CN110951706B

CN110951706B - 重组R-ω-转氨酶、突变体及在不对称合成西他列汀中的应用

Info

Publication number: CN110951706B
Application number: CN201910871261.3A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 李军良; 贾东旭; 郑裕国; 张晓健; 徐海鹏; 彭晨
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-09-16
Filing date: 2019-09-16
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2039-09-16
Also published as: CN110951706A

Abstract

本发明涉及一种新型重组R‑ω‑转氨酶及其高活力突变体在催化西他列汀前体酮不对称合成西他列汀中的应用。所述重组R‑ω‑转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID:1所示，其突变体是将SEQ ID:1所示的氨基酸序列的第60、113、178、233、146、214或186中的一个或者多个进行单位点突变或多位点突变获得的。本发明提供了具有高活性、高立体选择性的新型R‑ω‑TA突变体，对于实现西他列汀生物催化制备技术的自主化、国产化具有里程碑意义，可以改变目前不对称合成西他列汀过程中出现的酶源单一的技术垄断局面。

Description

重组R-ω-转氨酶、突变体及在不对称合成西他列汀中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种新的重组R-ω-转氨酶及突变体，以及该R-ω-转氨酶和突变体在不对称合成西他列汀中的应用。

(二)背景技术

西他列汀，英文名称sitagliptin，全称(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮，是由Merck和Codexis公司研制和开发的一种二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制药，可通过保护内源性肠降血糖素和增强其作用而控制血糖水平。与磺酰脲类药物与二甲双胍类药物相比，其降糖功能更加稳定、副作用少、临床效果更好，能有效应用于II型糖尿病治疗，是一种有巨大潜力II型糖尿病的治疗药物。

制备sitagliptin主要有化学合成法和不对称合成法。化学合成法通过4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]-三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮与乙酸铵形成烯胺中间体，经过[(COD)RhCl]₂和R,S-t-Bu Josiphos为不对称催化剂氢化烯胺得到sitagliptin。但该方法的劣势是工艺步骤繁琐、反应条件苛刻、使用的催化剂价格昂贵、金属离子残留率高、产物纯化分离成本投入过高、产物光学纯度低(e.e.＜97％)，对环境污染严重。相比之下，不对称合成法具有立体和区域选择性高、反应条件温和、催化效率高、产物收率高、容易进行产物的分离纯化等众多优点，在替代传统化学法不对称合成手性胺方面具有优势。

转氨酶(transaminase，简称TA，EC 2.6.1.X)是辅酶型PLP(5’-磷酸吡哆醛)依赖型酶。在反应过程中PLP与5’-磷酸吡哆胺(PMP)会相互进行转换，同时催化氨基从合适的供体到羰基受体的可逆转移。TA根据氨基被转移到不同位置的氨基受体上，可以被分为α-TA和ω-TA。α-TA需要一个α位置的羰基受体来发挥其催化功能，ω-TA可以催化任何结构的酮和胺，因此具有更高的应用价值，是一种具有重要工业应用价值的生物催化剂。

催化制备sitagliptin的酶是R-ω-TA。2010年，Codexis公司以Arthrobactersp.来源的R-ω-TA117为研究对象，首先利用定点饱和突变对底物结合区域大口袋进行改造，获得突变体对1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)丁烷-1,3-二酮(sitagliptin前体酮截短底物)展现了催化活性(见图1)。然后以该突变体为母本，对底物结合区域组合小口袋进行定点突变、组合突变，经过11轮改造，共27个位点，最终获得了催化1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁烷-1,3-二酮(sitagliptin前体酮)的高产突变体(见图2)，催化活性较野生菌酶活提高了28000倍。(Savile C K,Janey J M,Mundorff E C,et al.BiocatalyticAsymmetric Synthesis of Chiral Amines from Ketones Applied to SitagliptinManufacture[J].Science，2010，329(5989):305-309.)。除此之外，再没有利用其它R-ω-TA成功制备sitagliptin的报道。因此，sitagliptin的不对称合成生产技术一直被Codexis公司垄断，研发具有自主知识产权的新型R-ω-TA势在必行。

(三)发明内容

本发明目的即是提供一种具有高活性、高立体选择性的新型R-ω-转氨酶及突变体，以及该R-ω-转氨酶和突变体在不对称合成西他列汀中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种重组R-ω-转氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因如SEQ IDNO.2所示。

本发明还涉及一种R-ω-转氨酶突变体，由序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸经定点突变而来，所述突变的位点为下列中的一个或多个：(1)第60位、(2)第113位、(3)第178位、(4)第233位、(5)第146位、(6)第214位、(7)第186位。

具体的，所述R-ω-转氨酶突变体由序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸经下列之一或多个位点突变而得：(1)第60位缬氨酸突变为谷氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、苏氨酸或亮氨酸；(2)第113位突变为天冬酰胺、亮氨酸或酪氨酸；(3)第178位突变为脯氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或苯丙氨酸；(4)第233位突变为丙氨酸、组氨酸或苏氨酸；(5)第146位突变为脯氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、精氨酸或亮氨酸；(6)第214位突变为蛋氨酸、缬氨酸、酪氨酸或赖氨酸；(7)第186位突变为脯氨酸、天冬酰胺、组氨酸或苏氨酸。

优选的，所述R-ω-转氨酶突变体由序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸经下列之一或多个位点突变而得：(1)第60位缬氨酸突变为天冬酰胺；(2)第113位突变为酪氨酸；(3)第178位突变为酪氨酸；(4)第233位突变为组氨酸、(5)第146位突变为蛋氨酸、(6)第214位突变为蛋氨酸、(7)第186位突变为脯氨酸。

更为优选的，所述R-ω-转氨酶突变体序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明还涉及所述的R-ω-转氨酶及其突变体在催化西他列汀前体酮不对称合成西他列汀中的应用。

具体的，所述应用为：以含所述R-ω-转氨酶或突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液作为催化剂，以西他列汀前体酮为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，以异丙胺为氨基供体，在pH9.0的三乙醇胺-HCl缓冲液中，40～60℃、300～500r/min条件下反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得西他列汀。

