CN111534494B

CN111534494B - (R)-ω-转氨酶突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用

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Publication number: CN111534494B
Application number: CN202010273326.7A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 彭晨; 贾东旭; 李军良; 程峰; 张晓健; 郑裕国; 何人宝; 金逸中; 林娇华
Original assignee: Zhejiang Yongtai Pharmaceutical Co ltd; ZHEJIANG YONGTAI TECHNOLOGY CO LTD; Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang Yongtai Pharmaceutical Co ltd; ZHEJIANG YONGTAI TECHNOLOGY CO LTD; Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-04-09
Filing date: 2020-04-09
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2040-04-09
Also published as: CN111534494A

Abstract

本发明公开了一种(R)‑ω‑转氨酶突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用，该突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第77位的精氨酸、第181位的亮氨酸、第130位的精氨酸、第139位的酪氨酸和第273位苏氨酸经多点突变得到。本发明通过基因挖掘技术筛选新型的(R)‑ω‑TA重组酶，并通过蛋白质工程技术进行分子改造，获得了高酶活、高底物耐受性和高立体选择性的(R)‑ω‑TA突变体催化剂，该突变体能够以前体酮类似物1‑(吡咯烷‑1‑基)‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)‑1,3‑丁二酮为底物不对称催化合成西他列汀中间体(R)‑3‑氨基‑1‑(吡咯烷‑1‑基)‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)丁‑1‑酮，且转化率较高，最高可达到94.6％。

Description

(R)-ω-转氨酶突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种(R)-ω-转氨酶突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用，尤其是在制备西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮中的应用。

背景技术

西他列汀，英文名称sitagliptin，全称(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮，是由Merck和Codexis公司研制和开发的一种二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制药，可通过保护内源性肠降血糖素和增强其作用而控制血糖水平，是一种有巨大潜力Ⅱ型糖尿病的治疗药物。

制备西他列汀主要是不对称合成法，通常使用转氨酶为生物催化剂进行生物转化。转氨酶(transaminase，简称TA，EC 2.6.1.X)是辅酶型PLP(5’-磷酸吡哆醛)依赖型酶。在反应过程中PLP与5’-磷酸吡哆胺(PMP)会相互进行转换，同时催化氨基从合适的供体到羰基受体的可逆转移。TA可以被分为α-TA和ω-TA。其中，ω-TA可以催化任何结构的酮和胺，具有更高的应用价值。

催化制备西他列汀的酶属于(R)-ω-TA。Codexis公司以Arthrobacter sp.来源的(R)-ω-TA117为研究对象，首先利用定点饱和突变对底物结合区域大口袋进行改造，获得突变体对1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-1,3-丁二酮(简称：截短前体酮)展现了催化活性。然后对该突变体进行11轮分子改造，最终获得了催化1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮(简称：前体酮底物)的高产突变体，催化活性较野生菌酶活提高了28000倍。(Savile C K,Janey J M,Mundorff E C,et al.Biocatalytic Asymmetric Synthesisof Chiral Amines from Ketones Applied to Sitagliptin Manufacture[J].Science，2010，329(5989):305-309.)。

另外，还有其他以(R)-ω-TA不对称合成作为主要反应步骤合成西他列汀的工艺路线。中国专利CN108586346A以1-(哌嗪-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮为底物，经转氨酶催化(如式I所示)、水解、氨基保护、缩合、脱保护，转氨酶催化的底物浓度仅367mM，转化率为99.9％，底物浓度较低，不利于工业化大规模应用。

在目前不对称合成西他列汀技术被Merck和Codexis公司垄断的情况下，应用(R)-ω-TA制备西他列汀其他技术工艺路线的底物浓度仍不具备竞争优势。在西他列汀转化工艺酶源单一、技术被垄断的背景下，亟需开发具有高活性、高立体选择性、高底物耐受的(R)-ω-TA突变体，突破现有的西他列汀生物催化制备技术壁垒，对于实现西他列汀新制备技术的自主化、国产化具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种(R)-ω-转氨酶突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用，尤其涉及生物催化前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮中的应用，该(R)-ω-转氨酶突变体不仅具有较高的酶活，而且能够高效催化前体酮类似物制备西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮，转化率最高可达94.6％。

