JP4641100B2 - 改善された特性を有するヒダントイナーゼ変異体及びそのアミノ酸の製造のための使用 - Google Patents
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Description
発明の背景
1.発明の分野
本発明は一般にヒダントイナーゼに関する。殊に、本発明は従来単離されたヒダントイナーゼに対して改善された酵素特性を示す幾つかの改変ヒダントイナーゼを見いだすこと並びにアミノ酸の製造のための全細胞触媒中でのそれらの使用に関する。
【0002】
2.関連分野の記載
本発明において“ヒダントイナーゼ”と呼称されるヒダントイン加水分解酵素は広範な特異性並びに生物学的機能を有する多様なクラスの酵素を含む。幾つかのヒダントイナーゼは、例えばピリミジン分解の還元経路において必須の役割を果たし(ジヒドロピリミジナーゼ、EC3.5.2.2)、一方、その他はプリン分解経路での反応を触媒する(アラントイナーゼ、EC3.5.2.5)。それらの機能的多様性にもかかわらず、ヒダントイナーゼは多大な配列類似性を示し、Holm,L及びSander,C(1997)進化の産物(An evolutionary treasure):ウレアーゼに関連するアミドヒドロラーゼの広範な集合の統一(Unification of a broad set of amidohydrolases related to ureases)、プロテインズ(Proteins) 28:72−82によって記載されるようなウレアーゼに関連するアミドヒドロラーゼのスーパーファミリーに属する。種々のヒダントイナーゼからの配列のアライメントを使用して、May,O.,Habenicht,A.,Mattes,R.,Syldatk,C及びSiemann,M(1998)ヒダントイナーゼの分子進化(Molecular Evolution of Hydantoinases),Biol.Chem.379:743−747並びにKim,G.J及びKim,H.S(1998)環式のアミド環に作用する機能的に関連するアミドヒドロラーゼにおける構造的類似性の同定(Identification of the structural similarity in the functionally related amidohydrolase acting on the cyclic amide ring).Biochem.J.330:295−302によって記載されるような触媒機能のために重要な保存された残基を同定した。種々のヒダントイナーゼの相当アミノ酸残基を同定することができる知識にもかかわらず、他のアミノ酸残基の機能についての知識は限られている。更に、ヒダントイナーゼのX−線構造は報告されていない。
【0003】
ヒダントイナーゼの重要な特性は、光学的に純粋なD−アミノ酸又はL−アミノ酸の製造のために有用とされるそれらのエナンチオ選択性である。ヒダントイナーゼの詳細な背景は、Oliver Mayの公表された博士論文の表題“オースロバクター アウレッセンスDSM3745からのヒダントイナーゼ並びに他のヒダントイナーゼとの関連(The Hydantoinase from Arthrobacter aurescens DSM 3745 and its Relation to other Hydantoinases)”(Institut fuer Bioverfahrenstechnik, Lehrstuhl Physiologische Mikrobiologie, Universitaet Stuttgart- 1998)に提供されている。
【0004】
光学的に純粋なアミノ酸の製造に対するヒダントイナーゼの重要性の観点において、アミノ酸酸性に関して改善された特性を有する改変酵素を開発する努力が集中してなされている。この努力の結果として、ヒダントイナーゼを所望の酵素特性を伴って製造する幾つかの微生物が単離かつ同定された。米国特許第5516660号はDSM7329及びDSM7330として同定される微生物を開示しており、これらはD−、L−及び/又はD,L−5−一置換されたヒダントインからからL−α−アミノ酸を製造できるヒダントイナーゼを製造する。米国特許第5714355号においてはDSM7330微生物の突然変異体を開示しており、これは親生物よりも2.7倍までのより高い酵素活性を有する。該突然変異体(DSM9771)は親のDSM7330生物を選択圧下に唯一の窒素源としてのL−カルバモイルメチオニン(L−CAM)を使用して培養することによって得られた。前記の微生物によって産生されたヒダントイナーゼがその意図された少なくとも幾つかの目的のために非常に適しているけれども、依然としてなおもより望ましいヒダントイナーゼ活性を示す新規の酵素を開発することが必要とされ続けている。特にエナンチオ選択性並びに触媒活性を改善することが必要である。
【0005】
発明の概要
本発明によれば、改変されたヒダントイナーゼが提供され、これらは米国特許第5714355号で同定される微生物DSM9771によって産生されるヒダントイナーゼに対して高められた酵素特性(より良好な全細胞触媒)を有する。DSM9771のヒダントイナーゼは1〜458の連続的な範囲の限定された位置を含むアミノ酸配列(配列番号2)を有する。
【0006】
DSM9771酵素内の1つ以上の特定のアミノ酸位置でのアミノ酸の置換によって活性及びエナンチオ選択性に関して高められた特性を有する酵素が形成されることが判明した。置換により本発明により改変ヒダントイナーゼ酵素が達成される特定のアミノ酸位置番号は位置番号95、154、180、251及び255である。本発明の他の特徴として、種々の位置での特定のアミノ酸の置換は特定の型の改変ヒダントイナーゼを提供することが明らかにされた。特定のアミノ酸置換は、I95F、I95L、V154A、V180A、Q251R及びV255Aを含む。これらの特定の置換の1つ以上は酵素活性を高め、かつ“野生型”のDSM9771のヒダントイナーゼのエナンチオ選択性を変化させることが判明した。これらの変化した酵素特性はN−カルバモイル−アミノ酸の逆のエナンチオマーの蓄積を削減することによってかなり改善されたヒダントイナーゼ法に貢献すると判明した。
【0007】