所述R-ω-转氨酶或突变体编码基因序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.8所示。

本发明通过基因挖掘技术筛选新型的R-ω-TA重组酶，并通过蛋白质工程技术进行分子改造，将具有活性和底物耐受性提高的R-ω-TA突变体催化剂用于不对称合成制备sitagliptin，可以改变目前不对称合成sitagliptin过程中出现的酶源单一的技术垄断局面，本发明提供的具有高活性、高立体选择性的新型R-ω-TA突变体，对于实现sitagliptin生物催化制备技术的自主化、国产化具有里程碑意义。

(四)附图说明

图1为生物酶法不对称催化sitagliptin前体酮截短底物反应过程示意图；

图2为生物酶法不对称催化生成sitagliptin反应过程示意图；

图3为GzTA及其突变体在不同反应温度下的相对酶活。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：新型ω-TA的筛选、立体选择性确定与酶活精准测定

1、酶的来源与基因合成

以商品酶R-ω-TA 117的氨基酸序列为模板，从NCBI数据库中基因挖掘获得三株ω-TA，分别为Gibberella zeae TA(GzTA，GenBank编号XP_381942.1)，Mycobacteriumvanbaalenii TA(MvTA，GenBank编号WP_011781668.1)和Neosartorya fischeri TA(NfTA，GenBank编号XP_001261640.1)。上述三株酶与R-ω-TA 117同源性分别为44％、52％和38％。依据E.coli密码子偏好性进行密码子优化，以全基因合成的方法合成了三株酶的核苷酸序列，分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示；编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示。在核酸序列末端加入6×his-tag标签，两端加入酶切位点Xho I和NcoI，将该基因克隆至pET28b(+)对应的Xho I和Nco I位点，获得重组表达质粒pET28b/GzTA、pET28b/MvTA和pET28b/NfTA。

2、重组工程菌的诱导表达

LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然；LB固体培养基在LB液体培养基中添加20g/L琼脂；121℃高压灭菌20min；使用前添加终浓度50μg/mL卡那霉素。

将基因工程菌接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养至OD₆₀₀约0.6～0.8，获得种子液；将种子液以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.6～0.8，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于28℃下诱导表达10h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体备用。

3、重组工程菌超声破碎

采用超声破碎法对湿菌体进行破碎。取1g制备的湿菌体，用10mL Na₂CO₃/NaHCO₃(pH 7.5)缓冲液悬浮，在39W条件下超声破碎，有效时间5min，离心收集破碎上清液。

4、确定新型ω-TA的立体选择性

取重组GzTA、MvTA和NfTA破碎上清液进行如下反应。反应体系：30mM 3,4-二甲氧基苯丙酮、52mM R,S-α-甲基苄胺、1mL破碎上清液(GzTA酶液)、2mM PLP，加入0.1M Na₂CO₃/NaHCO₃(pH 7.5)缓冲液至总体积10mL。反应条件：于30℃反应30min，冰浴10min终止反应，8000r/min离心10min，获得反应上清液。

反应上清液进行衍生化反应以确定ω-TA的立体选择性。反应体系：8mL反应上清液、1mg 4-异丁基恶唑烷-2,5-二酮、加入0.45M硼酸盐缓冲液(pH 10.4)至总体系10mL。反应条件：室温下条件下反应2min，加入0.1mL 1M的HCl终止反应，8000r/min离心10min，取上清液；采用高效液相色谱(HPLC)检测3,4二甲氧基苯丙胺的构型。分析柱为Agilent C18柱(250×4.6mm，5μm)(安捷伦科技有限公司，美国)。Agilent 2414荧光检测器，Agilent 1525泵，Agilent 717进样器。与R-3,4-二甲氧基苯丙胺和S-3,4-二甲氧基苯丙胺标样衍生化的出峰时间对比，根据产物构型来判断所筛ω-TA的立体选择性。如表1所示，只有GzTA的催化产物为R构型，说明GzTA属R-ω-TA。

表1：各转氨酶立体选择性的鉴定

5、GzTA重组工程菌对3,4-二甲氧基苯丙酮酶活的精准测定

采用超声破碎法对湿菌体进行破碎。取1g制备的湿菌体，用10mL三乙醇胺-HCl(pH7.5)缓冲液悬浮，在39W条件下超声破碎，有效时间5min，离心收集破碎上清液用于下述反应。反应体系：30mM 3,4-二甲氧基苯丙酮、200μL破碎上清液(GzTA酶液)、50mM R-α-甲基苄胺、1mM PLP，加入三乙醇胺-HCl缓冲液(pH 8.0)至总体系5mL。反应条件：30℃条件下反应30min，加入6mM HCl终止反应，8000r/min离心10min，取反应上清液；采用HPLC检测3,4二甲氧基苯丙胺的浓度，分析方法同实施例1的“确定新型ω-TA的立体选择性”。酶活定义：30℃和pH 8.0下，每h内3,4-二甲氧基苯丙酮催化生成1μmoL的R-3,4二甲氧基苯丙胺所需酶量定义为一个酶活单位(U)。经酶活检测，GzTA的酶活为104.6U/g。

表2：重组GzTA的酶活测定

实施例2：GzTA单位点突变体的构建与筛选

1、突变体构建

将筛选到的新型的R-ω-TA进行单点突变，根据NCBI的GzTA的氨基酸序列(GenBank编号为XP_381942.1，氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO：2示)设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/GzTA为模板，对GzTA氨基酸序列的60位引入单突变，引物为：

正向引物GACCTGACCTACGACNNKCCAGCTGTGTGGGAC(下划线为突变碱基)

反向引物GTCCCACACAGCTGGMNNGTCGTAGGTCAGGTC(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，50℃15s，61℃6.5min)30循环；72℃5min。

取5μL的PCR产物，加入100μL冰浴的感受态细胞悬液中，冰上静置30min，将转化产物于42℃热激90s，迅速置于冰上冷却2min。向Ep管中加入600μL的LB液体培养基，37℃，150r/min培养60min，12000r/min离心1min，弃掉600μL上清，将剩余的菌液悬浮后涂板，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h。