具体技术方案如下：

本发明提供了(R)-ω-转氨酶突变体，该突变体为下列之一：

(1)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第77位的精氨酸突变为天冬酰胺，第181位的亮氨酸突变为苏氨酸，第130位的精氨酸突变为组氨酸、赖氨酸、甘氨酸或异亮氨酸；

(2)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第77位的精氨酸突变为天冬酰胺，第181位的亮氨酸突变为苏氨酸，第130位的精氨酸突变为异亮氨酸，第139位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、丝氨酸或丙氨酸；

(3)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第77位的精氨酸突变为天冬酰胺，第181位的亮氨酸突变为苏氨酸，第130位的精氨酸突变为异亮氨酸，第139位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，第273位苏氨酸突变为丝氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸或天冬氨酸。

本发明通过野生型ω-转氨酶的筛选，得到立体选择性高的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型CeTA酶，再利用多位点的定点突变，获得了具有较高酶活的(R)-ω-转氨酶突变体，能够以前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮为底物催化合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮，该中间体可以进一步通过常规化学法对西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮进行水解、氨基保护、缩合和脱保护的后步骤，获得西他列汀。

作为优选，所述(R)-ω-转氨酶突变体(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，由SEQID NO.1所示氨基酸序列的第77位的精氨酸(密码子为CGT)突变为天冬酰胺(密码子为AAC)，第181位的亮氨酸(密码子为CTG)突变为苏氨酸(密码子为ACC)，第130位的精氨酸(密码子为CGT)突变为异亮氨酸(密码子为ATC)，第139位的酪氨酸(密码子为TAC)突变为苯丙氨酸(密码子为TTC)，第273位苏氨酸(密码子为ACC)突变为酪氨酸(密码子为TAC)。

本发明提供了一种(R)-ω-转氨酶突变体的编码基因。

本发明还提供了一种包含所述编码基因的重组载体。

本发明还提供了一种包含所述编码基因的基因工程菌。

本发明还提供了所述(R)-ω-转氨酶突变体在生物催化前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮中的应用。

本发明还提供了所述基因工程菌在生物催化前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮中的应用。

本发明还提供了一种催化前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的方法，包括：以前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮为底物，所述(R)-ω-转氨酶突变体或所述基因工程菌为生物催化剂，异丙胺为氨基供体，磷酸吡哆醛为辅酶，在缓冲溶液中进行生物催化合成反应，得到西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。

进一步地，所述生物催化合成反应的温度为35～50℃；缓冲溶液为三乙醇胺-HCl缓冲液，pH为8～9。

进一步地，所述底物的浓度为500～800mM。

其中，对于本发明提供的最优的五点突变体而言，生物催化合成反应的温度在50℃时效果最佳，且当底物浓度为700mM时，转化率最高，达到94.6％。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过基因挖掘技术筛选新型的(R)-ω-TA重组酶，并通过蛋白质工程技术进行分子改造，获得了高酶活、高底物耐受性和高立体选择性的(R)-ω-TA突变体催化剂，该突变体能够以前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮为底物不对称催化合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮，且转化率较高，最高可达到94.6％，对于突破西他列汀生物催化制备技术具有里程碑意义。

附图说明

图1为实施例9中各CeTA突变体在不同反应温度下的相对酶活。

图2为西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮化学合成西他列汀的路线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1新型ω-TA的筛选、立体选择性确定与酶活精准测定

1、酶的来源与基因合成

以商品酶(R)-ω-TA 117的氨基酸序列为模板，从NCBI数据库中基因挖掘获得三株ω-TA野生型酶，分别为Capronia epimyces CBS 606.96 TA(简称CeTA，GenBank编号XP_007730450.1)，Mycolicibacterium litorale TA(简称MlTA，GenBank编号AQT79271)和Exophiala xenobiotica TA(简称ExTA，GenBank编号XP_013320890)。

