CN106795511A - 氧化酶、编码该酶的多核苷酸、以及它们的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了：编码SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列的多核苷酸，具有SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列的蛋白质，包含使本发明蛋白质与α‑羟基羧酸化合物作用的步骤的α‑氧代羧酸化合物的制备方法，以及包含使本发明蛋白质与α‑羟基羧酸化合物作用获得对应的α‑氧代羧酸化合物的步骤（1）、以及使具有将α‑氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L‑α‑氨基酸化合物的能力的蛋白质与步骤（1）中得到的α‑氧代羧酸化合物作用得到对应的L‑α‑氨基酸化合物的步骤的L‑α‑氨基酸化合物的制备方法等。

Description

氧化酶、编码该酶的多核苷酸、以及它们的应用
技术领域
本发明涉及氧化酶、编码该氧化酶的多核苷酸、以及利用它们的α-氨基酸化合物等的制备方法。
背景技术
以往，作为α-氨基酸化合物之一的甲硫氨酸用作动物用饲料添加剂。在制备该化合物时，使丙烯醛和甲硫醇反应生成3-甲硫基丙醛，再使3-甲硫基丙醛与氢氰酸、氨和二氧化碳反应生成5-（2-甲基-巯基乙基）-乙内酰脲（甲硫氨酸乙内酰脲）。最后，将5-（2-甲基-巯基乙基）-乙内酰脲通过碱水解生成碱金属甲硫氨酸盐，随后通过用酸例如硫酸或碳酸中和使甲硫氨酸游离（例如，参见专利文献1等）。
现有技术文献
专利文献
专利文献1 : 特开昭55-102557号公报。
发明内容
发明要解决的课题
上述制备方法使用氢氰酸和丙烯醛作为C1或C3构成要素，但这些原料化合物的处理需要充分的管理和与其相适合的设备等。因此，期望开发例如甲硫氨酸等α-氨基酸化合物的新的制备方法。
解决课题的手段
本发明提供下列：
第1项．编码下述（A1）至（A4）中的任一氨基酸序列的多核苷酸（下文也称为本发明多核苷酸(A)）：
（A1）SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列、
（A2）i）与SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列具有45％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、
（A3）i）与由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（A4）i）在SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列；
第2项．前述第1项记载的多核苷酸，其具有SEQ ID NO:2、4、6、15、16或17中的任一所示的核苷酸序列；
第3项．在宿主细胞内可发挥功能的启动子与前述第1或2项记载的多核苷酸以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；
第4项．含有前述第1至3项中任一项记载的多核苷酸的重组载体（下文也称为本发明重组载体）；
第5项．前述第4项记载的重组载体，进一步包含编码具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列的多核苷酸、或该多核苷酸与在宿主细胞内可发挥功能的启动子以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；
第6项．前述第5项记载的重组载体，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列是下述（B1）至（B3）中任一氨基酸序列：
（B1）SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列、
（B2）i）与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化转换成对应的L-甲硫氨酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（B3）i）在SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化转换成对应的L-甲硫氨酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列；
第7项．将前述第1至3项中任一项记载的多核苷酸或前述第4项记载的重组载体导入宿主细胞而成的转化体；
第8项．前述第7项记载的转化体，其中宿主细胞是微生物或大肠杆菌；
第9项．将前述第5或6项记载的重组载体导入宿主细胞而成的转化体；
第10项．前述第9项记载的转化体，其中宿主细胞是微生物或大肠杆菌；
第11项．拥有前述第1至3项中任一项记载的多核苷酸的转化体；
第12项．转化体，其拥有：
i）具有编码具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，或该多核苷酸与在宿主细胞内可发挥功能的启动子以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；和
ii）前述第1至3项中任一项记载的多核苷酸；
第13项．重组载体的制备方法，其包含在可在宿主细胞内复制的载体中整合前述第1至3项中任一项记载的多核苷酸的步骤；
第14项．转化体的制备方法，其包含将前述第1至3项中任一项记载的多核苷酸或前述第4至6项中任一项记载的重组载体导入宿主细胞的步骤；
第15项．具有下述（A1）至（A4）中的任一氨基酸序列的蛋白质（下文也称为本发明蛋白质(A)）：
（A1）SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列、
（A2）i）与SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列具有45％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、
（A3）i）与由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（A4）i）在SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列；
第16项．α-氧代羧酸化合物的制备方法（下文也称为本发明制备方法1），其包含使具有下述（A1）至（A4）中的任一氨基酸序列的蛋白质与α-羟基羧酸化合物作用的步骤：
（A1）SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列、
（A2）i）与SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列具有45％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、
（A3）i）与由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（A4）i）在SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列；
第17项．前述第16项记载的制备方法，其中α-羟基羧酸化合物是含硫α-羟基羧酸化合物，对应的α-氧代羧酸化合物是含硫α-氧代羧酸化合物；
第18项．前述第17项记载的制备方法，其中：
含硫α-羟基羧酸化合物是式（1）所示化合物：
式中，R1表示氢或任选取代的碳原子数为1-8的烷基；
含硫α-氧代羧酸化合物是式（2）所示化合物：
式中，R1表示与前述相同的含义；
第19项．前述第16至18项中任一项记载的制备方法，其中具有前述（A1）至（A4）中任一氨基酸序列的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系；
第20项．前述第19项记载的制备方法，其中前述转化体是前述第7、8或11项中任一项记载的转化体；
第21项．前述第16至20项中任一项记载的制备方法，其中前述步骤在具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的存在下进行；
第22项．前述第21项记载的制备方法，其中具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质是过氧化氢酶；
第23项．前述第21或22项记载的制备方法，其中具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系；
第24项．L-α-氨基酸化合物的制备方法（下文也称为本发明制备方法2），其包含：
（1）使具有下述（A1）至（A4）中任一氨基酸序列的蛋白质与α-羟基羧酸化合物作用，得到对应的α-氧代羧酸化合物的步骤：
（A1）SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列、
（A2）i）与SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列具有45％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、
（A3）i）与由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（A4）i）在SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列；
和
（2）使具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质与步骤（1）中得到的α-氧代羧酸化合物作用，得到对应的L-α-氨基酸化合物的步骤；
第25项．前述第24项记载的制备方法，其中α-羟基羧酸化合物是含硫α-羟基羧酸化合物，对应的α-氧代羧酸化合物是含硫α-氧代羧酸化合物，对应的L-α-氨基酸化合物是含硫L-α-氨基酸化合物；
第26项．前述第25项记载的制备方法，其中：
含硫α-羟基羧酸化合物是式（1）所示化合物：
式中，R1表示氢或任选取代的碳原子数为1-8的烷基；
含硫α-氧代羧酸化合物是式（2）所示化合物：
式中，R1表示与前述相同的含义；
含硫L-α-氨基酸化合物是式（3）所示化合物：
式中，R1表示与前述相同的含义；
第27项．前述第24至26项中任一项记载的制备方法，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质是亮氨酸脱氢酶；
第28项．前述第27项记载的制备方法，其中亮氨酸脱氢酶是来自球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）的亮氨酸脱氢酶；
第29项．前述第24至27项中任一项记载的制备方法，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列是下述（B1）至（B3）中任一氨基酸序列：
（B1）SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列、
（B2）i）与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化转换成对应的L-甲硫氨酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（B3）i）在SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化转换成对应的L-甲硫氨酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列；
第30项．前述第24至29项中任一项记载的制备方法，其中具有前述（A1）至（A4）中任一氨基酸序列的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系；
第31项．前述第30项记载的制备方法，其中前述转化体是前述第7至12项中任一项记载的转化体；
第32项．前述第24至31项中任一项记载的制备方法，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系；
第33项．前述第32项记载的制备方法，其中前述转化体是前述第9、10或12项中任一项记载的转化体；
第34项．前述第24至33项中任一项记载的制备方法，其中步骤（1）在具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的存在下进行；
第35项．前述第34项记载的制备方法，其中具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质是过氧化氢酶；
第36项．前述第34或35项记载的制备方法，其中具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系；
第37项．前述第24至36项中任一项记载的制备方法，其中步骤（2）在具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成还原型的能力的蛋白质的存在下进行；
第38项．前述第37项记载的制备方法，其中具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成还原型的能力的蛋白质是甲酸脱氢酶；
第39项．前述第37或38项记载的制备方法，其中具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成还原型的能力的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系；以及
第40项．前述第24至39项中任一项记载的制备方法，其中步骤（1）和步骤（2）在一个反应体系中进行；
等等。
发明效果
根据本发明，可以提供氧化酶、编码该氧化酶的多核苷酸、以及利用它们的甲硫氨酸等α-氨基酸化合物的制备方法等。
具体实施方式
为了在宿主细胞中表达目标多核苷酸，例如，制备在宿主细胞内可发挥功能的启动子和前述多核苷酸以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸，将其导入宿主细胞。
本文中，“以可发挥功能的形式连接而成”意指通过将目标多核苷酸导入宿主细胞来转化宿主细胞时，该多核苷酸处于以在启动子的控制下表达的方式与启动子结合的状态。
作为在微生物中可发挥功能的启动子，可举出：大肠杆菌乳糖操纵子的启动子、大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子、T7噬菌体的启动子、或者tac启动子、trc启动子或T7lac启动子等在大肠杆菌内可发挥功能的合成启动子等。
通过将目标多核苷酸、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和前述多核苷酸以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸整合到载体，可以制备重组载体。作为所使用的载体，可举出例如：包含能够在宿主细胞中复制的遗传信息，可以自主增殖，能够从宿主细胞分离、纯化，编码可检测标记的载体。作为可在宿主细胞为大肠杆菌时利用的载体，可举出：pUC119（Takara Bio Inc.制）、pTV118N（Takara Bio Inc.制）、pBluescriptII （东洋纺公司制）、pCR2.1-TOPO（Invitrogen公司制）、pTrc99A（GE Healthcare 公司制）、pKK223-3（GEHealthcare 公司制）、pET-22b（Novagen公司制）、pET-15b（Novagen公司制）等。作为载体，若使用包含选择标记基因（例如，卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因等赋予抗生素抗性的基因等）的载体，则可以将该选择标记基因的表型等作为指标选择导入了该载体的转化体。
本发明中所使用的转化体可以通过将目标多核苷酸、在宿主细胞内可发挥功能的启动子和前述多核苷酸以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸、或含有这些多核苷酸的重组载体导入宿主细胞来制备。
作为宿主细胞，可举出例如：属于埃希氏菌（Escherichia）属、芽孢杆菌（Bacillus）属、棒状杆菌（Corynebacterium）属、葡萄球菌（Staphylococcus）属、链霉菌（Streptomyces）属、酵母菌（Saccharomyces）属、克鲁维酵母菌（Kluyveromyces）属、毕赤酵母（Pichia）属、红球菌（Rhodococcus）属和曲霉菌（Aspergillus）属的微生物等。
作为将多核苷酸或重组载体导入宿主细胞的方法，可对应于所用宿主细胞适用通常所使用的导入方法，可举出例如：“Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ndedition”（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、“Current Protocols inMolecular Biology”(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等中记载的氯化钙法、“Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System” Bio-Rad Laboratories, (1993)等中记载的电穿孔法等。
导入了目标多核苷酸或重组载体等的转化体例如可以以如上所述载体中所含的选择标记基因的表型作为指标来挑选。
例如，基于“Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition”（1989）,Cold Spring Harbor Laboratory Press等中记载的通常的方法，通过进行限制性酶切位点的确认、核苷酸序列的解析、DNA印迹杂交（Southern hybridization）、蛋白质印迹杂交（Western hybridization）等，可以确认所得转化体拥有目标多核苷酸。
作为用于培养本发明中使用的转化体的培养基，可以使用例如：适宜含有微生物等宿主细胞的培养中所通常使用的碳源、氮源、有机盐、无机盐等的各种培养基。
作为碳源，可举出例如：葡萄糖、糊精、蔗糖等糖类，甘油等糖醇，富马酸、柠檬酸、丙酮酸等有机酸，动物油、植物油和糖蜜。这些碳源在培养基中的添加量相对于培养液通常为0.1至30%（w/v）左右。
作为氮源，可举出例如：肉提取物、蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、大豆粉、玉米浆（Corn Steep Liquor）、棉籽粉、干燥酵母、酪蛋白氨基酸等天然有机氮源，氨基酸类、硝酸钠等无机酸的钠盐，氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等无机酸的铵盐，富马酸铵、柠檬酸铵等有机酸的铵盐以及尿素。它们之中，有机酸的铵盐、天然有机氮源、氨基酸类等在许多情形中也可作为碳源使用。这些氮源在培养基中的添加量相对于培养液通常为0.1至30%（w/v）左右。
作为有机盐、无机盐，可举出例如：钾、钠、镁、铁、锰、钴、锌等的氯化物、硫酸盐、乙酸盐、碳酸盐和磷酸盐。具体可举出例如：氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钴、硫酸锌、硫酸铜、乙酸钠、碳酸钙、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。这些有机盐和/或无机盐在培养基中的添加量相对于培养液通常为0.0001至5%（w/v）左右。
在导入tac启动子、trc启动子、T7lac启动子和lac启动子等由异乳糖诱导的类型的启动子和编码目标蛋白质的多核苷酸以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸所得的转化体的情形中，还可以向培养基中少量添加例如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）作为用于诱导目标蛋白质产生的诱导剂。在整合了受lacUV5启动子支配的T7 RNA聚合酶基因的噬菌体DE3的溶原菌（λDE3 lysogen）中，导入T7噬菌体启动子和编码目标蛋白质的多核苷酸以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸，并培养所得转化体的情形中，也可以在培养基中少量添加IPTG作为用于诱导目标蛋白质产生的诱导剂。
转化体的培养可以基于微生物等宿主细胞的培养所通常使用的方法来进行，可举出例如：试管振荡式培养、往复式振荡培养、小型发酵罐（Jar Fermenter）培养、罐（tank）培养等液体培养和固体培养。
培养温度可以在该转化体能够生长的范围适宜改变，通常为约15℃至约40℃。培养基的pH优选为约6至约8的范围。培养时间根据培养条件而不同，但通常优选为约1天至约5天。
作为从拥有编码目标蛋白质的多核苷酸并产生该目标蛋白质的转化体，例如，将编码目标蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体的培养物纯化目标蛋白质的方法，可以适用蛋白质纯化中所使用的通常的方法，例如，可举出如下所述的方法。
通过离心分离等从转化体的培养物收集细胞后，将其通过超声处理、DYNO MILL处理、弗氏压碎器处理等物理破碎法、或者使用表面活性剂或溶菌酶(lysozyme)等溶菌酶的化学破碎法等进行破碎。通过离心分离、膜滤器过滤等从所得破碎液除去杂质，由此制备无细胞提取液，将其通过适宜使用阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤色谱、金属螯合色谱、亲和色谱等分离纯化方法进行分级，可以纯化目标蛋白质。
作为色谱中所使用的载体，可举出例如：导入了羧甲基（CM）基团、二乙基氨基乙基（DEAE）基团、苯基或丁基的纤维素、糊精或琼脂糖等不溶性高分子载体。也可以使用市售的载体预填充柱，作为该市售的载体预填充柱，可举出例如：Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名，均为GE Healthcare公司制）、TSK-gel G3000SW（商品名，Tosoh公司制）等。
在目标蛋白质是在其氨基酸末端或羧基末端区域添加了连续数个残基的组氨酸的蛋白质时，可以使用金属螯合亲和柱来纯化该蛋白质。在目标蛋白质是以与谷胱甘肽S-转移酶融合的蛋白质的形式产生时，可以使用谷胱甘肽S-转移酶单克隆抗体柱对其进行纯化。
作为本发明中所使用的“转化体的处理物”，可举出例如：冻干转化体、有机溶剂处理转化体、干燥转化体、转化体磨碎物、转化体的自溶物、转化体的超声处理物、转化体提取物、转化体的碱处理物。作为转化体提取物，可举出无细胞提取液、由转化体制备的的粗纯化蛋白质或纯化蛋白质、以及它们的固定化物。作为得到固定化物的方法，可举出例如：载体结合法（使目标蛋白质等吸附于硅胶、陶瓷等无机载体、纤维素、或离子交换树脂等的方法）和包含法（将目标蛋白质等拘束于聚丙烯酰胺、含硫多糖凝胶（例如角叉菜胶凝胶）、海藻酸凝胶、或琼脂凝胶等高分子的网孔结构之中的方法）。
若考虑使用了转化体的工业生产，则相较于使用存活转化体，使用杀死该转化体得到的处理物在制造设备限制少的方面是优选的。作为转化体的杀死处理方法，可举出例如：物理杀菌法（加热、干燥、冷冻、光线、超声、过滤、通电），使用化学药品的杀菌法（碱、酸、卤素、氧化剂、硫、硼、砷、金属、醇、酚、胺、硫化物、醚、醛、酮、氰(シアン)和抗生素）。通常，这些杀菌法之中，理想的是选择尽量不使目标蛋白质的酶活性失活、并且在反应体系中的残留、污染等影响少的处理方法。
本发明多核苷酸(A)编码下述（A1）至（A4）中任一氨基酸序列：
（A1）SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列、
（A2）i）与SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列具有45％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、
（A3）i）与由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（A4）i）在SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列。
本发明蛋白质(A)具有下述（A1）至（A4）中任一氨基酸序列：
（A1）SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列、
（A2）i）与SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列具有45％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、
（A3）i）与由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（A4）i）在SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列。
在本发明多核苷酸(A)编码的氨基酸序列或本发明蛋白质(A)的氨基酸序列中，与SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列之间可观察到的区别是一部分氨基酸的缺失、置换或添加等（以下，有时统称为氨基酸的改变）。前述“添加”不仅包括氨基酸在序列端部的添加，而且还包括氨基酸在序列中的插入。作为该氨基酸的改变，可举出例如：(a)具有SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列的蛋白质在细胞内受到的加工所致的缺失、(b)前述蛋白质由于来源生物的种类差异、个体差异等而天然产生的基因突变所造成的氨基酸的缺失、置换或添加、或者(c)由于人工导入的基因突变等而产生的氨基酸的缺失、置换或添加。
对于改变氨基酸的数目，只要是具有产生了改变的上述氨基酸序列的蛋白质可以发挥将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的范围内的数目即可。作为本发明多核苷酸(A)编码的氨基酸序列的（A4）或本发明蛋白质(A)的氨基酸序列的（A4）中的“多个氨基酸”，可举出例如：2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸。
作为氨基酸的置换，可举出例如：保守性置换为疏水性、电荷、pK、立体结构上的特征等类似的氨基酸。作为这样的置换，具体可举出例如：(1)甘氨酸、丙氨酸；(2)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；(3)天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、(4)丝氨酸、苏氨酸；(5)赖氨酸、精氨酸；(6)苯丙氨酸、酪氨酸等组内的置换。
作为氨基酸的添加，可举出例如：在氨基酸序列的氨基末端或羧基末端的、包含连续6个残基左右的组氨酸的约20个残基的氨基酸的添加。
作为人工进行氨基酸的改变的手法，可举出例如：对编码SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列的多核苷酸实施位点特异性突变导入，然后通过常规方法使该多核苷酸表达的手法。作为位点特异性突变导入方法，可举出例如：Olfert Landt 等人（Gene96 125-128 1990）、Smith等人（Genetic Engineering 3 1 Setlow，J.and Hollaender，APlenum：New York）、Vlasuk等人（Experimental Manipulation of Gene Expression，Inouye，M.：Academic Press，New York）、Hos.N.Hunt等人（Gene 77 51 1989）等的方法、利用Mutan-Express Km（Takara Bio Inc.制）、TaKaRa La PCR in vitro Mutagenesis Kit（Takara Bio Inc.制）、QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE公司制）等市售试剂盒的方法。
作为人工进行氨基酸的改变的手法，还可举出例如：对编码SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列的多核苷酸实施随机突变导入，然后通过常规方法使该多核苷酸表达的手法。本文中，作为随机导入突变的手法，可举出例如，以编码上述氨基酸序列中任一的多核苷酸为模板，使用能够扩增各多核苷酸的全长这样的引物对，在令用于底物的dATP、dTTP、dGTP、dCTP的各自添加浓度与通常发生了改变的反应条件下、或者在使促进聚合酶反应的Mg2＋的浓度较通常增加的反应条件下进行PCR的方法等。作为这样的PCR的手法，可举出例如：Method in Molecular Biology, (31), 1994, 97-112中记载的方法。
“序列同一性”是指2个氨基酸序列或核苷酸序列间的同一性。前述“序列同一性”是通过对比较对象的序列整个区域以最适状态比对的2个序列进行比较来决定。本文中，比较对象的氨基酸序列或核苷酸序列的最适比对中，可以允许添加或缺失（例如空位等）。这样的序列同一性可以使用，例如，UWGCG Package提供的BESTFIT程序（Devereux et al（1984）Nucleic Acids Research 12， p387-395）、PILEUP、BLAST算法（Altschul S.F.（1993）J Mol Evol 36：290-300； Altschul S.F.（1990）J Mol Biol 215：403-10）等序列分析用工具而算出。序列同一性也可以使用市售的序列解析软件求出。
作为本发明多核苷酸(A)编码的氨基酸序列的（A2）或本发明蛋白质(A)的氨基酸序列的（A2）中的“45%以上的序列同一性”，可举出例如：45、50、55、60、65、70、75、80，85、90、95、98或99%以上的序列同一性。
本发明多核苷酸(A)编码的氨基酸序列或本发明蛋白质(A)的氨基酸序列中，“与由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸”是指，例如，在“克隆与测序”（渡边格监修、杉浦昌弘编集、1989年、农村文化社发行）等中记载的DNA印迹杂交法中，在（1）高离子浓度下［可举出例如：6XSSC（900mM的氯化钠、90mM的柠檬酸钠）］，在65℃杂交从而与由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸通过碱基配对形成杂交体，在（2）低离子浓度下［可举出例如：0.1 X SSC（15mM的氯化钠、1.5mM的柠檬酸钠）］，在65℃保温30分钟后该杂交体也能够维持的多核苷酸。
作为上述多核苷酸，具体可举出：具有SEQ ID NO:2、4、6、15、16或17中的任一所示的核苷酸序列的多核苷酸，具有在SEQ ID NO:2、4、6、15、16或17中的任一所示的核苷酸序列中缺失、置换或添加了其一部分核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸；或具有与SEQ ID NO:2、4、6、15、16或17中的任一所示核苷酸序列有90%、95%、98%或99%以上的序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸。
本发明多核苷酸(A)可以是从自然界存在的DNA之中克隆得到的多核苷酸，也可以是该克隆得到的多核苷酸的核苷酸序列中人工导入其一部分核苷酸的缺失、置换或添加而成的多核苷酸，还可以是化学合成得到的多核苷酸。
本发明多核苷酸(A)可以由例如具有将α-羟基羧酸氧化为对应的α-氧代羧酸的能力的微生物，具体由反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans）ATCC55564株等属于无色杆菌属的微生物得到。这些微生物可以从天然分离，也可以通过从菌株保藏机构购入获得。
作为能够获得这类微生物的菌株保藏机构，可举出例如：下述的菌株保藏机构。
1.IFO（Institute of Fermentation Osaka：财团法人发酵研究所）保藏中心
现在移管于独立行政法人 制品评价技术基础机构 生物遗传资源部门（NBRC）。在获得微生物之际，向NBRC申请购入即可，购入申请时例如可以访问NBRC的主页。
