KR100575058B1

KR100575058B1 - 방향족 기질에 대하여 효소활성이 향상된 히단토이나제변이체

Info

Publication number: KR100575058B1
Application number: KR1020040031878A
Authority: KR
Inventors: 김학성; 천영훈; 박희성; 남성훈
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2004-05-06
Filing date: 2004-05-06
Publication date: 2006-05-04
Also published as: KR20050106831A

Abstract

본 발명은 방향족 기질에 대한 효소활성이 향상된 히단토이나제(D-hydantoinase) 변이체에 관한 것으로서, 구체적으로 바실러스 스테아로써머필러스 SD1(Bacillus stearothermophilus SD1) 유래의 야생형 히단토이나제의 활성부위를 구성하는 3개의 루프(loop)에 위치한 소수성의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여 수득되는, 방향족 치환기를 갖는 기질에 대하여 효소활성이 증진된 새로운 히단토이나제 변이체에 관한 것이다.

본 발명에 따른 히단토이나제 변이체는 야생형 히단토이나제에 비하여 방향족 기질에 대한 기질 특이성이 최대 150배 이상 향상되어 산업적으로 매우 유용하다.

히단토이나제, D-아미노산, 하이드록시페닐히단토인, 변이, 기질 특이성

Description

방향족 기질에 대하여 효소활성이 향상된 히단토이나제 변이체{D-Hydantoinase Variants Having Improved Activity for Aromatic Substrates}

도 1은 바실러스 스테아로써머필러스 SD1 유래 히단토이나제의 기질 결합부위(A) 및 상기 결합부위를 형성하고 있는 스테레오케미스트리 게이트 루프(Stereochemistry gate Loops, 이하 "SGLs"로 칭함)(B)의 소수성 아미노산들을 나타내는 분자모델링 결과이다.

도 2는 서로 다른 기질 특이성을 가지고 있는 바실러스 스테아로써머필러스 SD1 유래 히단토이나제(BstHYD), 바실러스 써머카테눌라투스 GH2(Bacillus thermocatenulatus GH2)(bthHTD) 유래 히단토이나제 및 대장균 유래 페닐히단토이나제(PhHYD)에 존재하는 각각의 SGLs 아미노산 서열을 비교한 결과이다.

도 3은 본 발명에 따른 159번째 페닐알라닌의 무작위 치환 변이효소들의 기질 특이성 및 활성을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 방향족 기질에 대한 효소활성이 향상된 히단토이나제(D-hydantoinase) 변이체에 관한 것으로서, 구체적으로 바실러스 스테아로써머필러스 SD1(Bacillus stearothermophilus SD1) 유래의 야생형 히단토이나제의 활성부위를 구성하는 3개의 루프(loop)에 위치한 소수성의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써 방향족 치환기를 갖는 기질에 대하여 효소활성이 증진된 새로운 히단토이나제 변이체에 관한 것이다.

히단토이나제(D-Hydantoinase)는 광학적으로 순수한 비천연 D-아미노산을 생산하기 위해 산업적으로 이용되는 효소로서, 기질인 히단토인 유도체들의 싸이클릭 아미드 결합(cyclic amide bond)을 절단하여 N-카바모일 D-아미노산을 만든다. 상기 N-카바모일 D-아미노산 중간체는 다시 화학적 방법이나 효소적 방법에 의해 산업적으로 사용되고 있는 비천연 D-아미노산으로 전환된다.

비천연 D-아미노산은 반합성 항생제, 살충제, 감미료 또는 의약용 펩타이드 등 의약용 및 산업적으로 매우 중요한 원료 물질로서 광범위하게 사용되고 있다. 특히, 5-하이드록시페닐히단토인(5-hydroxyphenylhydantoin)과 페닐히단토인(phenylhydantoin)으로부터 히단토이나제에 의해 생산되는 D-하이드록시 페닐글리신(D-hydroxylphenylglycine)이나 D-페닐글리신(D-phenylglycine)은 반합성 항생제인 쎄파드록실(cephadroxil)과 아목시실린(amoxycillin)의 원료물질로 이용되는 산업적으로 매우 중요한 비천연 D-아미노산으로서, 그 생산량이 연간 수천톤에 이른다.