上述三株酶与(R)-ω-TA 117同源性分别为44.86％、51.94％和42.41％。依据E.coli密码子偏好性进行密码子优化，以全基因合成的方法合成了三株酶，在核酸序列末端加入6×His-tag标签，两端加入酶切位点Xho I和Nco I，将该基因克隆至pET28b(+)对应的Xho I和Nco I位点，获得重组表达质粒pET28b/CeTA、pET28b/MlTA和pET28b/ExTA。

2、重组工程菌的诱导表达

LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然；LB固体培养基在LB液体培养基中添加20g/L琼脂；121℃高压灭菌20min；使用前添加终浓度50μg/mL卡那霉素。

将基因工程菌接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养至OD₆₀₀约0.6～0.8，获得种子液；将种子液以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.6～0.8，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于28℃下诱导表达10h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体备用。

3、重组工程菌的超声破碎

采用超声破碎法对湿菌体进行破碎。取1g制备的湿菌体，用10mL Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液(pH 7.5)悬浮，在39W条件下超声破碎，有效时间5min，离心收集破碎上清液。

4、确定新型ω-TA的立体选择性

取重组CeTA、ExTA和MlTA破碎上清液进行如下反应。

反应体系：10mM的1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-1,3-丁二酮(简称：截短前体酮)、52mM(R,S)-α-甲基苄胺、1mL细胞破碎上清液(酶液)、2mM PLP，加入0.1M Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液(pH 7.5)至总体积10mL。

反应条件：于30℃反应2h，冰浴10min终止反应，8000r/min离心10min，获得反应上清液。

反应过程如下：

反应上清液进行衍生化反应以确定ω-TA的立体选择性。

反应体系：8mL反应上清液、1mg的4-异丁基恶唑烷-2,5-二酮溶于0.45M硼酸盐缓冲液(pH 10.4)，总体系10mL。

反应条件：室温下条件下反应2min，加入0.1mL 1M的HCl终止反应，8000r/min离心10min，取上清液；采用高效液相色谱(HPLC)检测对应产物的构型。分析柱为Agilent C18柱(250×4.6mm，5μm)(安捷伦科技有限公司，美国)。Agilent 2414荧光检测器，Agilent 1525泵，Agilent 717进样器。

与产物标样衍生化的出峰时间对比，根据产物构型来判断所筛ω-TA的立体选择性。如表1所示，CeTA和ExTA属于(R)-ω-TA，且CeTA的立体选择性最好。

表1：各转氨酶立体选择性的鉴定

5、CeTA重组工程菌对截短前体酮酶活的精准测定

采用超声破碎法对湿菌体进行破碎。取1g制备的湿菌体，用10mL三乙醇胺-HCl缓冲液(pH 7.5)悬浮，在39W条件下超声破碎，有效时间5min，离心收集破碎上清液用于下述反应。

反应体系：10mM的1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-1,3-丁二酮(简称：截短前体酮)、200μL破碎上清液(CeTA酶液)、50mM(R)-α-甲基苄胺、1mM PLP，加入三乙醇胺-HCl缓冲液(pH 8.0)至总体系5mL。

反应条件：30℃条件下反应2h，加入6mM HCl终止反应，8000r/min离心10min，取反应上清液；采用HPLC检测产物浓度，分析方法同实施例1第4部分的“确定新型ω-TA的立体选择性”。

酶活定义：30℃和pH 8.0下，每h内催化截短前体酮底物生成1μmoL的产物所需酶量定义为一个酶活单位(U)。经酶活检测，CeTA的酶活为84.3U/g。

表2：重组CeTA的酶活测定

实施例2CeTA单点突变体的构建与筛选

1、突变体构建

将筛选到的新型的(R)-ω-TA进行单点突变，根据CeTA的核苷酸序列(如SEQ IDNO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)设计突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/CeTA为模板，对CeTA氨基酸序列的77位引入单突变，引物为：

正向引物：GACGACCACATCTCTNNKCTGGAAAAATCTTGC(下划线为突变碱基，如SEQ IDNO.4所示)；

反向引物：GCAAGATTTTTCCAGMNNAGAGATGTGGTCGTC(下划线为突变碱基，如SEQ IDNO.5所示)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，50℃15s，61℃6.5min)30循环；72℃5min。

