动植物、微生物中， 多为金属依懒性水解酶。
发明内容
本发明的第一个目的是提供制备(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的方法。
本发明提供的一种制备(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的方法，包括：以3-异 丁基戊二酰亚胺为底物，利用蛋白质进行催化反应，得到(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲 基己酸；
所述蛋白质为C1、C2、C3、C4或C5：
C1、一种来源于Bacillus stearothermophilus SD-1的蛋白质(记为R-单酰胺合成 蛋白，简称为RSP)，其序列为SEQ ID No.1的第37-508位氨基酸；
C2、包含SEQ ID No.1的第37-508位氨基酸的蛋白质；
C3、RSP突变蛋白质，为对RSP的第63、65和/或317位氨基酸残基进行突变得 到的蛋白质；
C4、RSP突变蛋白质，为对C3所述RSP突变蛋白质的第63、65和317位外其 他氨基酸残基进行突变得到的蛋白质；
C5、在C1或C2或C3或C4所述蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合 蛋白质。
上述方法中，C3所述RSP突变蛋白质为对所述RSP进行包含以下A1、A2和/ 或A3的改造得到的蛋白质：
A1、将所述RSP第63位的甲硫氨酸残基突变为丙氨酸残基、半胱氨酸残基、谷 氨酸残基、异亮氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、 缬氨酸残基、天冬氨酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基、 亮氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基；
A2、将所述RSP第65位的亮氨酸残基突变为组氨酸残基、天冬酰胺残基、脯氨 酸残基、丙氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、 甘氨酸残基、异亮氨酸残基、赖氨酸残基、甲硫氨酸残基、谷氨酰胺残基、精氨酸残 基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基；
A3、将所述RSP第317位的半胱氨酸残基突变为丙氨酸残基、天冬氨酸残基、 谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、赖氨酸残基、 亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、天冬酰胺残基、脯氨酸残基、谷氨酰胺残基、精氨酸残 基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基。
具体的，C3所述RSP突变蛋白质可为对所述RSP进行上述A1、A2和/或A3的 改造得到的蛋白质。
在本发明的一个实施例中，所述融合蛋白质为在C1或C2的N端连接序列表中 SEQID No.1的第1-36位得到的蛋白质。
上述方法中，所述催化反应的体系可为：缓冲液50mM Trsi-HCl(pH 7.5)，10μgC1、C2、C3、C4或C5所述蛋白质，1mM MnCl2，5mM 3-异丁基戊二酰亚胺。
所述反应的温度可为50-75℃。所述反应的时间以实际情况完全为准，一般可为0.5小时。
本发明还提供的另一种制备(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的方法，包括：以 3-异丁基戊二酰亚胺为底物，利用表达C1、C2或C3所述蛋白质的重组细胞进行催化 反应，得到(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸。
上述方法中，所述重组细胞可通过向生物细胞中导入能表达所述蛋白质的重组载体获得。
所述生物细胞可为微生物。所述微生物可为大肠杆菌，也可以是其他菌。在本发明的一个实施例中，所述微生物为大肠杆菌BL21(DE3)。
所述重组载体可为将pET-28a(+)载体中EcoRI和HindIII识别序列间的小DNA 片段替换为RSP基因或所述突变蛋白质的编码基因得到的重组质粒。
所述RSP基因可为序列表中SEQ ID No.2的第109-1527位所示的核酸分子。
所述突变蛋白质的编码基因可为进行如下E1、E2和/或E3的改造得到的DNA分 子：
E1、将SEQ ID No.2的第109-1527位所示基因中的第187-189位由ATG突变为 丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、缬 氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、精氨酸、 色氨酸或酪氨酸的密码子；
E2、将SEQ ID No.2的第109-1527位所示基因中的第193-195位由CTG突变为 组氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘 氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、 色氨酸或酪氨酸的密码子；
E3、将SEQ ID No.2的第109-1527位所示基因中的第949-951位由TGT突变为 丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨 酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、 色氨酸或酪氨酸的密码子。
在本发明的实施例中，各氨基酸的密码子为大肠杆菌偏好密码子。具体的，所述丙氨酸的密码子可为GCG；所述半胱氨酸的密码子可为TGT；所述天冬氨酸的密码子可为GAT；所述谷氨酸的密码子可为GAA；所述苯丙氨酸的密码子可为TTT；所 述甘氨酸的密码子可为GGT；所述组氨酸的密码子可为CAT；所述异亮氨酸的密码 子可为ATT；所述赖氨酸的密码子可为AAA；所述亮氨酸的密码子可为CTG；所述 甲硫氨酸的密码子可为ATG；所述天冬酰胺的密码子可为AAT；所述谷氨酰胺的密 码子可为CAG；所述脯氨酸的密码子可为CCG；所述精氨酸的密码子可为CGC；所 述丝氨酸的密码子可为AGT；所述苏氨酸的密码子可为ACC；所述缬氨酸的密码子 可为GTT；所述色氨酸的密码子可为TGG；所述酪氨酸的密码子可为TAT；所述丙 氨酸的密码子可为GCG；所述半胱氨酸的密码子可为GCG。
所述重组细胞可为将所述重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。
上述方法中，所述催化反应的体系可为：缓冲液50mM Trsi-HCl(pH 7.5)， 1.8±0.7×108cfu/L所述重组细胞，1mM MnCl2，10mM 3-异丁基戊二酰亚胺。
所述反应的温度可为45-75℃，如50-75℃。所述反应的时间以实际情况完全为准，一般可为0.5-2小时。
C1、C2、C3、C4或C5所述蛋白质，也属于本发明的保护范围。
与C1、C2、C3、C4或C5所述蛋白质相关的生物材料，也属于本发明的保护范 围，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)编码C1、C2、C3、C4或C5所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生 物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述 核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
所述的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达C1、C2、C3、C4或C5所 述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动C1、C2、C3、C4或C5所述蛋白质编码 基因转录的启动子，还可包括终止C1、C2、C3、C4或C5所述蛋白质编码基因转录的终止子。更进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。
所述的核酸分子的重组载体可为携带有C1、C2、C3、C4或C5所述蛋白质编码 基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，具体如pET-28a等)、 噬菌体、酵母质粒(如YEp系列载体等)或逆转录病毒包装质粒。
所述重组载体为将所述核酸分子插入表达载体中得到的载体。
本发明还提供了下述任一产品：
Y1、由C1、C2、C3、C4或C5所述蛋白质与3-异丁基戊二酰亚胺组成的成套产 品；
Y2、由所述生物材料与3-异丁基戊二酰亚胺组成的成套产品。
本发明还提供了所述制备(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的方法在制备普瑞巴 林或3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸中的应用。
本发明还提供了C1、C2、C3、C4或C5所述蛋白质，或所述生物材料，或所述 产品的下述任一应用：
Z1、生产普瑞巴林；
Z2、制备生产普瑞巴林产品；
Z3、生产3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸；
Z4、制备生产3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸产品；
Z5、生产(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸；