히단토이나제는 매우 다양한 히단토인 유도체들에 대해 활성을 나타내기 때 문에 어떤 기질을 사용하느냐에 따라 다양한 D-아미노산을 생산할 수 있지만, 각각의 기질에 따른 활성에는 상당한 차이를 보인다. 현재까지는 여러 가지 비천연 D-아미노산을 산업적으로 생산하기 위하여, 자연계에서 히단토이나제 활성을 갖는 미생물을 탐색하여 이로부터 얻어진 우수한 히단토이나제를 선별하여 사용하여 왔다. 따라서, 주로 자연계에 존재하는 야생형 히단토이나제를 사용하여 왔으며, 특정 기질에 대해 우수한 활성을 갖는 새로운 히단토이나제의 제조에 관한 연구는 거의 보고 되지 않았다. 다만, 최근에 미국의 아놀드(Arnold) 박사 그룹에서 아쓰로박터(Arthrobacter) 유래의 히단토이나제에 무작위로 돌연변이를 유도하여 광학적 이성질체에 대한 특이성이 바뀐 변이효소를 제조한 것이 보고된 바 있다(May, O. et al., Nat. Biotechnol., 18:317-20, 2000).

히단토이나제는 다이하이드로피리미디나제(dihydropyrimidinase), 알란토이나제(allantoinase) 및 다이하이드로오로타제(dihydroorotase)와 함께 싸이클릭-아미도하이드롤라제(cyclic amidohydrolase) 군에 속한다. 상기한 효소들은 매우 다른 기질 특이성에도 불구하고 모두 유사한 구조와 활성부위를 갖는 (β/α)₈-배럴(barrel) 구조로 이루어져 있다. 또한, 서로 다른 유래의 히단토이나제들은 기질의 치환기에 따라 상당히 다른 기질 특이성을 보이는데, 특히 최근에 보고된 대장균 유래 페닐히단토이나제는 기존의 히단토이나제와 달리 치환기가 없는 작은 기질인 히단토인에는 매우 낮은 활성을 보이는 반면, 방향족 치환기를 갖는 큰 기질에는 높은 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다(Kim, G. J. et al., J. Bacteriol., 182:7021- 8, 2000).

한편, 바실러스 스테아로써머필러스 SD1(Bacillus stearothermophilus SD1) 유래의 히단토이나제(유전자 서열: 서열번호 1; 아미노산 서열: 서열번호 2)는 다양한 기질에 대한 활성을 나타내고, 높은 열안정성과 발현의 용이성 등에 있어 장점을 가지고 있는 매우 유용한 효소임에도 불구하고, 반합성 항생제와 같은 중요 의약품의 전구체로 사용되는 5-하이드록시페닐히단토인(5-Hydroxyphenyl hydantoin)에 대하여 상대적으로 낮은 활성을 나타내는 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 히단토이나제 유사 효소들의 3차원 구조 및 아미노산 서열을 비교하여 상기 효소의 기질 특이성을 결정하는 인자를 찾아내고, 이를 바탕으로 산업적으로 중요한 방향족 기질에 대하여 높은 활성을 나타내는 바실러스 스테아로써머필러스 SD1 유래 히단토이나제의 새로운 변이효소를 제조한 결과, 야생형 히단토이나제에 비하여 방향족 기질에 대하여 높은 기질 특이성을 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 방향족 기질에 대하여 효소활성이 향상된 히단토이나제 변이체를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 히단토이나제 변이체를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 미생물 을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 히단토이나제 변이체의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 히단토이나제 변이체 및 상기 형질전환된 미생물을 이용하는 것을 특징으로 하는 D,L-히단토인 유도체로부터 D-아미노산을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 바실러스 스테아로써머필러스 SD1(Bacillus stearothermophilus SD1) 유래 히단토이나제에서 63, 65 및 159 위치의 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 방향족 기질에 대한 효소활성이 향상된 히단토이나제 변이체를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 히단토이나제 변이체는 159 위치의 페닐알라닌(Phe)이 알라닌(Ala)으로 치환된 히단토이나제 변이체(F159A), 63 위치의 메치오닌(Met)이 페닐알라닌(Phe)으로 치환되고, 65 위치의 루이신(Leu)이 발린(Val)으로 치환된 히단토이나제 변이체(M63F/L65V) 및 159 위치의 페닐알라닌(Phe)이 알라닌(Ala)으로 치환되고, 65 위치의 루이신(Leu)이 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 히단토이나제 변이체(L65F/F159A)이다.