前記のアミノ酸置換の1つ以上を有する6つの特定の改変ヒダントイナーゼを開示している。これらの改変ヒダントイナーゼのためのアミノ酸配列は配列番号4、6、8、10、12及び14に示されている。これらの改変ヒダントイナーゼは、それぞれ1CG7、11DH7、1BF7、19AG11、22CG2及びQ2H4として明細書中に記載される。
【0008】
更に活性及び/又はエナンチオ選択性に関して進化させたヒダントイナーゼは、進化させたヒダントイナーゼを少なくとも1種のカルバモイラーゼの他に含む全細胞触媒を使用するアミノ酸(すなわちL−メチオニン)の製造を劇的に改善することができると判明した。
【0009】
先に論じられた多くの他の本発明の特徴及び付随の利点は、添付の図面と共に考慮するときに以下の詳細な記載を参照してより良く理解されるはずである。
【0010】
図面の簡単な説明
図1はアルスロバクターsp.DSM9771からのヒダントイナーゼ遺伝子(hyuH)の発現のために使用されるベクターの制限地図である。
【0011】
図2は突然変異体Q2H4、11DH7及び1CG7によって生産されるN−カルボモイル−メチオニンエナンチオマーの分離のDSM9771ヒダントイナーゼとの比較による結果を示しているクロマトグラムである。
【0012】
図3はDSM9771ヒダントイナーゼ(W)に対する本発明の突然変異酵素によって提供される酵素活性及びエナンチオ選択性における相対的な改善を示している図である。
【0013】
図4は種々のアルスロバクター株及び本発明の突然変異体Q2H4の酵素活性を示す図である。
【0014】
図5はA)E.coli JM109(pOM20/pOM21)(野生型の経路)並びにB)E.coli JM109(pOM22/pOM21)(Q2H4からの進化されたヒダントイナーゼによる経路)の8mgの細胞乾燥質量を使用する0.1Mのトリス pH7.8中37℃での100mMのD,L−MTEHの加水分解の時間経過を示す2種の図である。
【0015】
図6は25g/lのE.coli JM109(pOM20,pOM21)及びE.coli JM109(pOM21,pOM23)を使用する0.9%(w/v)のNaCl、1mMのMnCl2、pH7.8中での100mMのD,L−MTEHの加水分解の1時間の反応時間後の比較を示す図である。
【0016】
本発明の詳細な記載
本発明による改変されたヒダントイナーゼを、米国特許番号5316935号及び同第5906930号に記載されるタイプのランダム突然変異誘発手順を使用して製造し、同定し、かつ単離した。方向付け進化手順としても知られるランダム突然変異誘発プロトコールは、Kuchner,O.,Arnold,F.H(1997)酵素触媒の方向付け進化(Directed Evolution of Enzyme Catalysts),TIBTECH 15:523−530;Chen,K及びArnold F.(1991)非水性溶剤のための酵素エンジニアリング−極性有機媒体中でサブチリシンEの活性を高めるためのランダム突然変異誘発(Enzyme engineering for nonaqueous solvents-random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media),Bio/Technology 9:1073−1077;Chen,K及びArnold,F(1993)通常環境のための酵素活性の調節:ジメチルホルムアミドにおける触媒のためのサブチリシンEの連続的ランダム突然変異誘発(Tuning the activity of an enzyme for unusual environments: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide)、Proc,Natl.Acad.Sci.USA 90:5618−5622;並びにYou,L及びArnold,F.H(1996)水性ジメチルホルムアミドにおける全活性を高めるためのバシラス サブチリスでのサブチリシンEの定方向進化(Directed Evolution of Subtilisin E in Bacillus Subtilis to Enhance Total Activity in Aqueous Dimethylformamide),Protein Engineering,977−83にも記載されている。
【0017】
ランダム突然変異誘発手順を使用して、改変ヒダントイナーゼを同定及び単離することは前記に定義したような同様な基本的な手順に従った。まず、野生型のヌクレオチド配列(配列番号1)における多数のランダム突然変異を発生させた。ヌクレオチド配列のライブラリーを次いで使用して多数の突然変異した酵素を発現させる。次いで突然変異されたヒダントイナーゼのライブラリーをスクリーニングして、高められた酵素活性及び変化したエナンチオ選択性を有する突然変異体を同定した。
【0018】
所望の変異体を同定するために、発現されたアミノ酸配列の第1のライブラリーをスクリーニングする工程は、所望の酵素活性を測定する任意の数の適当なスクリーニング技術を使用して達成できた。事実上使用されたスクリーニング法はpH−インジケータアッセイであり、これは以下により詳細に記載する。
【0019】
本発明によれば、高められたヒダントイナーゼ特性を有する4種の酵素をDSM9711ヌクレオチド配列(配列番号1)のランダム突然変異誘発の第1工程の結果として同定した。1回目の突然変異酵素は1CG7、11DH7、1BF7及び19AG11である。これらの第1工程の突然変異体のためのヌクレオチド配列は配列番号3、5、7及び9にそれぞれ示されている。相応のアミノ酸配列は配列番号4、6、8及び10にそれぞれ示されている。
【0020】
2回目のランダム突然変異誘発は11DH7ヌクレオチド配列をランダムに突然変異誘発させて、突然変異体の第2のライブラリーを作成して実施した。単一の突然変異体(22CG2)が同定され、これは所望の酵素特性を示す改変ヒダントイナーゼを発現した。22CG2酵素は11DH7酵素と同一であるが、但し、22CG2突然変異体は位置180にアミノ酸置換を有している。
【0021】
22CG2突然変異体に飽和突然変異誘発を実施して、アミノ酸位置95に全ての異なる20種のアミノ酸全てを導入した。400個のクローンをスクリーニングし、かつ高められた酵素活性及びより高い(L)−選択性を有する突然変異酵素はQ2H4として同定された。Q2H4突然変異体は22CG2突然変異体と同一であるが、但し、位置95でフェニルアラニンにイソロイシンが置換されている。
【0022】