2.ATCC（美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection））
可以通过Summit Pharmaceuticals International ATCC 商业团体获得，购入微生物之际，例如可以访问该团体的主页。也可以从ATCC直接购入微生物。
3.JCM（理化学研究所微生物系统保存设施 (Japan Collection ofMicroorganisms, JCM)
现在移管于独立行政法人理化学研究所生物资源中心 (RIKEN BRC) 微生物材料开发室。获得微生物之际，向该机构申请购入即可，例如可以访问该机构的主页的培养物保藏中心相关的网址。
4.IAM培养物保藏中心
现在，IAM培养物保藏中心保存菌株之中，细菌、酵母、丝状真菌移管于独立行政法人理化学研究所生物资源中心微生物材料开发室（JCM），微藻类则移管于独立行政法人 国立环境研究所微生物系统保存设施（NIES）。获得微生物之际，向这些机构申请购入即可，例如可以访问这些机构的主页的培养物保藏中心相关的网址。
本发明多核苷酸(A)例如可以如下所述制备。
由反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans）等属于无色杆菌属的微生物等，基于通常的基因工程手法（例如，“新 细胞工学实验规程”（东京大学医科学研究所制癌研究部编、秀润社、1993年）中记载的方法），制备DNA文库，将制备的DNA文库作为模板，并且使用适合的引物进行PCR，由此可以扩增编码SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列的多核苷酸、编码SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的多核苷酸、或具有SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的多核苷酸等，并制备本发明多核苷酸(A)。
在上述PCR中所用的引物的5’末端侧或3’末端侧或这两者中，可以添加限制酶识别序列等。
例如，以上述DNA文库为模板，并且将具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的寡核苷酸与具有SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR，由此可以扩增由SEQID NO:2所示核苷酸序列组成的多核苷酸，并制备本发明多核苷酸(A)。
以上述DNA文库为模板，并且将具有SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的寡核苷酸与具有SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR，由此可以扩增由SEQ IDNO:4所示核苷酸序列组成的多核苷酸。
以上述DNA文库为模板，并且将具有SEQ ID NO:13所示核苷酸序列的寡核苷酸与具有SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物进行PCR，由此可以扩增由SEQ IDNO:6所示核苷酸序列组成的多核苷酸。
作为上述PCR的条件，可举出例如下述条件：将混合了4种dNTP各20μM、2种寡核苷酸引物各15pmol、Taq聚合酶1.3U以及作为模板的DNA文库的反应液在94℃保温2分钟后，将94℃10秒、然后65℃30秒、然后72℃90秒的保温循环进行10次，接着将94℃10秒、然后65℃30秒、然后72℃1分钟和5秒的保温循环进行20次，进而在72℃保持7分钟。
以上述DNA文库为模板，将具有选自编码SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列的寡核苷酸（例如，由编码SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示氨基酸序列的核苷酸序列的5’末端的约14个核苷酸以上的核苷酸序列组成的寡核苷酸）以及由DNA文库构建中所用载体的DNA插入位点附近的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的约14个核苷酸以上的寡核苷酸用作引物，进行PCR，由此也可以扩增具有编码SEQ IDNO:1、3或5中的任一所示氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸、具有编码SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸等，并制备本发明多核苷酸(A)。
本发明多核苷酸(A)也可如下获得，例如，对于插入微生物或噬菌体来源的载体的DNA文库，以由具有选自编码SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列的约15个核苷酸以上的核苷酸序列组成的DNA作为探针，使之在后述条件下进行杂交，通过检测该探针特异性结合的DNA而获得。
作为使探针与染色体DNA或DNA文库杂交的方法，可举出例如：菌落杂交、噬菌斑杂交，可以根据制备文库所用的载体的种类选择方法。
在使用的文库是使用质粒载体制备的情形中，可以利用菌落杂交。具体地，通过将文库DNA导入宿主微生物获得转化体，稀释所得转化体后，将该稀释物接种于琼脂培养基上，培养直至菌落出现。
在使用的文库是使用噬菌体载体制备的情形中，可以利用噬菌斑杂交。具体地，将宿主微生物和文库噬菌体在能够感染的条件下混合，进而混合软琼脂培养基后，将该混合物接种于琼脂培养基上，培养直至噬菌斑出现。
在上述任一杂交的情形中，均在进行了上述培养的琼脂培养基上设置膜，使转化体或噬菌体吸附/转印于该膜。将该膜进行碱处理后，进行中和处理，接着进行将DNA固定于该膜的处理。更具体地，例如，在噬菌斑杂交的情形中，在前述琼脂培养基上设置硝基纤维素膜或尼龙膜（例如，Hybond-N+（GE Healthcare 公司商标）），静置约1分钟使噬菌体粒子吸附/转印于膜。接着，将该膜在碱溶液（例如1.5M氯化钠、0.5M氢氧化钠）中浸渍约3分钟使噬菌体粒子溶解，由此使噬菌体DNA溶出至膜上，然后在中和溶液（例如，1.5M氯化钠、0.5MTris-盐酸缓冲溶液pH7.5）中浸渍约5分钟。接着将该膜用清洗液（例如，0.3M氯化钠、30mM柠檬酸、0.2MTris-盐酸缓冲液pH7.5）清洗约5分钟，然后在例如约80℃加热约90分钟，由此将噬菌体DNA固定于膜。
使用如此制备的膜，以上述DNA为探针进行杂交。杂交可以基于例如，J.Sambrook,E.F.Frisch, T.Maniatis著“Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）” Cold Spring Harbor Laboratory Press等的记载进行。
用于探针的DNA可以是利用放射性同位素标记的DNA，也可以是用荧光色素标记的DNA。
作为将用于探针的DNA通过放射性同位素标记的方法，可举出例如：通过利用Random Primer DNA Labeling Kit（Takara Bio Inc.制）等，将PCR反应液中的dCTP替换为（α-32P）dCTP，以用于探针的DNA为模板进行PCR的方法。
在将用于探针的DNA以荧光色素标记的情形中，可以使用例如，ECL DirectNucleic Acid Labeling and Detection System（GE Healthcare 公司制）等。
杂交例如可以如下所述进行。
按照每1cm2如上所述制备的膜为50至200μl的比例，准备含有450至900mM的氯化钠和45至90mM的柠檬酸钠、以0.1至1.0重量%的浓度含有十二烷基硫酸钠（SDS）、以0至200μl/ml的浓度含有变性的非特异性DNA、视情况可以以各自0至0.2重量%的浓度含有白蛋白、聚蔗糖（Ficoll）、聚乙烯吡咯烷酮等的预杂交液（优选为含有900mM的氯化钠、90mM的柠檬酸钠、1.0重量%的SDS和100μl/ml的变性Calf-thymusDNA的预杂交液），将前述膜浸渍于该预杂交液中，在42至65℃保温1至4小时。
接着，按照每1cm2膜为50至200μl的比例准备下述溶液，该溶液混合了例如含有450至900mM的氯化钠和45至90mM的柠檬酸钠、以0.1至1.0重量%的浓度含有SDS、以0至200μg/ml的浓度含有变性的非特异性DNA、视情况可以以各自0至0.2重量%的浓度含有白蛋白、聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等的杂交溶液（优选为含有900mM的氯化钠、90mM的柠檬酸钠、1.0重量%的SDS和100μg/ml的变性Calf-thymusDNA的杂交溶液）以及通过前述方法制得的探针（相当于每1cm2膜为1.0×104至2.0×106cpm的量），浸渍于该杂交溶液中，在42至65℃保温12至20小时。
该杂交后将膜取出，使用含有15至300mM的氯化钠、1.5至30mM的柠檬酸钠和0.1至1.0重量%的SDS等的42至65℃的清洗液（优选为含有15mM的氯化钠、1.5mM的柠檬酸钠和1.0重量%的SDS的65℃的清洗液）等进行清洗。将清洗后的膜用2×SSC（300mM氯化钠、30mM柠檬酸钠）轻轻漂洗后，进行干燥。将该膜供给例如放射自显影等检测膜上探针的位置，由此在原始琼脂培养基上鉴定相当于与所用探针杂交的DNA的膜上位置的克隆，通过对其进行钓菌，分离具有该DNA的克隆。
培养如此得到的克隆，可以由所得培养菌体制备本发明多核苷酸(A)。
本发明多核苷酸(A)也可以基于其核苷酸序列，按照例如亚磷酸三酯法（Hunkapiller, M.et al., Nature, 310, 105, 1984）等通常的方法，进行具有目标核苷酸序列的核酸的化学合成来制备。
作为编码上述（A1）至（A4）中的任一氨基酸序列的密码子，以匹配大肠杆菌中的密码子使用频率的方式选择密码子，由此设计核苷酸序列，通过化学合成由所设计核苷酸序列组成的多核苷酸，也可以制备本发明多核苷酸(A)。
具体地，例如，以近似于进行表达的微生物细胞（例如，大肠杆菌）中的密码子使用频率的密码子使用频率的方式，选择与SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示氨基酸序列所含的各氨基酸对应的密码子，设计编码目标氨基酸序列的核苷酸序列。大肠杆菌等中的密码子使用频率的信息可以利用，例如，本领域技术人员公知的DNA数据库（GenBank、EMBL、DDBJ等）得到。
以下，示出具体步骤。
求出目标氨基酸序列所含的各氨基酸的个数。以与表达多核苷酸的微生物细胞的密码子的平均出现频率最接近的方式，对上述求出的个数的氨基酸分配使用的密码子。以同一密码子尽量不连续的方式，编辑各密码子的使用顺序。从N末端侧的氨基酸开始依次按照对各氨基酸所确定的顺序选择密码子，预定为该氨基酸残基的密码子。重复这些步骤，预定直至C末端的全部氨基酸的密码子，最后配置终止密码子。对于由预定密码子组成的核苷酸序列，确认不存在在微生物细胞中阻碍基因转录的核苷酸序列、后续操作中使用的限制酶识别的核苷酸序列。这类核苷酸序列存在时，将该核苷酸序列所涉及的密码子与其它部分使用的密码子进行交换。在设计这种核苷酸序列之际，为了后续操作，优选预先将适当的限制酶识别的核苷酸序列添加于5’末端侧和3’末端侧。
具有如此设计的核苷酸序列的多核苷酸的合成可以使用利用PCR的长链DNA合成法进行（细胞工学别册，植物细胞工学系列7“植物的PCR实验规程”，95-100页、岛本巧・佐佐木卓治编辑秀润社、1997年7月1日刊行）（以下，有时将本法记为Assembly PCR法）。该方法中，仅使用长的合成寡核苷酸引物合成DNA。引物对以引物在各自3’末端具有约10bp至约12bp的互补链或重叠的方式而合成，以彼此的引物作为模板进行DNA合成。作为引物的全长，可举出例如：约60mer至约100mer等。优选可举出例如：约80mer至约100mer等。
将这些寡核苷酸引物依次通过PCR反应结合，由此得到具有目标核苷酸序列的DNA。所得DNA按照常规方法导入克隆载体，进行克隆。所得克隆的核苷酸序列通过DNA测序仪来确认，确认得到了具有目标核苷酸序列的多核苷酸。如此可以人工合成例如具有SEQID NO:15、16或17中的任一所示核苷酸序列的本发明的多核苷酸，得到本发明多核苷酸(A)。
如上所述制备的多核苷酸可以基于“Molecular Cloning: A Laboratory Manual2nd edition”（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、“Current Protocols inMolecular Biology”(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等中记载的方法克隆到载体。
如上所述制备的多核苷酸的核苷酸序列可以通过F.Sanger, S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467页等中记载的双脱氧链终止方法等进行解析。在用于核苷酸序列分析的试样制备中，可以使用例如，Perkin Elmer公司的ABI PRISM Dye Terminator Cycle SequencingReady Reaction Kit等市售的试剂。
如上所述制备的多核苷酸编码具有将α-羟基羧酸（例如，2-羟基-4-（甲硫基）丁酸）氧化转换成对应的α-氧代羧酸（例如，2-氧代-4-（甲硫基）丁酸）的能力的蛋白质的氨基酸序列的确认可以例如如下进行。
将如上所述得到的多核苷酸以连接于在宿主细胞内可发挥功能的启动子的下游的方式插入载体，将所得重组载体导入宿主细胞获得转化体。将所得转化体的培养物与α-羟基羧酸（例如，含硫α-羟基羧酸，更具体地2-羟基-4-（甲硫基）丁酸）作用。分析反应产物中的对应α-氧代羧酸（例如，含硫α-氧代羧酸，更具体地2-氧代-4-（甲硫基）丁酸）的量，由此可以确认所得多核苷酸编码具有目标能力的蛋白质的氨基酸序列。
为了使本发明多核苷酸(A)在宿主细胞中表达，例如，制备将在宿主细胞内可发挥功能的启动子与本发明多核苷酸(A)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸，将其导入宿主细胞。
作为在微生物中可发挥功能的启动子，可举出如上所述的在大肠杆菌内可发挥功能的合成启动子等。也可以利用在反硝化无色杆菌中控制本发明多核苷酸(A)的表达的启动子。
将本发明多核苷酸(A)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(A)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸整合至载体中，由此可以制备本发明重组载体。
除了本发明多核苷酸(A)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(A)以可发挥功能的形式连接而成多核苷酸之外，本发明重组载体还可以含有编码具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质（以下，有时记作本蛋白质(B)）的氨基酸序列的多核苷酸、或该多核苷酸与在宿主细胞内可发挥功能的启动子以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸。
作为具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质，可举出氨基酸脱氢酶、转氨酶。作为氨基酸脱氢酶，具体可举出：丙氨酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶，优选可举出：亮氨酸脱氢酶。
作为具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的上述蛋白质，更具体地，可举出：Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 23(2003) 239-247中记载的来自球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus） IFO3525株的亮氨酸脱氢酶、和具有前述亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列中第113位的丙氨酸被改变为甘氨酸的氨基酸序列的蛋白质。
SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列是Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 23 (2003) 239-247中记载的来自球形芽孢杆菌 IFO3525株的亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列是SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列中第113位的丙氨酸被改变为甘氨酸的氨基酸序列。
作为具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列，具体还可举出下述（B1）至（B3）中任一氨基酸序列：
（B1）SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列、
（B2）i）与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列、并且ii）具有将2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化转换成对应的L-甲硫氨酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（B3）i）SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、并且ii）具有将2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化转换成对应的L-甲硫氨酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列。
本蛋白质(B)的上述氨基酸序列中，在与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列之间可观察到的区别是一部分氨基酸的缺失、置换或添加等。前述“添加”不仅包括氨基酸在序列端部的添加，也包括氨基酸在序列中的插入。作为该氨基酸的改变，可举出例如：(a)具有SEQID NO:7所示氨基酸序列的蛋白质在细胞内受到的加工所致的缺失，(b)由于前述蛋白质的来源生物的种类差异、个体差异等而天然产生的基因突变导致的氨基酸的缺失、置换或添加，或(c)由于人工导入的基因突变等而产生的氨基酸的缺失、置换或添加。
对于改变氨基酸的数目，只要是具有产生了改变的上述氨基酸序列的蛋白质可以发挥将2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化转换成对应的L-甲硫氨酸衍生物的能力的范围内的数目即可。作为本蛋白质(B)的上述氨基酸序列的（B3）中的“多个氨基酸”，可举出例如：2、3、4、5、6、7、10、15、18、20、25、30、35、36或40个氨基酸。
作为氨基酸的置换，可举出例如：保守性置换为疏水性、电荷、pK、立体结构上的特征等类似的氨基酸。作为这样的置换，具体可举出例如：(1)甘氨酸、丙氨酸；(2)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；(3)天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；(4)丝氨酸、苏氨酸；(5)赖氨酸、精氨酸；(6)苯丙氨酸、酪氨酸等组内的置换。
作为氨基酸的添加，可举出例如：在氨基酸序列的氨基末端或羧基末端的、包含连续6个残基左右的组氨酸的约20个残基的氨基酸的添加。
作为人工进行氨基酸的改变的手法，可举出例如：对编码SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的多核苷酸实施位点特异性突变导入，然后通过常规方法使该多核苷酸表达的手法。
作为人工进行氨基酸的改变的手法，可举出例如：对编码SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的多核苷酸实施随机突变导入，然后通过常规方法使该多核苷酸表达的手法。
作为本蛋白质(B)的上述氨基酸序列的（B2）中的“90%以上的序列同一性”，可举出例如90、95、98或99%以上的序列同一性。
编码具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列的多核苷酸（以下，有时也记为本多核苷酸(B)）可以从例如具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的微生物、例如球形芽孢杆菌 IFO3525株等属于芽孢杆菌属的微生物得到。
基于通常的基因工程手法由球形芽孢杆菌 IFO3525株等属于芽孢杆菌属的微生物等制备DNA文库，以制备的DNA文库为模板，并且使用适合的引物进行PCR，由此可以扩增编码SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的多核苷酸、或编码SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的多核苷酸等而制备本多核苷酸(B)。
例如，作为具有编码SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的SEQ ID NO:40所示核苷酸序列的多核苷酸的扩增用引物，合成具有SEQ ID NO:18所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的寡核苷酸。作为用于将SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的第113位的丙氨酸改变为甘氨酸的突变导入用引物，合成具有SEQ ID NO:20所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的寡核苷酸。
以上述DNA文库为模板，使用具有SEQ ID NO:18所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR，由此扩增具有SEQ ID NO:40所示核苷酸序列的多核苷酸。将扩增得到的多核苷酸整合至载体，得到含有具有SEQ IDNO:40所示核苷酸序列的多核苷酸的重组载体。以所得重组载体为模板，使用具有SEQ IDNO:20所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR，将所得PCR产物用Dpn I处理，然后导入大肠杆菌。分析所得转化体拥有的重组载体的核苷酸序列，得到编码导入了目标氨基酸突变的氨基酸序列、即SEQ ID NO:39所示氨基酸序列中第113位的丙氨酸被置换为甘氨酸的氨基酸序列（SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列）的多核苷酸。作为编码SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的核苷酸序列，可举出SEQ IDNO:8所示的核苷酸序列。
本多核苷酸(B)可以基于其核苷酸序列，按照例如亚磷酸三酯法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310, 105, 1984）等通常的方法，进行具有目标核苷酸序列的核酸的化学合成来制备。
作为编码上述（B1）至（B3）中任一氨基酸序列的密码子，以匹配大肠杆菌中的密码子使用频率的方式选择密码子，由此设计核苷酸序列，通过化学合成由所设计核苷酸序列组成的多核苷酸，也可以制备本多核苷酸(B)。
为了使本多核苷酸(B)在宿主细胞中表达，例如，制备在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本多核苷酸(B)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸，将其导入宿主细胞。
作为在微生物中可发挥功能的启动子，可举出如上所述的在大肠杆菌内可发挥功能的合成启动子等。也可以利用在球形芽孢杆菌等属于芽孢杆菌属的微生物中控制本多核苷酸(B)的表达的启动子。
如上所述制备的多核苷酸编码具有将α-氧代羧酸化合物（例如，2-氧代-4-（甲硫基）丁酸）氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物（例如，L-甲硫氨酸）的能力的蛋白质的氨基酸序列的确认可以例如如下进行。
将如上所述得到的多核苷酸以连接于在宿主细胞内可发挥功能的启动子的下游的方式插入载体，将所得重组载体导入宿主细胞获得转化体。将所得转化体的培养物与α-氧代羧酸（例如，含硫α-氧代羧酸，更具体地2-氧代-4-（甲硫基）丁酸）作用。分析反应产物中的对应L-α-氨基酸（例如，含硫L-α-氨基酸，更具体地L-甲硫氨酸）的量，由此可以确认所得多核苷酸编码具有目标能力的蛋白质的氨基酸序列。
通过将本发明多核苷酸(A)、本多核苷酸(B)、或含有这些多核苷酸中的任一或两者的重组载体导入宿主细胞，可以制备转化体。
作为宿主细胞，可举出例如，属于埃希氏菌（Escherichia）属、芽孢杆菌（Bacillus）属、棒状杆菌（Corynebacterium）属、葡萄球菌（Staphylococcus）属、链霉菌（Streptomyces）属、酵母菌（Saccharomyces）属、克鲁维酵母菌（Kluyveromyces）属、毕赤酵母菌（Pichia）属、红球菌（Rhodococcus）属和曲霉菌（Aspergillus）属的微生物等。
如上所述操作，通过将本发明多核苷酸(A)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(A)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸导入宿主细胞，可以得到拥有本发明多核苷酸(A)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(A)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸的转化体。作为该转化体，可举出：将外源的上述多核苷酸导入宿主细胞的染色体而成的转化体，即，染色体上拥有外源的上述多核苷酸的转化体。
拥有本发明多核苷酸(A)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子与本发明多核苷酸(A)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸的转化体进而还可以拥有本多核苷酸(B)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本多核苷酸(B)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸。
如上所述操作，通过将：
i）本多核苷酸(B)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本多核苷酸(B)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；和
ii）本发明多核苷酸(A)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(A)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸
导入宿主细胞，可以获得拥有下述多核苷酸的转化体：
i）本多核苷酸(B)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本多核苷酸(B)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；和
ii）本发明多核苷酸(A)、或在宿主细胞内可发挥功能的启动子和本发明多核苷酸(A)以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸。
上述i）的多核苷酸和ii）的多核苷酸可以分别整合至不同的载体导入宿主细胞，也可以整合至相同的载体上导入宿主细胞。在两个多核苷酸整合至单一载体的情形中，例如，可以将启动子、终止子等的参与表达控制的区域与两个多核苷酸各自连接整合至载体，也可以作为乳糖操纵子之类的含有多个顺反子的操纵子，以使两个多核苷酸表达的方式整合至载体。可以在宿主细胞的染色体上拥有上述i）的多核苷酸和ii）的多核苷酸中的任一或两者。
本发明蛋白质(A)可以通过例如培养拥有本发明多核苷酸(A)的转化体而表达本发明蛋白质(A)来制备。
本蛋白质(B)可以通过例如培养拥有本多核苷酸(B)的转化体而表达本蛋白质(B)来制备。
作为从拥有本发明多核苷酸(A)或本多核苷酸(B)的转化体的培养物纯化本发明蛋白质(A)或本蛋白质(B)的方法，可以适用蛋白质纯化中所使用的通常的方法。
含有本发明蛋白质(A)的级分可以以例如将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸氧化优先地生产2-氧代-4-（甲硫基）丁酸的能力为指标进行挑选。
含有本蛋白质(B)的级分可以以例如将2-氧代-4-（甲硫基）丁酸氨基化优先地生产L-甲硫氨酸的能力为指标进行挑选。
本发明制备方法1是包含使本发明蛋白质(A)与α-羟基羧酸化合物作用的步骤的α-氧代羧酸化合物的制备方法。
作为上述α-羟基羧酸化合物，可举出含硫α-羟基羧酸化合物，作为对应α-氧代羧酸化合物，可举出含硫α-氧代羧酸化合物。
作为上述含硫α-羟基羧酸化合物，例示式（1）所示的含硫α-羟基羧酸：
式中，R1表示氢或任选取代的碳原子数为1-8的烷基。
作为使本发明蛋白质(A)与上述式（1）所示的含硫α-羟基羧酸作用而得的含硫α-氧代羧酸化合物，例示式（2）所示的含硫α-氧代羧酸：
式中，R1表示与前述相同的含义。
式（1）的含硫α-羟基羧酸、和式（2）的含硫α-氧代羧酸中，作为R1所表示的任选取代的C1-8的烷基中的C1-8的烷基，例示例如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基。
作为式（1）所示的含硫α-羟基羧酸，具体可举出例如：2-羟基-4-（甲硫基）丁酸、2-羟基-4-（乙硫基）丁酸、2-羟基-4-（丙硫基）丁酸、2-羟基-4-（丁硫基）丁酸、2-羟基-4-（戊硫基）丁酸、2-羟基-4-（己硫基）丁酸、2-羟基-4-（庚硫基）丁酸、2-羟基-4-（辛硫基）丁酸。
作为式（2）所示的含硫α-氧代羧酸，具体可举出例如：2-氧代-4-（甲硫基）丁酸、2-氧代-4-（乙硫基）丁酸、2-氧代-4-（丙硫基）丁酸、2-氧代-4-（丁硫基）丁酸、2-氧代-4-（戊硫基）丁酸、2-氧代-4-（己硫基）丁酸、2-氧代-4-（庚硫基）丁酸、2-氧代-4-（辛硫基）丁酸等。
作为R1所表示的任选取代的C1-8的烷基，优选为甲基，作为式（1）所示的含硫α-羟基羧酸，优选例示2-羟基-4-（甲硫基）丁酸。
本发明制备方法1中，以2-羟基-4-（甲硫基）丁酸为底物时，得到2-氧代-4-（甲硫基）丁酸。
本发明制备方法1中，本发明蛋白质(A)可以以各种形态供给用于与α-羟基羧酸化合物作用的反应体系。本发明蛋白质(A)可以以经纯化的蛋白质的形态提供给本发明制备方法1的反应体系，也可以以包含于产生该蛋白质的微生物或该微生物的处理物中的形态提供给前述反应体系。“微生物的处理物”意指与上述“转化体的处理物”相同地制备的处理物。本发明蛋白质(A)还可以以包含于将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给上述反应体系。
为了使本发明蛋白质(A)与α-羟基羧酸化合物作用，具体地，例如，可将本发明蛋白质(A)、本发明蛋白质(A)的固定化物、将编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸导入宿主细胞而成且产生本发明蛋白质(A)的转化体的培养物、或前述转化体的处理物提供给本发明制备方法1的反应体系。
本发明制备方法1通常在水的存在下进行。此时所用的水可以是缓冲水溶液。作为该缓冲水溶液中所用的缓冲剂，可举出例如：三羟基甲基氨基甲烷、磷酸钠或磷酸钾等磷酸碱金属盐、乙酸钠或乙酸钾等乙酸碱金属盐、或它们的混合物。