2、高通量筛选阳性转化子

反应混合液组成：52mM邻苯二甲胺二盐酸、30mM 3,4-二甲氧基苯丙酮、1mM PLP、0.1M KOH，加入去离子水至总反应体系配成1L备用。反应混合液冰浴待用。

在96孔聚苯乙烯微孔培养板中每孔加入100μL含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养液，接种不同的转化菌落，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.6～0.8，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于28℃下诱导表达10h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液。取265μL上述反应混合液加入含有菌体的的96孔板中，振荡器振荡混匀后在30℃、500r/min反应30min，冰浴3min停止反应。以重组菌菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA的反应为对照，取颜色比E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA的反应深的突变株进行酶活测定。

3、阳性转化子发酵产酶

同实施例1的“重组工程菌的诱导表达”。

4、酶活检测

同实施例1的“GzTA重组工程菌对3,4-二甲氧基苯丙酮酶活的精准测定”。

该实例的结果为：运用高通量的筛选方法，对获得的298株重组转化菌初筛，筛选出5株酶活提高的突变株，在对其进行酶活检测，具体结果见表3。经分析测定，其余293株重组酶活保持不变或者下降的原因是60位的缬氨酸V突变为了谷氨酸E、酪氨酸Y、天冬酰胺N、苏氨酸T和亮氨酸L外的其它氨基酸。

表3：单点突变工程菌的酶活检测

将酶活提高最显著的突变体pET28b/GzTA-V60N记为GzTA₁，获得重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28b/GZTA₁。

实施例3：GzTA二位点突变体的构建与筛选

根据实施例2构建的单突变体GzTA₁序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/GzTA₁为模板，对GzTA₁氨基酸序列的113位引入单突变，引物为：

正向引物ATCAAAGACGCTNNKGTTGAACTGATCGTT(下划线为突变碱基)

反向引物GATCAGTTCAACMNNAGCGTCTTTGATACC(下划线为突变碱基)

PCR反应体系同实施例2的“突变体的构建”。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，50℃15s，63℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用上述提到的高通量的筛选方法对突变体进行初筛，方法同实施例2的“高通量筛选阳性转化子”。

对初筛的阳性突变株进行酶活的检测，方法同实施例1的“GzTA重组工程菌对3,4-二甲氧基苯丙酮酶活的精准测定”。

该实施例的结果为：运用高通量的筛选方法，对获得的213株重组转化菌进行初筛，筛选出了3株酶活提高的突变株，在对其进行酶活测定，具体结果见表4。经分析确定，其余210株重组菌酶或保持不变或下降的原因是第113位苯丙氨酸F变为了天冬酰胺N、亮氨酸L和酪氨酸Y外的其它氨基酸。

表4：双点突变重组菌的酶活测定

将酶活提升最多的突变体GzTA₁-F113Y标记为GzTA₂，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₂。

实施例4：GzTA三位点突变体的构建与筛选

根据实施例3构建的单突变体GzTA₂序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/GzTA₂为模板，对GzTA₂氨基酸序列178位引入单突变，引物为：

正向引物ATGGACCNNKCCCGAAAAAACCTGCAGTGG(下划线为突变碱基)

反向引物CTGCAGGTTTTTMNNGGTCGGGTCCATAGA(下划线为突变碱基)

PCR反应体系同实施例2的“突变体的构建”。

该实施例的结果为：对获得的357株重组转化菌初筛，筛选出4株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表5。经分析确定，其余353株重组菌酶或保持不变或下降的原因是第178位异亮氨酸I突变为了脯氨酸P、酪氨酸Y、天冬氨酸D和苯丙氨酸F外的其它氨基酸。

表5：三点突变重组菌的酶活测定

将酶活提升最多的突变体GzTA₂-I178Y标记为GzTA₃，获得重组菌E.coli BL21(DE3)pET28b/GzTA₃。

实施例5：原始酶与突变酶的底物特异性研究

1、底物特异性地研究

取1g原始酶或突变酶的湿菌体，用10mL三乙醇胺-HCl(pH 7.5)缓冲液悬浮，在39W条件下超声破碎，有效时间5min，离心收集破碎上清液用于下述反应。反应体系：30mM各种底物(见表6)、200μL破碎上清液(酶液)、50mM R-α-甲基苄胺、1mM PLP，加入三乙醇胺-HCl缓冲液(pH 8.0)至总体系5mL。反应条件：30℃下反应24h，加入6mM HCl终止反应，8000r/min离心10min，取反应上清液，采用HPLC检测对应的产物的浓度，方法同实施例1的“GzTA重组工程菌对3,4-二甲氧基苯丙酮酶活的精准测定”。酶活定义：每h将R-α-甲基苄胺生成1μmoL苯乙酮所需酶量定义为一个酶活单位(U)。将GzTA对3,4-二甲氧基苯丙酮测定的酶活设定为100％。由表6结果可知，GzTA₂首次对sitagliptin前体酮产生了活力，GzTA₂和GzTA₃可催化sitagliptin前体酮至sitagliptin的不对称催化反应。

表6：各酶的底物特异性研究

2、GzTA重组工程菌sitagliptin前体酮酶活的精准测定

取1g原始酶或突变酶的湿菌体，用10mL三乙醇胺-HCl(pH 7.5)缓冲液悬浮，在39W条件下超声破碎，有效时间5min，离心收集破碎上清液用于下述反应。反应体系：20mMsitagliptin前体酮、400μL破碎上清液(酶液)、80mM异丙胺、1mM PLP，加入三乙醇胺-HCl缓冲液(pH 8.0)至总体系10mL。反应条件：30℃下反应24h，加入6mM HCl终止反应，8000r/min离心10min，取反应上清液，采用HPLC检测sitagliptin的浓度。分析方法：分析柱为AgilentC18柱(250×4.6mm，5μm)(安捷伦科技有限公司，美国)。Agilent 2414荧光检测器，Agilent1525泵，Agilent 717进样器。流动相：乙腈与10mM乙酸铵的混合液(体积比55:45)，流速1.5mL/min，检测波长265nm。酶活定义：30℃和pH 8.0下，每h将sitagliptin前体酮催化生成1μmoLsitagliptin所需酶量定义为一个酶活单位(U)。