Z6、制备生产(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸产品。
C1、C2、C3、C4或C5所述蛋白质在作为酶中的应用，也属于本发明的保护范 围。
本发明选择环亚胺到单酰胺这一步骤作为改造出发点，筛选到一个可以催化3-异丁基戊二酰亚胺生成单一手性(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的酰胺水解酶，同时利用点突变技术获得具有可以催化合成高纯度R型产物的突变体，通过生物法实现 环亚胺到R-单酰胺的专一转化，从而减少化学反应步骤，可利用本发明制备的R-单酰胺进一步最终获得高光学纯度的S-普瑞巴林。本发明对于高光学纯度的S-普瑞巴林 生产具有重要意义。
附图说明
图1为纯酶液的SDS-PAGE电泳检测结果。泳道1-5分别为BL21/pET-28a-RSP-O、BL21/pET-28a-M63A、BL21/pET-28a-M63A/L65H、BL21/pET-28a-M63A/L65N、 BL21/pET-28a-M63A/L65A所得纯酶液；M表示蛋白marker。
图2为各酶的最适温度检测结果。纵坐标为相对酶活力(％)，即将最适温度下 的3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的总生成量定义为100时各温度下3-(氨甲酰甲基)-5-甲 基己酸的总生成量的相对值。M63AL65H、M63AL65N、M63AL65A、M63A、RSP 分别表示M63AL65H融合蛋白、M63AL65N融合蛋白、M63AL65A融合蛋白、M63A 融合蛋白、RSP融合蛋白。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域 普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文 献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、 仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置 三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端 核苷酸。
3-异丁基戊二酰亚胺：CAS号：916982-10-0；实施例中使用的3-异丁基戊二酰亚胺为Macklin产品。
(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸：CAS号：181289-33-8；实施例中使用的(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸为上海源叶生物科技有限公司产品。
下述实施例中3-异丁基戊二酰亚胺和(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸采用高效 液相色谱进行检测，检测条件如下：安捷伦C18反相柱(250×4.6mm,5μm)，检测波 长：210nm；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；运行时间：45min；流动 相A：缓冲盐(称取磷酸氢二钾约3.5g，加1000ml水溶解，混匀后用磷酸调pH至3.0， 滤过)，流动相B：乙腈；程序设置如表1所示。3-异丁基戊二酰亚胺标准品的出峰时 间为26.5min，(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的出峰时间为8.0min。所用标准品为 Macklin的3-异丁基戊二酰亚胺和(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸。
表1、高效液相色谱进行检测条件
时间(min) 流速(ml/min) 流动相A％ 流动相B％
0 1.0 80 20
20 1.0 80 20
30 1.0 60 40
35 1.0 60 40
40 1.0 80 20
45 1.0 80 20
下述实施例中(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸手性纯度(即R型产物占总产物的 比例)首先采用高效液相色谱进行检测(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸与(S)-(+)-3- 氨甲酰甲基-5-甲基己酸的产量，检测条件如下：色谱柱：Chiralpak AD-H柱， 250×4.6mm，5μm；检测波长：210nm；柱温：25℃；流速：0.5ml/min；流动相：正 己烷：乙醇：三氟乙酸＝880：120：1.5(体积比)。所用标准品为混消旋的3-(氨甲 酰甲基)-5-甲基己酸(即(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸与(S)-(+)-3-氨甲酰甲基-5- 甲基己酸的混合物)(上海源叶生物科技有限公司,货号：S62775)。
而后计算(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸手性纯度，(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5- 甲基己酸手性纯度＝(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸产量/((R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5- 甲基己酸产量+(S)-(+)-3-氨甲酰甲基-5-甲基己酸产量)。
实施例1、酶活性检测
本实施例发现一种来源于Bacillus stearothermophilus SD-1的蛋白质(记为R-单酰 胺合成蛋白，简称为RSP)，可以水解3-异丁基戊二酰亚胺，RSP的氨基酸序列为序 列表中序列1的第37-508位，本实施例将RSP基因根据大肠杆菌密码子偏好性进行 了优化，得到RSP-O基因，RSP-O基因的序列为序列表中SEQ ID No.2的第109-1527 位。
1、重组载体的构建
将表达载体pET-28a(+)(Novagen)的EcoRI和HindIII识别序列间的DNA片 段替换为SEQ ID No.2的第109-1527位所示的RSP-O基因，得到重组载体，将该重 组载体记为pET-28a-RSP-O，pET-28a-RSP-O含有序列表中SEQ ID No.2所示的DNA 片段(记为RSP-O融合基因)，能够表达RSP与His标签所形成的融合蛋白(其序 列为序列表中序列1，记为RSP融合蛋白)。
其中，SEQ ID No.2所示的DNA片段编码序列1所示的融合蛋白。序列1的第 37-508位为RSP，第5-10位为His标签。SEQ ID No.2的第109-1527位为RSP-O基 因，第13-30位为His标签的编码DNA序列。
2、重组菌的制备
将步骤1所得pET-28a-RSP-O导入大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组菌 BL21/pET-28a-RSP-O；将表达载体pET-28a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)，获得对 照重组菌。
3、酶活的检测
将步骤2制备的重组菌BL21(DE3)/pET-28a-RSP-O和对照重组菌分别作为待测菌株按照如下步骤进行实验：
1)将待测菌株接种于含40μg/mL卡那霉素的10mL LB液体培养基中，37℃培养至OD600＝0.6-0.8，添加诱导剂IPTG至其在培养体系中的浓度为0.5mM，而后24℃、 200rpm过夜培养后收集菌体，并用50mM Trsi-Hcl(pH 7.5)将菌体洗1遍去除菌体表面 培养基，得到菌体。
2)将步骤1)清洗后的菌体重悬于50mM Trsi-Hcl(pH 7.5)中，调节OD600至30 (活菌含量为1.8±0.7×108cfu/L)，得到菌体悬液，而后向菌体悬液中加入底物3-异 丁基戊二酰亚胺(其在反应体系中的浓度为10mM)，45℃、120rpm反应2h，得到 反应产物。
3)完成步骤2)后，将反应产物于12000rpm离心2min，取上清液进行HPLC检 测，以混消旋的3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸为标准品，根据3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己 酸生成总量判断重组菌株的催化活力。
结果显示，BL21/pET-28a-RSP-O对底物3-异丁基戊二酰亚胺具有催化活性，反 应结束可以催化生成约8mM 3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸，对照重组菌对底物3-异丁 基戊二酰亚胺不具有催化活性。
实施例2、点突变
本实施例对优化后的RSP-O基因进行突变，获得RSP氨基酸得到突变的突变蛋白，各突变蛋白名称分别为M63A、C317A、C317G、L65A、L65D和L65Y。
其中，M63A为将RSP的第63位的甲硫氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的突变蛋白；C317A为将RSP的第317位的半胱氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的突变蛋白； C317G将RSP的第317位的半胱氨酸残基突变为甘氨酸残基得到的突变蛋白；L65A将 RSP的第65位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的突变蛋白；L65D将RSP的第65位 的亮氨酸残基突变为天冬氨酸残基得到的突变蛋白；L65Y将RSP的第65位的亮氨酸残 基突变为酪氨酸残基得到的突变蛋白。