本发明制备方法1中，除了水之外还可以使有机溶剂共存于反应体系中。作为所用的有机溶剂，可举出例如：叔丁基甲醚、二异丙醚、四氢呋喃等醚类；甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯等酯类；甲苯、己烷、环己烷、庚烷、异辛烷等烃类；甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇、叔丁醇等醇类；二甲基亚砜等有机硫化合物、丙酮等酮类、乙腈等腈类、以及它们的混合物。
本发明制备方法1中，伴随α-羟基羧酸化合物（例如，2-羟基-4-（甲硫基）丁酸等含硫α-羟基羧酸）的氧化反应的进行，反应液中的氧被消耗，转换成过氧化氢。转换产生的过氧化氢可通过与具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质作用而恢复至原始的分子氧，因此，在上述方法的反应体系内，可以进一步存在具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质。
作为具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质，可举出例如过氧化氢酶。作为过氧化氢酶，可举出大肠杆菌的过氧化氢酶，更具体地，可举出：具有SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的过氧化氢酶。
具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质可以以经纯化的蛋白质或其固定化物的形态提供给本发明制备方法1的反应体系，也可以以包含于产生该蛋白质的微生物或该微生物的处理物中的形态提供给前述反应体系。“微生物的处理物”意指与上述“转化体的处理物”相同地制备的处理物。可以将将编码具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给上述反应体系。作为编码具有SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的过氧化氢酶的核苷酸序列，可举出SEQ ID NO:42所示的核苷酸序列。
本发明制备方法1中，可以将将编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物、以及将编码具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给用于与α-羟基羧酸化合物作用的反应体系。
本发明制备方法1中，可以将将编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸与编码具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的多核苷酸两者导入同一宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给前述反应体系。可以将编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸与编码具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的多核苷酸分别整合至不同的载体导入宿主细胞，也可以整合至相同载体上导入宿主细胞。将两个多核苷酸整合至单一的载体时，例如，可以将启动子、终止子等参与表达控制的区域与两个多核苷酸各自连接整合至载体，也可以作为乳糖操纵子之类的含有多个顺反子的操纵子，以使两个多核苷酸表达的方式整合至载体。可以在宿主细胞的染色体上拥有编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸与编码具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的多核苷酸中的任一或两者。
本发明制备方法1中的反应例如通过将含有水、α-羟基羧酸化合物(例如2-羟基-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-羟基羧酸化合物)、以及本发明蛋白质(A)或者产生该蛋白质的转化体或其处理物、根据需要还含有有机溶剂、过氧化氢酶等的反应液通过搅拌、振荡等进行混合来进行。
上述方法中的反应时的pH值可以适当选择，但通常pH值在约3～约10的范围。反应温度可以适当选择，但从原料和产物的稳定性、反应速度的角度考虑，通常在约0℃～约60℃的范围。
反应终点例如可以通过利用液相色谱等分析反应液中的α-羟基羧酸化合物(例如2-羟基-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-羟基羧酸化合物)的量来确定。
反应时间可以适当选择，但通常是约0.5小时～约10天的范围。
从反应液中回收α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸化合物)可以按照通常已知的任意方法来进行。
例如可以列举下述方法：通过将反应液的有机溶剂提取操作、浓缩操作等后处理根据需要与柱色谱、蒸馏等组合进行来纯化目标化合物。
本发明制备方法2是L-氨基酸化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1). 使本发明蛋白质(A)与α-羟基羧酸化合物反应，得到对应的α-氧代羧酸化合物；以及
(2). 使具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质(本蛋白质(B))与步骤(1)中得到的α-氧代羧酸化合物反应，得到对应的L-α-氨基酸化合物。
作为上述α-羟基羧酸，例示式(1)所示的含硫α-羟基羧酸：
式中，R1表示氢或任选取代的碳原子数为1-8的烷基。
作为使本发明蛋白质(A)与上述式(1)所示的含硫α-羟基羧酸作用而得到的含硫α-氧代羧酸化合物，例示式(2)所示的含硫α-氧代羧酸：
式中，R1表示与前述相同的含义。
作为使本蛋白质(B)与上述式(2)所示的含硫α-氧代羧酸作用而得到的含硫L-氨基酸化合物，例示式(3)所示的含硫L-氨基酸。
在式(1)的含硫α-羟基羧酸、式(2)的含硫α-氧代羧酸和式(3)的含硫L-α-氨基酸中，作为R1所表示的任选取代的C1-8烷基中的C1-8烷基，例如例示：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基。
作为式(1)所示的含硫α-羟基羧酸，具体而言，例如可以列举：2-羟基-4-(甲硫基)丁酸、2-羟基-4-(乙硫基)丁酸、2-羟基-4-(丙硫基)丁酸、2-羟基-4-(丁硫基)丁酸、2-羟基-4-(戊硫基)丁酸、2-羟基-4-(己硫基)丁酸、2-羟基-4-(庚硫基)丁酸、2-羟基-4-(辛硫基)丁酸。
作为式(2)所示的含硫α-氧代羧酸，具体而言，例如可以列举：2-氧代-4-(甲硫基)丁酸、2-氧代-4-(乙硫基)丁酸、2-氧代-4-(丙硫基)丁酸、2-氧代-4-(丁硫基)丁酸、2-氧代-4-(戊硫基)丁酸、2-氧代-4-(己硫基)丁酸、2-氧代-4-(庚硫基)丁酸、2-氧代-4-(辛硫基)丁酸。
作为式(3)所示的含硫L-α-氨基酸，具体而言，例如可以列举：2-氨基-4-(甲硫基)丁酸、2-氨基-4-(乙硫基)丁酸、2-氨基-4-(丙硫基)丁酸、2-氨基-4-(丁硫基)丁酸、2-氨基-4-(戊硫基)丁酸、2-氨基-4-(己硫基)丁酸、2-氨基-4-(庚硫基)丁酸、2-氨基-4-(辛硫基)丁酸。
作为R1所表示的任选取代的C1-8烷基，优选甲基，作为式(1)所示的含硫α-羟基羧酸，优选例示2-羟基-4-(甲硫基)丁酸。
在本发明制备方法2的步骤(1)中，当以2-羟基-4-(甲硫基)丁酸作为底物时，在步骤(1)中得到2-氧代-4-(甲硫基)丁酸，在步骤(2)中得到L-甲硫氨酸。
本发明制备方法2的步骤(1)可以和本发明制备方法1同样地实施。
将步骤(1)中得到的α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸化合物)从反应液中纯化或者部分纯化后，可以供给步骤(2)。通过在步骤(2)中添加步骤(1)的反应液，还可以将步骤(1)中得到的α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸化合物)供给步骤(2)。
在本发明制备方法2的步骤(2)中，本蛋白质(B)能够以各种形态提供给用于与α-氧代羧酸化合物作用的反应体系。本蛋白质(B)可以以纯化蛋白质的形态提供给上述步骤(2)的反应体系，也可以以包含在产生该蛋白质的微生物或者该微生物的处理物中的形态提供给上述反应体系。“微生物的处理物”是指与上述的“转化体的处理物”同样制备的物质。本蛋白质(B)可以以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给上述反应体系。
为了使本蛋白质(B)与α-氧代羧酸化合物作用，具体而言，例如可以将本蛋白质(B)、本蛋白质(B)的固定化物、将编码本蛋白质(B)的多核苷酸导入宿主细胞而成的产生本蛋白质(B)的转化体的培养物、或者上述转化体的处理物提供给上述步骤(2)的反应体系。
本发明制备方法2的步骤(2)通常在水、铵离子和辅酶的存在下进行。
此时使用的水可以是缓冲水溶液。作为该缓冲水溶液中使用的缓冲剂，例如可以列举：三羟甲基氨基甲烷、磷酸钠或磷酸钾等磷酸碱金属盐、乙酸钠或乙酸钾等乙酸碱金属盐、或者它们的混合物。
在本发明制备方法2的步骤(2)中，除了水以外，还可以使有机溶剂共存于反应体系中。作为使用的有机溶剂，例如可以列举：叔丁基甲醚、二异丙醚、四氢呋喃等醚类；甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯等酯类；甲苯、己烷、环己烷、庚烷、异辛烷等烃类；甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇、叔丁醇等醇类；二甲基亚砜等有机硫化合物、丙酮等酮类、乙腈等腈类、以及它们的混合物。
在本发明制备方法2的步骤(2)中，为了利用铵离子作为氨基供体，通常在反应体系中添加铵盐化合物。作为所添加的铵盐化合物，例如可以列举硫酸铵、甲酸铵、氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、氢氧化铵、酒石酸铵、乙酸铵等。反应体系内的铵离子的量通常是与作为底物的α-氧代羧酸化合物的量等摩尔或其以上，并优选在反应开始时预先添加。
在本发明制备方法2的步骤(2)中，为了利用辅因子(cofactor)作为共轭系统，通常可以在反应体系中添加辅酶(coenzyme)。作为所添加的辅酶，例如可以列举还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下有时还记作NADH。)、还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下有时还记作NADPH。)。反应体系内的辅因子的量通常是与作为底物的α-氧代羧酸化合物的量等摩尔或其以上，并优选在反应开始时预先添加。
在本发明制备方法2的步骤(2)中，随着α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸)的还原性氨基化反应的进行，反应液中的NADH转换成氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下有时还记作NAD+。)。经转换而产生的NAD+通过与具有将NAD+转换成还原型(NADH)的能力的蛋白质作用可以恢复成原始的NADH，因此在上述步骤(2)的反应体系内，还可以存在具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质。当上述步骤(2)的反应体系内还存在具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质时，反应体系内的辅因子的量通常可以是催化剂量，与作为底物的α-氧代羧酸化合物的量等摩尔或其以下。
作为具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质，例如可以列举：甲酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶等有机酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、或氨基酸脱氢酶。作为甲酸脱氢酶，可以列举属于芽孢杆菌(Bacillus)属的微生物的甲酸脱氢酶，更具体而言，可以列举具有SEQ ID NO: 43所示氨基酸序列的甲酸脱氢酶。
具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质可以以纯化蛋白质或其固定化物的形态提供给本发明制备方法2的步骤(2)的反应体系，还可以以包含在产生该蛋白质的微生物或者该微生物的处理物中的形态提供给上述反应体系。“微生物的处理物”是指与上述的“转化体的处理物”同样制备的物质。可以将将编码具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给上述反应体系。
在本发明制备方法2的步骤(2)中，可以将将编码本蛋白质(B)的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物、和将编码具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给用于与α-氧代羧酸化合物作用的反应体系。
在本发明制备方法2的步骤(2)中，可以将将编码本蛋白质(B)的多核苷酸和编码具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质的多核苷酸两者导入同一宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给上述反应体系。编码本蛋白质(B)的多核苷酸和编码具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质的多核苷酸可以分别整合到不同的载体中导入宿主细胞，也可以整合到相同的载体上导入宿主细胞。将两个多核苷酸整合到单一的载体中时，例如可以将启动子、终止子等的参与表达控制的区域与两个多核苷酸各自连接整合至载体，也可以作为乳糖操纵子之类的含有多个顺反子的操纵子，以使两个多核苷酸表达的方式整合至载体。可以在宿主细胞的染色体上拥有编码本蛋白质(B)的多核苷酸和编码具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质的多核苷酸中的任一或者两者。
本发明制备方法2的步骤(2)中的反应例如通过将含有水、铵盐化合物、NADH、α-氧代羧酸化合物(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸化合物)、以及本蛋白质(B)或者产生该蛋白质的转化体或其处理物、根据需要还含有有机溶剂、具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质等的反应液通过搅拌、振荡等混合来进行。
当具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质为葡萄糖脱氢酶时，通过使葡萄糖等共存于反应体系内，有时也增强该蛋白质的活性，例如可以在反应液中加入葡萄糖等。当具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质为甲酸脱氢酶时，通过使甲酸铵作为氨基供体共存于反应体系内，有时也增强该蛋白质的活性，例如可以在反应液中加入甲酸铵。
上述方法中的反应时的pH值可以适当选择，但通常pH值在约3～约10的范围。反应温度可以适当选择，但从原料和产物的稳定性、反应速度的角度考虑，通常在约0℃～约60℃的范围。
反应终点例如可以通过利用液相色谱等分析反应液中的α-氧代羧酸化合物(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸化合物)的量来确定。
反应时间可以适当选择，但通常是约0.5小时～约10天的范围。
从反应液中回收L-α-氨基酸(例如L-甲硫氨酸等含硫L-α-氨基酸)可以按照通常已知的任意方法来进行。
例如，可以列举下述方法：通过将反应液的晶析、有机溶剂提取操作、浓缩操作等后处理按照需要与柱色谱、蒸馏等组合进行来纯化目标化合物。
还可以在一个反应体系内进行本发明制备方法2的步骤(1)和步骤(2)。
这种情况下，本发明蛋白质(A)和本蛋白质(B)各自可以以各种形态提供给上述反应体系。
本发明蛋白质(A)和本蛋白质(B)可以以纯化蛋白质的形态提供给上述反应体系，也可以以包含在产生这些蛋白质的微生物或者该微生物的处理物中的形态提供给上述反应体系。
本发明蛋白质(A)和本蛋白质(B)可以以包含在将编码这些蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给上述反应体系。
例如，可以将将编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物和将编码本蛋白质(B)的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给上述反应体系。可以将将编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸和编码本蛋白质(B)的多核苷酸两者导入同一宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给上述反应体系。可以将编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸和编码本蛋白质(B)的多核苷酸分别整合到不同的载体中导入宿主细胞，也可以整合到相同的载体上导入宿主细胞。将两个多核苷酸整合到单一的载体中时，例如可以将启动子、终止子等的参与表达控制的区域与两个多核苷酸各自连接整合至载体，也可以作为乳糖操纵子之类的含有多个顺反子的操纵子，以使两个多核苷酸表达的方式整合至载体。可以在宿主细胞的染色体上拥有编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸和编码本蛋白质(B)的多核苷酸中的任一或两者。
还可以使具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质或者具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质、或者这两种蛋白质存在于上述反应体系内。具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质和具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质可以以纯化蛋白质或其固定化物的形态提供给上述反应体系，也可以以包含在产生这些蛋白质的微生物或者该微生物的处理物中的形态提供给上述反应体系。可以将将编码具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的多核苷酸或者编码具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给上述反应体系。
可以将选自下述多核苷酸的两种以上的多核苷酸导入同一宿主细胞而成的转化体或其处理物提供给上述反应体系：编码本发明蛋白质(A)的多核苷酸、编码本蛋白质(B)的多核苷酸、编码具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的多核苷酸、以及编码具有将NAD+转换成NADH的能力的蛋白质的多核苷酸。
在一个反应体系中进行本发明制备方法2的步骤(1)和步骤(2)时的反应可以利用依据上述本发明制备方法2的步骤(2)的反应的反应液和反应条件来进行。
反应终点例如可以通过利用液相色谱等分析反应液中的α-羟基羧酸化合物(例如2-羟基-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-羟基羧酸化合物)的量来确定。
反应时间可以适当选择，但通常是约0.5小时～约10天的范围。
从反应液中回收L-α-氨基酸(例如L-甲硫氨酸等含硫L-α-氨基酸)可以与上述本发明制备方法2的步骤(2)的情形同样地进行。
实施例
以下，通过实施例等来更详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。
参考例1 (染色体DNA的制备)
在两只500ml容量的烧瓶中分别装入各100ml的培养基(将2g葡萄糖、0.5g聚蛋白胨、0.3g酵母提取物、0.3g肉提取物、0.2g硫酸铵、0.1g磷酸二氢钾、0.05g硫酸镁七水合物溶解于100ml水中，用2N的HCl将pH值调节至6而得到的培养基)，在121℃灭菌15分钟。向其中分别加入各0.3ml在相同组成的培养基中、在30℃振荡培养了48小时的反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)ATCC55564株的培养液，在30℃振荡培养24小时。将所得培养液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，收集所产生的沉淀。将所得沉淀用50ml的0.85%的食盐水清洗，得到了3.5g的湿菌体。
使用QIAprep Genomic-tip System(Qiagen公司制)，由所得菌体得到了染色体DNA(以下记作染色体DNA(A)。)。
实施例1 (本发明多核苷酸(A)、本发明重组载体和本发明的转化体的制备)
合成分别具有SEQ ID NO: 9～14所示核苷酸序列的寡核苷酸引物。
[表1]
。
使用具有SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO: 10所示的寡核苷酸引物，以上述染色体DNA(A)为模板，按照下述反应液组成进行了PCR。
[反应液组成]
染色体DNA(A)溶液 1.5μl
dNTP(各2mM的混合物) 10μl
引物(50pmol/μl) 各0.3μl
2×缓冲液 25μl
KOD-FX(1U/μl、东洋纺公司制) 1μl
超纯水 11.9μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem 9700)中，在94℃保温2分钟，之后进行30次的98℃10秒、然后是60℃30秒、接着是68℃60秒的保温循环，之后在4℃保持。
之后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到了约1.2kb的DNA条带。
在剩下的PCR反应液中加入限制酶NdeI和BamHI，将DNA进行双酶切（doubledigestion），纯化了酶切过的约1.2kb的DNA。
将质粒载体pET-22b(Novagen公司制)用限制酶NdeI和BamHI进行双酶切，纯化了酶切过的载体DNA。
混合这些已纯化的DNA，用T4 DNA连接酶进行连接，使用所得的连接液来转化大肠杆菌(E. coli)DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所选择的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用NdeI和BamHI进行双酶切，之后供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中确认了，分别有约1.2kb的DNA被插入上述载体中。在分析这些质粒中的1个所拥有的约1.2kb的插入DNA的核苷酸序列时，判明了该DNA具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。将该质粒命名为pET174。SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
使用具有SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO: 12所示的寡核苷酸引物，以上述染色体DNA(A)为模板，按照下述反应液组成进行了PCR。
[反应液组成]
染色体DNA(A)溶液 1.5μl
dNTP(各2mM的混合物) 10μl
引物(50pmol/μl) 各0.3μl
2×缓冲液 25μl
KOD-FX(1U/μl、东洋纺公司制) 1μl
超纯水 11.9μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem 9700)中，在94℃保温2分钟，之后进行30次的98℃10秒、然后是60℃30秒、接着是68℃60秒的保温循环，之后在4℃保持。
之后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到了约1.2kb的DNA条带。
在剩下的PCR反应液中加入限制酶NdeI和BamHI，将DNA进行双酶切，纯化了酶切过的约1.2kb的DNA。
将质粒载体pET-22b(Novagen公司制)用限制酶NdeI和BamHI进行双酶切，纯化了酶切过的载体DNA。
混合这些已纯化的DNA，用T4 DNA连接酶进行连接，使用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所选择的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用NdeI和BamHI进行双酶切，之后供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中确认了，分别有约1.2kb的DNA被插入上述载体中。在分析这些质粒中的1个所拥有的约1.2kb的插入DNA的核苷酸序列时，判明了该DNA具有SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列。将该质粒命名为pET204。SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。
使用具有SEQ ID NO: 13所示核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO: 14所示的寡核苷酸引物，以上述染色体DNA(A)为模板，按照下述反应液组成进行了PCR。
[反应液组成]
染色体DNA(A)溶液 1.5μl
dNTP(各2mM的混合物) 10μl
引物(50pmol/μl) 各0.3μl
2×缓冲液 25μl
KOD-FX(1U/μl、东洋纺公司制) 1μl
超纯水 11.9μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem 9700)中，在94℃保温2分钟，之后进行30次的98℃10秒、然后是60℃30秒、接着是68℃60秒的保温循环，之后在4℃保持。
之后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到了约1.2kb的DNA条带。
在剩下的PCR反应液中加入限制酶NdeI和BamHI，将DNA进行双酶切，纯化了酶切过的约1.2kb的DNA。
将质粒载体pET-22b(Novagen公司制)用限制酶NdeI和BamHI进行双酶切，纯化了酶切过的载体DNA。
混合这些已纯化的DNA，用T4 DNA连接酶进行连接，使用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
将所得的转化体用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所选择的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用NdeI和BamHI进行双酶切，之后供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中确认了，分别有约1.2kb的DNA被插入上述载体中。在分析这些质粒中的1个所拥有的约1.2kbp的插入DNA的核苷酸序列时，判明了该DNA具有SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。将该质粒命名为pET436。SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。
实施例2 (使用了本发明转化体的处理物的L-α-氨基酸化合物的制备)
使用质粒pET174来转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将所得的转化体接种在10ml的含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在37℃振荡培养15小时。将所得培养液进行离心分离，得到了湿菌体。将约1g的该湿菌体悬浮在1ml 0.1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmφ)以2500rpm进行了20分钟的破碎处理。将所得破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到了约0.7ml的离心上清液。在所得的0.45ml离心上清液中混合1.0mg的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的钙盐(东京化成公司制)、2.5mg的NADH、0.05ml的100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、0.2mg的硫酸铵、0.4U的亮氨酸脱氢酶(和光公司制)，在30℃振荡了22小时。将该反应液在下述条件下供给基于液相色谱的含量分析。可知：相对于反应中使用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的钙盐的量，生成了1.6%的L-甲硫氨酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)；
流动相：将含有50mM的磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)与乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)=90：10的比例混合；
流量：0.8ml/分钟；
柱温：37℃；
检测：210nm。
使用质粒pET204来转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将所得的转化体接种在10ml的含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在37℃振荡培养15小时。将所得培养液进行离心分离，得到了湿菌体。将约1g的该湿菌体悬浮在1ml 0.1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmφ)以2500rpm进行了20分钟的破碎处理。将所得破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到了约0.7ml的离心上清液。在所得的0.45ml离心上清液中混合1.0mg的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的钙盐(东京化成公司制)、2.5mg的NADH、0.05ml的100mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、0.2mg的硫酸铵、0.4U的亮氨酸脱氢酶(和光公司制)，在30℃振荡了22小时。将该反应液在下述条件下供给基于液相色谱的含量分析。可知：相对于反应中使用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的钙盐的量，生成了2.8%的L-甲硫氨酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)；
流动相：将包含50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)=90：10的比例混合；
流量：0.8ml/分钟；
柱温：37℃；
检测：210nm。
使用质粒pET436来转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将所得的转化体接种在10ml的含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在37℃振荡培养15小时。将所得的培养液进行离心分离，得到了湿菌体。将约1g的该湿菌体悬浮在1ml 0.1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmφ)以2500rpm进行了20分钟的破碎处理。将所得破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到了约0.7ml的离心上清液。在所得的0.45ml离心上清液中混合1.0mg的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的钙盐(东京化成公司制)、2.5mg的NADH、0.05ml 100mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、0.2mg的硫酸铵、0.4U的亮氨酸脱氢酶(和光公司制)，在30℃振荡了22小时。在下述条件下将该反应液供给基于液相色谱的含量分析。可知：相对于反应中使用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的钙盐的量，生成了3.9%的L-甲硫氨酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)；
