ES2244430T3 - Variantes de hidantoinasa con propiedades mejoradas y su uso para la produccion de aminoacidos. - Google Patents
Variantes de hidantoinasa con propiedades mejoradas y su uso para la produccion de aminoacidos.Info
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Abstract
Una hidantoinasa modificada que tiene enantioselectividad cambiada y/o actividad enzimática mejorada con relación a la hidantoinasa no modificada de SEQ. ID. NO. 2, donde dicha hidantoinasa no modificada ha sido modificada por una sustitución de amino ácidos en una o más posiciones de amino ácidos seleccionadas del grupo que consiste de los números de posición de amino ácidos 95, 154, 180, 251 y 295.
Description
Variantes de hidantoinasa con propiedades
mejoradas y su uso para la producción de amino ácidos.
La presente invención se relaciona generalmente
con las hidantoinasas. Más particularmente, la presente invención
incluye el hallazgo de un número de hidantoinasas modificadas que
exhiben propiedades enzimáticas mejoradas con relación a las
hidantoinasas aisladas anteriormente y su uso en los catalizadores
de célula entera para producir amino ácidos.
Las enzimas que hidrolizan la hidantoina, las
cuales serán referidas aquí como "hidantoinasas", comprenden
una clase diversa de enzimas que tienen un amplio rango de funciones
biológicas y especificidades. Algunas hidantoinasas por ejemplo
juegan un papel esencial en la ruta de reducción de la degradación
de la pirimidina (dihidropirimidinasas, EC 3.5.2.2) mientras otras
catalizan las reacciones en la ruta de degradación de la purina
(alantoinasas, EC 3.5.2.5). A pesar de su diversidad funcional las
hidantoinasas muestran similitudes significativas de la secuencia y
pertenecen a una super familia de amidohidrolasas relacionadas con
las ureasas como fue descrito por Holm, L., y Sander, C. (1997) Un
tesoro de la evolución: Unificación de un conjunto amplio de
amidohidrolasas relacionadas con las ureasas, Proteins
28:72-82. El alineamiento de secuencias a
partir de diferentes hidantoinasas fue usado para identificar
residuos conservados que son importantes para la función catalítica
como fue descrito por May, O., Habenicht, A., Mattes, R., Syldatk,
C. y Siemann, M. (1998) Evolución Molecular de las Hidantoinasas,
Biol. Chem. 379:743-747; y Kim, G.J. y
Kim, H.S. (1998) Identificación de la similitud estructural en las
amidohidrolasas relacionadas funcionalmente que actúan sobre el
anillo de amida cíclico. Biochem. J.
330:295-302. A pesar de este conocimiento que
permite identificar residuos de amino ácidos equivalentes de
diferentes hidantoinasas, el conocimiento acerca de la función de
otros residuos de amino ácidos es limitado. Hasta ahora, no fue
reportada ninguna estructura por rayos X de la
hidantoinasa.
hidantoinasa.
Una importante propiedad de las hidantoinasas es
su enantioselectividad que las hace valiosas para la producción de
L- o D-amino ácidos ópticamente puros. Un
antecedente detallado de las hidantoinasas es proporcionado en la
tesis doctoral publicada de Oliver May titulada ``La Hidantoinasa a
partir del Arthrobacter aurescens DSM 3745 y su Relación con
otras Hidantoinasas (Institut fuer Bioverfahrenstechnik, Lehrstuhl
Physiologische Mikrobiologie, Universitaet
Stuttgart-1998).
En vista de la importancia de las hidantoinasas
para la producción de amino ácidos ópticamente puros, ha existido un
esfuerzo concentrado para desarrollar enzimas modificadas las cuales
tienen propiedades mejoradas con respecto a la producción de amino
ácidos. Como resultado de este esfuerzo, un número de
microorganismos han sido aislados e identificados que producen
hidantoinasas con propiedades enzimáticas deseables. La patente U.S.