取5μL的PCR产物，加入100μL冰浴的感受态细胞悬液中，冰上静置30min，将转化产物于42℃热激90s，迅速置于冰上冷却2min。向EP管中加入600μL的LB液体培养基，37℃，150r/min培养60min，12000r/min离心1min，弃掉600μL上清，将剩余的菌液悬浮后涂板，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h。

2、高通量筛选阳性转化子

反应混合液组成：52mM邻苯二甲胺二盐酸、10mM 1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-1,3-丁二酮(简称：截短前体酮)、1mM PLP、0.1MKOH，加入去离子水至总反应体系配成1L。反应混合液冰浴待用。

在96孔聚苯乙烯微孔培养板中每孔加入100μL含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养液，接种不同的转化菌落，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.6～0.8，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于28℃下诱导表达10h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液。

取265μL上述反应混合液加入含有菌体的的96孔板中，振荡器振荡混匀后在30℃、500r/min反应2h，冰浴3min停止反应。以重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA的反应为对照，取颜色比E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA的反应深的突变株进行酶活测定。

3、阳性转化子发酵产酶

同实施例1第2部分的“重组工程菌的诱导表达”。

4、酶活检测

同实施例1第5部分的“CeTA重组工程菌对截短前体酮酶活的精准测定”。

该实例的结果为：运用高通量的筛选方法，对获得的372株重组转化菌初筛，筛选出4株酶活提高的突变株，在对其进行酶活检测，具体结果见表3。

经分析测定，其余368株重组酶活保持不变或者下降的原因是77位的精氨酸R突变为了赖氨酸K、天冬酰胺N、甲硫氨酸M和组氨酸H外的其它氨基酸。

表3：单点突变工程菌的酶活检测

将酶活提高最显著的突变体pET28b/CeTA-R77N记为CeTA₁，获得重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28b/CeTA₁。

实施例3 CeTA二位点突变体的构建与筛选

根据实施例2构建的单突变体CeTA₁序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/CeTA₁为模板，对CeTA₁氨基酸序列的181位引入单突变，引物为：

正向引物：CCGACCGTTAAAAACNNKCAGTGGGGTGACCTG(下划线为突变碱基，如SEQ IDNO.6所示)；

反向引物：CAGGTCACCCCACTGMNNGTTTTTAACGGTCGG(下划线为突变碱基，如SEQ IDNO.7所示)。

PCR反应体系同实施例2第1部分的“突变体的构建”。

PCR扩增条件为：95℃3min；(95℃15s，50℃15s，63℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用上述提到的高通量的筛选方法对突变体进行初筛，方法同实施例2第2部分的“高通量筛选阳性转化子”。

对初筛的阳性突变株进行酶活的检测，方法同实施例1第5部分的“CeTA重组工程菌对截短前体酮酶活的精准测定”。

该实施例的结果为：运用高通量的筛选方法，对获得的279株重组转化菌进行初筛，筛选出了5株酶活提高的突变株，在对其进行酶活测定，具体结果见表4。

经分析确定，其余274株重组菌酶或保持不变或下降的原因是第181位亮氨酸L变为了丙氨酸A、缬氨酸V、苏氨酸T、丝氨酸S和天冬氨酸D外的其它氨基酸。

表4：双点突变重组菌的酶活测定

将酶活提升最多的突变体CeTA₁-L181T标记为CeTA₂，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA₂。

实施例4 CeTA及突变酶对前体酮类似物酶活的精准测定

反应体系：20mM 1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮(简称：前体酮类似物)、400μL细胞破碎上清液(酶液)、80mM异丙胺、1mM PLP，加入三乙醇胺-HCl缓冲液(pH 8.0)、25％(v/v)的二甲基亚砜(DMSO)至总体系10mL。

反应条件：30℃下反应2h，加入6mM HCl终止反应，8000r/min离心10min，取反应上清液，采用HPLC检测产物(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮(简称：sitagliptin中间体)的浓度。

分析方法：分析柱为Agilent C18柱(250×4.6mm，5μm)(安捷伦科技有限公司，美国)。Agilent 2414荧光检测器，Agilent 1525泵，Agilent 717进样器。流动相：乙腈与10mM乙酸铵的混合液(体积比55:45)，流速1.5mL/min，检测波长265nm。