流动相：将包含50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)=90：10的比例混合；
流量：0.8ml/分钟；
柱温：37℃；
检测：210nm。
实施例3 (含有编码本蛋白质(B)的多核苷酸的重组载体和拥有该载体的转化体的制备、以及本蛋白质(B)的制备)
(1) 含有编码本蛋白质(B)的氨基酸序列的多核苷酸的重组载体和拥有该载体的转化体的制备(1)
将球形芽孢杆菌IFO3525株在100ml的灭菌LB培养基中进行培养，得到了0.4g菌体。使用Qiagen Genomic Tip(Qiagen公司制)，按照其附带的操作手册中记载的方法，由该菌体纯化染色体DNA(以下记作染色体DNA(B)。)。
根据Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247中记载的、编码来自球形芽孢杆菌IFO3525株的亮氨酸脱氢酶的核苷酸序列，合成具有SEQ IDNO: 18所示核苷酸序列(GCCATGGAAATCTTCAAGTATATGG)的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO:19所示核苷酸序列(GGGCCCGGGTTAACGGCCGTTCAAAATATT)的寡核苷酸引物。
使用具有SEQ ID NO: 18所示核苷酸序列的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO: 19所示核苷酸序列的寡核苷酸引物，以上述染色体DNA(B)为模板，按照采用了Expand HighFidelity PCR System(Roche Diagnostic公司制)的下述反应液组成进行了PCR。
[反应液组成]
染色体DNA(B)溶液 1μl
dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl
引物(20pmol/μl) 0.4μl
引物(4pmol/μl) 2μl
5×缓冲液(含MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi(3.5×103U/ml) 0.5μl
超纯水 35.1μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem 2400)中，在94℃保温2分钟，之后进行25次的94℃20秒、然后是55℃30秒、接着是72℃1.5分钟的保温循环，再于72℃保持7分钟。
之后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到了约1.1kb的DNA条带。
在剩下的PCR反应液中加入限制酶NcoI和SmaI，将DNA进行双酶切，纯化了酶切过的约1.1kb的DNA。
将质粒载体pTrc99A(GE Healthcare公司制)用限制酶NcoI和SmaI进行双酶切，纯化了酶切过的载体DNA。
混合这些已纯化的DNA，用T4 DNA连接酶进行连接，使用所得的连接液来转化大肠杆菌DH5α。
将所得转化体用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所选择的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)由各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶NcoI和XbaI进行双酶切，之后供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中确认了，分别有约1.1kb的DNA被插入上述载体中。将这些质粒中的1个命名为pTrcLD。
(2) 含有编码本蛋白质(B)的氨基酸序列的多核苷酸的重组载体和拥有该载体的转化体的制备(2)
根据Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247中记载的、编码来自球形芽孢杆菌IFO3525株的亮氨酸脱氢酶的核苷酸序列，合成具有SEQ ID NO:20所示核苷酸序列(GTCGCTATATTACCGGTGAAGATGTTG)的寡核苷酸(有义引物)和具有SEQ IDNO: 21所示核苷酸序列(CAACATCTTCACCGGTAATATAGCGAC)的寡核苷酸(反义引物)，作为用于将上述酶的第113位的丙氨酸置换成甘氨酸的突变导入引物。将具有SEQ ID NO: 20所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO: 21所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物，以上述(1)中制备的重组载体pTrcLD为模板，按照使用了QuikChange II定点诱变试剂盒(STRATAGENE公司制)的以下的反应液组成进行了PCR。
[反应液组成]
pTrcLD的DNA溶液 0.4μl
dNTP混合物(包含在上述试剂盒中) 1μl
有义引物(50μM) 0.4μl
反义引物(50μM) 0.4μl
10×缓冲液(包含在上述试剂盒中) 5μl
PfuUltra(包含在上述试剂盒中) 1μl
超纯水 41.8μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem 2400)中，在95℃保温1分钟，之后进行12次的95℃50秒、然后是55℃1分钟、接着是68℃5分钟的保温循环，之后在4℃保存。
在所得的PCR反应液中添加1μl的DpnI限制酶(包含在上述试剂盒中)，之后在37℃保温1小时。使用所得的保温液来转化大肠杆菌DH5α。
从所得的各转化体中提取质粒，之后利用双脱氧法确定突变位点的核苷酸序列，确认到导入了如同设计的突变。将具有SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列的质粒命名为pTrcLD(A113G)。SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。
(3) 含有编码本蛋白质(B)的氨基酸序列的多核苷酸的重组载体和拥有该载体的转化体的制备(3)
(3-1) 用于核苷酸置换的位点特异性突变导入
根据Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247中记载的、编码来自球形芽孢杆菌IFO3525株的亮氨酸脱氢酶的核苷酸序列，合成具有SEQ ID NO:22所示核苷酸序列(GATAGTATTCCAACCTATGTTGCGGC)的寡核苷酸(有义引物)和具有SEQ IDNO: 23所示核苷酸序列(GCCGCAACATAGGTTGGAATACTATC)的寡核苷酸(反义引物)，作为用于将第993位的腺嘌呤置换成胞嘧啶的突变导入引物。将具有SEQ ID NO: 22所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO: 23所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物，以上述(2)中制备的重组载体pTrcLD(A113G)为模板，按照使用了QuikChange II定点诱变试剂盒(STRATAGENE公司制)的下述反应液组成进行了PCR。
[反应液组成]
pTrcLD(A113G)的DNA溶液 1μl
dNTP混合物(包含在上述试剂盒中) 1μl
有义引物(50μM) 0.4μl
反义引物(50μM) 0.4μl
10×缓冲液(包含在上述试剂盒中) 5μl
PfuUltra(包含在上述试剂盒中) 1μl
超纯水 41.2μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem 2400)中，在95℃保温1分钟，之后进行12次的95℃50秒、然后是60℃1分钟、接着是68℃5.5分钟的保温循环，之后在4℃保存。
在所得的PCR反应液中添加1μl的DpnI限制酶(包含在上述试剂盒中)，之后在37℃保温1小时。使用所得的保温液来转化大肠杆菌DH5α。
从所得的各转化体中提取质粒，之后利用双脱氧法确定突变位点的核苷酸序列。将确认到了导入有如同设计的突变的质粒命名为pTrcLD (A113G)nd。
(3-2) 含有编码本蛋白质(B)的氨基酸序列的多核苷酸的重组载体和拥有该载体的转化体的制备
根据Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247中记载的、编码来自球形芽孢杆菌IFO3525株的亮氨酸脱氢酶的核苷酸序列，合成具有SEQ ID NO:24所示核苷酸序列(GGGCATATGGAAATCTTCAAGTATATGG)的寡核苷酸引物(有义引物)和具有SEQ ID NO: 25所示核苷酸序列(GGATCCTTAACGGCCGTTCAAAATATT)的寡核苷酸引物(反义引物)。使用具有SEQ ID NO: 24所示核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO: 25所示寡核苷酸引物，以上述(3-1)中制备的重组载体pTrcLD(A113G)nd为模板，按照使用了ExpandHigh Fidelity PCR System(Roche Diagnostic公司制)的下述反应液组成进行了PCR。
[反应液组成]
pTrcLD(A113G)nd的DNA溶液 1μl
dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl
引物(20pmol/μl) 各0.4μl
5×缓冲液(具有MgCl2) 10μl
enz.expandHiFi(3.5ｘ103U/ml) 0.5μl
超纯水 36.7μl。
将装有上述组成的反应液的容器放在热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem 2400)中，在94℃保温2分钟，之后进行10次的94℃15秒、然后是55℃30秒、接着是72℃1.5分钟的保温循环，然后进行20次的94℃15秒、然后是60℃30秒、接着是72℃1.5分钟的保温循环，再于72℃保持7分钟。
之后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到了约1.1kb的DNA条带。
在剩下的PCR反应液中加入限制酶NdeI和BamHI，将DNA进行双酶切，纯化了酶切过的约1.1kb的DNA。
将质粒载体pET-15b(Novagen公司制)用限制酶NdeI和BamHI进行双酶切，纯化了酶切过的载体DNA。
混合这些已纯化的DNA，用T4 DNA连接酶进行连接，利用所得的连接液来转化大肠杆菌DH5α。
将所得转化体用含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行培养，从生长出的菌落中随机挑选10个菌落。将所选择的菌落分别接种在2ml的含50μg/ml氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用限制酶NdeI和BamHI进行双酶切，之后供给琼脂糖凝胶电泳。在4个质粒中，分别确认到了有约1.1kb的DNA被插入上述载体中。如此操作而得到的质粒设计成可以表达在重组载体pTrcLD(A113G)nd所编码的亮氨酸脱氢酶的氨基末端添加由包含连续6个残基的组氨酸的20个氨基酸构成的氨基酸序列(SEQ ID NO: 44：MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHis)的蛋白质。将所得质粒中的1个命名为pETLD(A113G)。
(4) 本蛋白质(B)的制备
使用重组载体pETLD(A113G)来转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将所得的转化体接种在100ml的含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。将所得培养液进行离心分离，得到了约0.8g的湿菌体。将约0.8g的该湿菌体悬浮在10ml的包含0.5M的NaCl和5mM的咪唑的20mM的磷酸缓冲液(pH7.4)(以下有时还记作结合缓冲液。)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmφ)以2500rpm进行了20分钟的破碎处理。将所得破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到了约7ml的离心上清液。
在所得的约7ml的离心上清液中追加3ml的结合缓冲液达到约10ml，之后将其以5ml/分钟的流速加载到HisTrap HP柱(凝胶床5ml)(GE Healthcare公司制)上。使约25ml的结合缓冲液以5ml/分钟的流速流过该柱，将未吸附蛋白质洗脱。之后，维持流速不变，使约35ml的包含0.5M NaCl和29.75mM咪唑的20mM的磷酸缓冲液(pH7.4)流过，将未吸附蛋白质和低吸附蛋白质洗脱。然后，通过在流过47.5ml期间将咪唑浓度由29.75mM增加到500mM的梯度洗脱来洗脱吸附蛋白质，分离收集了25ml的咪唑浓度为160mM～443mM左右的级分。将所得级分供给Amicon Ultra-15(Millipore公司制)，进行脱盐浓缩和与0.5M Tris-HCl(pH9)的缓冲液交换，得到了约1.5ml的级分。以下，将该级分记作亮氨酸脱氢酶(A113G)纯化酶液。
实施例4 (使用了本发明的转化体处理物的L-α-氨基酸化合物的制备)
使用质粒pET174来转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将所得转化体接种在10ml的含0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在37℃振荡培养15小时。将所得的培养液进行离心分离，得到了湿菌体。将约1g的该湿菌体悬浮在1ml的0.1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmφ)以2500rpm进行了20分钟的破碎处理。将所得破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到了约0.7ml的离心上清液。在所得的0.4ml离心上清液中混合0.02ml的用氨水制备成了pH9的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(东京化成公司制)的40%水溶液、10mg的NAD+、2U的甲酸脱氢酶(SIGMA公司制)、2.5mg的甲酸铵、0.1ml的实施例3中得到的亮氨酸脱氢酶(A113G)纯化酶液(36g蛋白质/l)，在30℃振荡了16小时。将该反应液在下述条件下利用液相色谱进行含量分析。可知：相对于反应中使用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了1.7%的L-甲硫氨酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)；
流动相：将包含50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)=90：10的比例混合；
流量：0.8ml/分钟；
柱温：37℃；
检测：210nm。
使用质粒pET204来转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将所得转化体接种在10ml的含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在37℃振荡培养了15小时。将所得培养液进行离心分离，得到了湿菌体。将约1g的该湿菌体悬浮在1ml的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmφ)以2500rpm进行了20分钟的破碎处理。将所得破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到了约0.7ml的离心上清液。在所得的0.4ml的离心上清液中混合0.02ml的用氨水制备成了pH9的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(东京化成公司制)的40%水溶液、10mg的NAD+、2U的甲酸脱氢酶(SIGMA公司制)、2.5mg的甲酸铵、0.1ml的实施例3中得到的亮氨酸脱氢酶(A113G)纯化酶液(36g蛋白质/l)，在30℃振荡了16小时。将该反应液在下述条件下利用液相色谱进行含量分析。可知：相对于反应中使用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了9.7%的L-甲硫氨酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)；
流动相：将包含50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)=90：10的比例混合；
流量：0.8ml/分钟；
柱温：37℃
检测：210nm。
使用质粒pET436来转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将所得转化体接种在10ml的含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在37℃振荡培养15小时。将所得培养液进行离心分离，得到了湿菌体。将约1g的该湿菌体悬浮在1ml的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmφ)以2500rpm进行了20分钟的破碎处理。将所得破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到了约0.7ml的离心上清液。在所得的0.4ml的离心上清液中混合0.02ml用氨水制备成了pH9的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(东京化成公司制)的40%水溶液、10mg的NAD+、2U的甲酸脱氢酶(SIGMA公司制)、2.5mg的甲酸铵、0.1ml的实施例3中得到的亮氨酸脱氢酶(A113G)纯化酶液(36g蛋白质/l)，在30℃振荡了16小时。将该反应液在下述条件下利用液相色谱进行含量分析。可知：相对于反应中使用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了6.7%的L-甲硫氨酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)；
流动相：将包含50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)=90：10的比例混合；
流量：0.8ml/分钟；
柱温：37℃；
检测：210nm。
实施例5 (本发明多核苷酸(A)、本发明重组载体和本发明的转化体的制备)
制备具有分别在SEQ ID NO: 15所示核苷酸序列的5’末端添加核苷酸序列ccatggct、在3’末端添加核苷酸序列ggatcc的核苷酸序列的双链DNA。SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
将所制备的上述双链DNA(约1.2kb)用限制酶NcoI和BamHI进行双酶切，纯化了酶切过的DNA。
将质粒载体pTrc99A(GE Healthcare公司制)用限制酶NcoI和BamHI进行双酶切，纯化了酶切过的载体DNA。
混合这些已纯化的DNA，用T4 DNA连接酶进行连接，使用所得的连接液来转化大肠杆菌JM109株。
将所得的转化体用含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所选择的菌落分别接种在2ml的含有50μg/ml的氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养了17小时。使用QIAprep Spin MiniprepKit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将已提取出的各质粒的一部分用限制酶NcoI和BamHI进行双酶切，之后供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中确认了，分别有约1.2kb的DNA被插入上述载体中。确定所得质粒的核苷酸序列，将具有目标核苷酸序列的质粒命名为pTrc174。
制备具有分别在SEQ ID NO: 16所示核苷酸序列的5’末端侧添加核苷酸序列ccatggct、在3’末端侧添加核苷酸序列ggatcc的核苷酸序列的双链DNA。SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。
将所制备的上述双链DNA(约1.2kb)用限制酶NcoI和BamHI进行双酶切，纯化了酶切过的DNA。
将质粒载体pTrc99A(GE Healthcare公司制)用限制酶NcoI和BamHI进行双酶切，纯化了酶切过的载体DNA。
混合这些已纯化的DNA，用T4 DNA连接酶进行连接，使用所得的连接液来转化大肠杆菌JM109株。
将所得的转化体用含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所选择的菌落分别接种在2ml的含有50μg/ml的氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养了17小时。使用QIAprep Spin MiniprepKit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用NcoI和BamHI进行双酶切，之后供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中确认了，分别有约1.2kb的DNA被插入上述载体中。确定所得质粒的核苷酸序列，将具有目标核苷酸序列的质粒命名为pTrc204。
制备具有分别在SEQ ID NO: 17所示核苷酸序列的5’末端侧添加核苷酸序列ccatggct、在3’末端侧添加核苷酸序列ggatcc的核苷酸序列的双链DNA。SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。
将所制备的上述双链DNA(约1.2kb)用限制酶NcoI和BamHI进行双酶切，纯化了酶切过的DNA。
将质粒载体pTrc99A(GE Healthcare公司制)用限制酶NcoI和BamHI进行双酶切，纯化了酶切过的载体DNA。
混合这些已纯化的DNA，用T4 DNA连接酶进行连接，使用所得的连接液来转化大肠杆菌JM109株。
将所得转化体用含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行培养，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将所选择的菌落分别接种在2ml的含有50μg/ml的氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，在试管中、在37℃振荡培养了17小时。使用QIAprep Spin MiniprepKit(Qiagen公司制)从各培养菌体中提取出质粒。将所提取出的各质粒的一部分用NcoI和BamHI进行双酶切，之后供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中确认了，分别有上述约1.2kb的DNA被插入上述载体中。确定所得质粒的核苷酸序列，将具有目标核苷酸序列的质粒命名为pTrc436。
实施例6 (含有编码具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转换成还原型的能力的蛋白质的多核苷酸的重组载体和拥有该载体的转化体的制备)
以Journal of Applied Microbiology, 111 (2011) 1075-1085中所述的芽胞杆菌物种(Bacillus sp.) F1(2010)株来源的甲酸脱氢酶的氨基酸序列为基础，设计了SEQ IDNO: 26所示的核苷酸序列。SEQ ID NO: 26所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列。制备具有分别在SEQ ID NO: 26所示的核苷酸序列的5’末端侧添加核苷酸序列ccatggct、在3’末端侧添加核苷酸序列ggatcc的核苷酸序列的双链DNA。
用限制酶NcoI和BamHI对制备的上述双链DNA(约1.2kb)进行双酶切，纯化了酶切过的DNA。
用限制酶NcoI和BamHI对质粒载体pTrc99A(GE Healthcare公司制)进行双酶切，纯化了酶切过的载体DNA。
将这些纯化的DNA混合，用T4 DNA连接酶连接，并用所得的连接液转化大肠杆菌JM109株。
在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养所得的转化体，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将挑选的菌落分别接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的2ml灭菌LB培养基中，在试管中于37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，从各自的培养菌体提取出质粒。用NcoI和BamHI对提取出的各质粒的一部分进行双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳，在6个质粒中确认了，分别有约1.2kb的DNA插入到上述载体中。确定所得的质粒的核苷酸序列，将具有目标核苷酸序列的质粒命名为pTrcFDH。
用质粒pTrcFDH转化大肠杆菌JM109株。将所得的转化体接种到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。离心分离所得的培养液，得到湿菌体。将约0.7g该湿菌体悬浮到10ml的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎处理20分钟。将所得的破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到约0.7ml离心上清液。
实施例7 (使用本发明的转化体的处理物制备L-α-氨基酸化合物)
用质粒pTrc174转化大肠杆菌JM109株。将所得的转化体接种到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。离心分离所得的培养液，得到湿菌体。将约0.1g该湿菌体悬浮到1ml的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎处理20分钟。将所得的破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到约0.7ml离心上清液。在0.4ml所得的离心上清液中混合：0.02ml用氨水制备成pH9的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(东京化成公司制)的40%水溶液、10mg NAD＋、0.05ml实施例6中所得的离心上清液、2.5mg甲酸铵、0.05ml实施例3中所得的亮氨酸脱氢酶(A113G)纯化酶液(36g蛋白质/l)，在30℃振荡17.5小时。将该反应液在下述条件下利用液相色谱进行含量分析。可知：相对于反应中所用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了5.6%的L-甲硫氨酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：将含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合
流速：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
用质粒pTrc204转化大肠杆菌JM109株。将所得的转化体接种到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。离心分离所得的培养液，得到湿菌体。将约0.1g该湿菌体悬浮到1ml的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎处理20分钟。将所得的破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到约0.7ml离心上清液。在0.4ml所得的离心上清液中混合：0.02ml用氨水制备成pH9的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(东京化成公司制)的40%水溶液、10mg NAD＋、0.05ml实施例6中所得的离心上清液、2.5mg甲酸铵、0.05ml实施例3中所得的亮氨酸脱氢酶(A113G)纯化酶液(36g蛋白质/l)，在30℃振荡17.5小时。将该反应液在下述条件下利用液相色谱进行含量分析。可知：相对于反应中所用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了30.2%的L-甲硫氨酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：将含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合
流速：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
用质粒pTrc436转化大肠杆菌JM109株。将所得的转化体接种到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。离心分离所得的培养液，得到湿菌体。将约0.1g该湿菌体悬浮到1ml的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎处理20分钟。将所得的破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到约0.7ml离心上清液。在0.4ml所得的离心上清液中混合：0.02ml用氨水制备成pH9的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(东京化成公司制)的40%水溶液、10mg NAD＋、0.05ml实施例6中所得的离心上清液、2.5mg甲酸铵、0.05ml实施例3中所得的亮氨酸脱氢酶(A113G)纯化酶液(36g蛋白质/l)，在30℃振荡17.5小时。将该反应液在下述条件下利用液相色谱进行含量分析。可知：相对于反应中所用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了12.1%的L-甲硫氨酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：将含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合
流速：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
实施例8 (本发明的多核苷酸(A)、本发明的重组载体和本发明的转化体的制备)
合成分别具有SEQ ID NO: 27至32所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物。
[表2]
使用具有SEQ ID NO: 27所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO: 28所示的寡核苷酸引物，将质粒pTrc174作为模板，以下述反应液组成进行了PCR。
[反应液组成]
pTrc174的DNA溶液　　　　　　　 1.5μl
dNTP(各2mM的混合物)　　　　　　10μl
引物(50pmol/μl) 　　　　　　　 各0.3μl