步骤如下：
1、利用常规重叠PCR的方法以实施例1中的BL21/pET-28a-RSP-O作为模板进行PCR扩增，将所得PCR产物使用内切酶DpnI消化去除模板，将消化产物转化大肠杆菌 BL21(DE3)，而后培养菌株，提取质粒进行测序，获得能表达目的突变蛋白与序列1 的第1-36位形成的融合蛋白(记为相应的融合蛋白)的重组菌。构建各突变蛋白所用 引物序列如表2所示。
表2、引物序列
将表达M63A融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63A，BL21/pET-28a-M63A 含有重组载体pET-28a-M63A，所得BL21/pET-28a-M63A与pET-28a-M63A中，RSP-O 基因的第187-189位由ATG突变为GCG，将突变后的基因记为M63A基因。
将表达C317A融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-C317A，BL21/pET-28a-C317A含有重组载体pET-28a-C317A，所得BL21/pET-28a-C317A与pET-28a-C317A中，RSP-O 基因的第949-951位由TGT突变为GCG，将突变后的基因记为C317A基因。
将表达C317G融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-C317G，BL21/pET-28a-C317G含有重组载体pET-28a-C317G，所得BL21/pET-28a-C317G与pET-28a-C317G中，RSP-O 基因的第949-951位由TGT突变为GGT，将突变后的基因记为C317G基因。
将表达L65A融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-L65A，BL21/pET-28a-L65A含有重组载体pET-28a-L65A，所得BL21/pET-28a-L65A与pET-28a-L65A中，RSP-O基因 的第193-195位由CTG突变为GCG，将突变后的基因记为L65A基因。
将表达L65D融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-L65D，BL21/pET-28a-L65D含有重组载体pET-28a-L65D，所得BL21/pET-28a-L65D与pET-28a-L65D中，RSP-O基因 的第193-195位由CTG突变为GAT，将突变后的基因记为L65D基因。
将表达L65Y融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-L65Y，BL21/pET-28a-L65Y含有重组载体pET-28a-L65Y，所得BL21/pET-28a-L65Y与pET-28a-L65Y中，RSP-O基因 的第193-195位由CTG突变为TAT，将突变后的基因记为L65Y基因。
2、将步骤1制备的重组菌分别接种于含40μg/mL卡那霉素的10mL LB液体培养基中，37℃培养至OD600＝0.6-0.8，添加诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，24℃、200rpm 过夜培养后收集菌体，并用50mM Trsi-Hcl(pH 7.5)将菌体洗1遍去除菌体表面培养基。
3、将步骤2清洗后的菌体重悬于50mM Trsi-Hcl(pH 7.5)中，调节OD600至30(活菌含量为1.8±0.7×108cfu/L)，得到菌体悬液，而后向菌体悬液中加入底物3-异丁基 戊二酰亚胺(其在反应体系中的浓度为10mM)，45℃、120rpm反应2h，得到反应 产物。
4、完成步骤3后，将反应体系12000rpm离心2min，取上清液，使用真空冷冻 干燥机将样品冷冻干燥。干燥后加入1mL乙醇溶解样品，HPLC检测确定产物中 (R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸手性纯度(即R型产物占总产物的比例)。
利用实施例1的BL21(DE3)/pET-28a-RSP-O作为对照，结果如表3所示。表3结果显示，表达M63A融合蛋白的重组菌的产物中的(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸手性纯度最高，说明，RSP第63位由甲硫氨酸突变为丙氨酸可以提高产物中(R)-(-)-3-(氨甲酰 甲基)-5-甲基己酸手性纯度，C317A、C317G、G66A、K334A、I335A、L65D也可以 不同程度提高产物中(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸手性纯度。
表3、(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸手性纯度
蛋白名称 平均值±标准差(％) P值
RSP融合蛋白 70.91±4.70
M63A融合蛋白 94.73±0.32 0.0186
C317A融合蛋白 78.77±3.96 0.2121
C317G融合蛋白 73.02±2.09 0.619
L65A融合蛋白 64.52±15.72 0.6372
L65D融合蛋白 83.35±4.70 0.1179
L65Y融合蛋白 44.50±2.73 0.0205
注：表3中，P值为与RSP融合蛋白的显著性分析结果；表3列出的各突变位点中， 数字表示突变位点的位数，数字前的字母为野生型的氨基酸残基，数字后的字母为突 变后的氨基酸残基，例如：M63A是将野生型蛋白第63位M突变为A得到的。
实施例3、RSP的M63位点饱和突变
本实施例对M63位点进行饱和突变，以实施例1中的BL21/pET-28a-RSP-O作为 模板进行PCR扩增，将所得PCR产物使用内切酶DpnI消化去除模板，将消化产物转 化大肠杆菌BL21(DE3)，而后培养菌株，提取质粒进行测序验证。获得能分别表达 M63H、M63N、M63P、M63A、M63C、M63D、M63E、M63F、M63G、M63I、M63K、 M63M、M63Q、M63R、M63S、M63T、M63V、M63W、M63Y突变蛋白(数字前为 未突变氨基酸残基，数字后为突变后氨基酸残基)与序列1的第1-36位形成的融合蛋白(记为相应的融合蛋白)的重组菌。
所用引物如下：
F：CGCATACCCATCTGGATNNNCCTCTGGGTGGTACCGTGAC(5'-->3'方向)；
R：GTCACGGTACCACCCAGAGGNNNATCCAGATGGGTATGCG(5'-->3'方向)， N表示A、T、C或G。
按照实验例2中步骤2-4的方法，将重组菌分别替换为本实施例所得重组菌，其 他步骤均不变，检测各重组菌所得产物中(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的手性纯度，利用实施例1的BL21/pET-28a-RSP-O作为对照。
结果显示，除了M63G外其他所有突变体催化的反应手性均有不同程度的提高 (表4)。
表4、(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸手性纯度
表4中，P值为与RSP融合蛋白的显著性分析结果。
将表达M63C融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63C，BL21/pET-28a-M63C含有重组载体pET-28a-M63C，所得BL21/pET-28a-M63C与pET-28a-M63C中，RSP-O基因 的第187-189位由ATG突变为TGT，将突变后的基因记为M63C基因。
将表达M63E融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63E，BL21/pET-28a-M63E含有重组载体pET-28a-M63E，所得BL21/pET-28a-M63E与pET-28a-M63E中，RSP-O基因 的第187-189位由ATG突变为GAA，将突变后的基因记为M63E基因。
将表达M63I融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63I，BL21/pET-28a-M63I含有重组载体pET-28a-M63I，所得BL21/pET-28a-M63I与pET-28a-M63I中，RSP-O基因的第 187-189位由ATG突变为ATT，将突变后的基因记为M63I基因。
将表达M63N融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63N，BL21/pET-28a-M63N含有重组载体pET-28a-M63N，所得BL21/pET-28a-M63N与pET-28a-M63N中，RSP-O基 因的第187-189位由ATG突变为AAT，将突变后的基因记为M63N基因。
将表达M63Q融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63Q，BL21/pET-28a-M63Q含有重组载体pET-28a-M63Q，所得BL21/pET-28a-M63Q与pET-28a-M63Q中，RSP-O基 因的第187-189位由ATG突变为CAG，将突变后的基因记为M63Q基因。
将表达M63S融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63S，BL21/pET-28a-M63S含有重组载体pET-28a-M63S，所得BL21/pET-28a-M63S与pET-28a-M63S中，RSP-O基因 的第187-189位由ATG突变为AGT，将突变后的基因记为M63S基因。