酶活定义：30℃和pH 8.0下，每h将前体酮类似物催化生成1μmoL的sitagliptin中间体所需酶量定义为一个酶活单位(U)。

反应过程如下：

按照上述得到反应上清液，采用HPLC检测sitagliptin中间体的构型。

分析方法：分析柱Daicel Chiralpak AD-H column(4.6×150mm,5μm)(大赛璐药物手性技术有限公司，上海，中国)。Agilent 2414荧光检测器，Agilent 1525泵，Agilent717进样器。流动相为乙醇与庚烷混合液(体积比60:40)，流速为0.8mL/min，柱温35℃。

由表5可知，只有CeTA₂对前体酮类似物有催化能力，产物e.e.值＞99％。

表5：重组菌及突变菌的酶活测定

实施例5 CeTA三位点突变体的构建与筛选

1、突变体的构建与高通量筛选

根据实施例3构建的突变体CeTA₂序列设计突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/CeTA₂为模板，对CeTA₂氨基酸序列第130位引入单点突变，引物为：

正向引物：GTTCGTGGTGCTGGTNNKCCGGAAGACCTGGTT(下划线为突变碱基，如SEQ IDNO.8所示)

反向引物：AACCAGGTCTTCCGGMNNACCAGCACCACGAAC(下划线为突变碱基，如SEQ IDNO.9所示)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH2O至50μL。PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，50℃15s，7℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。反应混合液组成：52mM邻苯二甲胺二盐酸、30mM前体酮类似物、1mM PLP、0.1M KOH，加入去离子水、25％(v/v)的二甲基亚砜(DMSO)至总反应体系配成1L。反应混合液冰浴待用。

取265μL上述反应混合液加入含有菌体的的96孔板中，振荡器振荡混匀后在30℃、500r/min反应2h，冰浴3min停止反应。以重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA₂的反应为对照，取颜色比E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA₂的反应深的突变株进行酶活测定。

对初筛的阳性突变株进行酶活的检测，方法同实施例4的“CeTA及突变酶对前体酮类似物酶活的精准测定”。

该实施例的结果为：运用高通量的筛选方法，对获得的257株重组菌初筛，筛选出了4株酶活提高的突变株，在对其进行酶活检测，具体结果见表6。

经分析确定，其余253株重组菌酶或保持不变或下降的原因是第130位的精氨酸R突变为了组氨酸H、赖氨酸K、甘氨酸G和异亮氨酸I外的其它氨基酸。

表6：三点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体CeTA₂-R130I记为CeTA₃，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA₃。

实施例6 CeTA四位点突变体的构建与筛选

根据实施例5构建的突变体CeTA₃序列设计突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/CeTA₃为模板，CeTA₃氨基酸序列第139位引入单点突变，引物为：

正向引物：CTGGTTAACAACCTGNNKATGTTCCTGCAGCCG(下划线为突变碱基，如SEQ IDNO.10所示)

反向引物：CGGCTGCAGGAACATMNNCAGGTTGTTAACCAG(下划线为突变碱基，如SEQ IDNO.11所示)

PCR反应体系方法同实施例5的“突变体的构建与高通量筛选”。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，55℃20s，72℃7min)30循环；72℃10min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用上述提到的高通量的筛选方法对突变体进行初筛方法同实施例5的“突变体的构建与高通量筛选”。

该实施例的结果为：对获得的292株重组转化菌初筛，筛选出了3株酶活提高的突变株，在对其进行酶活测定，具体结果见表7。经分析确定，其余289株重组菌酶或保持不变或下降的原因是第139位的酪氨酸Y突变为了苯丙氨酸F、丝氨酸S、和丙氨酸A外的其它氨基酸。

表7：四点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体CeTA₃-Y139F记为CeTA₄，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA₄。

实施例7 CeTA五位点突变体的构建与筛选

根据实施例6构建的突变体CeTA₄序列设计突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/CeTA₄为模板，CeTA₄氨基酸序列第273位引入单点突变，引物为：

正向引物：GAAATCTTCATGTGCNNKACCGCTGGTGGTATC(下划线为突变碱基，如SEQ IDNO.12所示)