2×缓冲液 　　　　　 　　　　　25μl
KOD-FX(1U/μl，东洋纺公司制) 　　1μl
超纯水　　　　　　　　　　　　 11.9μl。
将加入了上述组成的反应液的容器置于热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem 9700)中，在94℃保温2分钟后，进行30次下述保温循环：98℃ 10秒、接着60℃ 30秒、接着68℃ 60秒，然后在4℃保持。
其后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到约1.2kb的DNA条带。
在剩余的PCR反应液中加入限制酶NdeI和BamHI，对DNA进行双酶切，纯化了酶切过的约1.2kb的DNA。
用限制酶NdeI和BamHI对质粒载体pET-15b(Novagen公司制)进行双酶切，纯化了酶切过的载体DNA。
将这些纯化的DNA混合，用T4 DNA连接酶连接，并用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养所得的转化体，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将挑选的菌落分别接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的2ml灭菌LB培养基中，在试管中于37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，从各自的培养菌体提取出质粒。用NcoI和BamHI对提取出的各质粒的一部分进行双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中确认了，分别有约1.2kb的DNA插入到上述载体中。如此操作而得到的质粒设计成可以表达在重组载体pTrc174所编码的本发明蛋白质(A)的氨基末端添加由包含连续6个残基的组氨酸的20个氨基酸组成的氨基酸序列(SEQ ID NO:44：MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHis)的蛋白质。将所得的质粒中的1个命名为pET174SC。
使用具有SEQ ID NO: 29所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO: 30所示的寡核苷酸引物，将质粒pTrc204作为模板，以下述反应液组成进行了PCR。
[反应液组成]
pTrc204的DNA溶液　　　　　　　 1.5μl
dNTP(各2mM的混合物)　　　　　　10μl
引物(50pmol/μl) 　　　　　　　 各0.3μl
2×缓冲液 　　　　　　 　　　　25μl
KOD-FX(1U/μl，东洋纺公司制)　　 1μl
超纯水　　　　　　 　　　　　　11.9μl。
将加入了上述组成的反应液的容器置于热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem 9700)中，在94℃保温2分钟后，进行30次下述保温循环：98℃ 10秒、接着60℃ 30秒、接着68℃ 60秒，然后在4℃保持。
其后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到约1.2kb的DNA条带。
在剩余的PCR反应液中加入限制酶NdeI和BamHI，对DNA进行双酶切，纯化了酶切过的约1.2kb的DNA。
用限制酶NdeI和BamHI对质粒载体pET-15b(Novagen公司制)进行双酶切，纯化了酶切过的载体DNA。
将这些纯化的DNA混合，用T4 DNA连接酶连接，并用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养所得的转化体，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将挑选的菌落分别接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的2ml灭菌LB培养基中，在试管中于37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，从各自的培养菌体提取出质粒。用NcoI和BamHI对提取出的各质粒的一部分进行双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中确认到，分别有约1.2kb的DNA插入到上述载体中。如此操作而得到的质粒设计成可以表达在重组载体pTrc204所编码的本发明蛋白质(A)的氨基末端添加由包含连续6个残基的组氨酸的20个氨基酸组成的氨基酸序列(SEQ ID NO:44：MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHis)的蛋白质。将所得的质粒中的1个命名为pET204SC。
使用具有SEQ ID NO: 31所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO: 32所示的寡核苷酸引物，将质粒pTrc436作为模板，以下述反应液组成进行了PCR。
[反应液组成]
pTrc436的DNA溶液　　　　　　　　1.5μl
dNTP(各2mM的混合物)　　　　　　 10μl
引物(50pmol/μl) 　　　　　　　 各0.3μl
2×缓冲液 　　　　　 　　　　　25μl
KOD-FX(1U/μl，东洋纺公司制)　　　1μl
超纯水　　　　　　　　　　　　　11.9μl。
将加入了上述组成的反应液的容器置于热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem 9700)中，在94℃保温2分钟后，进行30次下述保温循环：98℃ 10秒、接着60℃ 30秒、接着68℃ 60秒，然后在4℃保持。
其后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到约1.2kb的DNA条带。
在剩余的PCR反应液中加入限制酶NdeI和XhoI，对DNA进行双酶切，纯化了酶切过的约1.2kb的DNA。
用限制酶NdeI和XhoI对质粒载体pET-22b(Novagen公司制)进行双酶切，纯化了酶切过的载体DNA。
将这些酶切过的DNA混合，用T4 DNA连接酶连接，并用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养所得的转化体，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将挑选的菌落分别接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的2ml灭菌LB培养基中，在试管中于37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，从各自的培养菌体提取出质粒。用NcoI和XhoI对提取出的各质粒的一部分进行双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中确认到，分别有约1.2kb的DNA插入到上述载体中。如此操作而得到的质粒设计成可以表达在重组载体pTrc436所编码的本发明蛋白质(A)的氨基末端添加由包含连续6个残基的组氨酸的20个氨基酸组成的氨基酸序列(SEQ ID NO:44：MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHis)的蛋白质。将所得的质粒中的1个命名为pET436SC。
实施例9 (含有编码具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的多核苷酸的重组载体和拥有该载体的转化体的制备，以及该蛋白质的制备)
(1) 含有编码具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的氨基酸序列的多核苷酸的重组载体和拥有该载体的转化体的制备
在100ml灭菌的LB培养基中培养大肠杆菌BL21(DE3)株，得到约1.0g菌体。使用QiagenGenomic Tip (Qiagen公司制)，按照其附带的操作手册中记载的方法，从该菌体纯化了染色体DNA(以下记为染色体DNA(C))。
根据Journal of Bacteriology, 170(9) (1988) 4415-4419中记载的、编码来自大肠杆菌的过氧化氢酶的核苷酸序列，合成了具有SEQ ID NO: 33所示的核苷酸序列(CCATATGAGCACGTCAGACGATATCCATAAC)的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO: 34所示的核苷酸序列(ACTCGAGCAGCAGGTCGAAACGGTCGAGGTTC)的寡核苷酸引物。
使用具有SEQ ID NO: 33所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物，将前述染色体DNA(C)作为模板，按照采用了ExpandHigh Fidelity PCR System(Roche Diagnostic公司制)的以下反应液组成进行了PCR。
[反应液组成]
染色体DNA(C)溶液　　　　　　　　1μl
dNTP(各2.5mM的混合物)　　　　　 1μl
引物(20pmol/μl)　　　　　　　　 各0.4μl
5×缓冲液(具有MgCl2)　 　　　　 10μl
enz.expandHiFi (3.5ｘ103U/ml) 　0.5μl
超纯水 　　　　 　　　　　　　　33.7μl。
将加入了上述组成的反应液的容器置于热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400)中，在94℃保温2分钟后，进行10次下述保温循环：94℃ 15秒、接着60℃ 30秒、接着72℃ 2分钟，接着进行20次下述保温循环：94℃ 15秒、接着65℃ 30秒、接着72℃ 2分钟，进而在72℃保持7分钟。
其后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到约2.2kb的DNA条带。
在剩余的PCR反应液中加入限制酶NdeI和XhoI，对DNA进行双酶切，纯化了酶切过的约2.2kb的DNA。
用限制酶NdeI和XhoI对质粒载体pET-22b(Novagen公司制)进行双酶切，纯化了酶切过的载体DNA。
将这些纯化的DNA混合，用T4 DNA连接酶连接，并用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养所得的转化体，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将挑选的菌落分别接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的2ml灭菌LB培养基中，在试管中于37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，从各自的培养菌体提取出质粒。用NdeI和XhoI对提取出的各质粒的一部分进行双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中确认到，分别有约2.2kb的DNA插入到上述载体中。如此操作而得到的质粒设计成可以表达在上述过氧化氢酶的羧基末端添加由包含连续6个残基的组氨酸的8个氨基酸组成的氨基酸序列(SEQ ID NO: 45：LeuGluHisHisHisHisHisHis)的蛋白质。将所得的质粒中的1个命名为pETcatE。
(2)具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的制备
用重组载体pETcatE转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将所得的转化体接种到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中，在37℃振荡培养15小时。离心分离所得的培养液，得到约0.8g湿菌体。将约0.8g该湿菌体悬浮到10ml含有0.5M NaCl和5mM咪唑的20mM磷酸缓冲液(pH7.4)(即，结合缓冲液)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎处理20分钟。将所得的破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到约7ml离心上清液。
在约7ml所得的离心上清液中追加3ml结合缓冲液使达到约10ml之后，将其以1ml/min的流速加载到HisTrap HP柱(凝胶床1ml)(GE Healthcare Japan公司制)上。使约5ml的结合缓冲液以1ml/分钟的流速流过该柱，将未吸附蛋白质洗脱。之后，维持流速不变，使约7ml的包含0.5M NaCl和29.75mM咪唑的20mM的磷酸缓冲液(pH7.4)流过，将未吸附蛋白质和低吸附蛋白质洗脱。接着，通过在流过9.5ml期间将咪唑浓度从29.75mM增加到500mM的梯度洗脱来洗脱吸附蛋白质，分离收集了5ml的咪唑浓度为30mM~180mM左右的级分。将所得级分供给Amicon Ultra-15(Millipore公司制)，进行脱盐浓缩和与0.1M Tris-HCl(pH8)的缓冲液交换，得到约1ml的级分。以下，将该级分记作过氧化氢酶纯化酶液。
实施例10 (使用本发明的转化体的处理物制备α-氧代羧酸化合物)
用质粒pET174SC转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将所得的转化体接种到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。离心分离所得的培养液，得到湿菌体。将约0.1g该湿菌体悬浮到1ml的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎处理20分钟。将所得的破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到约0.7ml离心上清液。在0.35ml所得的离心上清液中混合：0.02ml用氨水制备成pH9的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(东京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml实施例9中所得的过氧化氢酶纯化酶液(3.3g蛋白质/l)和0.1ml的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，在30℃振荡22小时。将该反应液在下述条件下利用液相色谱进行含量分析。可知：相对于反应中所用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了18.0%的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：将含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合
流速：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
用质粒pET204SC转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将所得的转化体接种到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。离心分离所得的培养液，得到湿菌体。将约0.1g该湿菌体悬浮到1ml的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)、玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎处理20分钟。将所得的破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到约0.7ml离心上清液。在0.35ml所得的离心上清液中混合：0.02ml用氨水制备成pH9的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(东京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml实施例9中所得的过氧化氢酶纯化酶液(3.3g蛋白质/l)和0.1ml的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，在30℃振荡22小时。将该反应液在下述条件下利用液相色谱进行含量分析。可知：相对于反应中所用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了22.8%的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：将含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合
流速：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
用质粒pET436SC转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将所得的转化体接种到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。离心分离所得的培养液，得到湿菌体。将约0.1g该湿菌体悬浮到1ml的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎处理20分钟。将所得的破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到约0.7ml离心上清液。在0.35ml所得的离心上清液中混合：0.02ml用氨水制备成pH9的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(东京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml实施例9中所得的过氧化氢酶纯化酶液(3.3g蛋白质/l)和0.1ml的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，在30℃振荡22小时。将该反应液在下述条件下利用液相色谱进行含量分析。可知：相对于反应中所用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了24.2%的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：将含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合
流速：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
实施例11 (含有编码具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转换成还原型的能力的蛋白质的多核苷酸的重组载体和拥有该载体的转化体的制备，以及该蛋白质的制备)
(1)含有编码具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转换成还原型的能力的蛋白质的多核苷酸的重组载体和拥有该载体的转化体的制备
以Journal of Applied Microbiology 111 (2011) 1075-1085中所述的芽胞杆菌物种(Bacillus sp.) F1(2010)株来源的甲酸脱氢酶的氨基酸序列为基础，以其密码子使用频率与大肠杆菌中的密码子使用频率相近的方式设计SEQ ID NO: 26所示的核苷酸序列，基于该核苷酸序列，合成了具有SEQ ID NO: 35所示的核苷酸序列(CCATATGGCTAAGATCGTTTGCGTTCTGTAC)的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO: 36所示的核苷酸序列(ACTCGAGAGCAGATTTCTTGAAACGTGCAG)的寡核苷酸引物。
使用具有SEQ ID NO: 35所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物，将重组载体pTrcFDH作为模板，按照采用了ExpandHigh Fidelity PCR System(Roche Diagnostic公司制)的以下反应液组成进行了PCR。
[反应液组成]
pTrcFDH的DNA溶液 　　 　　　　1μl
dNTP(各2.5mM的混合物)　　　　　1μl
引物(20pmol/μl)　　　　　　　　各0.4μl
5×缓冲液(具有MgCl2)　 　　　　10μl
enz.expandHiFi (3.5×103U/ml)　0.5μl
超纯水 　　　　　　　　　　　　33.7μl。
将加入了上述组成的反应液的容器置于热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400)中，在94℃保温2分钟后，进行10次下述保温循环：94℃ 15秒、接着55℃ 30秒、接着72℃ 1.5分钟，接着进行20次下述保温循环：94℃ 15秒、接着60℃ 30秒、接着72℃1.5分钟，进而在72℃保持7分钟。
其后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到约1.2kb的DNA条带。
在剩余的PCR反应液中加入限制酶NdeI和XhoI，对DNA进行双酶切，纯化了酶切过的约1.2kb的DNA。
用限制酶NdeI和XhoI对质粒载体pET-22b(Novagen公司制)进行双酶切，纯化了酶切过的载体DNA片段。
将这些纯化的DNA混合，用T4 DNA连接酶连接，并用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养所得的转化体，从生长出的菌落中随机挑选8个菌落。将挑选的菌落分别接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的2ml灭菌LB培养基中，在试管中于37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，从各自的培养菌体提取出质粒。用NdeI和XhoI对提取出的各质粒的一部分进行双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。在6个质粒中确认到，分别有约1.2kb的DNA插入到上述载体中。如此操作而得到的质粒设计成可以表达在上述甲酸脱氢酶的羧基末端添加由包含连续6个残基的组氨酸的8个氨基酸组成的氨基酸序列(SEQ ID NO: 45：LeuGluHisHisHisHisHisHis)的蛋白质。将所得的质粒中的1个命名为pETFDH。
(2)具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转换成还原型的能力的蛋白质的制备
用重组载体pETFDH转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将所得的转化体接种到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中，在37℃振荡培养15小时。离心分离所得的培养液，得到约0.8g湿菌体。将约0.8g该湿菌体悬浮到10ml含有0.5M NaCl和5mM咪唑的20mM磷酸缓冲液(pH7.4)(即，结合缓冲液)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎处理20分钟。将所得的破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到约7ml离心上清液。
在约7ml所得的离心上清液中追加3ml结合缓冲液使达到约10ml之后，将其以1ml/min的流速加载到HisTrap HP柱(凝胶床1ml)(GE Healthcare公司制)上。使约5ml的结合缓冲液以1ml/分钟的流速流过该柱，将未吸附蛋白质洗脱。之后，维持流速不变，使约7ml的包含0.5M NaCl和29.75mM咪唑的20mM的磷酸缓冲液(pH7.4)流过，将未吸附蛋白质和低吸附蛋白质洗脱。接着，通过在流过9.5ml期间将咪唑浓度从29.75mM增加到500mM的梯度洗脱来洗脱吸附蛋白质，分离收集了4ml的咪唑浓度为30mM~230mM左右的级分。将所得级分供给Amicon Ultra-15(Millipore公司制)，进行脱盐浓缩和与0.1M Tris-HCl(pH8)的缓冲液交换，得到约1ml的级分。以下，将该级分记作甲酸脱氢酶纯化酶液。
实施例12 (使用本发明的转化体的处理物制备L-α-氨基酸化合物)
用质粒pET174SC转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将所得的转化体接种到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。离心分离所得的培养液，得到湿菌体。将约0.1g该湿菌体悬浮到1ml的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎处理20分钟。将所得的破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到约0.7ml离心上清液。在0.35ml所得的离心上清液中混合：0.02ml用氨水制备成pH9的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(东京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml实施例9中所得的过氧化氢酶纯化酶液(3.3g蛋白质/l)、0.05ml实施例11中所得的甲酸脱氢酶纯化酶液(5.3g蛋白质/l)、10mg NAD＋、2.5mg甲酸铵和0.05ml实施例3中所得的亮氨酸脱氢酶(A113G)纯化酶液(36g蛋白质/l)，在30℃振荡22小时。将该反应液在下述条件下利用液相色谱进行含量分析。可知：相对于反应中所用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了12.0%的L-甲硫氨酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：将含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合
流速：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
用质粒pET204SC转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将所得的转化体接种到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。离心分离所得的培养液，得到湿菌体。将约0.1g该湿菌体悬浮到1ml的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎处理20分钟。将所得的破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到约0.7ml离心上清液。在0.35ml所得的离心上清液中混合：0.02ml用氨水制备成pH9的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(东京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml实施例9中所得的过氧化氢酶纯化酶液(3.3g蛋白质/l)、0.05ml实施例11中所得的甲酸脱氢酶纯化酶液(5.3g蛋白质/l)、10mg NAD＋、2.5mg甲酸铵和0.05ml实施例3中所得的亮氨酸脱氢酶(A113G)纯化酶液(36g蛋白质/l)，在30℃振荡22小时。将该反应液在下述条件下利用液相色谱进行含量分析。可知：相对于反应中所用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了7.7%的L-甲硫氨酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：将含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合
流速：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
用质粒pET436SC转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将所得的转化体接种到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。离心分离所得的培养液，得到湿菌体。将约0.1g该湿菌体悬浮到1ml的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎处理20分钟。将所得的破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到约0.7ml离心上清液。在0.35ml所得的离心上清液中混合：0.02ml用氨水制备成pH9的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(东京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml实施例9中所得的过氧化氢酶纯化酶液(3.3g蛋白质/l)、0.05ml实施例11中所得的甲酸脱氢酶纯化酶液(5.3g蛋白质/l)、10mg NAD＋、2.5mg甲酸铵和0.05ml实施例3中所得的亮氨酸脱氢酶(A113G)纯化酶液(36g蛋白质/l)，在30℃振荡22小时。将该反应液在下述条件下利用液相色谱进行含量分析。可知：相对于反应中所用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了33.9%的L-甲硫氨酸。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：将含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合
流速：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
实施例13 (本发明重组载体的制备)
(1)编码本蛋白质(B)的多核苷酸的制备
以pTrc99A(GE Healthcare公司制)的SD序列附近的序列为参考，合成了具有SEQ IDNO: 37所示的核苷酸序列(CGGATCCGAGGAAACAGACCATGG)的寡核苷酸引物。以Journal ofMolecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247中所述的球形芽孢杆菌IFO3525株来源的亮氨酸脱氢酶的序列为基础，合成了具有SEQ ID NO: 38所示的核苷酸序列(ctcagagTTAACGGCCGTTCAAAATATT)的寡核苷酸引物。
使用具有SEQ ID NO: 37所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物，将实施例3(2)中所述的重组载体pTrcLD(A113G)作为模板，按照采用了Expand High Fidelity PCR System(Roche Diagnostic公司制)的以下反应液组成进行了PCR。
[反应液组成]
质粒pTrcLD液　　　　　　　　　 1μl
dNTP(各2.5mM的混合物)　 　　　　1μl
引物(20pmol/μl)　　　　　　　 　各0.4μl
5×缓冲液(具有MgCl2)　 　　　　 10μl
enz.expandHiFi (3.5×103U/ml)　 0.5μl
超纯水 　　　　　 　　　　　　　36.7μl。
将加入了上述组成的反应液的容器置于热循环仪(PERKIN ELMER-GeneAmp PCRSystem2400)中，在94℃保温2分钟后，进行25次下述保温循环：94℃ 20秒、接着55℃ 30秒、接着72℃ 1.5分钟，进而在72℃保持7分钟。
其后，将上述PCR反应液的一部分供给琼脂糖凝胶电泳。检测到约1.1kb的DNA条带。
在剩余的PCR反应液中加入限制酶BamHI和XbaI，对DNA进行双酶切，纯化了酶切过的约1.1kbp的DNA。
(2)本发明载体的制备