按照实施例5的“GzTA重组工程菌sitagliptin前体酮酶活的精准测定”得到上清液，采用HPLC检测sitagliptin的构型。分析方法：分析柱Daicel Chiralpak AD-H column(4.6×150mm,5μm)(大赛璐药物手性技术有限公司，上海，中国)。Agilent 2414荧光检测器，Agilent 1525泵，Agilent 717进样器。流动相为乙醇与庚烷混合液(体积比60:40)，流速为0.8mL/min，柱温35℃。由表7可以看出，GzTA₂和GzTA₃能够催化sitagliptin前体酮生成R-sitagliptin产物

表7：重组菌及突变菌的酶活测定

实施例6：GzTA四位点突变体的构建与筛选

1、突变体的构建与高通量筛选

根据实施例4构建的突变体GzTA₃序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/GzTA₃为模板，对GzTA₃氨基酸序列第233位引入单点突变，引物为：

正向引物TACACCCCGAACCGTNNKGTTCTGCAGGGT(下划线为突变碱基)

反向引物ACCCTGCAGAACMNNACGGTTCGGGGTGTA(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH2O至50μL。PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，50℃15s，62.7℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。反应混合液组成：52mM邻苯二甲胺二盐酸、30mMsitagliptin前体酮、1mM PLP、0.1M KOH，加入去离子水至总反应体系配成1L备用。反应混合液冰浴待用。

在96孔聚苯乙烯微孔培养板中每孔加入100μL含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB培养液，接种不同的转化菌落，于37℃、150r/min培养OD600至0.6～0.8，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于28℃下诱导表达10h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液。取265μL上述反应混合液加入含有菌体的的96孔板中，振荡器振荡混匀后在30℃、500r/min反应30min，冰浴3min停止反应。以邻苯二甲胺二盐酸显色法筛选突变体，在96孔板中进行，反应体系：29.2μL邻苯二甲按二盐酸，5μL sitagliptin前体酮，10μL PLP，加入0.1M KOH溶液至总体系265μL。30℃条件下12h后观察颜色变化，以重组菌菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₃的反应为对照，取颜色比E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₃的反应深的突变株进行酶活测定。

对初筛的阳性突变株进行酶活的检测，方法同实施例5的“GzTA重组工程菌sitagliptin前体酮酶活的精准测定”。

该实施例的结果为：运用高通量的筛选方法，对获得的246株重组菌初筛，筛选出了3株酶活提高的突变株，在对其进行酶活检测，具体结果见表8。经分析确定，其余243组菌酶或保持不变或下降的原因是第233位的缬氨酸V突变为了丙氨酸A、组氨酸H、苏氨酸T外的其它氨基酸。

表8：四点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体GzTA₃-V233H记为GzTA₄，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₄。

实施例7：GzTA五位点突变体的构建与筛选

根据实施例6构建的突变体GzTA₄序列试剂定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/GzTA₄为模板，GzTA₄氨基酸序列第146位引入单点突变，引物为：

正向引物GTTCAGCCATACNNKTGGGTAATGTCTCCG(下划线为突变碱基)

反向引物AGACATTACCCAMNNGTATGGCTGAACGAT(下划线为突变碱基)

PCR反应体系方法同实施例6的“突变体的构建与高通量筛选”。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，55℃20s，72℃7min)30循环；72℃10min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用上述提到的高通量的筛选方法对突变体进行初筛方法同实施例6的“突变体的构建与高通量筛选”。

对初筛的阳性突变株进行酶活的检测，方法同实施例5的“GzTA重组工程菌sitagliptin前体酮酶活的精准测定”。该实施例的结果为：对获得的385株重组转化菌初筛，筛选出了5株酶活提高的突变株，在对其进行酶活测定，具体结果见表9。经分析确定，其余380株重组菌酶或保持不变或下降的原因是第146位的缬氨酸V突变为了脯氨酸P、丝氨酸S、蛋氨酸M、精氨酸R和亮氨酸L外的其它氨基酸。

表9：五点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体GzTA₄-V146M记为GzTA₅，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₅。

实施例8：GzTA六位点突变体的构建与筛选

根据实施例7构建的突变体GzTA₅序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/GzTA₅为模板，GzTA₅氨基酸序列第214位引入单点突变，引物为：

正向引物ATCACCGAAGGTNNKGGTTTCAACGTTGTT(下划线为突变碱基)

反向引物AACGTTGAAACCMNNACCTTCGGTGATGTT(下划线为突变碱基)

PCR反应体系方法同实施例6“突变体的构建与高通量筛选”。PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，65℃20s，72℃7min)30循环；72℃10min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用上述提到的高通量的筛选方法对突变体进行初筛方法同实施例6“突变体的构建与高通量筛选”。

对初筛的阳性突变株进行酶活的检测，方法同实施例5的“GzTA重组工程菌sitagliptin前体酮酶活的精准测定”。该实施例的结果为：对获得的360株重组转化菌筛选，筛选出了4株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表10。经分析确定，其余356株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第214位色氨酸S突变为了蛋氨酸M、缬氨酸V、酪氨酸Y、赖氨酸K外的其它氨基酸。

表10：六点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体pET28b/GzTA₅-S214M记为GzTA₆，获得重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28b/GzTA₆。

实施例9：GzTA七位点突变体的构建与筛选

根据实施例8构建的突变体GzTA₅序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/GzTA₅为模板，GzTA₅氨基酸序列第186位引入单点突变，引物为：

正向引物CAGTGGTCTGACNNKACCCGTGGTATGTTC(下划线为突变碱基)

反向引物CATACCACGGGTMNNGTCAGACCACTGCAG(下划线为突变碱基)

PCR反应体系方法同实施例6“突变体的构建与高通量筛选”。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，65℃20s，72℃7min)30循环；72℃10min。

对初筛的阳性突变株进行酶活的检测，方法同实施例5的“GzTA重组工程菌sitagliptin前体酮酶活的精准测定”。该实施例的结果为：对获得的133株重组转化菌初筛，筛选出4株酶活提高的突变株，再对其进行酶活检测，具体结果见表11。经分析确定，其余129株酶或保持不变或下降的原因是第186位的苯丙氨酸F突变为了脯氨酸P、天冬酰胺N、组氨酸H和苏氨酸T外的其它氨基酸。