反向引物：GATACCACCAGCGGTMNNGCACATGAAGATTTC(下划线为突变碱基，如SEQ IDNO.13所示)

PCR反应体系方法同实施例5“突变体的构建与高通量筛选”。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，65℃20s，72℃7min)30循环；72℃10min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用上述提到的高通量的筛选方法对突变体进行初筛方法同实施例5“突变体的构建与高通量筛选”。

对初筛的阳性突变株进行酶活的检测，方法同实施例4的“CeTA及突变酶对前体酮类似物酶活的精准测定”。该实施例的结果为：对获得的342株重组转化菌筛选，筛选出了5株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表8。

经分析确定，其余337株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第273位苏氨酸T突变为了丝氨酸S、丙氨酸A、色氨酸W、酪氨酸Y和天冬氨酸D外的其它氨基酸。

表8：五点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体pET28b/CeTA₄-T273Y记为CeTA₅(该五点突变体酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA₅。

实施例8重组大肠杆菌发酵产酶

分别将重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA₂、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA₃、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA₄、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA₅接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃，150r/min培养OD₆₀₀约为0.6～0.8，获得种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，与37℃，150r/min培养OD₆₀₀至0.6～0.8，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于28℃下诱导表达12h后，4℃，8000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，备用。

实施例9确定催化酶的最适温度

收集1g上述实施例发酵的湿菌体，用10mL三乙醇胺-HCl缓冲液(pH 7.5)悬浮，在39W条件下超声破碎，有效时间5min，离心收集破碎上清液。使用nickel-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化，用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡层析柱，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，根据紫外检测器的信号响应，收集相应的洗脱液，即为各自纯酶液。

将上述纯酶液作为转化用酶，测定酶的最适反应温度。

反应体系如下：50mM的1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮(简称：前体酮类似物)、240mM异丙胺、2mM PLP、1mL纯酶液，加入三乙醇胺-HCl缓冲液(pH9.0)、25％(v/v)的二甲基亚砜(DMSO)至总体系10mL。分别于不用的转化温度(20-60℃)测定TA的活力，测定方法同实施例4的“CeTA及突变酶对前体酮类似物酶活的精准测定”，结果见图1。将各酶的最适反应温度下的酶活设定为100％。

最终，E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA₅的最适反应温度是50℃，比CeTA₂提高了10℃。高温有利于推动反应平衡向正向移动，提高产物得率，因此，E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA₅更有利于在较高温度下进行催化应用。

实施例10确定全细胞生物转化的最佳底物浓度

将重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA₂、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA₃、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA₄、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CeTA₅湿菌体作为生物催化剂，反应体系如下：适量的1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮(简称：前体酮类似物)(见表9)、800mM异丙胺、2mM磷酸吡哆醛(PLP)、1mL重组菌全细胞，加入三乙醇胺-HCl缓冲液(pH 9.0)、50％(v/v)的二甲基亚砜(DMSO)至总体系100mL。

反应条件：50℃和400r/min条件下反应30h，加入6mM HCl终止反应，8000r/min离心10min，取上清采用HPLC检测产物浓度，并计算转化率和e.e.值。分析方法同实施例4的“CeTA及突变酶对前体酮类似物酶活的精准测定”。

由表9可知，E.coli BL21(DE3)pET28b/CeTA₅在底物浓度为700mM时，转化率最高，达到94.6％。该底物浓度和转化率明显优于已报道的技术水平。

表9：不同底物浓度下生成sitagliptin中间体比较

实施例11化学法合成西他列汀(合成路径如图2所示)

在1.3L蒸馏水中，加入150g的(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮(简称：sitagliptin中间体，实施例10的反应产物)、40g NaOH，补加蒸馏水至总体系为1.5L。升温至55℃，反应3h。结束后降温至30℃，加入140g二碳酸二叔丁酯，反应6h，结束后通入盐酸调节pH至1.5～2.0，结晶过滤，蒸馏水水洗，加入2L二氯甲烷、150g二氯亚砜，25℃下反应2h，结束后加入140g二乙胺、185.4g 3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪盐酸盐，反应6.5h，结束后添加2L三氟乙酸，反应4h，结束后添加等体积蒸馏水，分层，留取有机层，水洗两次后浓缩结晶获得西他列汀干品201.2g，HPLC检测产率为98.1％，收率为96.2％。