将表达M63T融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63T，BL21/pET-28a-M63T含有重组载体pET-28a-M63T，所得BL21/pET-28a-M63T与pET-28a-M63T中，RSP-O基因 的第187-189位由ATG突变为ACC，将突变后的基因记为M63T基因。
将表达M63V融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63V，BL21/pET-28a-M63V含有重组载体pET-28a-M63V，所得BL21/pET-28a-M63V与pET-28a-M63V中，RSP-O基 因的第187-189位由ATG突变为GTT，将突变后的基因记为M63V基因。
将表达M63D融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63D，BL21/pET-28a-M63D含有重组载体pET-28a-M63D，所得BL21/pET-28a-M63D与pET-28a-M63D中，RSP-O基 因的第187-189位由ATG突变为GAT，将突变后的基因记为M63D基因。
将表达M63F融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63F，BL21/pET-28a-M63F含有重组载体pET-28a-M63F，所得BL21/pET-28a-M63F与pET-28a-M63F中，RSP-O基因 的第187-189位由ATG突变为TTT，将突变后的基因记为M63F基因。
将表达M63H融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63H，BL21/pET-28a-M63H含有重组载体pET-28a-M63H，所得BL21/pET-28a-M63H与pET-28a-M63H中，RSP-O基 因的第187-189位由ATG突变为CAT，将突变后的基因记为M63H基因。
将表达M63K融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63K，BL21/pET-28a-M63K含有重组载体pET-28a-M63K，所得BL21/pET-28a-M63K与pET-28a-M63K中，RSP-O基 因的第187-189位由ATG突变为AAA，将突变后的基因记为M63K基因。
将表达M63L融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63L，BL21/pET-28a-M63L含有重组载体pET-28a-M63L，所得BL21/pET-28a-M63L与pET-28a-M63L中，RSP-O基因 的第187-189位由ATG突变为CTG，将突变后的基因记为M63L基因。
将表达M63P融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63P，BL21/pET-28a-M63P含有重组载体pET-28a-M63P，所得BL21/pET-28a-M63P与pET-28a-M63P中，RSP-O基因 的第187-189位由ATG突变为CCG，将突变后的基因记为M63P基因。
将表达M63R融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63R，BL21/pET-28a-M63R含有重组载体pET-28a-M63R，所得BL21/pET-28a-M63R与pET-28a-M63R中，RSP-O基因 的第187-189位由ATG突变为CGC，将突变后的基因记为M63R基因。
将表达M63W融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63W，BL21/pET-28a-M63W 含有重组载体pET-28a-M63W，所得BL21/pET-28a-M63W与pET-28a-M63W中，RSP-O 基因的第187-189位由ATG突变为TGG，将突变后的基因记为M63W基因。
将表达M63Y融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63Y，BL21/pET-28a-M63Y含有重组载体pET-28a-M63Y，所得BL21/pET-28a-M63Y与pET-28a-M63Y中，RSP-O基 因的第187-189位由ATG突变为TAT，将突变后的基因记为M63Y基因。
实施例4、RSP的双突变
本实施例在实施例2的M63A的基础上对第65位的亮氨酸进行突变，以实施例 2的重组载体pET-28a-M63A为模板进行PCR扩增，将所得PCR产物使用内切酶DpnI 消化去除模板，将消化产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，而后培养菌株，提取质粒进行 测序，获得能分别表达M63AL65H、M63AL65N、M63AL65P、M63AL65A、M63AL65C、M63AL65D、M63AL65E、M63AL65F、M63AL65G、M63AL65I、M63AL65K、 M63AL65M、M63AL65Q、M63AL65R、M63AL65S、M63AL65T、M63AL65V、 M63AL65W、M63AL65Y双突变蛋白(数字前为未突变氨基酸残基，数字后为突变后氨基酸残基)与序列1的第1-36位形成的融合蛋白(记为相应的融合蛋白)的重组 菌。所用引物如下：
F：GTCACGGTACCACCCAGAGGNNNATCCAGATGGGTATGCG(5'-->3'方向)；
R：CGCATACCCATCTGGATNNNCCTCTGGGTGGTACCGTGAC(5'-->3'方向)， N表示A、T、C或G。
按照实验例2中步骤2-4的方法，将重组菌分别替换为本实施例所得重组菌，其 他步骤均不变，检测各重组菌所得产物中(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的手性纯度，利用实施例2的BL21/pET-28a-M63A作为对照。
结果如表5所示。结果显示，BL21/pET-28a-M63AL65H、 BL21/pET-28a-M63AL65N、BL21/pET-28a-M63AL65A所得产物中(R)-(-)-3-(氨甲酰甲 基)-5-甲基己酸的手性纯度均在97％以上。
表5、(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸手性纯度
表5中，P值为与M63A融合蛋白的显著性分析结果。
M63AL65H为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为组氨酸残基，将表达 M63AL65H融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65H， BL21/pET-28a-M63AL65H含有重组载体pET-28a-M63AL65H，所得 BL21/pET-28a-M63AL65H与pET-28a-M63AL65H中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为CAT，将突变后的基因记为M63AL65H基因。
M63AL65N为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为天冬酰胺残基，将表达M63AL65N融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65N， BL21/pET-28a-M63AL65N含有重组载体pET-28a-M63AL65N，所得 BL21/pET-28a-M63AL65N与pET-28a-M63AL65N中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为AAT，将突变后的基因记为M63AL65N基因。
M63AL65P为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为脯氨酸残基，将表达 M63AL65P融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65P， BL21/pET-28a-M63AL65P含有重组载体pET-28a-M63AL65P，所得 BL21/pET-28a-M63AL65P与pET-28a-M63AL65P中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为CCG，将突变后的基因记为M63AL65P基因。
M63AL65A为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基，将表达 M63AL65A融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65A， BL21/pET-28a-M63AL65A含有重组载体pET-28a-M63AL65A，所得 BL21/pET-28a-M63AL65A与pET-28a-M63AL65A中，RSP-O基因的第187-189位由ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为GCG，将突变后的基因记为M63AL65A基因。
M63AL65C为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为半胱氨酸残基，将表达M63AL65C融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65C， BL21/pET-28a-M63AL65C含有重组载体pET-28a-M63AL65C，所得 BL21/pET-28a-M63AL65C与pET-28a-M63AL65C中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为TGT，将突变后的基因记为M63AL65C基因。