No. 5,516,660 divulga microorganismos identificados como DSM 7329 y
DSM 7330 los cuales producen hidantoinasas que son capaces de
producir L-alfa amino ácidos a partir de
hidantoinasas D-,L- y/o D,L-5 monosustituidas. En la
patente U.S. No. 5,714,355, un mutante del microorganismo DSM 7330
es divulgado el cual tiene una actividad enzimática mayor que el
organismo madre por un factor de hasta 2.7. El mutante (DSM 9771)
fue obtenido cultivando el organismo DSM 7330 madre bajo presión
selectiva usando L-carbamilmetionina
(L-CAM) como la única fuente de nitrógeno (Wagner y
otros, J. Biotech. 1996, 46, 63). Aunque las hidantoinasas
producidas por los antes mencionados microorganismos son
convenientes para al menos algunos de sus pretendidos propósitos,
todavía existe una continua necesidad de desarrollar nuevas enzimas
que exhiban aún mayor actividad deseable de las hidantoinasas. En
particular, existe una necesidad de mejorar la enantioselectividad
así como la actividad catalítica.
De acuerdo con la presente invención,
hidantoinasas modificadas son proporcionadas las cuales tienen
propiedades enzimáticas mejoradas (mejor catalizador de célula
entera) con respecto a la hidantoinasa producida por el
microorganismo DSM 9771 el cual esta identificado en la patente de
U.S. No. 5,714,355. La hidantoinasa DSM 9771 tiene una secuencia de
amino ácidos la cual incluye posiciones numeradas que oscilan
secuencialmente desde 1 a 458 (SEQ. ID. NO. 2).
Fue encontrado que la sustitución de amino ácidos
en una o más posiciones específicas de amino ácidos dentro de la
enzima DSM 9771 resultó en la formación de enzimas que tienen
propiedades mejoradas con respecto a la actividad y la
enantioselectividad. Los números de las posiciones específicas de
los amino ácidos en las cuales la sustituciones son hechas para
lograr las enzimas hidantoinasas modificadas de acuerdo con la
presente invención son las posiciones Nos. 95, 154, 180, 251 y 295.
Como una característica adicional de la invención, las sustituciones
específicas de amino ácidos en varias posiciones son identificadas
para proporcionar tipos específicos de hidantoinasas modificadas.
Las sustituciones específicas de amino ácidos incluyen I95F, I95L,
V154A, V180A, Q251R y V295A. Fue encontrado que una o más de estas
sustituciones específicas mejoran la actividad enzimática y cambian
la enantioselectividad de las hidantoinasas DSM 9771 naturales. Se
descubrió que estas propiedades cambiadas de la enzima contribuyen a
un proceso de las hidantoinasas significativamente mejorado al
reducir la acumulación del enantiomero perjudicial del
N-carbamil amino ácido.
Seis hidantoinasas específicas modificadas están
divulgadas las cuales tienen una o más de las sustituciones de amino
ácidos anteriores. Las secuencias de amino ácidos para estas
hidantoinasas modificadas están establecidas en SEQ. ID. NOS. 4, 6,
8, 10, 12 y 14. Estas hidantoinasas modificadas son también
identificadas a través de la descripción como 1CG7, 11DH7, 1BF7,
19AG11, 22CG2 y Q2H4, respectivamente.
Fue adicionalmente descubierto que las
hidantoinasas evolucionadas por la actividad y/o la
enantioselectividad pueden dramáticamente mejorar la producción de
amino ácidos (es decir, L-metionina) usando un
catalizador de célula entera que comprende una hidantoinasa
evolucionada en adición a al menos una carbamilasa.
Las características anteriormente discutidas y
muchas otras características y ventajas acompañantes de la presente
invención serán mejor entendidas con referencia a la siguiente
descripción detallada.
Las hidantoinasas modificadas de acuerdo con la
presente invención fueron producidas, identificadas y aisladas
usando procedimientos de mutagénesis aleatoria del tipo descrito en
las Pat. U.S. Nos. 5,316,935 y 5,906,930. Los protocolos de
mutagénesis aleatorias, los cuales son también conocidos como
procedimientos de evolución dirigida, son también descritos en
Kuchner, O., Arnold, F.H. (1997) Evolución Dirigida de
Catalizadores de Enzimas, TIBTECH
15:523-530; Chen, K. y Arnold, F. (1991).