본 발명은 또한, 상기 히단토이나제 변이체를 코딩하는 유전자, 상기 유전자 를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 숙주세포에 도입하여 수득되는 형질전환된 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 형질전환된 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 방향족 기질에 대한 효소활성이 향상된 히단토이나제 변이체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 히단토이나제 변이체를 이용하여 D,L-히단토인 유도체로부터 N-카바모일-D-아미노산을 제조하는 단계; 및 (b) 효소 또는 산을 이용하여 상기 제조된 N-카바모일-D-아미노산으로부터 D-아미노산을 제조하는 단계를 포함하는 D-아미노산의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 수득되는 전세포(whole cell) 또는 그 부분 파쇄물을 이용하여 D,L-히단토인 유도체로부터 N-카바모일-D-아미노산을 제조하는 단계; 및 (b) 효소 또는 산을 이용하여 상기 제조된 N-카바모일-D-아미노산으로부터 D-아미노산을 제조하는 단계를 포함하는 D-아미노산의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 D,L-히단토인 유도체는 5-하이드록시페닐히단토인 또는 페닐히단토인인 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

일반적으로 효소의 활성을 증진시키거나 새로운 기질에 대한 활성을 부여하기 위하여 변이형 효소를 제조하는 방법은 크게 나누어 무작위적인 변이를 일으키는 방법(random mutagenesis)과 합리적으로 설계하는 방법(rational design)으로 시도된다. 무작위적으로 변이를 일으키는 방법은 대상이 되는 효소에 대한 특별한 정보가 없이도 적용할 수 있어 광범위하게 이용되고 있지만, 매우 많은 개체의 변이효소를 조사할 수 있는 스크리닝(screening) 시스템이 갖추어져 있어야 한다. 반면, 합리적 설계에 의한 효소의 개량은 한정된 수의 변이효소만을 생성하기 때문에 특별한 스크리닝 시스템은 필요하지 않지만, 대상 효소의 촉매작용 메카니즘(catalytic mechanism)이나 기질의 결합특성 또는 기질 특이성의 결정요인 등에 대하여 상세히 알고 있어야 한다.

히단토이나제의 경우, 특성이 개량된 변이효소를 초고속으로 스크리닝할 수 있는 시스템 개발이 어려우므로 각각의 변이효소의 특성을 일일이 조사해야 한다는 측면에서 많은 시간과 노동력이 요구된다. 따라서, 본 발명자들은 바실러스 스테아로써머필러스 SD1 유래 히단토이나제의 3차원 구조를 밝힘으로써 원하는 특성을 갖는 히단토이나제를 설계할 수 있는 토대를 마련하고, 특정 기질에 대해 향상된 활성이나 새로운 기질 특이성을 갖도록 히단토이나제를 설계 및 개량하기 위하여, 여러 종류의 히단토이나제의 기질 특이성을 결정하는 주요 인자를 찾아 그 원리를 분석하였다.

히단토이나제와 같은 효소군에 속하는 다이하이드로오로타제(dihydroorotase)의 최근 밝혀진 구조를 비교해 보면, 4차 구조 및 중합체(oligomer)를 형성하는 경계 등에서 큰 차이를 보이지만, 각 단위체(monomer)의 구조는 거의 유사하다. 특히, 기질 결합부위들을 비교해 보았을 때, 금속 결합에 관여하는 4개의 히스티딘(histidine)과 1개의 아스파테이트(aspartate), 그리고 카르 복실기로 수식된 라이신(lysine)은 구조상에서도 완벽히 일치하고 있다. 반면, 기질의 결합에 관여할 것으로 생각되는 활성부위의 3개의 루프(loop)의 모양 및 조성에는 큰 차이를 보이는데, 다이하이드로오로타제의 경우, 상기 루프들이 활성부위 바깥쪽으로 열려 있고, 기질인 다이하이드로오로테이트(dihydroorotate)의 카르복실(carboxyl) 기와 수소결합을 형성하는 히스티딘, 아르기닌(arginine) 및 아스파라진(asparagine)과 같은 친수성 아미노산으로 이루어져 있으나, 히단토이나제의 루프들은 활성부위 쪽으로 훨씬 치우쳐 있으며, 주로 소수성의 큰 가지를 갖는 아미노산들로 이루어져 있다.

싸이클릭 아미도하이드로라제(cyclic amidohydrolase) 군에 속하는 다른 효소들과의 아미노산 서열비교 결과에서도 상기 루프들에서 가장 큰 차이를 보인다. 따라서, 본 발명자들은 히단토이나제의 기질 및 광학 특이성은 주로 활성부위를 구성하는 3개의 루프들의 아미노산 구성과 형태에 의해 결정되는 것으로 판단하고, 상기 루프들을 스테레오케미스트리 게이트 루프(stereochemistry gate loops, 이하 "SGLs"로 칭함)로 명명하였다.