M63AL65D为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为天冬氨酸残基，将表达M63AL65D融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65D， BL21/pET-28a-M63AL65D含有重组载体pET-28a-M63AL65D，所得 BL21/pET-28a-M63AL65D与pET-28a-M63AL65D中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为GAT，将突变后的基因记为M63AL65D基因。
M63AL65E为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为谷氨酸残基，将表达 M63AL65E融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65E， BL21/pET-28a-M63AL65E含有重组载体pET-28a-M63AL65E，所得 BL21/pET-28a-M63AL65E与pET-28a-M63AL65E中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为GAA，将突变后的基因记为M63AL65E基因。
M63AL65F为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为苯丙氨酸残基，将表达M63AL65F融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65F， BL21/pET-28a-M63AL65F含有重组载体pET-28a-M63AL65F，所得 BL21/pET-28a-M63AL65F与pET-28a-M63AL65F中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为TTT，将突变后的基因记为M63AL65F基因。
M63AL65G为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为甘氨酸残基，将表达M63AL65G融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65G， BL21/pET-28a-M63AL65G含有重组载体pET-28a-M63AL65G，所得 BL21/pET-28a-M63AL65G与pET-28a-M63AL65G中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为GGT，将突变后的基因记为M63AL65G基因。
M63AL65I为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基，将表达M63AL65I融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65I， BL21/pET-28a-M63AL65I含有重组载体pET-28a-M63AL65I，所得 BL21/pET-28a-M63AL65I与pET-28a-M63AL65I中，RSP-O基因的第187-189位由ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为ATT，将突变后的基因记为M63AL65I基 因。
M63AL65K为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为赖氨酸残基，将表达 M63AL65K融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65K， BL21/pET-28a-M63AL65K含有重组载体pET-28a-M63AL65K，所得 BL21/pET-28a-M63AL65K与pET-28a-M63AL65K中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为AAA，将突变后的基因记为M63AL65K基因。
M63AL65M为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为甲硫氨酸残基，将表达M63AL65M融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65M， BL21/pET-28a-M63AL65M含有重组载体pET-28a-M63AL65M，所得 BL21/pET-28a-M63AL65M与pET-28a-M63AL65M中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为ATG，将突变后的基因记为M63AL65M基因。
M63AL65Q为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为谷氨酰胺残基，将表达M63AL65Q融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65Q， BL21/pET-28a-M63AL65Q含有重组载体pET-28a-M63AL65Q，所得 BL21/pET-28a-M63AL65Q与pET-28a-M63AL65Q中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为CAG，将突变后的基因记为M63AL65Q基因。
M63AL65R为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为精氨酸残基，将表达 M63AL65R融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65R，BL21/pET-28a-M63AL65R含有重组载体pET-28a-M63AL65R，所得 BL21/pET-28a-M63AL65R与pET-28a-M63AL65R中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为CGC，将突变后的基因记为M63AL65R基因。
M63AL65S为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为丝氨酸残基，将表达 M63AL65S融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65S， BL21/pET-28a-M63AL65S含有重组载体pET-28a-M63AL65S，所得 BL21/pET-28a-M63AL65S与pET-28a-M63AL65S中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为AGT，将突变后的基因记为M63AL65S基因。
M63AL65T为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为苏氨酸残基，将表达 M63AL6T融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65T， BL21/pET-28a-M63AL65T含有重组载体pET-28a-M63AL65T，所得 BL21/pET-28a-M63AL65T与pET-28a-M63AL65T中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为ACC，将突变后的基因记为M63AL65T基因。
M63AL65V为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为缬氨酸残基，将表达 M63AL65V融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65V， BL21/pET-28a-M63AL65V含有重组载体pET-28a-M63AL65V，所得 BL21/pET-28a-M63AL65V与pET-28a-M63AL65V中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为GTT，将突变后的基因记为M63AL65V基因。
M63AL65W为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为色氨酸残基，将表达 M63AL65W融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65W， BL21/pET-28a-M63AL65W含有重组载体pET-28a-M63AL65W，所得 BL21/pET-28a-M63AL65W与pET-28a-M63AL65W中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为TGG，将突变后的基因记为M63AL65W基因。
M63AL65Y为将M63A中第65位的亮氨酸残基突变为酪氨酸残基，将表达 M63AL65Y融合蛋白的重组菌记为BL21/pET-28a-M63AL65Y， BL21/pET-28a-M63AL65Y含有重组载体pET-28a-M63AL65Y，所得BL21/pET-28a-M63AL65Y与pET-28a-M63AL65Y中，RSP-O基因的第187-189位由 ATG突变为GCG、第193-195位由CTG突变为TAT，将突变后的基因记为M63AL65Y基因。
实施例5、M63AL65H，M63AL65N，M63AL65A酶学参数测定
本实施例检测了实施例4中部分重组菌的所表达融合蛋白的酶学参数，待测菌：BL21/pET-28a-M63AL65H，BL21/pET-28a-M63AL65N，BL21/pET-28a-M63AL65A， 实施例2的BL21/pET-28a-M63A，实施例1的BL21/pET-28a-RSP-O。