前記に定義された突然変異体の単離及び同定の結果として、改善されたヒダントイナーゼは、位置95、124、154、180、251及び255でのアミノ酸の置換によってDSM9771酵素を改変することによって得られると確立された。これらの置換は1つ以上の位置でなされてもよい。第1表は有利なアミノ酸置換を示している。
【0023】
【表1】
【0024】
第1表に示される置換の他に、得られるヒダントイナーゼが所望の酵素活性を示すアミノ酸置換は可能である。例えば位置95でのイソロイシンに対する他の適当なアミノ酸置換はGly、Ala、Val、Leu、Phe、Tyr及びTrpを含む。位置154、180及び255に関しては、バリンに対する適当な選択的アミノ酸置換はAla及びGlyを含む。位置251でのグルタミンに対する適当な選択的アミノ酸置換はArg、Lys及びAsnを含む。これらのアミノ酸置換は飽和突然変異誘発に引き続いてのクローンのスクリーニングによってなされてよい。これらの置換はDSM9711酵素の化学的操作によるか、又は所望の場所に所望のアミノ酸置換を有するペプチドの慣用の合成によっても作成することができる。前記のアミノ酸置換は種々の置換部位での有利な選択的置換の例として意図されることに留意すべきである。得られたタンパク質の酵素活性が破壊されていない他のアミノ酸の置換は可能である。位置95、154、180、251及び255での特定のアミノ酸置換の有用性は以下のように慣例のpHスクリーニングによって決定できる。
【0025】
前記のアミノ酸置換は他のヒダントイナーゼにおいて相当位置でなされてよい。“他のヒダントイナーゼ”は、任意の5′−一置換又は二置換されたヒダントイン誘導体の加水分解を触媒して、誘導体化されたN−カルバモイル−アミノ酸を得て、アルスロバクターsp.DSM9771からのヒダントイナーゼとBLAST(Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W.& Lipman, D.J.(1990) "Basic local alignment search tool." J.Mol.Biol.215:403-410)のような配列アライメントアルゴリズムによって決定できる20〜100%のアミノ酸配列の同一性を有してよい酵素とする。
【0026】
アミノ酸位置は線形順序で番号付け(開始コドンから出発する)し、それらの機能的かつ構造的関連によるものではない。従って種々のヒダントイナーゼの酵素機能に同様に貢献するアミノ酸残基は場合により、同一の酵素の欠失又は挿入の発生の故に同一のアミノ酸位置番号を有さない。従ってヒダントイナーゼの“相当位置”は、進化実験において同定されるアミノ酸としての機能(活性又はエナンチオ選択性)に同様に貢献するアミノ酸位置である。種々のヒダントイナーゼのアミノ酸同一性が高い、特に60%より大であり、アミノ酸位置が配列のギャップを伴わずに保存された領域に位置するのであれば、相当位置は、例えばBLASTアルゴリズムを使用して配列のアライメントによって決定できる。アミノ酸配列の同一性が低い、例えば60%未満であり、アミノ酸位置が非保存領域に位置するか、又はギャップの近くに保存されたアミノ酸の領域によって包囲されずに位置するのであれば、構造アライメントのような他の方法を、x−線構造を利用できれば使用できる(Mizuguchi, K., Go, N., Seeking significance in 3-dimensional protein-structure comparisons. Cur. Opin. Struc. Biol. 5:377-382(1995))。ここでは主鎖原子を構造的に整合させ、かつ相当位置をその構造のアミノ酸残基の相対位置に基づいて見いだすことができる。
【0027】
例えば定方向進化によって同定する特定の機能に貢献するアミノ酸位置はしばしば種々のアミノ酸残基によって占有されうるが、ランダム点突然変異誘発によって同定されたものではない。幾つかの置換は機能を破壊し、それらの幾つかは機能を変化させず、その他は機能を改善することになる。部位飽和突然変異誘発のような公知法を使用して、1つは、同様に機能に貢献するか、又はそれを存在するアミノ酸を全ての可能なアミノ酸残基と置換させることによって改善するアミノ酸を容易に同定できる(Miyazaki, K., Arnold, F., Exploring nonnatural evolutionary pathways by saturation mutagenesis:rapid improvement of protein function. J. Mol. Evol. 49:1716-1720)。非天然アミノ酸でさえも、同定された部位に停止コドン及びサプッレサーtRNAを非天然アミノ酸と結合させて使用して導入できる(Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T. A., Chamberlain, A.R., Diala, E.S., Biosynthetic Site-Specific Incorporation Of A Non-Natural Amino Acid Into A Polypeptide. JACS 111:8013-8014(1989))。
【0028】
本発明による6種の改変ヒダントイナーゼを第2表に記載する。また第2表も、同定されたそれぞれの改変された酵素についてのDSM9771配列(配列番号2)に関するアミノ酸置換を記載している。
【0029】
【表2】
【0030】
本発明の改変されたヒダントイナーゼを他のヒダントイナーゼと同様に使用して光学的に純粋なD−及びL−アミノ酸を製造してよい。例えば、DL−5−一置換されたヒダントインから光学的に純粋なアミノ酸を製造する際のヒダントイナーゼの使用の記載については、アミノ酸及び誘導体の生物触媒的製造(Biocatalytic Production of Amino Acids and Derivatives (Rozzel, J. D. and Wagner, F. eds.)(1992) Hanser Publisher, NY, at pages 75-176)を参照されたい。またヒダントイナーゼの一般的使用は、有機合成における酵素触媒(Enzyme catalysis in organic synthesis (Dranz, K. and Waldmann, H. eds.) 1995, VCH-Verlag, Weinheim, at pages 409-431)及びWagner,T他(1996)アルスロバクター種DSM7330の新規の突然変異株の休止細胞によるd,l−5−(2−メチルチオエチル)ヒダントインからの1−メチオニンの製造(Production of 1-methionine from d,l-5-(2-methylthioethyl)hydantoin by resting cells of a new mutant strain of Arthrobacter species DSM 7330),Journal of Biotechnology 46:63−68に記載されている。