히단토이나제는 아직 활성부위에 결합하는 것으로 알려진 저해제(inhibitor)가 없기 때문에, 활성부위의 루프에서 기질이 어떤 아미노산들과 결합하는지에 대하여 밝혀진 바가 없다. 본 발명자들은 활성부위의 어떤 아미노산들이 어떠한 방법으로 기질의 결합에 작용하는지 알아보기 위하여, 단백질과 리간드의 결합을 시뮬레이션하는 프로그램인 AutoDock 3.0 프로그램을 이용하여 산업적으로 중요한 기질인 5-하이드록시페닐히단토인과 바실러스 스테아로써머필러스 SD1 유래의 히단토이 나제가 결합된 분자모델의 구조를 얻었다. 그 결과, 기질 특이성을 결정할 것으로 추측되는 SGLs에서 소수성의 큰 곁가지(side chain)를 갖는 아미노산들이 기질의 치환기와 소수성의 기질 결합부위(hydrophobic substrate binding pocket)를 형성하고 있음을 확인하였다.

또한, 각기 다른 기질특이성을 갖는 여러 히단토이나제들의 활성부위를 이루고 있는 아미노산 서열을 비교분석한 결과, 기질의 치환기와 상호작용하는 SGLs의 아미노산 서열에는 상당한 차이를 보였는데, 이는 히단토이나제의 기질 특이성이 기질의 치환기와 상호작용하는 SGLs의 소수성 아미노산들에 의해 결정될 것이라는 것을 증명한다.

상기한 사실을 바탕으로, 각기 특징적인 기질 특이성을 가지고 있는 대장균 유래 페닐히단토이나제(phenylhydantoinase)와 바실러스 스테아로써머필러스 SD1 유래 히단토이나제의 스테레오케미스트리 게이트 루프(SGLs)를 구성하는 아미노산 서열을 비교하여, 이들의 차이가 기질 특이성에 어떠한 영향을 주는가를 알아보았다. 바실러스 유래 히단토이나제는 히단토인과 같은 작은 기질에 높은 활성을 가지고 있는 반면, 대장균 유래 페닐히단토이나제는 하이드록시페닐히단토인과 같은 방향족 기질에 대한 활성이 높다. 상기 두 효소의 SGLs 구조를 바탕으로 비교해 본 결과, 아미노산의 조성에서 상당한 차이를 보이는데, 특히 3번째 SGL에서 가장 큰 차이를 보였다. 구체적으로, 바실러스 유래 히단토이나제의 3번째 SGL은 첫 번째 SGL과 함께 잘 짜여진 소수성 포켓(pocket)을 형성하고 있고, 특히 159번째 페닐알라닌의 큰 곁가지는 기질의 치환기와 매우 가깝게 상호작용하고 있다. 반면, 대장 균 유래 페닐히단토이나제의 SGLs에는 기질의 치환기와 소수성 상호작용을 할 수 있는 아미노산이 존재하지 않으므로, 페닐히단토이나제의 활성부위는 바실러스 유래 히단토이나제에 비해 상당히 열려 있는 기질 결합부위를 형성하고 있다.

상기의 분석결과를 바탕으로 본 발명자들은 산업적으로 중요한 하이드록시페닐히단토인 또는 페닐히단토인과 같은 방향족 기질에 높은 활성을 갖는 새로운 바실러스 유래 히단토이나제를 제조하였다.

구체적으로, 바실러스 스테아로써머필러스 SD1 유래 히단토이나제의 활성부위를 구성하고 있는 3개의 SGLs에 위치한 아미노산 중 하이드록시페닐히단토인과 상호작용하는 아미노산을 분자 모델링을 통해 확인하고, 63번째 메치오닌(methionine), 65번째 루이신(luicine) 및 159번째 페닐알라닌(phenylalanin)이 주로 기질의 치환기와 작용한다는 것을 밝혔다(도 1 참조). 상기 결과에 의하여, 이들 아미노산들을 다른 아미노산으로 치환하여 하이드록시페닐히단토인에 대해 가장 높은 활성을 보이는 변이체를 제조하였다. 본 발명에 따른 변이형 히단토이나제의 제조과정은 하기와 같다.

제1단계: 변이를 일으킬 아미노산의 선정

상술한 바와 같이, 바실러스 유래 히단토이나제 및 싸이클릭 아미도하이드롤라제(cyclic amidohydrolase) 효소 군에 속하는 유사 효소들의 기질 특이성 및 특정 기질에 대한 활성은 스테레오케미스트리 게이트 루프(SGLs)의 모양 및 아미노산 구성에 의해 결정된다. 특히, 활성부위에서 기질의 치환기와 가까이 위치하여 상호 작용하고 있는 아미노산들이 활성 및 특이성에 크게 관여하고 있다. 상기 아미노산들은 대부분 히단토이나제에서 소수성의 기질 결합부위를 형성하여 기질의 치환기와 소수성적인 상호작용에 의해 기질의 결합 및 활성에 영향을 준다. 바실러스 스테아로써머필러스 SD1 유래 히단토이나제의 경우, 산업적으로 유용한 기질인 5-하이드록시페닐히단토인과의 분자 모델링을 통하여 63번째 메치오닌(Met), 65번째 루이신(Leu) 및 159번째 페닐알라닌(Phe)이 실제로 히단토이나제의 활성과 기질특이성을 결정하는 인자임을 확인하였다(도 1 참조). 따라서 본 발명에서는 상기 3 위치의 아미노산에 대해 돌연변이를 유도하여 새로운 기질 특이성을 갖는 변이효소를 제조하였다.