酶活定义：在特定条件下单位时间内生成1μmol 3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸所需 要的酶量定为1U。
一、重组蛋白表达及纯化
1、将待测菌接种于含40μg/mL卡那霉素的10mL LB液体培养基中，37℃培养至OD600＝0.6-0.8，添加诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，24℃、200rpm过夜培养后， 冷冻离心收集菌体12小时以上，用结合液(氯化钠：500mM，咪唑：10mM，Tris-HCl： 20mM，pH 7.5，余量为水)将菌体重悬，用溶菌酶在冰上处理半小时，超声破碎(10％ 功率10min，工作3s，间歇5s)，破碎后12000rpm离心10min后取上清溶液0.22μm 过膜得到粗酶液。
2、将步骤1的粗酶液使用常规Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)(北京康为世纪生物科技有限公司，CW0894A)进行纯化，步骤如下：
(1)将填料(His镍柱)混匀后加入到层析柱(镍柱)中，用5倍床柱体积的去 离子水冲洗装填好的柱子；
(2)用2.5个床体积的结合缓冲液(氯化钠：500mM，咪唑：10mM，Tris-HCl:20 mM，pH7.5，余量为水)平衡柱子；
(3)将粗酶液加入到层析柱里，在冰上结合1.5h；
(4)分别用含不同浓度咪唑的洗脱缓冲液(氯化钠：500mM，咪唑：80 mM-300mM，Tris-HCl：20mM，pH 7.5，余量为水)进行阶段洗脱，收集咪唑浓度 为300mM的缓冲液的洗脱峰；
(5)将步骤(4)收集洗脱峰使用Millipore超滤离心管(30KD)浓缩，加入4mL 50mMTrsi-HCl(pH 7.5)再次离心后取上清液，即为纯酶液，检测其中酶(即融合蛋白) 的浓度后进行进一步实验；
(6)用结合缓冲液和纯水分别流洗5个柱床体积，再用20％(体积百分含量) 的乙醇流洗3个柱床体积，柱子置于4-8℃环境中保存。
将收集的纯酶液进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图1所示，均得到了目的蛋白。
二、最适温度
针对步骤一制备的酶，分别检测其最适温度。
配置如下反应体系(1ml)：缓冲液50mM Trsi-HCl(pH 7.5)，10μg酶，1mM MnCl2，5mM 3-异丁基戊二酰亚胺。
将反应体系在不同温度(45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃) 反应30min，检测3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的总生成量(即(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5- 甲基己酸与(S)-(+)-3-氨甲酰甲基-5-甲基己酸总量)。
结果如图2所示。RSP融合蛋白以及其他其他蛋白的最适温度均为75℃。
三、比酶活测定
检测步骤一制备的各酶的比酶活。
配置如下反应体系(1ml)：缓冲液50mM Trsi-HCl(pH 7.5)，10μg酶，1mM MnCl2，5mM 3-异丁基戊二酰亚胺。
RSP融合蛋白以及其他蛋白均75℃反应，反应时间设置为10min、15min，20min、30min，检测3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的总生成量，计算比酶活。
结果如表6所示，结果显示M63A催化活力很高，双点突变中M63AL65N融合 蛋白的比酶活最高。
表6、比酶活的检测结果
实施例6、M63AL65A和M63AL65H基础上C317位点的突变
本实施例在实施例4的M63AL65A、M63AL65H基础上分别对其第317位的半 胱氨酸残基进行突变：
1、M63AL65A基础上的第317位半胱氨酸的突变
以实施例4的重组载体pET-28a-M63AL65A为模板进行PCR扩增，将所得PCR 产物使用内切酶DpnI消化去除模板，将消化产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，而后培 养菌株，提取质粒进行测序，获得能分别表达RSP三突变蛋白(M63AL65AC317A、 M63AL65AC317D、M63AL65AC317E、M63AL65AC317F、M63AL65AC317G、 M63AL65AC317H、M63AL65AC317I、M63AL65AC317K、M63AL65AC317L、 M63AL65AC317M、M63AL65AC317N、M63AL65AC317P、M63AL65AC317Q、 M63AL65AC317R、M63AL65AC317S、M63AL65AC317T、M63AL65AC317V、M63AL65AC317W、M63AL65AC317Y)与序列1的第1-36位形成的融合蛋白(记为 相应的融合蛋白)的重组菌。所用引物如下：
F：CGCATACCCATCTGGATNNNCCTCTGGGTGGTACCGTGAC(5'-->3'方向)；
R：GTCACGGTACCACCCAGAGGNNNATCCAGATGGGTATGCG(5'-->3'方向)， N表示A、T、C或G。
其中，M63AL65AC317T、M63AL65AC317A、M63AL65AC317D、 M63AL65AC317E、M63AL65AC317F、M63AL65AC317G、M63AL65AC317H、 M63AL65AC317I、M63AL65AC317K、M63AL65AC317L、M63AL65AC317M、 M63AL65AC317N、M63AL65AC317P、M63AL65AC317Q、M63AL65AC317R、 M63AL65AC317S、M63AL65AC317V、M63AL65AC317W、M63AL65AC317Y为将M63AL65A中第317位的半胱氨酸残基分别突变为丙氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨 酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、赖氨酸残基、亮 氨酸残基、甲硫氨酸残基、天冬酰胺残基、脯氨酸残基、谷氨酰胺残基、精氨酸残基、 丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基、酪氨酸残基得到的蛋白质，将其编码基因分别记为M63AL65AC317A基因、M63AL65AC317D基因、 M63AL65AC317E基因、M63AL65AC317F基因、M63AL65AC317G基因、 M63AL65AC317H基因、M63AL65AC317I基因、M63AL65AC317K基因、M63AL65AC317L基因、M63AL65AC317M基因、M63AL65AC317N基因、 M63AL65AC317P基因、M63AL65AC317Q基因、M63AL65AC317R基因、 M63AL65AC317S基因、M63AL65AC317T基因、M63AL65AC317V基因、 M63AL65AC317W基因、M63AL65AC317Y基因，依次为将M63AL65A基因的第 949-951位由TGT突变为ACC、GCG、GAT、GAA、TTT、GGT、CAT、ATT、AAA、 CTG、ATG、AAT、CCG、CAG、CGC、AGT、GTT、TGG、TAT得到的基因。
在RSP突变蛋白名称前分别添加“BL21/pET-28a-”和“pET-28a-”、在其后添加“-O”表示表达RSP突变蛋白融合蛋白的重组菌与重组载体。
按照实验例2中步骤2-4的方法，将重组菌分别替换为上述各重组菌，反应温度 为75℃，其他步骤均不变，检测各重组菌所得产物中(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己 酸的手性纯度，利用实施例4的BL21/pET-28a-M63AL65A作为对照。
结果如表7所示，M63AL65AC317T融合蛋白比M63AL65A双点突变手性有一 定程度的提高。
表7、(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸手性纯度
2、M63AL65H基础上的第317位半胱氨酸的突变
以实施例4的重组载体pET-28a-M63AL65H为模板进行PCR扩增，将所得PCR 产物使用内切酶DpnI消化去除模板，将消化产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，而后培 养菌株，提取质粒进行测序，获得能分别表达RSP突变蛋白(M63AL65HC317A、 M63AL65HC317D、M63AL65HC317E、M63AL65HC317F、M63AL65HC317G、 M63AL65HC317H、M63AL65HC317I、M63AL65HC317K、M63AL65HC317L、 M63AL65HC317M、M63AL65HC317N、M63AL65HC317P、M63AL65HC317Q、 M63AL65HC317R、M63AL65HC317S、M63AL65HC317T、M63AL65HC317V、M63AL65HC317W、M63AL65HC317Y)与序列1的第1-36位形成的融合蛋白(记为 相应的融合蛋白)的重组菌。所用引物如下：
F：CGCATACCCATCTGGATNNNCCTCTGGGTGGTACCGTGAC(5'-->3'方向)；
R：GTCACGGTACCACCCAGAGGNNNATCCAGATGGGTATGCG(5'-->3'方向)， N表示A、T、C或G。