【0031】
本発明において呼称されるアミノ酸は全ての天然又は非天然アミノ酸であり、その際、これらのアミノ酸は1つの媒介C−原子(α−C−原子)を介してカルボン酸基に連結する第一級アミンであると判断される。このC−原子はたった1つの他の残基を有する。有利な非天然アミノ酸はDE19903268.8号に開示されている。有利な天然アミノ酸はBeyer−Walter,有機化学の教科書(Lehrbuch der Organischen Chemie),第22版,S.Hirzel出版シュトゥットガルト,822〜827頁に挙げられるものである。前記に示されるアミノ酸のうち、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、t−ロイシン又はネオペンチルグリシンは改変されたヒダントイナーゼを使用する方法において変換されない。
【0032】
ヒダントインを酵素によって直接アミノ酸に変換するために、カルバモイラーゼと共に本発明のヒダントイナーゼを含む全細胞触媒を使用するのが有利である。ヒダントインラセマーゼをヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼの他に使用してもよい。
【0033】
ヒダントイナーゼを前記の方法においてその遊離形又は固定化形のいずれでも使用できる。またカルバモイラーゼ及びヒダントインラセマーゼを固定化してもよい。酵素の固定化の技術は当業者に公知である。有利な方法はBhavender P.Sharma,Lorraine F.Bailey及びRalph A.Messing,固定化された生物材料−技術及び使用(Immobilisierte Biomaterialien - Techniken und Anwendungen),Angew.Chem.1992,94,836−852;Dordick他,J.Am.Chem.Soc.194,116,5009−5010;Okahata他,Tetrahedron Lett.1997,38,1971−1974;Adlercreutz他,生体触媒(Biocatalysis)1992,6,291−305;Goto他,Biotechnol.Prog.1994,10,263−268;Kamiya他,Biotechnol.Prog.1995,11,270−275;Okahata他,Tibtech,1997年2月,15,50−54;Fishman他,Biotechnol.Lett.1998,20,535−538に挙げられている。
【0034】
論ぜられた変換はバッチ式方法又は連続式方法で実施できる。有利には、酵素−メンブレン−リアクターを反応容器として使用する(Wandrey et al.in Jahrbuch 1998, Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI S. 151ff.:Wandrey et al. in Applied Homogenous Catalysis with Organometallic Compounds, Vol. 2, VCH 1996, S. 832 ff.; Kragl et al., Angew. Chem. 1996, 6, 684f.)。
【0035】
本発明の更なる態様はカルバモイラーゼ、場合によりラセマーゼ及びヒダントイナーゼをコードする遺伝子を含有する全細胞触媒に向けられ、その際、ヒダントイナーゼは本発明の改変されたヒダントイナーゼによるものと考慮される。
【0036】
有利には細菌は、高い繁殖速度及び容易な増殖条件が適用されるべきであるので細胞として使用される。この点で使用できる当業者に公知の細菌は幾つか存在する。このことについては有利にはE.coliが細胞及び発現系として使用できる(Yanisch-Perron et al., Gene(1985), 33, 103-109)。本発明の他の態様は、本発明により全細胞触媒を使用するエナンチオマー的に高められたアミノ酸の製造のための方法である。
【0037】
この点に関しては、メチオニン、トレオニン、リジン又はt−ロイシンのようなアミノ酸を全細胞触媒を使用して製造することが更に有利である。
【0038】
前記の実例で論ぜられる変換はバッチ式方法又は連続式方法で実施できる。有利には、酵素−メンブレン−リアクターを反応容器として使用する(Wandrey et al.in Jahrbuch 1998, Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI S. 151ff.:Wandrey et al. in Applied Homogenous Catalysis with Organometallic Compounds, Vol. 2, VCH 1996, S. 832 ff.; Kragl et al., Angew. Chem. 1996, 6, 684f; DE19910691.6)。
【0039】
本発明の他の態様は、本発明の全細胞触媒の製造のための方法に向けられる。該方法は、有利には発現ベクターpOM17、pOM18、pOM20、pOM22及び/又はpOM21を使用することによって実施する。更に配列番号17、配列番号18、配列番号15及び/又は配列番号16のプライマーが全細胞触媒の製造に関して使用される。
【0040】
実施例は以下の通りである:
例1
以下の例は、本発明による改変ヒダントイナーゼを同定及び単離するために使用される手順に関して更なる詳細を提供する。
【0041】