대부분의 히단토이나제는 그 구조가 밝혀져 있지 않으므로 아미노산 서열을 비교하여 변이를 일으킬 위치를 선정할 수 있다(도 2 참조). 아미노산 서열의 유사성이 높을 때에는 Met 63, Leu 65 및 Phe 159가 거의 일치하거나 유사한 아미노산으로 이루어져 있어 변이위치를 선정하는데 큰 어려움은 없다. 그러나 유사성이 낮은 경우 아미노산 서열에 많은 차이와 빈 간격(gap)이 생겨 비교하기가 쉽지 않다. 이 경우 모든 히단토이나제 및 싸이클릭 아미도하이드롤라제(cyclic amidohydrolase)에서 보존되어 있는 메탈이온의 결합 및 촉매 작용에 관여하는 아미노산들을 기준으로 삼는다.

제2단계: 특정 위치의 아미노산에 대한 변이 유발

원하는 기질에 대한 높은 활성이나 기질 특이성을 갖는 히단토이나제를 제조 하기 위하여, 상기 제1단계에서 선별한 위치에 특이적으로 아미노산 변이를 유발시켜야 한다. 그 방법은 주어진 정보에 따라 선택적으로 사용한다.

먼저 제1단계에서 찾은 바실러스 스테아로써머필러스 SD1 유래 히단토이나제의 63번째 메치오닌(Met), 65번째 루이신(Leu) 및 159번째 페닐알라닌의 무작위 변이(random mutagenesis)를 유도한다. 이때 원하는 특성을 가진 변이효소를 선별하는 방법에 따라 하나의 위치에서 각각 무작위로 변이를 유발시키거나 2개 이상의 위치에서 동시에 무작위로 변이를 일으킨다. 또한, 위의 3개 아미노산에 대해 위치-특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis) 방법을 이용하여 특정 아미노산으로 변이를 유발시킨다.

제3단계: 개량된 변이효소의 선별 및 2차 개량

상기 제2단계에서 만들어진 여러 변이효소의 집단에서 원하는 특성을 가진 변이효소를 선별한다. 변이집단이 크지 않을 경우, 활성을 하나씩 측정하여 개량된 변이효소를 선별할 수 있다. 변이집단이 클 경우, 변이효소를 함유한 콜로니(colony)들을 LB 플레이트에서 성장시킨 후, 활성측정 플레이트(activity screening plate)로 옮겨 효소의 작용에 따라 변하는 pH를 인지하는 pH 지시약의 변화 정도를 감지하여 기질특이성이나 활성이 높은 변이효소를 선별한다 (Kim G.J. et al., Biotechnol. Tech., 11:511-3, 1997). 상기한 방법으로 선별된 변이효소들은 염기서열 분석으로 어떤 위치에서 어떤 아미노산으로 치환이 일어났는지를 확인한다. 이를 바탕으로 특이적으로 변이시킬 위치와 무작위로 변이시킬 위치 및 아미 노산의 종류를 결정하고 다시 변이효소 집단을 생성시켜 원하는 특성을 가진 우수한 변이효소를 같은 방법으로 선별한다.

본 발명자들은 상기한 단계에 따른 방법으로 제조된 히단토이나제 변이체 중, 159 위치의 페닐알라닌이 알라닌으로 치환된 F159A, 63 위치의 메치오닌 및 65 위치의 루이신이 각각 페닐알라닌 및 발린으로 치환된 M63F/L65V 및 상기 3가지 아미노산이 서로 복합적으로 치환된 L65F/F159A를 선별하고, 상기 변이체가 야생형 히단토이나제에 비해 산업적으로 유용한 기질인 하이드록시페닐히단토인에 대하여 높은 활성을 보임을 확인하였다.