其中，M63AL65HC317T、M63AL65HC317A、M63AL65HC317D、 M63AL65HC317E、M63AL65HC317F、M63AL65HC317G、M63AL65HC317H、 M63AL65HC317I、M63AL65HC317K、M63AL65HC317L、M63AL65HC317M、 M63AL65HC317N、M63AL65HC317P、M63AL65HC317Q、M63AL65HC317R、 M63AL65HC317S、M63AL65HC317V、M63AL65HC317W、M63AL65HC317Y为将M63AL65H中第317位的半胱氨酸残基分别突变为丙氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨 酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、赖氨酸残基、亮 氨酸残基、甲硫氨酸残基、天冬酰胺残基、脯氨酸残基、谷氨酰胺残基、精氨酸残基、 丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基、酪氨酸残基得到的蛋白质，将其编码基因分别记为M63AL65HC317A基因、M63AL65HC317D基因、 M63AL65HC317E基因、M63AL65HC317F基因、M63AL65HC317G基因、 M63AL65HC317H基因、M63AL65HC317I基因、M63AL65HC317K基因、M63AL65HC317L基因、M63AL65HC317M基因、M63AL65HC317N基因、 M63AL65HC317P基因、M63AL65HC317Q基因、M63AL65HC317R基因、 M63AL65HC317S基因、M63AL65HC317T基因、M63AL65HC317V基因、 M63AL65HC317W基因、M63AL65HC317Y基因，依次为将M63AL65H基因的第 949-951位由TGT突变为ACC、GCG、GAT、GAA、TTT、GGT、CAT、ATT、AAA、 CTG、ATG、AAT、CCG、CAG、CGC、AGT、GTT、TGG、TAT得到的基因。
在RSP突变蛋白名称前分别添加“BL21/pET-28a-”和“pET-28a-”、在其后添加 “-O”表示表达RSP突变蛋白融合蛋白的重组菌与重组载体。
按照实验例2中步骤2-4的方法，将重组菌分别替换为上述各重组菌，反应温度 为75℃，其他步骤均不变，检测各重组菌所得产物中(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己 酸的手性纯度，利用实施例4的BL21/pET-28a-M63AL65H作为对照。
结果如表8所示，M63AL65HC317I融合蛋白、M63AL65HC317N融合蛋白、M63AL65HC317T融合蛋白、63AL65HC317V融合蛋白手性值与M63AL65H融合蛋 白双点突变基本一致或者稍有提高。
表8、(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸手性纯度
实施例7、M63AL65HC317T，M63AL65AC317T酶学参数测定
按照实施例5中步骤一的方法进行重组蛋白的表达与纯化，并按照实施例5中步骤三的方法对所得M63AL65HC317T融合蛋白，M63AL65AC317T融合蛋白三点突变 融合蛋白进行酶学参数测定。结果如表9所示。
表9、比酶活的检测结果
蛋白名称 比酶活(μmol/min/mg) Kcat(S-1) Kcat/Km(M-1.S-1) 手性(％)
M63AL65AC317T融合蛋白 0.64±0.02 0.94±0.06 542.19 98.26
M63AL65HC317T融合蛋白 1.08±0.06 1.26±0.05 857.03 98.50
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨 和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较 宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发 明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的 改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸合成蛋白及其突变体与应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 508
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg
20 25 30
Gly Ser Glu Phe Met Thr Lys Ile Ile Lys Asn Gly Thr Ile Val Thr
35 40 45
Ala Thr Asp Thr Tyr Glu Ala His Leu Leu Ile Lys Asp Gly Lys Ile
50 55 60
Ala Met Ile Gly Gln Asn Leu Glu Glu Lys Gly Ala Glu Val Ile Asp
65 70 75 80
Ala Lys Gly Cys Tyr Val Phe Pro Gly Gly Ile Asp Pro His Thr His
85 90 95
Leu Asp Met Pro Leu Gly Gly Thr Val Thr Lys Asp Asp Phe Glu Ser
100 105 110
Gly Thr Ile Ala Ala Ala Phe Gly Gly Thr Thr Thr Ile Ile Asp Phe
115 120 125
Cys Leu Thr Asn Lys Gly Glu Pro Leu Lys Lys Ala Ile Glu Thr Trp
130 135 140
His Asn Lys Ala Asn Gly Lys Ala Val Ile Asp Tyr Gly Phe His Leu
145 150 155 160
Met Ile Ser Glu Ile Thr Asp Asp Val Leu Glu Glu Leu Pro Lys Val
165 170 175
Leu Glu Glu Glu Gly Ile Thr Ser Leu Lys Val Phe Met Ala Tyr Lys
180 185 190
Asn Val Phe Gln Ala Asp Asp Gly Thr Leu Tyr Cys Thr Leu Leu Ala
195 200 205
Ala Lys Glu Leu Gly Ala Leu Val Met Val His Ala Glu Asn Gly Asp
210 215 220
Val Ile Asp Tyr Leu Thr Lys Lys Ala Leu Ala Asp Gly Asn Thr Asp
225 230 235 240
Pro Ile Tyr His Ala Leu Thr Arg Pro Pro Glu Leu Glu Gly Glu Ala
245 250 255
Thr Gly Arg Ala Cys Gln Leu Thr Glu Leu Ala Gly Ser Gln Leu Tyr
260 265 270
Val Val His Val Thr Cys Ala Gln Ala Val Glu Lys Ile Ala Glu Ala
275 280 285
Arg Asn Lys Gly Leu Asp Val Trp Gly Glu Thr Cys Pro Gln Tyr Leu
290 295 300
Val Leu Asp Gln Ser Tyr Leu Glu Lys Pro Asn Phe Glu Gly Ala Lys
305 310 315 320
Tyr Val Trp Ser Pro Pro Leu Arg Glu Lys Trp His Gln Glu Val Leu
325 330 335
Trp Asn Ala Leu Lys Asn Gly Gln Leu Gln Thr Leu Gly Ser Asp Gln
340 345 350
Cys Ser Phe Asp Phe Lys Gly Gln Lys Glu Leu Gly Arg Gly Asp Phe
355 360 365
Thr Lys Ile Pro Asn Gly Gly Pro Ile Ile Glu Asp Arg Val Ser Ile
370 375 380
Leu Phe Ser Glu Gly Val Lys Lys Gly Arg Ile Thr Leu Asn Gln Phe
385 390 395 400
Val Asp Ile Val Ser Thr Arg Ile Ala Lys Leu Phe Gly Leu Phe Pro
405 410 415
Lys Lys Gly Thr Ile Val Val Gly Ser Asp Ala Asp Leu Val Ile Phe
420 425 430
Asp Pro Asn Ile Glu Arg Val Ile Ser Ala Glu Thr His His Met Ala
435 440 445
Val Asp Tyr Asn Ala Phe Glu Gly Met Lys Val Thr Gly Glu Pro Val
450 455 460
Ser Val Leu Cys Arg Gly Glu Phe Val Val Arg Asp Lys Gln Phe Val
465 470 475 480
Gly Lys Pro Gly Tyr Gly Gln Tyr Leu Lys Arg Ala Lys Tyr Gly Thr
485 490 495
Ser Thr Ile Ser Lys Gln Ser Glu Glu Leu Thr Ile
500 505
<210> 2
<211> 1527