アルスロバクターsp.DSM9771からのヒダントイナーゼ(米国特許第5714355号)をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってクローニングした。ヌクレオチド配列を決定し、親密に関連するアルスロバクター株からの他のヒダントイナーゼと比較した。ヒダントイナーゼのためのヌクレオチド及びアミノ酸配列を配列番号1及び2にそれぞれ示す。アルスロバクターsp.DSM9771からクローニングされた酵素はアルスロバクター アウレッセンスDSM3747及びDSM3745からの酵素と、それらのヌクレオチド配列に基づき約97.5%の同一性を共有している。これらの酵素はInstitute of Industrial Genetics,Universitaet Stuttgart(ドイツ)によって提供されたラムノース誘導性ベクター構築物を使用してE.coli JM109中で発現させた。制限地図を図1に示す。
【0042】
該ヒダントイナーゼにエラー−プロンPCR(error-prone PCR)を使用するランダム突然変異誘発を実施した。約10000個のクローンを以下のようにpH−インジケータアッセイを使用してスクリーニングした:
1. 種培養プレート:100μl/ウェルのLBampを含有するプレートに単集落/ウェルで接種し、30℃、250rpmで24時間インキュベートした。
【0043】
2. 主培養プレート:種培養プレートからの細胞を96ピンのレプリケータを使用して200μlのLBamp+0.2%のラムノースを含有するプレート中に移した。プレートを30℃、250rpmで24時間インキュベートした。
【0044】
3. アッセイ:ピペッティングロボットを使用して、それぞれのウェルの培養をピペッティング(上下を3回)によって混合し、かつ2つの新鮮なプレート中に移した(それぞれ75μl)。2つのプレートを100μl/ウェルの新鮮に製造された基質溶液(0.05g/lのクレゾールレッド中のそれぞれ80mMのD−MTEH及びL−MTEH pH8.6)で満たした。580nmでの吸光を、基質をプレートに添加した直後及び室温で3時間インキュベートした後に測定した。活性を以下のように測定した:
活性=(A580(0時間)-A580(3時間))/(A580(0時間)-0.8))
(記:0.8は細胞不含での吸光)
スクリーニングの目的のために、D−及びL−エナンチオマーに関する活性の比を、変化したエナンチオ選択性のためのインジケータとして得た。
【0045】
スクリーニング試験での種々のエナンチオマーに関する活性の比はエナンチオ選択性のたった1つの最大の暗示なので、同定された突然変異体は以下のようにラセミ体基質を使用するキラルHPLCによって確認された。2mlのオーバーナイト培養を0.1Mのトリス(pH8.5)中の2mlの80mMのDL−MTEHに添加し、37℃でインキュベートした。それぞれ1時間及び2時間後に、反応混合物を14000rpmで2分間遠心分離した。20μの上清をHPLCカラム上に適用し、種々の分画が溶離した。
【0046】
約2%のポピュレーションによって野生型のDSM9771と比較してかなり高い(>50%)活性が示された。これらのクローンの相当数はポピュレーション中での発現レベルの共通の変動の故に擬陽性の場合があるので、むしろ再スクリーニングされたクローンの約50%がより高い活性の突然変異体であった。大きい数は、ヒダントイナーゼが大きな進化ポテンシャルを有することを示している。(その活性及びエナンチオ選択性を従って改善することが出来る)。これは高いKm値(約15mM)、かなり低い比活性(約12U/mg)及び低い発現レベル(<10%の全タンパク質)がこの酵素の改善のための余地を残しているので合理的に説明することができる。
【0047】
第3表は試験された突然変異体の結果を示している。突然変異体1CG7は(D−)選択性の劇的な増大を示す。野生型と比較して生成物のエナンチオマー過剰は4倍に増大する。クローン11DH7及び19AG11のエナンチオ選択性を反対方向に変化させた。それというのも両者の突然変異体は絶対的に非選択性だからである。活性突然変異体1BF7は野生型と同じエナンチオ選択性を有する。
【0048】
【表3】
【0049】
全ての突然変異体の配列決定をし、ヌクレオチド及びアミノ酸配列は第4表に示されるように確立された。
【0050】
第4表
【0051】
【表4】
【0052】
ランダム突然変異誘発の第2工程を親として第一世代の突然変異体11DH7を使用して実施した。
【0053】
異なるエラー率(20%及び50%の不活性クローン)を有する2つの異なるライブラリーを製造し、各ライブラリーの10000クローンを前記のpH−インジケータ法を使用してスクリーニングした。スクリーニングされたクローンはいずれもかなり高いL−選択性を示さないが、改善された活性及び高いD−選択性を有する突然変異体が見られた。親とたった1つのアミノ酸だけが異なる1つの突然変異体(22CG2)は親の11DH7と比較して4倍も活性が高いことが判明した。
【0054】
第一世代の突然変異体11DH7及び19AG11の配列決定によって、単一の突然変異(I95L)が低減されたD−選択性に関連することが明らかにされた。全ての20種の種々のアミノ酸を突然変異体22CG2のアミノ酸位置95中に飽和突然変異誘発によって導入し、かつ約400個のクローンをスクリーニングすることによって、大きく改善されたL−選択性(eeL=20%)及びその親の22CG2と比較して1.5倍に改善された活性を有する新規の突然変異体(Q2H4)が示された。エナンチオ選択性に関するHPLC分析の結果を図2に示す。22CG2のためのヌクレオチド及びアミノ酸配列を配列番号11及び12にそれぞれ示す。Q2H4のためのヌクレオチド及びアミノ酸配列を配列番号13及び14にそれぞれ示す。
【0055】
前記の突然変異体によって提供される改善の他に全細胞触媒の活性を、1mMのマンガンを増殖培地及び基質溶液に添加することによって10倍に増大させることができた。これらの条件下に、突然変異体22CG2の活性を測定すると、約380U/gCDWであり、これはアルスロバクターsp.DSM9771に関して記載される活性と比較して50倍の活性増加である。突然変異体Q2H4と他の株との活性の比較を図4に示す。
【0056】