Ingeniería de enzimas para solventes no
acuosos-mutagénesis aleatoria para mejorar la
actividad de la subtilisina E en un medio orgánico polar,
Bio/Technology 9:1073-1077; Chen, K. y
Arnold, F. (1993) Ajustando la actividad de una enzima para medios
inusuales: mutagénesis aleatoria secuencial de la subtilisina E para
la catálisis en dimetilformamida, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:5618-5622; y You, L. y Arnold, F.H.
(1996). Evolución Dirigida de la Subtilisina E en Bacillus
Subtilis para mejorar la Actividad Total en Dimetilformamida
Acuosa, Protein Engineering, 9, 77-83.
El procedimiento de mutagénesis aleatoria usado
para identificar y aislar las hidantoinasas modificadas siguió los
mismos procedimientos básicos identificados anteriormente. Primero,
un gran número de mutaciones aleatorias en la secuencia de
nucleótidos naturales (SEQ. ID. NO. 1) fueron generadas. Esta
biblioteca de secuencias de nucleótidos fueron entonces usadas para
expresar un gran número de enzimas mutadas. La biblioteca de
hidantoinasas mutadas fue entonces investigada para identificar
aquellos mutantes con actividad enzimática mejorada y
enantioselectividad cambiada.
El paso de la investigación de la primera
biblioteca de secuencias de amino ácidos expresadas para identificar
variantes deseables pudiera haber sido acompañado usando cualquier
número de técnicas de investigación apropiadas que midieran las
propiedades deseables de la enzima. El método de investigación
realmente usado fue un ensayo indicador de pH el cual será descrito
en más detalle posteriormente.
De acuerdo con la presente invención, cuatro
enzimas que tienen propiedades de la hidantoinasa mejorada fueron
identificadas como resultado de la primera ronda de mutagénesis
aleatoria de la secuencia de nucleótidos DSM 9711 (SEQ. ID. NO. 1).
Las enzimas mutantes de la primera ronda son ICG7, 11DH7, 1BF7 y
19AG11. Las secuencias de nucleótidos para estos mutantes de la
primera ronda están establecidas en las SEQ. ID. NOS. 3, 5, 7 y 9,
respectivamente. Las secuencias de amino ácidos correspondientes son
establecidas en SEQ. ID. NOS. 4, 6, 8 y 10, respectivamente.
Una segunda ronda de mutagénesis aleatoria fue
conducida en la cual la secuencia de nucleótidos 11DH7 fue mutada
aleatoriamente para formar una segunda biblioteca de mutantes. Un
único mutante (22CG2) fue identificado el cual expresó una
hidantoinasa modificada que exhibió propiedades enzimáticas
deseables. La enzima 22CG2 es la misma que la enzima 11DH7 excepto
que el mutante 22CG2 tiene una sustitución de amino ácidos en la
posición
180.
180.
El mutante 22CG2 fue sometido a mutagénesis de
saturación para introducir todos los 20 amino ácidos diferentes en
la posición 95 de los amino ácidos. 400 clones fueron investigados y
una enzima mutante con actividad enzimática mejorada y (L)-
selectividad más alta fue identificada como Q2H4. El mutante Q2H4 es
el mismo que el mutante 22CG2 excepto que la fenilalanina es
sustituida por isoleucina en la posición 95.
Como resultado del aislamiento e identificación
de los mutantes anteriormente identificados, fue establecido que las
hidantoinasas mejoradas pueden ser obtenidas modificando la enzima
DSM 9771 sustituyendo los amino ácidos en la posición 95, 124, 154,
180, 251 y 295. Las sustituciones pueden ser hechas en una o más de
las posiciones. La Tabla 1 establece las sustituciones de amino
ácidos preferidas.
| Posición del Amino Ácido | Sustitución | Abreviatura |
| 95 | Ile \rightarrow Phe | I95F |
| 95 | Ile \rightarrow Leu | I95L |
| 154 | Val \rightarrow Ala | V154A |
| 180 | Val \rightarrow Ala | V180A |
| 251 | Gln \rightarrow Arg | Q251R |
| 295 | Val \rightarrow Ala | Q295A |
Las sustituciones de amino ácidos diferentes a
aquellas establecidas en la Tabla 1 son posibles a condición de que
la hidantoinasa resultante exhiba propiedades enzimáticas deseables.