表11：七点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的突变体pET28b/GzTA₆-F186P记为GzTA₇，获得重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28b/GzTA₇。

实施例10：重组大肠杆菌发酵产酶

分别将重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₁、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₂、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₃、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₄、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₅、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₆、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₇接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃，150r/min培养OD₆₀₀约为0.6～0.8，获得种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，与37℃，150r/min培养OD₆₀₀至0.6～0.8，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于28℃下诱导表达12h后，4℃，8000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，备用。

实施例11：确定催化酶的最适温度

收集实施例10中1g原始酶或突变酶的湿菌体，用10mL三乙醇胺-HCl(pH 7.5)缓冲液悬浮，在39W条件下超声破碎，有效时间5min，离心收集破碎上清液。使用nickel-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化，用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡层析柱，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，根据紫外检测器的信号响应，收集相应的洗脱液，即为各自纯酶液。

将上述纯酶液作为转化用酶，测定酶的最适反应温度。反应体系如下：50mMsitagliptin前体酮、240mM异丙胺、2mM PLP、1mL纯酶液，加入三乙醇胺-HCl缓冲液(pH9.0)至总体系10mL。分别于不用的转化温度(20-60℃)测定TA的活力，测定方法同实施例5的“GzTA重组工程菌sitagliptin前体酮酶活的精准测定”，结果见图3。将各酶的最适反应温度下的酶活设定为100％。最终，E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₇的最适反应温度是45℃，比原始酶提高了15℃。高温有利于推动反应平衡向正向移动，提高产物得率，因此，E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₇更有利于催化应用。

实施例12：重组菌全细胞催化sitagliptin前体酮不对称合成sitagliptin按实施例10的方法，获得重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28b/GzTA₁、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₂、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₃、E.c oli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₄、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₅、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₆、E.coli BL21(DE3)/pET28b/GzTA₇湿菌体作为生物催化剂，反应体系如下：不同浓度的sitagliptin前体酮底物(见表11)、800mM异丙胺、2mM磷酸吡哆醛(PLP)、1mL重组菌全细胞，加入三乙醇胺-HCl缓冲液(pH 9.0)至总体系100mL。反应条件：45℃和400r/min条件下反应30h，加入6mM HCl终止反应，8000r/min离心10min，取上清采用HPLC检测sitagliptin的浓度和e.e.值，并计算转化率。分析方法同实施例5的“GzTA重组工程菌sitagliptin前体酮酶活的精准测定”。由表12可知，E.coli BL21(DE3)pET28b/GzTA₇在底物浓度为200mM时，转化30h，转化率为82.6％。与野生菌和其它突变体相比，转化效率大幅提高，可用于规模化不对称合成制备sitagliptin。

表12：不同底物浓度下生成sitagliptin的比较

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 重组R-ω-转氨酶、突变体及在不对称合成西他列汀中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 331

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Ser Thr Met Asp Lys Ile Phe Ala Gly His Ala Gln Arg Gln Ala

1 5 10 15

Thr Leu Val Ala Ser Asp Asn Ile Phe Ala Asn Gly Ile Ala Trp Ile

20 25 30

Gln Gly Glu Leu Val Pro Leu Asn Glu Ala Arg Ile Pro Leu Met Asp

35 40 45

Gln Gly Phe Met His Gly Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ala Val Trp

50 55 60

Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Leu Asp Arg Leu Glu Ala

65 70 75 80

Ser Val Lys Lys Met Arg Met Gln Phe Pro Ile Pro Arg Asp Glu Ile

85 90 95

Arg Met Thr Leu Leu Asp Met Leu Ala Lys Ser Gly Ile Lys Asp Ala

100 105 110

Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Pro Val Arg Glu Ala

115 120 125

Lys Pro Gly Glu Val Leu Asn Asn His Leu Tyr Leu Ile Val Gln Pro

130 135 140

Tyr Val Trp Val Met Ser Pro Glu Ala Gln Tyr Val Gly Gly Asn Ala

145 150 155 160

Val Ile Ala Arg Thr Val Arg Arg Ile Pro Pro Gly Ser Met Asp Pro

165 170 175

Thr Ile Lys Asn Leu Gln Trp Ser Asp Phe Thr Arg Gly Met Phe Glu

180 185 190

Ala Tyr Asp Arg Gly Ala Gln Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp Thr

195 200 205

Asn Ile Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Val Val Phe Val Lys Asn Asn

210 215 220

Val Ile Tyr Thr Pro Asn Arg Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Arg Lys