親のDSM9771に関する種々の改変された酵素の酵素活性の一覧を図3に示す。図3から明らかなように、本発明により同定された全ての改変された酵素は改変されていないDSM9771のヒダントイナーゼよりも良好な活性及び/又はエナンチオ選択性を有する。標準的な条件下にHPLCによって試験する場合に、Q2H4突然変異体はD,L−MTEHの加水分解に関して逆のエナンチオ選択性を示した。Q2H4はN−カルバモイル−L−メチオニンを約30%の変換率において20%のエナンチオマー過剰(ee)で産出した。更にQ2H4突然変異体はその親の22CG2より約1.5倍高い活性であった。
【0057】
例2
更なる例において、L−メチオニンを組み換え全細胞触媒を使用して製造した。組み換え全細胞触媒を以下のようにE.coli中で、進化された又は野生型のヒダントイナーゼとヒダントインラセミ体及びL−カルバモイラーゼとを同時発現させることによって製造した。
【0058】
株及び発現ベクター。L−カルバモイラーゼ及びヒダントイナーゼの発現ベクターpOM17及びpOM18を、アルスロバクターsp.DSM9771からのそれぞれhyuC及びhyuH遺伝子を以下のプライマー:hyuC−増幅のため:5′−AGGCGACATATGACCCTGCAGAAAGCGCAA−3′(配列番号17)、5′−ATGGGATCCCCGGTCAAGTGCCTTCATTAC−3′(配列番号18);hyuH−増幅のため:5′−AGAACATATGTTTGACGTAATAGTTAAGAA−3′(配列番号15)、5′−AAAAGGATCCTCACTTCGACGCCTCGTA−3′(配列番号16)を使用してPCR増幅することによって構築した。増幅された断片を制限酵素NdeI及びBamHIで切断し、同じ酵素を使用してrhaBADプロモーター(ラムノースプロモーター)の下流でベクターpJOE2702(Volff, J.-N., Eichenseer, C., Viell, P., Piendl, W. & Altenbuchner, J. (1996) Nucleotide sequence and role in DNA amplification of the direct repeats composing the amplificable element AUDI og Streptomyces lividans 66. Mol. Microbiol. 21, 1037-1047)中に挿入した。両者とも別個にラムノースプロモーターの制御下のL−カルバモイラーゼ及びヒダントイナーゼ遺伝子を有する同時発現プラスミドpOM20をプラスミドpOM17及びpOM18から誘導した。pOM17をSalIによって消化し、かつクレノウ断片で処理して、平滑末端を形成させた。pOM18をBamHIによって消化し、またクレノウ断片で処理して、ブラントエンドを形成させた。引き続き両者の断片をHindIIIで消化した。pOM17から得られるカルバモイラーゼ遺伝子及びラムノースプロモーターを有する1521kbの断片を消化されたpOM18の5650kbの断片とライゲーションして、pOM20が得られた。L−選択性のヒダントイナーゼの突然変異をpOM20中に制限酵素RsrII及びKasIを使用して導入して、pOM22が得られた。ラセマーゼ発現ベクターpOM21をpACYC184(Rose, R.E. The nucleotide sequence of pACYC184. Nucleic Acids Res. 16, 355(1988))から得て、これはクロラムフェニコール選択マーカー及びアルスロバクターsp.DSM3747からのラセマーゼ遺伝子hyuRをラムノースプロモーターの制御下に有している。全てのプラスミドを慣例通りにE.coli JM109中に形質転換させた(Yanisch-Perron, C., Viera, J. & Messing, J. (1984) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13 mp18 and pUC vectors, Gene 33, 103-109)。ヒダントイン変換経路をE.coli JM109において、pOM20及びpOM22をそれぞれE.coli JM109(pOM21)中に形質転換することによって導入した。細胞を、両者とも増殖培地及び発現培地のための各抗生物質(100μg/mlのアンピシリン、50μg/mlのクロラムフェニコール)が供給され、かつ発現媒体のための2mg/mlのラムノースが添加されたLB液体培地又はLB−アガープレート中で増殖させた(Luria. S. E., Adams, J. N. & TIng, R. C. (1960) Transduction of lactose-utilizing ability among strains of Escherichia coli and Shigella dysenteriae and properties of phage particles. Virology 12, 348-390)。
【0059】
エラー−プロンPCR。ヒダントイナーゼ遺伝子のランダム突然変異誘発を、鋳型として0.25ngのプラスミドDNA、ベーリンガーPCRバッファー(10mMのトリス、1.5mMのMgCl2、50mMのKCl、pH8.3)、200μMのdATP、200μMのdTTP、200μMのdGTP、200μMのdCTP、50ピコモルの各プライマー及び2.5UのTaqポリメラーゼ(ベーリンガー)を含有する100μlの反応混合物中で実施した。30サイクル後に、1667増幅生成物をゲルからQiaexIIゲル抽出キット(キアゲン、バレンシア、CA)を使用して抽出し、かつベクターpJOE2702中にEcoRI及びHindIII部位を使用してサブクローニングした。アルカリ性ホスファターゼ処理されたベクターのリライゲーション頻度は1%未満であった。
【0060】
飽和突然変異誘発。アミノ酸位置95についてのコドンの無作為化のために、QuickChangeTMプロトコール(ストラタジーン、La Jolla,CA)を使用した。クローン22CG2からの約10ngのプラスミドを2種の相補的なオリゴヌクレオチド(5′−CATCGAGATGCCGNNNACCTTCCCGCCCAC−3′、5−GTGGGCGGGAAGGTNNNCGGCATCTCGATG−3′)を使用してPCRによって増幅した。PCR増幅後に、反応混合物を20Uの制限酵素DpnIで2時間処理した。10μlのDpnIで消化された反応混合物をコンピテント細胞中に形質転換させることによって、2000より多い突然変異体のライブラリーが得られ、この中の約400個をスクリーニングした。
【0061】