用限制酶BamHI和XbaI对实施例5中所述的重组载体pTrc174进行双酶切，纯化酶切过的DNA。
将所得的DNA和上述(1)中纯化的约1.1kbp的DNA混合，用T4 DNA连接酶连接，并用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养所得的转化体，从生长出的菌落中随机挑选菌落。将挑选的菌落分别接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的2ml灭菌LB培养基中，在试管中于37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，从各自的培养菌体提取出质粒。用BamHI和XbaI对提取出的各质粒的一部分进行双酶切后，供给琼脂糖凝胶电泳。确认在所得的质粒中插入有约1.1kb的DNA。以下将如此得到的质粒记作pTrc174LD(A113G)。
用限制酶BamHI和XbaI对实施例5中所述的重组载体pTrc204进行双酶切，纯化酶切过的DNA。
将所得的DNA和上述(1)中纯化的约1.1kbp的DNA混合，用T4 DNA连接酶连接，并用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养所得的转化体，从生长出的菌落中随机挑选菌落。将挑选的菌落分别接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的2ml灭菌LB培养基中，在试管中于37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，从各自的培养菌体提取出质粒。用BamHI和XbaI对提取出的各质粒的一部分进行双酶切后，供给电泳。确认在所得的质粒中插入有约1.1kbp的DNA。以下将如此得到的质粒记作pTrc204LD(A113G)。
用限制酶BamHI和XbaI对实施例5中所述的质粒载体pTrc436进行双酶切，纯化酶切过的DNA。
将所得的DNA和上述(1)中纯化的约1.1kbp的DNA混合，用T4 DNA连接酶连接，并用所得的连接液转化大肠杆菌DH5α。
在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养所得的转化体，从生长出的菌落中随机挑选菌落。将挑选的菌落分别接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的2ml灭菌LB培养基中，在试管中于37℃振荡培养17小时。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，从各自的培养菌体提取出质粒。用BamHI和XbaI对提取出的各质粒的一部分进行双酶切后，供给电泳。确认在所得的质粒中插入有约1.1kbp的DNA。以下将如此得到的质粒记作pTrc436LD(A113G)。
实施例14 (使用本发明的转化体的处理物制备L-α-氨基酸化合物)
用实施例13的(2)中所述的质粒pTrc174LD(A113G)转化大肠杆菌JM109株。将所得的转化体接种到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。离心分离所得的培养液，得到湿菌体。将约0.1g该湿菌体悬浮到1ml的0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎处理20分钟。将所得的破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到约0.7ml离心上清液。在0.35ml所得的离心上清液中混合：0.02ml用氨水制备成pH9的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(东京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml实施例9中所述的过氧化氢酶纯化酶液(3.3g蛋白质/l)、0.05ml实施例11中所述的甲酸脱氢酶纯化酶液(5.3g蛋白质/l)、10mg NAD＋和2.5mg甲酸铵，在30℃振荡22小时。对于该反应液，在下述条件下进行基于液相色谱的含量分析。确认L-甲硫氨酸相对于反应中所用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的量的收率。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：将含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合
流速：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
用实施例13的(2)中所述的质粒pTrc204LD(A113G)转化大肠杆菌JM109株。将所得的转化体接种到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。离心分离所得的培养液，得到湿菌体。将约0.1g该湿菌体悬浮到1ml的0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎处理20分钟。将所得的破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到约0.7ml离心上清液。在0.35ml所得的离心上清液中混合：0.02ml用氨水制备成pH9的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(东京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml实施例9中所述的过氧化氢酶纯化酶液(3.3g蛋白质/l)、0.05ml实施例11中所述的甲酸脱氢酶纯化酶液(5.3g蛋白质/l)、10mg NAD＋和2.5mg甲酸铵，在30℃振荡22小时。对于该反应液，在下述条件下进行基于液相色谱的含量分析。确认L-甲硫氨酸相对于反应中所用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的量的收率。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：将含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合
流速：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
用实施例13的(2)中所述的质粒pTrc436LD(A113G)转化大肠杆菌JM109株。将所得的转化体接种到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的20ml灭菌LB培养基中，在30℃振荡培养15小时。离心分离所得的培养液，得到湿菌体。将约0.1g该湿菌体悬浮到1ml的0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎处理20分钟。将所得的破碎液在8000rpm、4℃离心分离10分钟，得到约0.7ml离心上清液。在0.35ml所得的离心上清液中混合：0.02ml用氨水制备成pH9的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(东京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml实施例9中所述的过氧化氢酶纯化酶液(3.3g蛋白质/l)、0.05ml实施例11中所述的甲酸脱氢酶纯化酶液(5.3g蛋白质/l)、10mg NAD＋和2.5mg甲酸铵，在30℃振荡22小时。对于该反应液，在下述条件下进行基于液相色谱的含量分析。确认L-甲硫氨酸相对于反应中所用的2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的量的收率。
(含量分析条件)
柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)
流动相：将含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸钠水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合
流速：0.8ml/分钟
柱温：37℃
检测：210nm。
工业利用性
依据本发明，可提供氧化酶、编码该酶的多核苷酸和利用它们的甲硫氨酸等α-氨基酸化合物的制备方法等。
[序列表自由文本]
SEQ ID NO: 9-14
设计用于PCR的寡核苷酸引物
SEQ ID NO: 15-17
编码氧化酶的多核苷酸
SEQ ID NO: 18-38
设计用于PCR的寡核苷酸引物
SEQ ID NO: 44-45
设计的氨基酸序列。
序列表
<110> SUMITOMO CHEMICAL CO., LTD.
<120> 氧化酶、编码该酶的多核苷酸、以及它们的应用
<130> S33396WO01
<150> JP2014-143021
<151> 2014-7-11
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 391
<212> PRT
<213> 反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans）
<400> 1
Met Ser Arg Leu Asp Arg Cys Leu Ser Val Arg Asp Phe Glu Arg Glu
1 5 10 15
Ala Arg Arg Ile Met Pro Arg Cys Val Glu Gly Tyr Val Cys Gly Gly
20 25 30
Thr Glu Asp Gly Ala Ser Leu Ala Glu Ser Val Arg Ala Leu Gly Asp
35 40 45
Val Gly Phe Arg Pro Arg Gly Leu Arg Val Val Asp Gln Arg Asn Ser
50 55 60
Lys Val Glu Leu Tyr Gly Gln Thr Tyr Ala Met Pro Val Gly Phe Ala
65 70 75 80
Pro Thr Gly Phe Ser Ala Ile Val Met His Glu Cys Asp Leu Ala Leu
85 90 95
Ala Gln Ala Ala Gln His Ala Glu Ile Pro Phe Ile Ile Ser Gly Ala
100 105 110
Ser Ser Val Pro Leu Glu Arg Leu Gln Gln Ala Thr Gly Lys Arg Cys
115 120 125
Trp Tyr Gln Ala Tyr Leu Pro Gly Asn Thr Glu Arg Ile Gly Arg Leu
130 135 140
Leu Gly Arg Leu Arg Gln Ala Glu Ile Pro Val Leu Val Val Thr Ile
145 150 155 160
Asp Thr Cys Val Gly Ala Asn Arg Glu Asn Leu Gln Arg Leu Ala Phe
165 170 175
Thr Val Pro Phe Lys Met Ser Ala Ser Val Val Leu Asp Gly Leu Arg
180 185 190
His Pro Arg Trp Ser Leu Asn Val Phe Met Arg Thr Leu Leu Gly Ser
195 200 205
Gly Val Pro Arg Phe Ser Asn Leu Cys Glu Glu Ile Gly Pro Pro Ile
210 215 220
Thr Gln Asp Pro Pro Asn Gly Phe Arg Gly Glu Arg Asp Lys Leu Ser
225 230 235 240
Trp Glu His Ile Arg Trp Ile Arg Glu Asn Trp Pro Gly Lys Leu Val
245 250 255
Leu Lys Gly Val Met His Pro Asp Asp Ala Arg Gln Ala Cys Val Ala
260 265 270
Gly Ala Asp Gly Val Ile Val Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp
275 280 285
Gly Cys Ile Ser Pro Leu Gln Ala Leu Pro Glu Ile Val Ala Ala Val
290 295 300
Pro Pro Gly Phe Pro Val Met Val Asp Gly Gly Phe Arg Arg Gly Ser
305 310 315 320
Asp Val Leu Lys Ala Val Ala Leu Gly Ala Arg Met Val Phe Thr Gly
325 330 335
Arg Pro Gln Leu Phe Gly Ala Ala Val Gly Gly Gln Ala Gly Ile Arg
340 345 350
Lys Val Ala Ala Ile Phe Arg Ser Glu Ile Ser Thr Asp Leu Ala Leu
355 360 365
Leu Gly Cys Ser Ser Leu Ala Asp Val Thr Pro Asp Leu Ile Ala Pro
370 375 380
Ile Arg Pro Ala Ser Pro Ala
385 390
<210> 2
<211> 1173
<212> DNA
<213> 反硝化无色杆菌
<400> 2
atgagccggc tggaccgctg cctgtcggtg cgcgacttcg agcgcgaggc gcggcgcatc 60
atgccgcgct gcgtcgaagg ctacgtctgc ggcggcaccg aggacggcgc ttcgctggcc 120
gagtcggtgc gcgccctggg cgacgtcggg ttccggccgc gggggctgcg cgtagtggac 180
cagcgcaaca gcaaggtcga actctacggc cagacctacg ccatgccggt gggtttcgcg 240
cccaccggat tctccgccat cgtcatgcac gagtgcgacc tggcgctggc gcaggccgcg 300
cagcacgccg agattccgtt catcatcagc ggcgcttcca gcgtgccgct ggaacgcctg 360
cagcaggcca cgggcaagcg ctgctggtac caggcctatc tgccgggcaa caccgaacgc 420
atcggcaggc tgttgggccg cctgcgccag gccgagatcc cggtgctggt ggtcaccatc 480
gacacctgcg taggcgcgaa ccgcgagaac ctgcagcgcc tggccttcac cgtgcctttc 540
aagatgagcg ccagcgtggt actcgacggc ctgcggcatc cgcgctggag cctgaacgtc 600
ttcatgcgca cgctgctggg cagcggcgtg ccgcgcttct cgaatctttg cgaggagatc 660
ggcccgccca tcacgcagga cccacccaac ggctttcgcg gcgaacgcga caagctgtcg 720
tgggagcaca tccgctggat tcgcgagaac tggccgggca agctggtgct caagggcgtg 780
atgcatcccg acgacgcgcg ccaggcctgc gtggccggcg ccgacggcgt catcgtctcc 840
aaccacggcg gccgccagct ggacggctgc atttcgccgc tgcaggcgct gcccgagatc 900
gtggcggcgg tgccgcccgg atttccggtc atggtcgacg gcggattccg ccgcggctcg 960
gacgtgctca aggcggtggc cctgggcgcg cgcatggtgt tcaccggcag gccgcagctt 1020
ttcggggcgg cggtcggcgg ccaggccggc atccgcaagg tggccgcgat tttccgcagc 1080
gaaatctcga ccgacctggc gctgctgggc tgcagcagcc tggccgacgt cacgccggat 1140
ctgatcgcgc cgatacggcc ggccagcccg gca 1173
<210> 3
<211> 386
<212> PRT
<213> 反硝化无色杆菌
<400> 3
Met Asn Ser Lys Lys Leu Leu Ser Ile Gly Asp Tyr Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
Lys Ala Val Leu Pro His Ala Val Phe Gly Tyr Val Asn Gly Gly Thr
20 25 30
Glu Asp Cys Leu Thr Leu Gln Ala Asn Arg Glu Ala Phe Arg Ser Val
35 40 45
Gln Phe Arg Pro Arg Gly Leu Val Gly Val Ala Gln Arg Thr Gln Ala
50 55 60
Val Glu Leu Trp Gly Arg Gln Tyr Arg His Pro Phe Gly Ile Ala Pro
65 70 75 80
Met Gly Met Thr Ala Met Cys Arg His Arg Cys Glu Trp Asp Leu Ala
85 90 95
Lys Ala Ala Ser Glu Ala Lys Ile Pro Phe Val Leu Ser Gly Leu Ser
100 105 110
Thr Leu Ala Met Glu Thr Val Arg Gln Ala Asp Ala Asp Phe Trp Tyr
115 120 125
Gln Gly Tyr Ile Pro Gly Asp Lys Asp Val Ile Glu Pro Leu Leu Arg
130 135 140
Arg Leu Arg Ala Asn Glu Val Asp Val Leu Val Val Thr Ile Asp Thr
145 150 155 160
Pro Val Gly Ala Asn Arg Glu Asn Asn Gln Arg Asn Gly Phe Thr Ile
165 170 175
Pro Phe Lys Phe Ser Gly Gly Leu Leu Trp Asp Gly Leu Arg His Pro
180 185 190
Arg Trp Ser Ala Asn Val Phe Leu Arg Thr Leu Leu Ser Asp Arg Gln
195 200 205
Val Pro Arg Phe Cys Asn Val Val Ala Asp Thr Arg Gly Tyr Arg Ile
210 215 220
Thr Glu Glu Pro Lys Gly Gly Leu Arg Gly Gly Arg Asp Arg Leu Asp
225 230 235 240
Trp Ser His Leu Ala Trp Met Arg Asp Ile Trp Pro Gly Arg Ile Val
245 250 255
Leu Lys Gly Val Ala His Pro Gly Asp Ala Gln Leu Ala Glu Gln Met
260 265 270
Gly Leu Asp Gly Val Ile Val Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp
275 280 285
Gly Ala Gln Gly Ala Leu Asp Ala Leu Pro Glu Val Val Ala Ala Val
290 295 300
Gly Pro Asn Phe Pro Val Met Val Asp Gly Gly Phe Arg Arg Gly Ala
305 310 315 320
Asp Val Leu Lys Ala Ile Ala Leu Gly Ala Arg Met Val Phe Leu Gly
325 330 335
Arg Pro Phe Leu Tyr Gly Ala Ser Val Ala Gly Gln Ala Gly Val Ala
340 345 350
Arg Ile Ile Asp Ile Leu Gly Thr Glu Ile Asp Arg Asn Leu Gly Leu
355 360 365
Leu Gly Cys Arg Asp Leu Ala Glu Leu Gly Ser Asp Phe Ile Val Ser
370 375 380
Arg Pro
385
<210> 4
<211> 1158
<212> DNA
<213> 反硝化无色杆菌
<400> 4
atgaactcaa agaaactctt gtcgataggc gactacgagc gcgcggccaa ggcggtcctg 60
ccgcacgcgg tgttcggcta cgtcaacggc ggcaccgaag actgtctgac gctgcaagcc 120
aaccgcgagg cgttccgttc ggtccagttc cgtccgcgcg gcctggtcgg cgtcgcgcag 180
cgcacgcagg ccgtggaact ctggggaagg caataccggc atcctttcgg gatcgcgccc 240
atgggcatga ccgccatgtg ccgccaccgc tgcgaatggg acctggccaa ggccgcgtca 300
gaggcgaaaa ttccgttcgt gctcagcggc ctttccacgc tggccatgga aaccgtgcgc 360
caggccgatg ccgatttctg gtaccagggc tacatccccg gcgacaagga cgtcatcgaa 420
ccgctgctgc ggcgcctgcg ggccaacgag gtcgacgtgc tggtcgtcac catcgacacg 480
cccgtgggcg cgaaccgcga gaacaaccag cgcaacggct tcaccattcc gttcaagttc 540
agcggcggcc tgctctggga cgggctgcgt catccccgct ggtccgccaa cgtgtttctc 600
cgcaccctgc tttcggaccg gcaggtgccg cgcttctgca acgtggtcgc cgatacgcgc 660
ggctaccgca tcaccgaaga acccaagggc ggcctgcgcg gcggccgcga ccggctggac 720
tggtcgcacc tggcctggat gcgcgacatc tggccgggcc gcatcgtcct caagggcgtc 780
gcccatcccg gcgacgcgca gctggcggaa caaatgggcc tggacggcgt catcgtctcc 840
aaccacggcg gacgccagct cgacggcgcg cagggcgccc tggacgcctt gcccgaggtc 900
gtcgccgcgg tgggcccgaa tttcccggtg atggtcgacg gcggttttcg ccgcggcgcc 960
gacgtcctca aggccatcgc gctgggcgcg cgcatggtgt tcctgggccg cccctttctc 1020
tacggcgcgt ccgtggccgg acaggccggc gtggcgcgca tcatcgacat tttgggaacc 1080
gaaatcgacc gcaacctggg gttgcttggg tgccgcgacc tggcggagct gggaagcgac 1140
ttcatcgtgt cgcgccct 1158
<210> 5
<211> 409
<212> PRT
<213> 反硝化无色杆菌
<400> 5
Met Thr Ser Ile Leu Pro Ser Val Thr Val Pro Gly Ser Ser Pro Ala
1 5 10 15
Glu Ala Ser Arg Pro Leu Pro Arg Ala Leu Gln Arg Met Leu Ser Leu
20 25 30
Asp Asp Phe Glu Ala Ala Ala Arg Arg Arg Leu Pro Arg Pro Ile Phe
35 40 45
Gly Tyr Ile Ala Gly Ala Ala Glu Asp Asn Gln Ser Leu Arg Ser Asn
50 55 60
Arg Glu Ala Phe Gly Arg Tyr Ala Phe Ala Pro Arg Val Leu Val Asp
65 70 75 80
Val Ser Arg Arg Ser Gln Gln Thr Glu Leu Phe Gly Arg Arg Tyr Ala
85 90 95
Ser Pro Phe Gly Ile Ala Pro Met Gly Ile Ser Ala Leu Ser Thr Tyr
100 105 110
Arg Gly Asp Ile Val Leu Ala Arg Ala Ala Arg Glu Gln Gly Ile Pro
115 120 125
Ala Ile Leu Ser Gly Thr Ser Leu Ile Pro Leu Glu Asp Val Ile Arg
130 135 140
Glu Ala Pro Gly Thr Trp Phe Gln Ala Tyr Leu Pro Gly Asp Pro Gln
145 150 155 160
Arg Ile Asp Ala Leu Val Glu Arg Ala Arg Arg Ala Gly Phe Glu Thr
165 170 175
Leu Val Leu Thr Val Asp Ile Pro Val Ser Ala Asn Arg Glu Asn Asn
180 185 190
Val Arg Thr Gly Phe Ser Thr Pro Leu Lys Pro Ser Leu Arg Leu Ala
195 200 205
Trp Asp Gly Val Thr Arg Pro Arg Trp Leu Ala Gly Thr Phe Leu Arg
210 215 220
Thr Leu Leu Lys His Gly Met Pro His Phe Glu Asn Ser Phe Ala Thr
225 230 235 240
Arg Gly Ala Pro Ile Val Ser Ala Ser Val Leu Arg Asp Phe Ser Ala
245 250 255
Arg Asp His Leu Asn Trp Glu His Val Ala Arg Ile Arg Arg Gln Trp
260 265 270
Pro Gly Ala Leu Ile Ile Lys Gly Ile Leu His Pro Gln Asp Ala Ala
275 280 285
Leu Ala Arg Ser His Gly Ala Asp Gly Val Ile Val Ser Asn His Gly
290 295 300
Gly Arg Gln Leu Asp Gly Ala Ile Ser Pro Leu Arg Ala Leu Pro Gly
305 310 315 320
Val Val Ala Ala Ala Gly Asp Met Thr Val Met Met Asp Ser Gly Ile
325 330 335
Arg Arg Gly Ser Asp Val Leu Lys Ala Leu Ala Leu Gly Ala Arg His
340 345 350
Val Phe Val Gly Arg Pro Phe Asn Tyr Ala Ala Ala Val Gly Gly Glu
355 360 365
Ala Gly Val Ala His Ala Ile Gly Leu Leu Arg Ala Glu Ile Asp Arg
370 375 380
Asn Met Ala Met Leu Gly Ile Asn Thr Leu Arg Glu Met Asp Ala Gly
385 390 395 400
Leu Leu Ala Arg Glu Ser Leu Ala Asp
405
<210> 6
<211> 1227
<212> DNA
<213> 反硝化无色杆菌
<400> 6
atgacatcca tccttccgtc cgtcaccgtt cccggcagca gccccgccga ggcctcgcgg 60
ccgctgccgc gcgcgctgca acgcatgctg tcgctggatg atttcgaggc cgccgcgcgc 120
cgccgcctgc cgcgcccgat cttcggctac atcgccggcg cggccgaaga caaccagtcg 180
ctgcgcagca accgcgaggc cttcggccgc tacgcgttcg cgccccgcgt gctggtggac 240
gtgtcgcgcc gcagccagca gaccgaactg ttcggacgcc gctacgcctc gcccttcggc 300
atcgcgccga tgggcatcag cgcgctgtcg acctaccgcg gcgacatcgt gctggcgcgc 360
gccgcccgcg agcaaggcat cccggccatc ctcagcggga cttcgctgat tccgctggaa 420
gacgtgatcc gcgaagcgcc cggcacctgg ttccaggcct atctgccggg cgatccgcag 480
cgcatcgacg cgctggtcga acgcgcgcgc cgcgccggtt tcgaaaccct ggtgctgacg 540
gtggacatcc cggtgtcggc caatcgcgaa aacaacgtgc gcaccggctt ttccacgccg 600
ctcaagccca gcctgcggct ggcctgggac ggcgtcacgc gcccgcgctg gttggccggc 660
acctttctgc gcacgctgct caagcacggc atgccgcatt tcgagaattc cttcgccacg 720
cgcggcgcgc ccatcgtctc ggcctcggtg ctgcgcgact tcagcgcgcg cgaccacctg 780
aactgggaac acgtggcccg catccgccgg caatggcccg gcgcgctgat catcaagggc 840
atcctgcacc cgcaggacgc ggcgctggcc cgcagccacg gcgccgacgg cgtcatcgtc 900
tcgaaccacg gcggccgcca gctcgacggc gcgatctcgc cgctgcgcgc gctgcccggc 960
gtggtcgcgg ccgccggcga catgacggtg atgatggaca gcggcatccg ccgcggcagc 1020
gacgtgctca aggccctggc gctgggcgcg cgccacgtgt tcgtgggccg ccccttcaac 1080
tatgcggcgg cggtcggcgg cgaggccggc gtggcgcacg ccatcggcct gctgcgcgcc 1140
gagatcgacc gcaacatggc catgctggga atcaatacat tgcgcgaaat ggacgcaggc 1200
ctgctggccc gcgagagcct ggcagat 1227
<210> 7
<211> 364
<212> PRT
<213> 球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)
<400> 7
Met Glu Ile Phe Lys Tyr Met Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val
1 5 10 15