225 230 235 240

Ser Val Ile Asp Ala Ala Lys Trp Cys Gly His Glu Val Arg Val Glu

245 250 255

Tyr Val Pro Val Glu Met Ala Tyr Glu Ala Asp Glu Ile Phe Met Cys

260 265 270

Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Met Asp Gly Lys Pro

275 280 285

Val Lys Asp Gly Lys Val Gly Pro Val Thr Lys Ala Ile Trp Asp Arg

290 295 300

Tyr Trp Ala Met His Trp Glu Asp Glu Phe Ser Phe Lys Ile Asp Tyr

305 310 315 320

Gln Lys Leu Lys Leu His His His His His His

325 330

<210> 2

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 2

atgtctacca tggacaaaat cttcgctggt cacgctcagc gtcaggctac cctggttgct 60

tctgacaaca tcttcgctaa cggtatcgct tggatccagg gtgaactggt tccgctgaac 120

gaagctcgta tcccgctgat ggaccagggt ttcatgcacg gtgacctgac ctacgacgtt 180

ccagctgtgt gggacggcag gttcttccgt ctggacgacc acctggaccg tctggaagct 240

tctgttaaaa aaatgcgtat gcagttcccg atcccgcgtg acgaaatccg tatgaccctg 300

ctggacatgc tggctaaatc tggtatcaaa gacgctttcg ttgaactgat cgttacccgt 360

ggtctgaaac cggttcgtga agctaaaccg ggtgaagttc tgaacaacca cctgtacctg 420

atcgttcagc catacgtctg ggtaatgtct ccggaagctc agtacgttgg tggtaacgct 480

gttatcgctc gtaccgttcg tcgtatcccg ccgggttcta tggacccgac catcaaaaac 540

ctgcagtggt ctgacttcac ccgtggtatg ttcgaagctt acgaccgtgg tgctcagtac 600

ccgttcctga ccgacggtga caccaacatc accgaaggtt ctggtttcaa cgttgttttc 660

gttaaaaaca acgttatcta caccccgaac cgtggtgttc tgcagggtat cacccgtaaa 720

tctgttatcg acgctgctaa atggtgcggt cacgaagttc gtgttgaata cgttccggtt 780

gaaatggctt acgaagctga cgaaatcttc atgtgcacca ccgctggtgg tatcatgccg 840

atcaccacca tggacggtaa accggttaaa gacggtaaag ttggtccggt taccaaagct 900

atctgggacc gttactgggc tatgcactgg gaagacgaat tctctttcaa aatcgactac 960

cagaaactga aactgcacca ccaccaccac cac 993

<210> 3

<211> 329

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ser Gly Tyr His Ala Arg Gln Lys

1 5 10 15

Leu Leu Glu Arg Ser Asp Asn Pro Phe Ser Lys Gly Ile Ala Tyr Val

20 25 30

Glu Gly Lys Leu Val Leu Pro Ser Asp Ala Arg Ile Pro Leu Leu Asp

35 40 45

Glu Gly Phe Met His Gly Asp Leu Thr Tyr Asp Val Thr Thr Val Trp

50 55 60

Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Met Gln Arg Ile Leu Glu

65 70 75 80

Ser Cys Asp Lys Met Arg Leu Lys Phe Pro Leu Ala Pro Ser Thr Val

85 90 95

Lys Asn Ile Leu Ala Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg Asp Ala

100 105 110

Phe Val Glu Val Ile Val Thr Arg Gly Leu Thr Gly Val Arg Gly Ser

115 120 125

Lys Pro Glu Asp Leu Tyr Asn Asn Asn Ile Tyr Leu Leu Val Leu Pro

130 135 140

Tyr Val Trp Val Met Ala Pro Glu Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ser Ala

145 150 155 160

Ile Ile Thr Arg Thr Val Arg Arg Thr Pro Pro Gly Ala Phe Asp Pro

165 170 175

Thr Ile Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Thr Lys Gly Leu Phe Glu

180 185 190

Ala Met Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp Thr

195 200 205

Asn Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asn Gly

210 215 220

Ile Ile Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Arg Gly Ile Thr Arg Lys

225 230 235 240

Ser Val Ile Asp Val Ala Arg Ala Asn Asn Ile Asp Ile Arg Leu Glu

245 250 255

Val Val Pro Val Glu Gln Val Tyr His Ser Asp Glu Ile Phe Met Cys

260 265 270

Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Leu Leu Asp Gly Gln Pro

275 280 285

Val Asn Asp Gly Gln Val Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp Gly