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcat gaccaaaatt 120
attaaaaatg gtaccatcgt taccgccacc gatacctatg aagcccatct gctgattaaa 180
gatggtaaaa ttgcaatgat tggccagaat ctggaagaaa aaggtgccga agttattgat 240
gcgaaaggct gttatgtgtt tccgggcggt attgatccgc atacccatct ggatatgcct 300
ctgggtggta ccgtgaccaa agatgatttt gaatcaggta ccattgccgc cgcgtttggc 360
ggtaccacca ccattattga tttttgcctg accaataaag gtgaaccgct gaaaaaagca 420
attgaaacct ggcataataa agccaatggc aaagcggtga tcgattatgg ttttcatctg 480
atgattagtg aaattactga tgatgtttta gaagaactgc cgaaagttct tgaagaagaa 540
ggtattacct cactgaaagt gtttatggcg tataaaaatg tttttcaggc tgatgatggt 600
accctgtatt gcaccctgct ggccgcaaaa gaactgggtg ccctggtgat ggtgcatgcc 660
gaaaacggtg atgttattga ttatctgacg aaaaaagcac tggcagatgg taataccgat 720
ccgatctatc atgcgctgac ccgtccgccg gaactggaag gtgaagctac aggtcgcgca 780
tgccagctga cagaactggc aggctcacag ctgtatgtgg tgcatgtgac atgtgcccag 840
gccgtggaaa aaattgcgga agcgcgcaat aaaggtctgg atgtttgggg cgaaacctgc 900
ccgcagtatt tagttctgga tcagagctat ctggaaaaac caaattttga aggtgcaaaa 960
tatgtgtgga gtccgccgct gcgcgaaaaa tggcatcagg aagttctgtg gaatgcgctg 1020
aaaaatggtc agctgcagac cctgggtagt gatcagtgta gttttgattt taaaggtcag 1080
aaagaactgg gacgtggtga ttttaccaaa attccgaatg gtggtccgat tattgaagat 1140
cgtgtgagta ttctgtttag cgaaggtgtt aaaaaaggtc gcattaccct gaaccagttt 1200
gttgatattg tgagcacccg cattgcaaaa ctgtttggcc tgtttccgaa aaaaggcacc 1260
attgttgtgg gtagcgatgc ggatctggtg atttttgatc cgaatattga acgtgtgatt 1320
agtgccgaaa cacatcatat ggccgttgat tataatgcgt ttgaaggcat gaaagtgacc 1380
ggtgaaccgg tgagcgttct gtgtcgtggt gaatttgtgg tgcgtgataa acagtttgtt 1440
ggcaaaccgg gttatggtca gtatctgaaa cgcgcgaaat atggcaccag caccattagt 1500
aaacagagcg aagaactgac catttaa 1527

Claims (10)

1.制备(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的方法，包括：以3-异丁基戊二酰亚胺为底物，利用蛋白质进行催化反应，得到(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸；
所述蛋白质为C1或C2：
C1、RSP突变蛋白质，为对RSP进行以下A1的改造、A2的改造、或A3的改造得到的蛋白质，RSP的序列为SEQ ID No.1的第37-508位；
A1、将所述RSP第63位的甲硫氨酸残基突变为丙氨酸残基、半胱氨酸残基、谷氨酸残基、异亮氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、天冬氨酸残基、苯丙氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基；
A2、将所述RSP第63位的甲硫氨酸残基突变为丙氨酸残基，将所述RSP第65位的亮氨酸残基突变为组氨酸残基、天冬酰胺残基、脯氨酸残基、丙氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、异亮氨酸残基、赖氨酸残基、甲硫氨酸残基、谷氨酰胺残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基；
A3、将所述RSP第63位的甲硫氨酸残基突变为丙氨酸残基，将所述RSP第65位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基或组氨酸残基，将所述RSP第317位的半胱氨酸残基突变为丙氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基；
所述RSP突变蛋白质排除对RSP进行M63AL65HC317K、M63AL65HC317Q和M63AL65HC317W的改造；
C2、在C1所述蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.制备(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的方法，包括：以3-异丁基戊二酰亚胺为底物，利用表达权利要求1中所述蛋白质的重组细胞进行催化反应，得到(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述重组细胞通过向生物细胞中导入能表达权利要求1中所述蛋白质的重组载体获得。
4.蛋白质，为C1或C2：
C1、RSP突变蛋白质，为对RSP进行如下改造得到的蛋白质，RSP的序列为SEQ ID No.1的第37-508位：
将RSP第63位的甲硫氨酸残基突变为丙氨酸残基，并将RSP第65位的亮氨酸残基突变为组氨酸残基，将RSP第317位的半胱氨酸残基突变为丙氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、天冬酰胺残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基或酪氨酸残基；或，将RSP第63位的甲硫氨酸残基突变为丙氨酸残基，并将RSP第65位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基，将RSP第317位的半胱氨酸残基突变为丙氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基；
C2、在C1所述蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
5.与权利要求4所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1）至B4）中的任一种：
B1）编码权利要求4所述蛋白质的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物。
6.用于制备(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的产品，由权利要求4所述蛋白质与3-异丁基戊二酰亚胺组成。
7.权利要求1-3中任一所述的方法在制备3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸中的应用。
8.权利要求1中所述蛋白质，或与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料，或权利要求6所述产品的下述任一应用：
X1、生产3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸；
X2、制备生产3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸产品；
所述生物材料，为下述B1）至B4）中的任一种：
B1）编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物。
9.权利要求1中所述蛋白质，或与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料，或权利要求6所述产品的下述任一应用：
Z1、生产(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸；
Z2、制备生产(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸产品；
所述生物材料，为下述B1）至B4）中的任一种：
B1）编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物。
10.权利要求4中所述蛋白质在作为酶中的应用。
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