Phe Cys Gln Asp Glu Ala Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His
20 25 30
Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Ala Arg Met Trp Thr Tyr
35 40 45
Ala Thr Glu Glu Asn Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly
50 55 60
Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys
65 70 75 80
Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Phe Lys Asp Lys Asn Glu Glu Met Phe
85 90 95
Arg Ala Leu Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr
100 105 110
Gly Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Thr Asp Met Asp Leu Ile His Glu
115 120 125
Glu Thr Asn Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly
130 135 140
Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala
145 150 155 160
Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Met Leu Glu Gly Arg Thr Ile
165 170 175
Ser Val Gln Gly Leu Gly Asn Val Ala Tyr Lys Leu Cys Glu Tyr Leu
180 185 190
His Asn Glu Gly Ala Lys Leu Val Val Thr Asp Ile Asn Gln Ala Ala
195 200 205
Ile Asp Arg Val Val Asn Asp Phe Gly Ala Thr Ala Val Ala Pro Asp
210 215 220
Glu Ile Tyr Ser Gln Glu Val Asp Ile Phe Ser Pro Cys Ala Leu Gly
225 230 235 240
Ala Ile Leu Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile
245 250 255
Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Gln Asp Ser Arg His Gly Asp Tyr
260 265 270
Leu His Glu Leu Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala
275 280 285
Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Glu
290 295 300
Arg Ala Leu Lys Arg Val Asp Gly Ile Tyr Asp Ser Ile Glu Lys Ile
305 310 315 320
Phe Glu Ile Ser Lys Arg Asp Ser Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asn
325 330 335
Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Arg Val Ala Lys Ser Arg Ser Gln
340 345 350
Phe Leu Lys Asn Glu Lys Asn Ile Leu Asn Gly Arg
355 360
<210> 8
<211> 1095
<212> DNA
<213> 球形芽孢杆菌
<400> 8
atggaaatct tcaagtatat ggaaaagtat gattatgaac aattggtatt ttgccaagac 60
gaagcatctg ggttaaaagc gattatcgct atccatgaca caacacttgg accagcatta 120
ggtggtgctc gtatgtggac ctacgcgaca gaagaaaatg cgattgagga tgcattaaga 180
ttagcacgcg ggatgacata taaaaatgca gctgctggtt taaaccttgg cggtggaaaa 240
acggtcatta ttggggaccc atttaaagat aaaaacgaag aaatgttccg tgctttaggt 300
cgtttcattc aaggattaaa cggtcgctat attaccggtg aagatgttgg tacaaccgta 360
acagatatgg atttaatcca tgaggaaaca aattacgtta caggtatatc gccagcgttt 420
ggttcatcgg gtaatccttc accagtaact gcttatggcg tttatcgtgg catgaaagca 480
gcggcgaaag aagcatttgg tacggatatg ctagaaggtc gtactatatc ggtacaaggg 540
ctaggaaacg tagcttacaa gctttgcgag tatttacata atgaaggtgc aaaacttgta 600
gtaacagata ttaaccaagc ggctattgat cgtgttgtca atgattttgg cgctacagca 660
gttgcacctg atgaaatcta ttcacaagaa gtcgatattt tctcaccgtg tgcacttggc 720
gcaattttaa atgacgaaac gattccgcaa ttaaaagcaa aagttattgc tggttctgct 780
aataaccaac tacaagattc acgacatgga gattatttac acgagctagg cattgtttat 840
gcacctgact atgtcattaa tgcaggtggt gtaataaatg tcgcggacga attatatggc 900
tataatcgtg aacgagcgtt gaaacgtgta gatggtattt acgatagtat tgaaaaaatc 960
tttgaaattt ccaaacgtga tagtattcca acatatgttg cggcaaatcg tttggcagaa 1020
gaacgtattg ctcgtgtagc gaaatcgcgt agtcagttct taaaaaatga aaaaaatatt 1080
ttgaacggcc gttaa 1095
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 9
ccatatgagc cggctggacc gctgcctgtc 30
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 10
ggatccctat gccgggctgg ccggccgtat c 31
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 11
ccatatgaac tcaaagaaac tcttgtcgat ag 32
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 12
ggatccctaa gggcgcgaca cgatgaagtc g 31
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 13
ccatatgaca tccatccttc cgtccgtcac c 31
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 14
ggatccctaa tctgccaggc tctcgcgggc c 31
<210> 15
<211> 1176
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸，编码氧化酶
<400> 15
atgtctcgcc tggaccgctg tctgagcgtt cgcgattttg agcgtgaagc ccgtcgtatt 60
atgccgcgct gcgtagaagg ttatgtgtgt ggtggtacgg aagatggtgc atctctggcg 120
gagtctgtgc gcgcgctggg cgatgtgggc ttccgtccgc gtggcctgcg tgtagtggac 180
cagcgcaatt ccaaagttga gctgtacggt cagacctacg cgatgccggt cggtttcgcg 240
cctactggct tctctgctat cgttatgcac gaatgcgatc tggccctggc ccaggcggca 300
cagcatgcgg aaatcccttt tatcatctcc ggcgcgtcca gcgttccgct ggaacgtctg 360
caacaggcaa ccggcaaacg ctgttggtat caggcgtacc tgccgggcaa caccgaacgc 420
atcggtcgcc tgctgggtcg tctgcgtcag gccgaaatcc cggttctggt agttaccatc 480
gacacttgcg tcggtgctaa ccgcgagaac ctgcaacgcc tggcgttcac cgttccattc 540
aagatgtccg cgagcgtagt tctggacggc ctgcgccacc cgcgttggag cctgaacgta 600
ttcatgcgta ctctgctggg ctctggtgtt ccgcgtttca gcaacctgtg cgaagaaatt 660
ggcccaccaa tcacccagga cccgccaaac ggcttccgtg gcgaacgtga caaactgtct 720
tgggagcaca tccgttggat tcgtgaaaac tggcctggca aactggttct gaaaggcgtg 780
atgcacccag acgatgcgcg tcaggcgtgt gttgcaggtg ctgacggtgt gatcgttagc 840
aatcatggtg gtcgtcagct ggatggctgc atttctccgc tgcaagcact gccggaaatt 900
gtagctgctg tcccgccggg ctttccggtg atggttgatg gcggtttccg tcgtggttcc 960
gatgtcctga aggctgttgc tctgggcgct cgtatggtgt ttacgggtcg tccgcagctg 1020
ttcggtgccg ctgtgggtgg tcaggctggc atccgtaaag tcgcggcaat tttccgttct 1080
gaaatctcta ccgacctggc actgctgggt tgctcctccc tggcagatgt aactccggac 1140
ctgattgcac cgatccgtcc ggccagcccg gcttaa 1176
<210> 16
<211> 1161
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸，编码氧化酶
<400> 16
atgaactcca agaaactgct gtctatcggc gactacgaac gtgccgctaa agccgttctg 60
ccacacgcgg tattcggtta tgtgaacggt ggcaccgaag attgtctgac gctgcaagct 120
aaccgtgaag cattccgtag cgtacaattt cgcccgcgcg gtctggtagg tgtagcgcag 180
cgtactcagg cggtggaact gtggggtcgt cagtaccgtc acccgttcgg tatcgccccg 240
atgggtatga ccgctatgtg ccgtcatcgc tgcgaatggg atctggcaaa agctgcgagc 300
gaagcgaaga tccctttcgt actgtctggt ctgtccaccc tggctatgga aaccgttcgc 360
caggcagatg ccgacttctg gtatcagggc tacattccgg gcgataaaga tgttatcgaa 420
ccgctgctgc gccgtctgcg cgccaacgaa gttgatgttc tggttgtgac tatcgacacc 480
ccggtgggtg ctaaccgcga gaacaaccaa cgcaacggct tcaccatccc gttcaaattc 540
tccggcggtc tgctgtggga tggtctgcgt cacccgcgtt ggtctgcaaa tgtcttcctg 600
cgtactctgc tgagcgaccg tcaggtgcca cgtttttgca acgtagtggc ggacacccgt 660
ggctaccgta tcactgaaga accgaaaggt ggcctgcgtg gtggccgtga tcgcctggat 720
tggtcccacc tggcgtggat gcgcgatatt tggccgggtc gcatcgtcct gaaaggcgtt 780
gcgcaccctg gtgacgcgca gctggctgaa cagatgggcc tggacggtgt gattgtgagc 840
aatcatggcg gtcgtcagct ggatggcgca cagggtgctc tggacgctct gccggaggtt 900
gtcgcggctg ttggtccgaa cttcccggtc atggttgacg gtggctttcg tcgtggcgca 960
gacgttctga aagcaattgc gctgggtgcg cgtatggttt ttctgggtcg cccattcctg 1020
tacggcgcat ctgtggcggg ccaggctggt gtagcacgta tcattgacat tctgggcacg 1080
gagatcgacc gtaacctggg cctgctgggc tgtcgtgacc tggccgagct gggttctgac 1140
tttatcgttt ctcgtccgta a 1161
<210> 17
<211> 1230
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸，编码氧化酶
<400> 17
atgacctcta ttctgccttc tgttactgtt ccgggttctt ctccggcgga ggcttctcgc 60
ccgctgcctc gtgcactgca acgtatgctg tccctggacg attttgaggc tgctgcacgt 120
cgtcgcctgc cgcgcccgat tttcggttat atcgcaggcg ccgccgaaga taaccagtct 180
ctgcgtagca atcgcgaagc gttcggccgc tacgcattcg ctccgcgtgt actggttgac 240
gtatcccgtc gttctcagca gactgaactg ttcggccgtc gttacgcgag cccgttcggc 300
attgcgccga tgggtatctc tgctctgagc acctaccgtg gcgacatcgt actggctcgt 360
gcggcccgtg aacagggtat cccagctatc ctgtccggta cgtctctgat tccgctggaa 420
gacgtgattc gcgaagcacc gggcacctgg ttccaagcat atctgccggg tgatccacag 480
cgcatcgacg cactggtcga gcgcgcccgt cgtgcgggct tcgagactct ggtgctgacc 540
gttgacatcc cggtctccgc taaccgtgaa aacaacgttc gcaccggctt ctctaccccg 600
ctgaaaccga gcctgcgcct ggcatgggat ggcgtaactc gtccgcgttg gctggcaggt 660
acttttctgc gtaccctgct gaaacatggt atgccgcact tcgaaaactc cttcgcgacc 720
cgtggcgcac cgatcgtgag cgcctccgtg ctgcgtgact ttagcgcacg tgaccacctg 780
aactgggaac acgttgctcg catccgtcgt cagtggccgg gtgcactgat cattaagggt 840
attctgcacc ctcaggatgc cgctctggca cgttctcacg gtgctgatgg cgttatcgtt 900
tccaatcatg gtggccgtca gctggatggc gcgatctctc cactgcgtgc gctgccaggt 960
gttgtggcgg ctgcgggtga tatgaccgtg atgatggaca gcggtatccg tcgcggttct 1020
gatgtcctga aagctctggc gctgggtgcc cgccatgttt tcgtgggtcg cccgtttaac 1080
tacgctgctg cggttggtgg cgaagcgggc gtagcccacg cgatcggtct gctgcgtgcc 1140
gaaattgacc gcaacatggc gatgctgggc atcaacacgc tgcgcgaaat ggatgcgggc 1200
ctgctggcgc gtgaatccct ggctgactaa 1230
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 18
gccatggaaa tcttcaagta tatgg 25
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 19
gggcccgggt taacggccgt tcaaaatatt 30
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于诱变
<400> 20
gtcgctatat taccggtgaa gatgttg 27
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于诱变
<400> 21
caacatcttc accggtaata tagcgac 27
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于诱变
<400> 22
gatagtattc caacctatgt tgcggc 26
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于诱变
<400> 23
gccgcaacat aggttggaat actatc 26
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 24
gggcatatgg aaatcttcaa gtatatgg 28
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 25
ggatccttaa cggccgttca aaatatt 27
<210> 26
<211> 1206
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸，编码甲酸脱氢酶
<400> 26
atggctaaga tcgtttgcgt tctgtacgat gacccggtta ccggttaccc taaaacttac 60
gcacgcgatg atctgccgaa aatcgaatgc tatccggacg gccagaccct gccgacccca 120
cgtgcgattg acttccagcc gggtgctctg ctgggtagcg tatctggtga actgggtctg 180
cgtaaatacc tggaaagcaa cggccacgaa ctggtcgtta cctcttccaa agacggtgac 240
aattccgtac tggaccgtga actggcagat gcggaaattg ttatcagcca gccgttctgg 300
ccagcgtata tgacggctga acgtatcaag cgcgcgaaaa aactgaaaat gattgtgact 360
gcgggcattg gctccgacca cacggatctg caagcagcga tggaacacgg tatcaccgtg 420
gcagaagtta cttactgcaa ctccaactcc gtggcggaac atgttatgat gaccaccctg 480
gctctggtac gtaactacct gccatcctac cagtgggtac tgaaaggtgg ttggaacatc 540
gcagattgtg ttgaacgttc ttacgatctg gaaggcatgc acgtcggtac tgtagcggcc 600
ggtcgtattg gtctgcgtgt tctgcgcctg atgaaacctt tcggtactca cctgcattat 660
ctggatcgtc accgcctgcc ggaatctgtg gagaaagagc tgaacctgac ccaccacact 720
tctctggagt ccctggcgaa agtgtgcgac gtggttacgc tgaactgccc gctgcacccg 780
gaaaccgaac acatgatcaa cgctgactcc ctgaaacatt ttaaacgcgg tgcgtacctg 840
atcaataccg cccgtggcaa actgtgtgac cgtgatgccg tcgcggcagc cctggaatct 900
ggccaactgg ccggctacgg cggcgacgtt tggtttccgc agccggcacc ggcggatcat 960
ccgtggcgta gcatgccgca ccacggtatg actccgcata ttagcggcac ctctctgtct 1020
gcccagaccc gttacgcggc tggcacccgc gagatcctgg aatgttattt cgagaaccgc 1080
ccgatccgta acgaatatct gatcgtgcag aacggcaagc tggctggtgt cggtgctcac 1140
agctattctg ctggtaacgc aactggcggc agcgaggaag ctgcacgttt caagaaatct 1200
gcttaa 1206
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 27
ccatatgtct cgcctggacc gctgtctgag 30
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 28
ggatccttaa gccgggctgg ccggacgg 28
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 29
ccatatgaac tccaagaaac tgctgtctat c 31
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 30
ggatccttac ggacgagaaa cgataaag 28
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 31
ccatatgacc tctattctgc cttctgttac 30
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 32
actcgaggtc agccagggat tcacgcgcca g 31
<210> 33
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 33
ccatatgagc acgtcagacg atatccataa c 31
<210> 34
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 34
actcgagcag caggtcgaaa cggtcgaggt tc 32
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 35
ccatatggct aagatcgttt gcgttctgta c 31
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 36
actcgagagc agatttcttg aaacgtgcag 30
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 37
cggatccgag gaaacagacc atgg 24
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的寡核苷酸引物，用于PCR
<400> 38
ctcagagtta acggccgttc aaaatatt 28
<210> 39
<211> 364
<212> PRT
<213> 球形芽孢杆菌
<400> 39
Met Glu Ile Phe Lys Tyr Met Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val
1 5 10 15
Phe Cys Gln Asp Glu Ala Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His
20 25 30
Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Ala Arg Met Trp Thr Tyr
35 40 45
Ala Thr Glu Glu Asn Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly
50 55 60
Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys
65 70 75 80
Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Phe Lys Asp Lys Asn Glu Glu Met Phe
85 90 95
Arg Ala Leu Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr
100 105 110
Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Thr Asp Met Asp Leu Ile His Glu
115 120 125
Glu Thr Asn Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly
130 135 140
Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala
145 150 155 160
Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Met Leu Glu Gly Arg Thr Ile
165 170 175
Ser Val Gln Gly Leu Gly Asn Val Ala Tyr Lys Leu Cys Glu Tyr Leu
180 185 190
His Asn Glu Gly Ala Lys Leu Val Val Thr Asp Ile Asn Gln Ala Ala
195 200 205
Ile Asp Arg Val Val Asn Asp Phe Gly Ala Thr Ala Val Ala Pro Asp
210 215 220
Glu Ile Tyr Ser Gln Glu Val Asp Ile Phe Ser Pro Cys Ala Leu Gly
225 230 235 240
Ala Ile Leu Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile
245 250 255
Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Gln Asp Ser Arg His Gly Asp Tyr
260 265 270
Leu His Glu Leu Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala
275 280 285
Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Glu
290 295 300
Arg Ala Leu Lys Arg Val Asp Gly Ile Tyr Asp Ser Ile Glu Lys Ile
305 310 315 320
Phe Glu Ile Ser Lys Arg Asp Ser Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asn
325 330 335
Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Arg Val Ala Lys Ser Arg Ser Gln
340 345 350
Phe Leu Lys Asn Glu Lys Asn Ile Leu Asn Gly Arg
355 360
<210> 40
<211> 1095
<212> DNA
<213> 球形芽孢杆菌
<400> 40
atggaaatct tcaagtatat ggaaaagtat gattatgaac aattggtatt ttgccaagac 60
gaagcatctg ggttaaaagc gattatcgct atccatgaca caacacttgg accagcatta 120
ggtggtgctc gtatgtggac ctacgcgaca gaagaaaatg cgattgagga tgcattaaga 180
ttagcacgcg ggatgacata taaaaatgca gctgctggtt taaaccttgg cggtggaaaa 240
acggtcatta ttggggaccc atttaaagat aaaaacgaag aaatgttccg tgctttaggt 300
cgtttcattc aaggattaaa cggtcgctat attaccgctg aagatgttgg tacaaccgta 360
acagatatgg atttaatcca tgaggaaaca aattacgtta caggtatatc gccagcgttt 420
ggttcatcgg gtaatccttc accagtaact gcttatggcg tttatcgtgg catgaaagca 480
gcggcgaaag aagcatttgg tacggatatg ctagaaggtc gtactatatc ggtacaaggg 540
ctaggaaacg tagcttacaa gctttgcgag tatttacata atgaaggtgc aaaacttgta 600
gtaacagata ttaaccaagc ggctattgat cgtgttgtca atgattttgg cgctacagca 660
gttgcacctg atgaaatcta ttcacaagaa gtcgatattt tctcaccgtg tgcacttggc 720
gcaattttaa atgacgaaac gattccgcaa ttaaaagcaa aagttattgc tggttctgct 780