Por ejemplo, otras sustituciones de amino ácidos apropiadas para la
isoleucina en la posición 95 incluyen Gly, Ala, Val, Leu, Phe, Tyr y
Trp. Para las posiciones 154, 180 y 295, sustituciones alternativas
apropiadas de amino ácidos para la valina incluyen Ala y Gly.
Sustituciones alternativas apropiadas de amino ácidos en la posición
251 para la glutamina incluyen Arg, Lys y Asn. Las sustituciones de
amino ácidos pueden ser hechas por mutagénesis de saturación seguida
por la investigación de los clones. Las sustituciones pueden también
ser hechas por manipulación química de la enzima DSM 9711 o por
síntesis convencional de péptidos que tienen las sustituciones de
amino ácidos deseadas en las locaciones deseadas. Debe notarse que
las sustituciones de amino ácidos antes listadas pretenden ser
ejemplos de sustituciones alternativas preferidas en los diferentes
sitios de sustitución. Las sustituciones de otros amino ácidos son
posibles a condición de que la actividad enzimática de la proteína
resultante no sea destruida. La utilidad de una sustitución de amino
ácidos particular en las posiciones 95, 154, 180, 251 y 295 puede
ser determinada por una investigación rutinaria del pH como es
descrito posteriormente.
Una posición de un amino ácido que es
identificada por ejemplo por medio de evolución dirigida para
contribuir a una función específica puede frecuentemente ser ocupada
por diferentes residuos de amino ácidos, no solamente aquel que fue
identificado por medio de la mutagénesis puntual aleatoria. Algunas
sustituciones destruirán la función, algunas de ellas no cambiarán
la función, e incluso otras mejorarán la función. Con métodos
conocidos, tal como la mutagénesis de saturación de sitio, uno puede
fácilmente identificar los amino ácidos que contribuyen en la misma
forma a la función o incluso la mejoran remplazando el residuo de
amino ácido encontrado con todos los residuos de amino ácidos
posibles (Miyazaki, K., Arnold, F., Explorando las rutas de la
evolución no natural por medio de la mutagénesis de saturación:
mejoramiento rápido de la función de la proteína. J. Mol.
Evol. 49:1716-1720). Incluso amino ácidos
no naturales pueden ser introducidos en el sitio identificado usando
un codón de parada y un supresor tRNA enlazado a un amino ácido no
natural (Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlain, A.R.,
Diala, E.S., Incorporación Biosintética Del Sitio Específico De Un
Amino Ácido No Natural En Un Polipéptido. JACS
111:8013-8014 (1989)).
Seis hidantoinasas modificadas de acuerdo con la
presente invención son listadas en la Tabla 2. La Tabla 2 también
lista las sustituciones de amino ácidos con respecto a la secuencia
DSM 9771 (SEQ. ID. NO. 2) para cada enzima modificada que es
identificada.
| Variante de Hidantoinasa | Sustitución de Amino Ácidos |
| 1CG7 (SEQ. ID. NO. 4) | V154A |
| 11DH7 (SEQ. ID. NO. 6) | I95L + Q251R |
| 1BF7 (SEQ. ID. NO. 8) | V295A |
| 19AG11 (SEQ. ID. NO. 10) | I95L |
| 22CG2 (SEQ. ID. NO. 12) | I95L + V180A + Q251R |
| Q2H4 (SEQ. ID. NO. 14) | I95F + V180A + Q251R |
Las hidantoinasas modificadas de la presente
invención pueden ser usadas de la misma manera que otras
hidantoinasas para producir D- y L-amino ácidos
ópticamente puros. Por ejemplo, ver Producción Biocatalítica de
Amino Ácidos y Derivados (Rozzell, J.D. y Wagner, F. eds.)(1992)
Hanser Publisher, NY, en las páginas 75-176, para
una descripción del uso de las hidantoinasas en la producción de
amino ácidos óptimamente puros a partir de hidantoinasas
DL-5 monosustituidas. El uso general de las
hidantoinasas está también descrito en Catálisis de las enzimas en
síntesis orgánica (Dranz, K. y Waldmann, H. eds) 1995,
VCH-Verlag, Weinheim, en las páginas
409-431; y Wagner, T. y otros (1996) Producción de
l-metionina a partir de hidantoina
d,l-5-(2-metiltioetil) por células
en reposo de una nueva cepa mutante de las especies
Arthrobacter DSM 7330, Journal of Biotechnology
46 :63-68.