序列表

<110> 浙江工业大学

浙江永太科技股份有限公司

浙江永太药业有限公司

<120> (R)-ω-转氨酶突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 341

<212> PRT

<213> 卡普罗尼亚表生菌(Capronia epimyces)

<400> 1

Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Gln Ser Arg Leu Arg

1 5 10 15

Val Leu Glu Ala Ser Thr Asn Pro Leu Ala Gln Gly Val Ala Trp Ile

20 25 30

Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ser Gln Ala Arg Ile Pro Leu Met Asp

35 40 45

Gln Gly Phe Leu His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ala Val Trp

50 55 60

Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Ser Arg Leu Glu Lys

65 70 75 80

Ser Cys Ser Lys Leu Arg Leu Lys Leu Pro Leu Pro Arg Asp Glu Val

85 90 95

Lys Arg Val Leu Val Asp Met Val Ala Arg Ser Gly Ile Arg Asp Ala

100 105 110

Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Thr Gly Val Arg Gly Ala

115 120 125

Gly Arg Pro Glu Asp Leu Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Leu Gln Pro

130 135 140

Tyr Leu Trp Val Met Pro Pro Glu Thr Gln Leu Val Gly Gly Ser Ala

145 150 155 160

Val Ile Thr Arg Thr Val Arg Arg Thr Pro Pro Gly Ser Met Asp Pro

165 170 175

Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Thr Arg Ala Leu Leu Glu

180 185 190

Ala Ser Asp Arg Gly Ala Ser Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp Ala

195 200 205

Asn Ile Thr Glu Gly Ser Gly Tyr Asn Ile Val Leu Ile Lys Asp Gly

210 215 220

Ala Ile His Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Glu Gly Val Thr Arg Lys

225 230 235 240

Thr Val Phe Asp Ile Ala Lys Ala Asn Gly Phe Glu Val Arg Leu Glu

245 250 255

Val Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Ala Asp Glu Ile Phe Met Cys

260 265 270

Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Ser Leu Asp Gly Gln Pro

275 280 285

Val Asn Gly Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp Asp

290 295 300

Tyr Trp Ala Leu His Tyr Asp Pro Ala Phe Ser Phe Glu Ile Lys Tyr

305 310 315 320

Asp Glu Ala Gly Ala Ser Thr Asn Gly Val Asn Gly Val His Lys His

325 330 335

His His His His His

340

<210> 2

<211> 1023

<212> DNA

<213> 卡普罗尼亚表生菌(Capronia epimyces)