ライブラリーの作成及びスクリーニング。形質転換されたE.coliの単集落を384ウェルプレート(マスタープレート)中にロボットシステムQbot(Genetix, Dorset, UK)を使用して移した。37℃で20時間増殖させた後に、プレートを−80℃で貯蔵した。引き続いてのスクリーニングのために、これらのプレートを解凍し、1ウェルあたり200μlのインジケータ媒体を含有する96ウェルプレート中に複製した。Biomek1000ピペッティングワークステーション(Beckman, Fullerton, CA)を使用して、30℃で24時間インキュベートされたプレートを2つの96ウェルプレートに分配した(一方は100μlの80mMのL−MTEHを含有し、もう一方はpH8.5に調整された50mg/lのクレゾールレッド溶液中の100μlの80mMのD−MTEHを含有する)。580nmでの初期吸光及び室温での3時間のインキュベーションの後の吸光をTHERMOmaxプレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を使用して測定した。活性を、初期吸光と3時間のインキュベーション後の吸光の差を各ウェルの細胞密度で割ることによって計算した。飽和突然変異誘発ライブラリーに関してはインキュベーション時間を1.5時間に減らした。L−及びD−エナンチオマーに対する活性の比をエナンチオ選択性のための第一のインジケータとして得た。同定されたクローンを次いでラセミ基質を使用して以下に記載の条件下に試験した。
【0062】
活性及びエナンチオ選択性の特徴付け。スクリーニングにおいて陽性であると判明した突然変異体のプラスミドの配列決定を行い、これをE.coli中に再形質転換させた。再形質転換されたE.coliの培養を1mMのMnCl2を供給したインジケータ媒体中で16〜18時間(OD10まで)増殖させた。80mMのD,L−MTEH、0.1Mのトリス(pH8.5)、1mMのMnCl2からなる2mlの基質溶液(37℃で予備インキュベートした)を2mlの細胞培養(OD600〜7)に添加した。反応混合物を直ちに水浴中で37℃でインキュベートした。種々の時間(本文に規定されるような)後に、1mlの試料を採取し、14000rpmで5分間遠心分離した。20μlの上清をキラルHPLCによってデグッサ−ヒュルスAG(Degussa-Huels AG)によって製造されたカラムを使用して分析した。活性は生産されたN−カルバモイル−D,L−メチオニンの量から計算し、U/mgの細胞乾燥質量(CDW)のU/mlの細胞培養として表され、その際、1Uは規定の反応条件下に1分間で1マイクロモルのN−カルバモイル−D,L−メチオニンを生産する全細胞触媒の量である。ヒダントイナーゼ及びその突然変異体のエナンチオ選択性を、種々の変換の程度での生成物についてeeD((D-L)/(D+L))とeeL((L-D)/(L+D))のそれぞれの割合を計算することによって比較した。Chen他(Chen, C.S., Fujimono, Y., Girdaukas, G, & Sih, C.J.(1982) Quantitative analysis of biochemical kinetic resolution of enantiomer. J.Am.Chem. Soc.104, 7294-7299)によって記載されるようなee値及び変換の程度からE(エナンチオマー比)を慣用に測定することは、基質の迅速なラセミ化の故に不可能である。
【0063】
D,L−MTEHのL−metへの変換。E.coli JM109(pOM20及びpOM21)及びE.coli JM109(pOM22及びpOM21)の8mgの細胞乾燥質量を、1mMのMnCl2を供給した0.1Mのトリス(pH7.8)中の4mlの100mMのD,L−MTEHに添加した。反応混合物を37℃でインキュベートした。これらの試料を指示される時間の後に分析し、かつVoelkel,D.&Wagner,F.Reation(1995)5−一置換されたヒダントインのエナンチオマー的に純粋なL−アミノ酸への変換に関するメカニズム(mechanism for the conversion of 5-monosubstituted hydantoins to enantiomerically pure L-amino acids).Ann.NY Acad.Sci.750,1−9に記載されるようにMTEH、D,L−C met及びD,L−metに関してHPLCによって分析した。これらの化合物の光学純度を前記のようにキラルHPLCによって分析した。
【0064】
図5に示されるように、D,L−MTEHのL−metへの変換は進化されたヒダントイナーゼによって触媒についてかなり改善された。3時間後に、約60mMのL−metが100mMのD,L−MTEHから生産され、一方で全細胞触媒は野生型経路でわずか10mMのアミノ酸を生産した。D−C met中間体の濃度は4分の1に低減し、L−アミノ酸の製造に関する生産性は反応の最初の1時間の間に8倍に増大した。
【0065】
例3
以下の例はL−メチオニンの製造が、改善された活性を有しかつエナンチオ選択的でない(42%の変換率において0%のエナンチオマー過剰 第3表参照)突然変異体22CG2の進化されたヒダントイナーゼによってかなり改善されることを示している。突然変異体22CG2からの進化されたヒダントイナーゼの突然変異体をpOM20中に従来から記載されているように制限酵素RsrII及びKasIを使用して導入して、pOM23が得られた。この同時発現ベクターをE.coli JM109(pOM21)中に形質転換させた。得られた全細胞触媒 E.coli JM109(pOM21/pOM23)及びE.coli JM109(pOM21/pOM20)をD,L−MTEHをメチオニンに変換するために使用した。125mgのそれぞれの細胞の細胞乾燥質量を5mlの基質溶液(0.9%のNaCl中の100mMのD,L−MTEH、1mMのMnCl2 pH7.8)に添加し、37℃で1時間インキュベートした。図6は両者の触媒についての、D,L−MTEHからメチオニン(Met)及びN−カルバモイル−メチオニン(C−Met)の製造を示している。クローン22CG2からの改善されたヒダントイナーゼを有する全細胞触媒は1時間以内に約65mMのメチオニンを産生し、一方で野生型のヒダントイナーゼを有する全細胞触媒は同じ反応時間の間にわずか8mMだけしか産生しない。このことは大きなエナンチオ選択性を有さないが、改善された活性を有する進化されたヒダントイナーゼはメチオニンの製造に重大な改善をもたらすことを証明している。