aataaccaac tacaagattc acgacatgga gattatttac acgagctagg cattgtttat 840
gcacctgact atgtcattaa tgcaggtggt gtaataaatg tcgcggacga attatatggc 900
tataatcgtg aacgagcgtt gaaacgtgta gatggtattt acgatagtat tgaaaaaatc 960
tttgaaattt ccaaacgtga tagtattcca acatatgttg cggcaaatcg tttggcagaa 1020
gaacgtattg ctcgtgtagc gaaatcgcgt agtcagttct taaaaaatga aaaaaatatt 1080
ttgaacggcc gttaa 1095
<210> 41
<211> 726
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 41
Met Ser Thr Ser Asp Asp Ile His Asn Thr Thr Ala Thr Gly Lys Cys
1 5 10 15
Pro Phe His Gln Gly Gly His Asp Gln Ser Ala Gly Ala Gly Thr Thr
20 25 30
Thr Arg Asp Trp Trp Pro Asn Gln Leu Arg Val Asp Leu Leu Asn Gln
35 40 45
His Ser Asn Arg Ser Asn Pro Leu Gly Glu Asp Phe Asp Tyr Arg Lys
50 55 60
Glu Phe Ser Lys Leu Asp Tyr Tyr Gly Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ala
65 70 75 80
Leu Leu Thr Glu Ser Gln Pro Trp Trp Pro Ala Asp Trp Gly Ser Tyr
85 90 95
Ala Gly Leu Phe Ile Arg Met Ala Trp His Gly Ala Gly Thr Tyr Arg
100 105 110
Ser Ile Asp Gly Arg Gly Gly Ala Gly Arg Gly Gln Gln Arg Phe Ala
115 120 125
Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp Asn Val Ser Leu Asp Lys Ala Arg Arg
130 135 140
Leu Leu Trp Pro Ile Lys Gln Lys Tyr Gly Gln Lys Ile Ser Trp Ala
145 150 155 160
Asp Leu Phe Ile Leu Ala Gly Asn Val Ala Leu Glu Asn Ser Gly Phe
165 170 175
Arg Thr Phe Gly Phe Gly Ala Gly Arg Glu Asp Val Trp Glu Pro Asp
180 185 190
Leu Asp Val Asn Trp Gly Asp Glu Lys Ala Trp Leu Thr His Arg His
195 200 205
Pro Glu Ala Leu Ala Lys Ala Pro Leu Gly Ala Thr Glu Met Gly Leu
210 215 220
Ile Tyr Val Asn Pro Glu Gly Pro Asp His Ser Gly Glu Pro Leu Ser
225 230 235 240
Ala Ala Ala Ala Ile Arg Ala Thr Phe Gly Asn Met Gly Met Asn Asp
245 250 255
Glu Glu Thr Val Ala Leu Ile Ala Gly Gly His Thr Leu Gly Lys Thr
260 265 270
His Gly Ala Gly Pro Thr Ser Asn Val Gly Pro Asp Pro Glu Ala Ala
275 280 285
Pro Ile Glu Glu Gln Gly Leu Gly Trp Ala Ser Thr Tyr Gly Ser Gly
290 295 300
Val Gly Ala Asp Ala Ile Thr Ser Gly Leu Glu Val Val Trp Thr Gln
305 310 315 320
Thr Pro Thr Gln Trp Ser Asn Tyr Phe Phe Glu Asn Leu Phe Lys Tyr
325 330 335
Glu Trp Val Gln Thr Arg Ser Pro Ala Gly Ala Ile Gln Phe Glu Ala
340 345 350
Val Asp Ala Pro Glu Ile Ile Pro Asp Pro Phe Asp Pro Ser Lys Lys
355 360 365
Arg Lys Pro Thr Met Leu Val Thr Asp Leu Thr Leu Arg Phe Asp Pro
370 375 380
Glu Phe Glu Lys Ile Ser Arg Arg Phe Leu Asn Asp Pro Gln Ala Phe
385 390 395 400
Asn Glu Ala Phe Ala Arg Ala Trp Phe Lys Leu Thr His Arg Asp Met
405 410 415
Gly Pro Lys Ser Arg Tyr Ile Gly Pro Glu Val Pro Lys Glu Asp Leu
420 425 430
Ile Trp Gln Asp Pro Leu Pro Gln Pro Ile Tyr Asn Pro Thr Glu Gln
435 440 445
Asp Ile Ile Asp Leu Lys Phe Ala Ile Ala Asp Ser Gly Leu Ser Val
450 455 460
Ser Glu Leu Val Ser Val Ala Trp Ala Ser Ala Ser Thr Phe Arg Gly
465 470 475 480
Gly Asp Lys Arg Gly Gly Ala Asn Gly Ala Arg Leu Ala Leu Met Pro
485 490 495
Gln Arg Asp Trp Asp Val Asn Ala Ala Ala Val Arg Ala Leu Pro Val
500 505 510
Leu Glu Lys Ile Gln Lys Glu Ser Gly Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ile
515 520 525
Ile Val Leu Ala Gly Val Val Gly Val Glu Lys Ala Ala Ser Ala Ala
530 535 540
Gly Leu Ser Ile His Val Pro Phe Ala Pro Gly Arg Val Asp Ala Arg
545 550 555 560
Gln Asp Gln Thr Asp Ile Glu Met Phe Glu Leu Leu Glu Pro Ile Ala
565 570 575
Asp Gly Phe Arg Asn Tyr Arg Ala Arg Leu Asp Val Ser Thr Thr Glu
580 585 590
Ser Leu Leu Ile Asp Lys Ala Gln Gln Leu Thr Leu Thr Ala Pro Glu
595 600 605
Met Thr Ala Leu Val Gly Gly Met Arg Val Leu Gly Gly Asn Phe Asp
610 615 620
Gly Ser Lys Asn Gly Val Phe Thr Asp Arg Val Gly Val Leu Ser Asn
625 630 635 640
Asp Phe Phe Val Asn Leu Leu Asp Met Arg Tyr Glu Trp Lys Ala Thr
645 650 655
Asp Glu Ser Lys Glu Leu Phe Glu Gly Arg Asp Arg Glu Thr Gly Glu
660 665 670
Val Lys Phe Thr Ala Ser Arg Ala Asp Leu Val Phe Gly Ser Asn Ser
675 680 685
Val Leu Arg Ala Val Ala Glu Val Tyr Ala Ser Ser Asp Ala His Glu
690 695 700
Lys Phe Val Lys Asp Phe Val Ala Ala Trp Val Lys Val Met Asn Leu
705 710 715 720
Asp Arg Phe Asp Leu Leu
725
<210> 42
<211> 2181
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 42
atgagcacgt cagacgatat ccataacacc acagccactg gcaaatgccc gttccatcag 60
ggcggtcacg accagagtgc gggggcgggc acaaccactc gcgactggtg gccaaatcaa 120
cttcgtgttg acctgttaaa ccaacattct aatcgttcta acccactggg tgaggacttt 180
gactaccgca aagaattcag caaattagat tactacggcc tgaaaaaaga tctgaaagcc 240
ctgttgacag aatctcaacc gtggtggcca gccgactggg gcagttacgc cggtctgttt 300
attcgtatgg cctggcacgg cgcggggact taccgttcaa tcgatggacg cggtggcgcg 360
ggtcgtggtc agcaacgttt tgcaccgctg aactcctggc cggataacgt aagcctcgat 420
aaagcgcgtc gcctgttgtg gccaatcaaa cagaaatatg gtcagaaaat ctcctgggcc 480
gacctgttta tcctcgcggg taacgtggcg ctagaaaact ccggcttccg taccttcggt 540
tttggtgccg gtcgtgaaga cgtctgggaa ccggatctgg atgttaactg gggtgatgaa 600
aaagcctggc tgactcaccg tcatccggaa gcgctggcga aagcaccgct gggtgcaacc 660
gagatgggtc tgatttacgt taacccggaa ggcccggatc acagcggcga accgctttct 720
gcggcagcag ctatccgcgc gaccttcggc aacatgggca tgaacgacga agaaaccgtg 780
gcgctgattg cgggtggtca tacgctgggt aaaacccacg gtgccggtcc gacatcaaat 840
gtaggtcctg atccagaagc tgcaccgatt gaagaacaag gtttaggttg ggcgagcact 900
tacggcagcg gcgttggcgc agatgccatt acctctggtc tggaagtagt ctggacccag 960
acgccgaccc agtggagcaa ctatttcttc gagaacctgt tcaagtatga gtgggtacag 1020
acccgcagcc cggctggcgc aatccagttc gaagcggtag acgcaccgga aattatcccg 1080
gatccgtttg atccgtcgaa gaaacgtaaa ccgacaatgc tggtgaccga cctgacgctg 1140
cgttttgatc ctgagttcga gaagatctct cgtcgtttcc tcaacgatcc gcaggcgttc 1200
aacgaagcct ttgcccgtgc ctggttcaaa ctgacgcaca gggatatggg gccgaaatct 1260
cgctacatcg ggccggaagt gccgaaagaa gatctgatct ggcaagatcc gctgccgcag 1320
ccgatctaca acccgaccga gcaggacatt atcgatctga aattcgcgat tgcggattct 1380
ggtctgtctg ttagtgagct ggtatcggtg gcctgggcat ctgcttctac cttccgtggt 1440
ggcgacaaac gcggtggtgc caacggtgcg cgtctggcat taatgccgca gcgcgactgg 1500
gatgtgaacg ccgcagccgt tcgtgctctg cctgttctgg agaaaatcca gaaagagtct 1560
ggtaaagcct cgctggcgga tatcatagtg ctggctggtg tggttggtgt tgagaaagcc 1620
gcaagcgccg caggtttgag cattcatgta ccgtttgcgc cgggtcgcgt tgatgcgcgt 1680
caggatcaga ctgacattga gatgtttgag ctgctggagc caattgctga cggtttccgt 1740
aactatcgcg ctcgtctgga cgtttccacc accgagtcac tgctgatcga caaagcacag 1800
caactgacgc tgaccgcgcc ggaaatgact gcgctggtgg gcggcatgcg tgtactgggt 1860
ggcaacttcg atggcagcaa aaacggcgtc ttcactgacc gcgttggcgt attgagcaat 1920
gacttcttcg tgaacttgct ggatatgcgt tacgagtgga aagcgaccga cgaatcgaaa 1980
gagctgttcg aaggccgtga ccgtgaaacc ggcgaagtga aatttacggc cagccgtgcg 2040
gatctggtgt ttggttctaa ctccgtcctg cgtgcggtgg cggaagttta cgccagtagc 2100
gatgcccacg agaagtttgt taaagacttc gtggcggcat gggtgaaagt gatgaacctc 2160
gaccgtttcg acctgctgta a 2181
<210> 43
<211> 401
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌物种（Bacillus sp.）
<400> 43
Met Ala Lys Ile Val Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Thr Gly Tyr
1 5 10 15
Pro Lys Thr Tyr Ala Arg Asp Asp Leu Pro Lys Ile Glu Cys Tyr Pro
20 25 30
Asp Gly Gln Thr Leu Pro Thr Pro Arg Ala Ile Asp Phe Gln Pro Gly
35 40 45
Ala Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu
50 55 60
Glu Ser Asn Gly His Glu Leu Val Val Thr Ser Ser Lys Asp Gly Asp
65 70 75 80
Asn Ser Val Leu Asp Arg Glu Leu Ala Asp Ala Glu Ile Val Ile Ser
85 90 95
Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Met Thr Ala Glu Arg Ile Lys Arg Ala
100 105 110
Lys Lys Leu Lys Met Ile Val Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Thr
115 120 125
Asp Leu Gln Ala Ala Met Glu His Gly Ile Thr Val Ala Glu Val Thr
130 135 140
Tyr Cys Asn Ser Asn Ser Val Ala Glu His Val Met Met Thr Thr Leu
145 150 155 160
Ala Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser Tyr Gln Trp Val Leu Lys Gly
165 170 175
Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Glu Gly
180 185 190
Met His Val Gly Thr Val Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Arg Val Leu
195 200 205
Arg Leu Met Lys Pro Phe Gly Thr His Leu His Tyr Leu Asp Arg His
210 215 220
Arg Leu Pro Glu Ser Val Glu Lys Glu Leu Asn Leu Thr His His Thr
225 230 235 240
Ser Leu Glu Ser Leu Ala Lys Val Cys Asp Val Val Thr Leu Asn Cys
245 250 255
Pro Leu His Pro Glu Thr Glu His Met Ile Asn Ala Asp Ser Leu Lys
260 265 270
His Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Leu Ile Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu
275 280 285
Cys Asp Arg Asp Ala Val Ala Ala Ala Leu Glu Ser Gly Gln Leu Ala
290 295 300
Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Ala Asp His
305 310 315 320
Pro Trp Arg Ser Met Pro His His Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly
325 330 335
Thr Ser Leu Ser Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile
340 345 350
Leu Glu Cys Tyr Phe Glu Asn Arg Pro Ile Arg Asn Glu Tyr Leu Ile
355 360 365
Val Gln Asn Gly Lys Leu Ala Gly Val Gly Ala His Ser Tyr Ser Ala
370 375 380
Gly Asn Ala Thr Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ala Arg Phe Lys Lys Ser
385 390 395 400
Ala
<210> 44
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的氨基酸序列
<400> 44
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His
20
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的氨基酸序列
<400> 45
Leu Glu His His His His His His
1 5

Claims (40)

1.编码下述（A1）至（A4）中的任一氨基酸序列的多核苷酸：
（A1）SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列、
（A2）i）与SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列具有45％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、
（A3）i）与由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（A4）i）在SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列。
2.权利要求1记载的多核苷酸，其具有SEQ ID NO:2、4、6、15、16或17中的任一所示的核苷酸序列。
3.在宿主细胞内可发挥功能的启动子与权利要求1或2记载的多核苷酸以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸。
4.含有权利要求1至3中任一项记载的多核苷酸的重组载体。
5.权利要求4记载的重组载体，进一步包含编码具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列的多核苷酸、或该多核苷酸与在宿主细胞内可发挥功能的启动子以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸。
6.权利要求5记载的重组载体，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列是下述（B1）至（B3）中任一氨基酸序列：
（B1）SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列、
（B2）i）与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化转换成对应的L-甲硫氨酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（B3）i）在SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化转换成对应的L-甲硫氨酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列。
7.将权利要求1至3中任一项记载的多核苷酸或权利要求4记载的重组载体导入宿主细胞而成的转化体。
8.权利要求7记载的转化体，其中宿主细胞是微生物或大肠杆菌。
9.将权利要求5或6记载的重组载体导入宿主细胞而成的转化体。
10.权利要求9记载的转化体，其中宿主细胞是微生物或大肠杆菌。
11.拥有权利要求1至3中任一项记载的多核苷酸的转化体。
12.转化体，其拥有：
i）具有编码具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，或该多核苷酸与在宿主细胞内可发挥功能的启动子以可发挥功能的形式连接而成的多核苷酸；和
ii）权利要求1至3中任一项记载的多核苷酸。
13.重组载体的制备方法，其包含在可在宿主细胞内复制的载体中整合权利要求1至3中任一项记载的多核苷酸的步骤。
14.转化体的制备方法，其包含将权利要求1至3中任一项记载的多核苷酸或权利要求4至6中任一项记载的重组载体导入宿主细胞的步骤。
15.具有下述（A1）至（A4）中的任一氨基酸序列的蛋白质：
（A1）SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列、
（A2）i）与SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列具有45％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、
（A3）i）与由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（A4）i）在SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列。
16.α-氧代羧酸化合物的制备方法，其包含使具有下述（A1）至（A4）中的任一氨基酸序列的蛋白质与α-羟基羧酸化合物作用的步骤：
（A1）SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列、
（A2）i）与SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列具有45％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、
（A3）i）与由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（A4）i）在SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列。
17.权利要求16记载的制备方法，其中α-羟基羧酸化合物是含硫α-羟基羧酸化合物，对应的α-氧代羧酸化合物是含硫α-氧代羧酸化合物。
18.权利要求17记载的制备方法，其中：
含硫α-羟基羧酸化合物是式（1）所示化合物：
式中，R1表示氢或任选取代的碳原子数为1-8的烷基；
含硫α-氧代羧酸化合物是式（2）所示化合物：
式中，R1表示与上述相同的含义。
19.权利要求16至18中任一项记载的制备方法，其中具有所述（A1）至（A4）中任一氨基酸序列的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系。
20.权利要求19记载的制备方法，其中所述转化体是权利要求7、8或11中任一项记载的转化体。
21.权利要求16至20中任一项记载的制备方法，其中所述步骤在具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的存在下进行。
22.权利要求21记载的制备方法，其中具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质是过氧化氢酶。
23.权利要求21或22记载的制备方法，其中具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系。
24.L-α-氨基酸化合物的制备方法，其包含：
（1）使具有下述（A1）至（A4）中任一氨基酸序列的蛋白质与α-羟基羧酸化合物作用，得到对应的α-氧代羧酸化合物的步骤：
（A1）SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列、
（A2）i）与SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列具有45％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、
（A3）i）与由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（A4）i）在SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-羟基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化转换成对应的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列；
和
（2）使具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质与步骤（1）中得到的α-氧代羧酸化合物作用，得到对应的L-α-氨基酸化合物的步骤。
25.权利要求24记载的制备方法，其中α-羟基羧酸化合物是含硫α-羟基羧酸化合物，对应的α-氧代羧酸化合物是含硫α-氧代羧酸化合物，对应的L-α-氨基酸化合物是含硫L-α-氨基酸化合物。
26.权利要求23记载的制备方法，其中：
含硫α-羟基羧酸化合物是式（1）所示化合物：
式中，R1表示氢或任选取代的碳原子数为1-8的烷基；
含硫α-氧代羧酸化合物是式（2）所示化合物：
式中，R1表示与上述相同的含义；
含硫L-α-氨基酸化合物是式（3）所示化合物：
式中，R1表示与上述相同的含义。
27.权利要求24至26中任一项记载的制备方法，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质是亮氨酸脱氢酶。
28.权利要求27记载的制备方法，其中亮氨酸脱氢酶是来自球形芽孢杆菌（Bacillussphaericus）的亮氨酸脱氢酶。
29.权利要求24至27中任一项记载的制备方法，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质的氨基酸序列是下述（B1）至（B3）中任一氨基酸序列：
（B1）SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列、
（B2）i）与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有将2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化转换成对应的L-甲硫氨酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列、或
（B3）i）在SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有将2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化转换成对应的L-甲硫氨酸衍生物的能力的蛋白质的氨基酸序列。
30.权利要求24至29中任一项记载的制备方法，其中具有所述（A1）至（A4）中任一氨基酸序列的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系。
31.权利要求30记载的制备方法，其中所述转化体是权利要求7至12中任一项记载的转化体。
32.权利要求24至31中任一项记载的制备方法，其中具有将α-氧代羧酸化合物氨基化转换成对应的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系。
33.权利要求32记载的制备方法，其中所述转化体是权利要求9、10或12中任一项记载的转化体。
34.权利要求24至33中任一项记载的制备方法，其中步骤（1）在具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质的存在下进行。
35.权利要求34记载的制备方法，其中具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质是过氧化氢酶。
36.权利要求34或35记载的制备方法，其中具有将过氧化氢转换成分子氧的能力的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系。
37.权利要求24至36中任一项记载的制备方法，其中步骤（2）在具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成还原型的能力的蛋白质的存在下进行。
38.权利要求37记载的制备方法，其中具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成还原型的能力的蛋白质是甲酸脱氢酶。
39.权利要求37或38记载的制备方法，其中具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换成还原型的能力的蛋白质以包含在将编码该蛋白质的多核苷酸导入宿主细胞而成的转化体或其处理物中的形态提供给反应体系。
40.权利要求24至39中任一项记载的制备方法，其中步骤（1）和步骤（2）在一个反应体系中进行。
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