<400> 2

atggcttcta tggacaaagt tttcgctggt taccagtctc gtctgcgtgt tctggaagct 60

tctaccaacc cgctggctca gggtgttgct tggatcgaag gtgaactggt tccgctgtct 120

caggctcgta tcccgctgat ggaccagggt ttcctgcact ctgacctgac ctacgacgtt 180

ccagctgtgt gggacggcag gttcttccgt ctggacgacc acatctctcg tctggaaaaa 240

tcttgctcta aactgcgtct gaaactgccg ctgccgcgtg acgaagttaa acgtgttctg 300

gttgacatgg ttgctcgttc tggtatacgt gacgcgttcg ttgaactgat agttacccgt 360

ggtctgaccg gtgttcgtgg tgctggtcgt ccggaagacc tggttaacaa cctgtacatg 420

ttcctgcagc cgtacctgtg ggttatgccg ccggaaaccc agctggttgg tggttctgct 480

gttatcaccc gtaccgttcg tcgtaccccg ccgggttcta tggacccgac cgttaaaaac 540

ctgcagtggg gtgacctgac ccgtgctctg ctggaagctt ctgaccgtgg tgcttcttac 600

ccgttcctga ccgacggtga cgctaacatc accgaaggtt ctggttacaa catcgttctg 660

atcaaagacg gtgctatcca caccccggac cgtggtgttc tggaaggtgt aacccgtaaa 720

accgtgttcg acatcgcaaa agctaacggt ttcgaagttc gtctggaagt tgttccggtt 780

gaactggctt accgtgctga cgaaatcttc atgtgcacca ccgctggtgg tatcatgccg 840

atcacctctc tggacggtca gccggttaac ggtggtcaga tcggtccgat caccaaaaaa 900

atctgggacg actactgggc tctgcactac gacccggctt tctctttcga aatcaaatac 960

gacgaagctg gtgcttctac caacggtgtt aacggtgttc acaaacacca ccaccaccac 1020

cac 1023

<210> 3

<211> 1023

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcttcta tggacaaagt tttcgctggt taccagtctc gtctgcgtgt tctggaagct 60

tctaccaacc cgctggctca gggtgttgct tggatcgaag gtgaactggt tccgctgtct 120

caggctcgta tcccgctgat ggaccagggt ttcctgcact ctgacctgac ctacgacgtt 180

ccagctgtgt gggacggcag gttcttccgt ctggacgacc acatctctaa cctggaaaaa 240

tcttgctcta aactgcgtct gaaactgccg ctgccgcgtg acgaagttaa acgtgttctg 300

gttgacatgg ttgctcgttc tggtatacgt gacgcgttcg ttgaactgat agttacccgt 360

ggtctgaccg gtgttcgtgg tgctggtatc ccggaagacc tggttaacaa cctgttcatg 420

ttcctgcagc cgtacctgtg ggttatgccg ccggaaaccc agctggttgg tggttctgct 480

gttatcaccc gtaccgttcg tcgtaccccg ccgggttcta tggacccgac cgttaaaaac 540

acccagtggg gtgacctgac ccgtgctctg ctggaagctt ctgaccgtgg tgcttcttac 600

ccgttcctga ccgacggtga cgctaacatc accgaaggtt ctggttacaa catcgttctg 660

atcaaagacg gtgctatcca caccccggac cgtggtgttc tggaaggtgt aacccgtaaa 720

accgtgttcg acatcgcaaa agctaacggt ttcgaagttc gtctggaagt tgttccggtt 780

gaactggctt accgtgctga cgaaatcttc atgtgctaca ccgctggtgg tatcatgccg 840

atcacctctc tggacggtca gccggttaac ggtggtcaga tcggtccgat caccaaaaaa 900

atctgggacg actactgggc tctgcactac gacccggctt tctctttcga aatcaaatac 960

gacgaagctg gtgcttctac caacggtgtt aacggtgttc acaaacacca ccaccaccac 1020

cac 1023

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

gacgaccaca tctctnnkct ggaaaaatct tgc 33

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

gcaagatttt tccagmnnag agatgtggtc gtc 33

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

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<223> n is a, c, g, or t

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ccgaccgtta aaaacnnkca gtggggtgac ctg 33

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

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<223> n is a, c, g, or t

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caggtcaccc cactgmnngt ttttaacggt cgg 33

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

gttcgtggtg ctggtnnkcc ggaagacctg gtt 33

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctggttaaca acctgnnkat gttcctgcag ccg 33

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gaaatcttca tgtgcnnkac cgctggtggt atc 33

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<221> misc_feature

<222> (17)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 13

gataccacca gcggtmnngc acatgaagat ttc 33

Claims

1.(R)-ω-转氨酶突变体，其特征在于，该突变体为下列之一：

2.一种如权利要求1所述的(R)-ω-转氨酶突变体的编码基因。

3.一种包含权利要求2所述编码基因的重组载体。

4.一种包含权利要求2所述编码基因的基因工程菌。

5.如权利要求1所述(R)-ω-转氨酶突变体在生物催化前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮中的应用。

6.如权利要求4所述的基因工程菌在生物催化前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮中的应用。

7.一种催化前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的方法，其特征在于，包括：以前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮为底物，权利要求1所述(R)-ω-转氨酶突变体或权利要求4所述基因工程菌为生物催化剂，异丙胺为氨基供体，磷酸吡哆醛为辅酶，在缓冲溶液中进行生物催化合成反应，得到西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生物催化合成反应为35～50℃；缓冲溶液为三乙醇胺-HCl缓冲液，pH为8～9。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述底物的浓度为500～800mM。