290 295 300

Tyr Trp Glu Met His Tyr Asn Pro Ala Tyr Ser Phe Pro Val Asp Tyr

305 310 315 320

Gly Ser Gly His His His His His His

325

<210> 4

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 4

atggcttcta tggataaagt tttttccggt tatcatgccc gtcaaaagtt attggaacgc 60

tcagacaatc ctttctcgaa aggcattgca tacgtcgagg gaaagcttgt actccccagt 120

gatgcgcgaa tcccactact ggacgaaggg tttatgcacg gtgatttaac ttatgacgtg 180

accacagttt gggatggccg gttctttaga ttggacgatc atatgcagag gatacttgag 240

agctgtgaca aaatgcgtct caagttcccg ctagctcctt ctacggtcaa aaacattctg 300

gccgaaatgg tagcaaagtc cggaatccgc gatgcgtttg tggaggttat agtcactcga 360

gggttaaccg gtgtacgggg ctcaaaaccc gaagacttgt acaataacaa tatttatctt 420

ctcgtgctac catacgtttg ggtcatggct ccggagaacc aactgttagg agggtcggcc 480

atcataacaa gaacggtaag gcgtactcct cccggtgcat tcgatccaac cattaagaat 540

ttgcagtggg gcgaccttac aaaaggactc tttgaagcga tggatcgcgg ggctacgtat 600

ccgttcctaa ctgacggtga taccaacctg acagagggca gtggatttaa tatcgtgtta 660

gttaagaacg ggataattta cacgcctgac cgaggtgtct tgcggggcat cactagaaaa 720

agcgtaatag atgtggccag ggcaaataac attgacatcc gtcttgaagt tgtccccgta 780

gagcaagtgt atcactctga tgaaatattc atgtgcacca cagcgggagg gattatgcca 840

atcacgctcc tagacggtca gccggttaat gatggccaag tcggacctat aactaagaaa 900

atttgggacg ggtactggga gatgcattat aaccccgctt actcctttcc agtagattat 960

ggttcaggcc accaccacca ccaccac 987

<210> 5

<211> 343

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

Met Gly Ile Asp Thr Gly Thr Ser Asn Leu Val Ala Val Glu Pro Gly

1 5 10 15

Ala Ile Arg Glu Asp Thr Pro Ala Gly Ser Val Ile Gln Tyr Ser Asp

20 25 30

Tyr Glu Ile Asp Tyr Ser Ser Pro Phe Ala Gly Gly Val Ala Trp Ile

35 40 45

Glu Gly Glu Tyr Leu Pro Ala Glu Asp Ala Lys Ile Ser Ile Phe Asp

50 55 60

Thr Gly Phe Gly His Ser Asp Leu Thr Tyr Thr Val Ala His Val Trp

65 70 75 80

His Gly Asn Ile Phe Arg Leu Gly Asp His Leu Asp Arg Leu Leu Asp

85 90 95

Gly Ala Arg Lys Leu Arg Leu Asp Ser Gly Tyr Thr Lys Asp Glu Leu

100 105 110

Ala Asp Ile Thr Lys Lys Cys Val Ser Leu Ser Gln Leu Arg Glu Ser

115 120 125

Phe Val Asn Leu Thr Ile Thr Arg Gly Tyr Gly Lys Arg Lys Gly Glu

130 135 140

Lys Asp Leu Ser Lys Leu Thr His Gln Val Tyr Ile Tyr Ala Ile Pro

145 150 155 160

Tyr Leu Trp Ala Phe Pro Pro Ala Glu Gln Ile Phe Gly Thr Thr Ala

165 170 175

Val Val Pro Arg His Val Arg Arg Ala Gly Arg Asn Thr Val Asp Pro

180 185 190

Thr Ile Lys Asn Tyr Gln Trp Gly Asp Leu Thr Ala Ala Ser Phe Glu

195 200 205

Ala Lys Asp Arg Gly Ala Arg Thr Ala Ile Leu Met Asp Ala Asp Asn

210 215 220

Cys Val Ala Glu Gly Pro Gly Phe Asn Val Cys Ile Val Lys Asp Gly

225 230 235 240

Lys Leu Ala Ser Pro Ser Arg Asn Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys

245 250 255

Thr Val Phe Glu Ile Ala Gly Ala Met Gly Ile Glu Ala Ala Leu Arg

260 265 270

Asp Val Thr Ser His Glu Leu Tyr Asp Ala Asp Glu Ile Met Ala Val

275 280 285

Thr Thr Ala Gly Gly Val Thr Pro Ile Asn Thr Leu Asp Gly Val Pro

290 295 300

Ile Gly Asp Gly Glu Pro Gly Pro Val Thr Val Ala Ile Arg Asp Arg

305 310 315 320

Phe Trp Ala Leu Met Asp Glu Pro Gly Pro Leu Ile Glu Ala Ile Gln

325 330 335

Tyr His His His His His His

340

<210> 6

<211> 1029

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 6

atgggtattg atactggcac ctctaattta gttgctgtcg aacctggagc catccgtgag 60

gacacacccg cagggtccgt aatacaatat tcagattacg aaattgacta ttcgagtcca 120

tttgcgggtg gcgtggcttg gatcgaggga gaatacttgc cggccgagga tgcaaaaata 180

agcattttcg acacggggtt tggtcattct gatcttactt ataccgttgc gcacgtctgg 240

catggcaaca tcttccgcct cggagaccac ctagatcgac tgttagacgg ggctcggaag 300

ttgagacttg attccggtta cacaaaagac gaactcgccg atataacgaa gaaatgtgta 360

tcactatcgc agctgaggga gagttttgtg aatttaacta ttacccgtgg ctatggaaag 420

cgcaaagggg aaaaggactt gagcaaactt acacatcaag tttacatcta tgcaatacct 480

tacctctggg cgttcccccc agctgagcag atttttggta cgactgccgt cgtaccgcga 540

cacgtgcgga gagcaggcag gaacaccgtt gatcctacaa tcaagaatta tcaatgggga 600

gacctaacgg cggcttcttt cgaagccaaa gatcgtgggg cacgcactgc gatactgatg 660

gacgctgata actgcgtcgc cgagggtccc ggctttaatg tatgtattgt gaaggacgga 720

aaattagcat ccccatcacg aaacgcgttg ccggggatca cccggaagac agttttcgaa 780

atagctggtg ccatgggcat tgaggcagcg cttagagatg tcacgtcgca tgaactctac 840

gacgctgatg agatcatggc cgtaactacc gcaggagggg tgacacctat aaatacgcta 900

gacggtgttc ccattggcga tggagaacca gggccggtca ctgtagcgat cagggaccgt 960

ttttgggctc tgatggatga gcctggtccc ttaatagaag ccattcagta tcaccaccac 1020

caccaccac 1029

<210> 7

<211> 331

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 7

Met Ser Thr Met Asp Lys Ile Phe Ala Gly His Ala Gln Arg Gln Ala

1 5 10 15

Thr Leu Val Ala Ser Asp Asn Ile Phe Ala Asn Gly Ile Ala Trp Ile

20 25 30

Gln Gly Glu Leu Val Pro Leu Asn Glu Ala Arg Ile Pro Leu Met Asp

35 40 45

Gln Gly Phe Met His Gly Asp Leu Thr Tyr Asp Asn Pro Ala Val Trp

50 55 60

Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Leu Asp Arg Leu Glu Ala

65 70 75 80

Ser Val Lys Lys Met Arg Met Gln Phe Pro Ile Pro Arg Asp Glu Ile

85 90 95

Arg Met Thr Leu Leu Asp Met Leu Ala Lys Ser Gly Ile Lys Asp Ala

100 105 110

Tyr Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Pro Val Arg Glu Ala

115 120 125

Lys Pro Gly Glu Val Leu Asn Asn His Leu Tyr Leu Ile Val Gln Pro

130 135 140

Tyr Met Trp Val Met Ser Pro Glu Ala Gln Tyr Val Gly Gly Asn Ala

145 150 155 160

Val Ile Ala Arg Thr Val Arg Arg Ile Pro Pro Gly Ser Met Asp Pro

165 170 175

Thr Tyr Lys Asn Leu Gln Trp Ser Asp Pro Thr Arg Gly Met Phe Glu

180 185 190

Ala Tyr Asp Arg Gly Ala Gln Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp Thr