효소를 이용하여 광학적으로 순수한 D-아미노산을 산업적으로 제조하는 방법은 주로 5' 위치에 치환기를 가진 히단토인 유도체를 기질로 하여 D-form 이성질체의 기질에 대해 특이성을 갖는 히단토이나제를 이용하여 N-카바모일-D-아미노산을 만든다. 다음으로 N-카바모일-D-아미노산을 N-카바모이라제(N-carbamyolase) 라는 효소 또는 질산을 이용하여 최종산물인 D-아미노산으로 전환한다. 따라서, 산업적으로 중요한 비천연 D-아미노산을 경제적으로 생산하기 위해서는 특정 기질에 대해 높은 특이성을 나타내는 히단토이나제의 확보가 매우 중요하다.

본 발명의 D-아미노산의 제조방법은 높은 열안정성을 나타내며, 대장균에서 쉽게 과발현될 뿐만 아니라, 산업적으로 중요한 방향족 기질인 5-하이드록시페닐히단토인(5-hydroxyphenylhydantoin)이나 페닐히단토인(phenylhydantoin)에 대하여 매우 향상된 활성을 보이는 변이형 히단토이나제를 이용하므로, 산업적으로 중요한 비천연 D-아미노산들의 생산성을 크게 향상시켜 생산 비용을 크게 줄이는 데 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 159번 아미노산 치환에 의한 변이형 히단토이나제의 제조

<1-1> 히단토이나제 변이체 F159A의 제조 및 기질 특이성

본 발명자들은 바실러스 스테아로써머필러스 SD1 유래의 야생형 히단토이나제의 3차원 구조를 바탕으로 대장균 유래의 페닐히단토이나제의 스테레오케미스트리 게이트 루프(SGLs)를 비교하여, 아미노산의 조성에 상당한 차이가 있음을 확인하고, 바실러스 스테아로써머필러스 SD1 유래 야생형 히단토이나제의 3번째 SGL에 위치한 159번의 페닐알라닌을 특정 프라이머를 이용한 위치-특이적 변이유발(site-specific mutagenesis) 방법으로 작은 곁가지(side chain)를 갖는 알라닌(Ala)으로 치환하였다.

구체적으로, 제한효소 EcoRI의 절단부위를 가진 N-말단 프라이머(서열번호 3)와 변이유발 프라이머(mutagenic primer; 서열번호 4)를 이용한 PCR 방법으로 D- 히단토이나제 유전자의 앞쪽에 해당하는 DNA를 증폭하였고, 제한효소 PstI의 절단부위를 가진 C-말단 프라이머(서열번호 5)와 서열번호 6의 변이유발 프라이머를 이용한 PCR 방법으로 뒤쪽에 해당하는 DNA를 증폭하였다.

서열번호 3: 5'-cccggcgaattcatgacaaaaattataaaaaat-3'

서열번호 4: 5'-tacgtttttatacgccataaa-3'

서열번호 5: 5'-gggccgctgcagttaaatggttaattcctcgct-3'

서열번호 6: 5'-tttatggcgtataaaaacgtagctcaggcagatgatgga-3'

상기 증폭된 두 DNA 조각과 제한효소 EcoRI의 절단부위를 가진 N-말단 프라이머(서열번호 3), 제한효소 PstI의 절단부위를 가진 C-말단 프라이머(서열번호 5)를 이용한 중첩(overlapping) PCR 방법으로 변이가 일어난 유전자를 수득하였다. 이 변이효소의 유전자를 제한효소 EcoRI과 PstI으로 자르고 같은 방법으로 절단한 벡터 pMAL-c2x(New England Biolabs, MA, USA)에 클로닝(cloning)하였다. 이를 발현 균주인 대장균 JM109에 형질전환시켜 변이주를 얻은 다음, 변이유전자의 염기서열을 분석하여 변이가 제대로 일어났음을 확인하였다.

변이효소를 정제하기 위하여 MBP가 붙어있는 형태로 amylose resin에 결합(binding)시켜 정제하였고, Factor Xa로 자른 후 Resource Q column으로 MBP를 제거하였다. 정제된 변이효소를 이용하여 5-하이드록시페닐히단토인에 대한 활성을 확인하였다. 활성을 측정하는 방법은 0.2~100μg 변이효소, 0.5mM MnCl₂, 10mM 5-하이드록시페닐히단토인를 포함한 100mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 1㎖를 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 12% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid) 0.5㎖를 넣고, 생성된 N-카바모일-D-하이드록시페닐알라닌(N-carbamoyl-D-hydroxyphenyl alanine)을 HPLC로 분석하였다. 그 결과, 변이효소인 히단토이나제 F159A는 5-하이드록시페닐히단토인에 대한 활성이 6배 이상 크게 증가함을 확인하였다.