【0066】
このように本発明の例示した実施態様を記載したので、当業者によれば、その範囲内の開示が例示されているだけであり、種々の他の選択肢、適合及び変更を本発明の範囲内で行ってよいことが留意されるはずである。従って本発明は本願に説明されるような特定の実施態様に制限されるものではなく、請求の範囲によってのみ制限される。
【0067】
【外1】
【0068】
【外2】
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1はアルスロバクターsp.DSM9771からのヒダントイナーゼ遺伝子(hyuH)の発現のために使用されるベクターの制限地図である。
【図2】 図2は突然変異体Q2H4、11DH7及び1CG7によって生産されるN−カルボモイル−メチオニンエナンチオマーの分離のDSM9771ヒダントイナーゼとの比較による結果を示しているクロマトグラムである。
【図3】 図3はDSM9771ヒダントイナーゼ(W)に対する本発明の突然変異酵素によって提供される酵素活性及びエナンチオ選択性における相対的な改善を示している図である。
【図4】 図4は種々のアルスロバクター株及び本発明の突然変異体Q2H4の酵素活性を示すグラフである。
【図5】 図5はA)E.coli JM109(pOM20/pOM21)(野生型の経路)並びにB)E.coli JM109(pOM22/pOM21)(Q2H4からの進化されたヒダントイナーゼによる経路)の8mgの細胞乾燥質量を使用する0.1Mのトリス pH7.8中37℃での100mMのD,L−MTEHの加水分解の時間経過を示す2つのグラフである。
【図6】 図6は25g/lのE.coli JM109(pOM20,pOM21)及びE.coli JM109(pOM21,pOM23)を使用する0.9%(w/v)のNaCl、1mMのMnCl2、pH7.8中での100mMのD,L−MTEHの加水分解の1時間の反応時間後の比較を示すグラフである。
【配列表】
Claims (22)
- 以下の(a)又は(b)の、配列番号2の非改変ヒダントイナーゼに対して変化したエナンチオ選択性及び/又は高められた酵素活性を有する改変されたヒダントイナーゼであって、
(a)以下の:
− V154A
− V255A
− I95L+Q251R
− I95L+V180A+Q251R
− I95F+V180A+Q251R
の群から選択されるアミノ酸置換によって改変された配列番号2の非改変ヒダントイナーゼからなる改変されたヒダントイナーゼ、又は
(b)前記改変されたヒダントイナーゼ(a)のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号2の非改変ヒダントイナーゼに対して変化したエナンチオ選択性及び/又は高められた酵素活性を有する改変されたヒダントイナーゼ。 - 以下の(a)の、配列番号2の非改変ヒダントイナーゼに対して変化したエナンチオ選択性及び/又は高められた酵素活性を有する改変されたヒダントイナーゼであって、
(a)以下の:
− V154A
− V255A
− I95L+Q251R
− I95L+V180A+Q251R
− I95F+V180A+Q251R
の群から選択されるアミノ酸置換によって改変された配列番号2の非改変ヒダントイナーゼからなる改変されたヒダントイナーゼ。 - 配列番号2の非改変ヒダントイナーゼに対して変化したエナンチオ選択性及び/又は高められた酵素活性を有する改変ヒダントイナーゼをコードする領域を有し、その際、該改変ヒダントイナーゼが以下の:
− V154A
− V255A
− I95L+Q251R
− I95L+V180A+Q251R
− I95F+V180A+Q251R
の群から選択されるアミノ酸置換によって改変された配列番号2の非改変ヒダントイナーゼからなる核酸セグメント。 - 請求項3記載の核酸セグメントを有する発現ベクター。
- 請求項3記載の核酸セグメントを有する宿主細胞。
- 請求項3記載の改変ヒダントイナーゼをコードする核酸セグメントを適当な宿主細胞中で発現させて、改変ヒダントイナーゼを製造し、かつ前記の発現工程によって製造された改変ヒダントイナーゼを回収する工程を含む、改変ヒダントイナーゼを製造するための方法。
- 請求項1又は2記載の改変ヒダントイナーゼを使用するアミノ酸の製造方法。
- 請求項2記載の改変ヒダントイナーゼを使用する、請求項7記載の方法。
- ヒダントイナーゼと共にカルバモイラーゼ及びヒダントインラセマーゼを使用する、請求項7記載の方法。
- 固定化されたヒダントイナーゼを使用する、請求項7記載の方法。
- アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン又はt−ロイシン又はネオペンチルグリシンを製造する、請求項7記載の方法。
- 方法を酵素−メンブレン−リアクター中で実施する、請求項7記載の方法。
- ヒダントイナーゼをコードする遺伝子を有し、その際、ヒダントイナーゼが請求項1又は2記載のものである全細胞触媒。
- 更にカルバモイラーゼをコードする遺伝子を有する、請求項13記載の全細胞触媒。
- 更にラセマーゼをコードする遺伝子を有する、請求項14記載の全細胞触媒。
- 細菌を全細胞として使用する、請求項13記載の全細胞触媒。
- エシェリキア コリを全細胞として使用する、請求項13記載の全細胞触媒。
- 請求項13記載の全細胞触媒を使用するアミノ酸の製造方法。
- メチオニン、バリン、トレオニン、リジン又はt−ロイシンを製造する、請求項18記載の方法。
- 方法を酵素−メンブレン−リアクター中で実施する、請求項18記載の方法。
- 配列番号17、配列番号18、配列番号15及び/又は配列番号16のプライマーを全細胞触媒の製造のために使用する、請求項18記載の方法。
- 請求項1又は2記載の改変ヒダントイナーゼを含有する全細胞を使用し、その際、該ヒダントイナーゼの作用によって製造されるN−カルバモイル−D−アミノ酸又はN−カルバモイル−L−アミノ酸を更に化学的又は酵素的に加水分解してアミノ酸を製造し、かつヒダントインのラセミ化を化学的又は酵素的に達成する、α−アミノ酸の製造方法。
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