195 200 205

Asn Ile Thr Glu Gly Met Gly Phe Asn Val Val Phe Val Lys Asn Asn

210 215 220

Val Ile Tyr Thr Pro Asn Arg Gly His Leu Gln Gly Ile Thr Arg Lys

225 230 235 240

Ser Val Ile Asp Ala Ala Lys Trp Cys Gly His Glu Val Arg Val Glu

245 250 255

Tyr Val Pro Val Glu Met Ala Tyr Glu Ala Asp Glu Ile Phe Met Cys

260 265 270

Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Met Asp Gly Lys Pro

275 280 285

Val Lys Asp Gly Lys Val Gly Pro Val Thr Lys Ala Ile Trp Asp Arg

290 295 300

Tyr Trp Ala Met His Trp Glu Asp Glu Phe Ser Phe Lys Ile Asp Tyr

305 310 315 320

Gln Lys Leu Lys Leu His His His His His His

325 330

<210> 8

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 8

atgtctacca tggacaaaat cttcgctggt cacgctcagc gtcaggctac cctggttgct 60

tctgacaaca tcttcgctaa cggtatcgct tggatccagg gtgaactggt tccgctgaac 120

gaagctcgta tcccgctgat ggaccagggt ttcatgcacg gtgacctgac ctacgacaat 180

ccagctgtgt gggacggcag gttcttccgt ctggacgacc acctggaccg tctggaagct 240

tctgttaaaa aaatgcgtat gcagttcccg atcccgcgtg acgaaatccg tatgaccctg 300

ctggacatgc tggctaaatc tggtatcaaa gacgcttacg ttgaactgat cgttacccgt 360

ggtctgaaac cggttcgtga agctaaaccg ggtgaagttc tgaacaacca cctgtacctg 420

atcgttcagc catacatgtg ggtaatgtct ccggaagctc agtacgttgg tggtaacgct 480

gttatcgctc gtaccgttcg tcgtatcccg ccgggttcta tggacccgac ctacaaaaac 540

ctgcagtggt ctgacccaac ccgtggtatg ttcgaagctt acgaccgtgg tgctcagtac 600

ccgttcctga ccgacggtga caccaacatc accgaaggta tgggtttcaa cgttgttttc 660

gttaaaaaca acgttatcta caccccgaac cgtggtcacc tgcagggtat cacccgtaaa 720

tctgttatcg acgctgctaa atggtgcggt cacgaagttc gtgttgaata cgttccggtt 780

gaaatggctt acgaagctga cgaaatcttc atgtgcacca ccgctggtgg tatcatgccg 840

atcaccacca tggacggtaa accggttaaa gacggtaaag ttggtccggt taccaaagct 900

atctgggacc gttactgggc tatgcactgg gaagacgaat tctctttcaa aatcgactac 960

cagaaactga aactgcacca ccaccaccac cac 993

Claims

1.一种R-ω-转氨酶突变体，其特征在于所述R-ω-转氨酶突变体为下列之一：

（1）序列如SEQ ID NO. 1所示氨基酸第60位缬氨酸突变为谷氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、苏氨酸或亮氨酸；

（2）序列如SEQ ID NO. 1所示氨基酸第60位缬氨酸突变为天冬酰胺，第113位突变为天冬酰胺、亮氨酸或酪氨酸；

（3）序列如SEQ ID NO. 1所示氨基酸第60位缬氨酸突变为天冬酰胺，第113位突变为酪氨酸，第178位突变为脯氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或苯丙氨酸；

（4）序列如SEQ ID NO. 1所示氨基酸第60位缬氨酸突变为天冬酰胺，第113位突变为酪氨酸，第178位突变为酪氨酸，第233位突变为丙氨酸、组氨酸或苏氨酸；

（5）序列如SEQ ID NO. 1所示氨基酸第60位缬氨酸突变为天冬酰胺，第113位突变为酪氨酸，第178位突变为酪氨酸，第233位突变为组氨酸，第146位突变为脯氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、精氨酸或亮氨酸；

（6）序列如SEQ ID NO. 1所示氨基酸第60位缬氨酸突变为天冬酰胺，第113位突变为酪氨酸，第178位突变为酪氨酸，第233位突变为组氨酸，第146位突变为蛋氨酸，第214位突变为蛋氨酸、缬氨酸、酪氨酸或赖氨酸；

（7）序列如SEQ ID NO. 1所示氨基酸第60位缬氨酸突变为天冬酰胺，第113位突变为酪氨酸，第178位突变为酪氨酸，第233位突变为组氨酸，第146位突变为蛋氨酸，第214位突变为蛋氨酸，第186位突变为脯氨酸、天冬酰胺、组氨酸或苏氨酸。

2.如权利要求1所述的R-ω-转氨酶突变体，其特征在于所述R-ω-转氨酶突变体序列如SEQ ID NO. 7所示。

3.权利要求1所述的R-ω-转氨酶突变体在催化西他列汀前体酮不对称合成西他列汀中的应用，所述突变体为下列之一：

（1）序列如SEQ ID NO. 1所示氨基酸第60位缬氨酸突变为天冬酰胺，第113位突变为天冬酰胺、亮氨酸或酪氨酸；

（2）序列如SEQ ID NO. 1所示氨基酸第60位缬氨酸突变为天冬酰胺，第113位突变为酪氨酸，第178位突变为脯氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或苯丙氨酸；

（3）序列如SEQ ID NO. 1所示氨基酸第60位缬氨酸突变为天冬酰胺，第113位突变为酪氨酸，第178位突变为酪氨酸，第233位突变为丙氨酸、组氨酸或苏氨酸；

（4）序列如SEQ ID NO. 1所示氨基酸第60位缬氨酸突变为天冬酰胺，第113位突变为酪氨酸，第178位突变为酪氨酸，第233位突变为组氨酸，第146位突变为脯氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、精氨酸或亮氨酸；

（5）序列如SEQ ID NO. 1所示氨基酸第60位缬氨酸突变为天冬酰胺，第113位突变为酪氨酸，第178位突变为酪氨酸，第233位突变为组氨酸，第146位突变为蛋氨酸，第214位突变为蛋氨酸、缬氨酸、酪氨酸或赖氨酸；

（6）序列如SEQ ID NO. 1所示氨基酸第60位缬氨酸突变为天冬酰胺，第113位突变为酪氨酸，第178位突变为酪氨酸，第233位突变为组氨酸，第146位突变为蛋氨酸，第214位突变为蛋氨酸，第186位突变为脯氨酸、天冬酰胺、组氨酸或苏氨酸。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：以含所述R-ω-转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液作为催化剂，以西他列汀前体酮为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，以异丙胺为氨基供体，在pH9.0 的三乙醇胺-HCl缓冲液中，30~60℃、300~500 r/min条件下反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得西他列汀。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述R-ω-转氨酶突变体编码基因序列如SEQID NO. 8所示。