<1-2> 159 위치 아미노산의 무작위 변이형 히단토이나제의 제조 및 기질 특이성

바실러스 유래 히단토이나제의 159 위치 페닐알라닌을 무작위로 다른 아미노산으로 치환시켜 5-하이드록시페닐히단토인에 대한 특이성이 개량된 변이효소를 역가 활성 플레이트(activity stating plate)에서 선별하였다. 무작위 변이체의 제조는 서열번호 4와 6 대신에 각각 서열번호 4와 7의 프라이머를 이용하여 상기 <1-1>에서 설명한 overlapping PCR 방법을 사용하였고, 역시 같은 방법으로, 제한효소 EcoRI과 PstI을 사용하여 pMAL-c2x에 클로닝(cloning)한 다음, 대장균 JM109에 형질전환하였다.

서열번호 7: 5'-tttatggcgtataaaaacgtannscaggcagatgat-3'

이 무작위 변이효소를 포함하는 변이주들을 0.2% 5-하이드록시페닐히단토인과 0.01% 페놀 레드(phenol red)를 함유한 1.5% 아가 플레이트에서 활성을 비교하였다. 변이주에 의하여 5-하이드록시페닐히단토인이 분해되어 N-카바모일-D-하이드록시페닐알라닌이 생성되면 pH 조성이 변하여 붉은색에서 노란색으로 변색된다. 변색정도가 큰 변이주들을 선별하여 상기 <1-1>에서 설명한 활성 측정방법으로 다시 정확하게 5-하이드록시페닐히단토인에 대한 활성을 분석하였다.

선별된 변이효소들의 염기서열을 분석한 결과, 159번째 페닐알라닌이 루이신(Leu), 이소루이신(Ile), 발린(Val), 알라닌(Ala) 및 세린(Ser)과 같이 주로 작고 소수성의 아미노산들로 치환되어 있음을 확인하였으며, 상기 변이효소들의 활성을 측정한 결과, 작은 곁가지 사슬(side chain)을 가진 변이효소 일수록 큰 치환기를 가진 기질인 5-하이드록시페닐히단토인과 페닐히단토인에 대해 높은 역가와 친화성(affinity)을 보였다 (도 3 및 표 1).

변이형 히단토이나제의 기질 특이성 및 효소활성

	히단토인(Hyd)			하이드록시페닐히단토인(HPH)			(k_cat/K_M)_HPH/₍k_cat/K_M)_Hyd
	k_cat(/s)	K_M(/mM)	k_cat/K_M	k_cat(/s)	K_M(/mM)	k_cat/K_M
야생형	440	98	4.5	18	5.4	3.3	0.74
F159L	280	89	3.2	11	2.2	5.0	1.6
F159I	270	190	1.4	46	3.5	13	9.3
F159V	97	160	0.61	50	3.6	14	23
F159A	45	450	0.10	110	7.4	15	150
F159S	21	400	0.053	280	27	10	190
M63F/L65V	42	260	0.16	180	24	7.5	47
L65F/F159A	48	470	0.10	200	13	15	150

실시예 2: 무작위 변이형 히단토이나제 M63F/L65V의 제조 및 기질 특이성

기질 결합부위를 형성하면서 기질의 치환기와 가까이 상호작용하고 있는 63번째 아미노산인 메치오닌(Met)과 65번째 아미노산인 루이신(Leu)을, 서열번호 4와 6 대신에 각각 서열번호 8과 9의 프라이머를 사용하는 것 이외에는 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로, 다른 모든 아미노산으로 치환하여 변이효소 집단을 만들 고, 5-하이드록시페닐히단토인에 대하여 높은 활성을 갖는 변이효소를 상기 실시예 <1-2>에서와 같이 활성측정 플레이트에서 선별하였다.

서열번호 8: 5'-atctaaatgcgtgtg-3'

서열번호 9: 5'-cacacgcatttagatnnsccgnnsggcggcacggtg-3'

그 결과, 63번째 메치오닌(Met)이 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 변이효소 M63F와 여기에 추가적으로 65번째 루이신(Leu)이 발린(Val)으로 바뀐 변이효소 M63F/L65V를 선별할 수 있었다. 상기 제조된 변이효소 M63F/L65V는 야생 효소에 비해 5-하이드록시페닐히단토인에 대한 활성(Kcat)이 10배 증가한 높은 활성을 보였다.

실시예 3: 변이형 히단토이나제 F159A의 무작위 변이형 L65F/F159A의 제조 및 기질특이성

실시예 2에서 야생형 히단토이나제를 기반으로 변이형을 만든 것과는 달리, 본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 변이형 히단토이나제 F159A를 기반으로 실시예 2에서와 같은 방법으로 63번째 메치오닌 및 65번째 루이신에 무작위 돌연변이를 유도한 후, 5-하이드록시페닐히단토인에 높은 기질 특이성을 보이는 변이효소를 활성측정 플레이트에서 선별하였다.

최종적으로 선별된 변이효소의 염기서열을 분석한 결과, 65번째 루이신이 페닐알라닌으로 치환된 새로운 변이형 히단토이나제 L65F/F159A는 상기 <실시예 1>의 변이형 히단토이나제 F159A에 비하여 5-하이드록시페닐히단토인에 대한 Kcat 값이 2배 정도 증가하였고, 야생종에 비해서는 Kcat 값이 10배 이상 증가하였다.

결론적으로, 본 발명에서 선별된 변이형 히단토이나제 F159A, M63F/L65V 및 L65F/F159A는 방향족 기질인 하이드록시페닐히단토인에 대해 야생형 히단토이나제보다 최대 150배 이상 향상된 기질특이성을 갖는 것으로 나타나 산업적으로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 방향족 기질에 대한 활성이 향상된 변이형 히단토이나제를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 히단토이나제 변이체는 높은 열안정성을 나타내고, 대장균에서 쉽게 과발현될 뿐만 아니라, 산업적으로 중요한 방향족 기질인 5-하이드록시페닐히단토인이나 페닐히단토인에 대하여 매우 향상된 활성을 가지므로, 산업적으로 중요한 비천연 D-아미노산들의 생산성을 크게 향상시키는데 유용하다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 바실러스 스테아로써머필러스 SD1(Bacillus stearothermophilus SD1) 유래 히단토이나제에서 63, 65 및 159 위치의 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 방향족 기질에 대한 효소활성이 향상된 히단토이나제 변이체.
제1항에 있어서, 159 위치의 페닐알라닌(Phe)이 알라닌(Ala)으로 치환된 히단토이나제 변이체(F159A).
제1항에 있어서, 63 위치의 메치오닌(Met)이 페닐알라닌(Phe)으로 치환되고, 65 위치의 루이신(Leu)이 발린(Val)으로 치환된 히단토이나제 변이체(M63F/L65V).
제1항에 있어서, 159 위치의 페닐알라닌(Phe)이 알라닌(Ala)으로 치환되고, 65 위치의 루이신(Leu)이 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 히단토이나제 변이체(L65F/F159A).
제2항의 히단토이나제 변이체(F159A)를 코딩하는 유전자.
제5항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
제6항의 재조합 벡터를 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 숙주세포에 도입하여 수득되는 형질전환된 미생물.
제7항에 있어서, 형질전환된 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 미생물.
제3항의 히단토이나제 변이체(M63F/L65V)를 코딩하는 유전자.
제9항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
제10항의 재조합 벡터를 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 숙주세포에 도입하여 수득되는 형질전환된 미생물.
제11항에 있어서, 형질전환된 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 미생물.
제4항의 히단토이나제 변이체(L65F/F159A)를 코딩하는 유전자.
제13항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
제14항의 재조합 벡터를 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 숙주세포에 도입하여 수득되는 형질전환된 미생물
제15항에 있어서, 형질전환된 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 미생물.
제7항, 제11항 또는 제15항의 형질전환된 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 방향족 기질에 대한 효소활성이 향상된 히단토이나제 변이체의 제조방법.
다음의 단계를 포함하는 D-아미노산의 제조방법:

(a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 히단토이나제 변이체를 이용하여 D,L-히단토인 유도체로부터 N-카바모일-D-아미노산을 제조하는 단계; 및

(b) 효소 또는 산을 이용하여 상기 제조된 N-카바모일-D-아미노산으로부터 D-아미노산을 제조하는 단계.
제18항에 있어서, D,L-히단토인 유도체는 5-하이드록시페닐히단토인 또는 페닐히단토인인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 효소는 N-카바모일라제인 것을 특징으로 하는 방법.
다음의 단계를 포함하는 D-아미노산의 제조방법:

(a) 제7항, 제11항 또는 제15항의 형질전환된 미생물을 배양하여 수득되는 전세포(whole cell) 또는 그 부분 파쇄물을 이용하여 D,L-히단토인 유도체로부터 N-카바모일-D-아미노산을 제조하는 단계; 및

(b) 효소 또는 산을 이용하여 상기 제조된 N-카바모일-D-아미노산으로부터 D-아미노산을 제조하는 단계.
제21항에 있어서, D,L-히단토인 유도체는 5-하이드록시페닐히단토인 또는 페닐히단토인인 것을 특징으로 하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 효소는 N-카바모일라제인 것을 특징으로 하는 방법.