Los amino ácidos referidos en la presente
invención son todos amino ácidos naturales o no naturales, donde los
amino ácidos son considerados como una amina primaria conectada al
grupo de ácido carboxílico a través de un átomo C intermediario
(átomo \alpha-C). Este átomo C lleva solamente un
residuo adicional. Amino ácidos no naturales preferidos son
divulgados en DE 19903268.8. Amino ácidos naturales preferidos son
aquellos mencionados en Beyer-Walter, Lehrbuch der
Organischen Chemie, 22. Auflage, S. Hirzel Verlag Stuttgart,
S.822-827. Dentro de aquellos amino ácidos
presentados anteriormente la alanina, la leucina, la isoleucina, la
metionina, la valina, la tert.-leucina o la neopentil glicina son
preferiblemente no transformadas en un proceso que utiliza la
hidantoinasa
modificada.
modificada.
Para transformar las hidantoinas directamente a
amino ácidos por medio de las enzimas es preferido usar un
catalizador de célula entera el cual incluye la hidantoinasa de la
invención acompañada con una carbamilasa. Una hidantoina racemasa
también puede ser usada en adición a la hidantoinasa y
carbamilasa.
La hidantoinasa puede ser usada dentro de este
proceso tanto en su forma libre como inmovilizada. También la
hidantoina racemasa y la carbamilasa pueden ser inmovilizadas. Las
técnicas para inmovilizar enzimas son bien conocidas para el
trabajador versado en la materia. Métodos preferidos son mencionados
en Bhavender P. Sharma, Lorraine F. Bailey y Ralph A. Messing,
Immobilisierte Biomaterialien-Techniken und
Anwendungen, Angew. Chem. 1992, 94, 836-852; Dordick
y otros, J. Am. Chem. Soc. 194, 116, 5009-5010;
Okahata y otros, Tetrahedron Lett. 1997, 38,
1971-1974; Adlercreutz y otros, Biocatalysis 1992,
6, 291-305; Goto y otros, Biotechnol. Prog. 1994,
10, 263-268; Kamiya y otros, Biotechnol. Prog. 1995,
11, 270-275; Okahata y otros, Tibtech, Febrero 1997,
15, 50-54; Fishman y otros, Biotechnol. Lett. 1998,
20, 535-538.
La transformación discutida puede ser conducida
en un proceso batch o de forma continua. Ventajosamente, un reactor
de membrana de enzimas es usado como recipiente de reacción (Wandrey
y otros en Jahrbuch 1998, Verfahrenstechnik und
Chemieingenieurwesen, VDI S. 151ff.; Wandrey y otros en Applied
Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds, Vol. 2, VCH
1996, S.832 ff.; Kragl y otros, Angew. Chem. 1996, 6, 684f.)
Una realización adicional de la presente
invención está dirigida a un catalizador de célula entera que
comprende un gen que codifica para una carbamilasa, una racemasa
opcional y una hidantoinasa donde la hidantoinasa es considerada
aquella de acuerdo a la hidantoinasa modificada de la invención.
Ventajosamente, una bacteria es usada como una
célula, debido a los altos valores de reproducción y condiciones de
rápido crecimiento a ser aplicados. Existen varias bacterias
conocidas para el trabajador versado en la materia las cuales pueden
ser utilizadas para este fin. Preferiblemente la E. coli
puede ser usada como el sistema de expresión y la célula en este
respecto (Yanisch-Perron y otros, Gene (1985), 33,
103-109).
Otro aspecto de la invención es un proceso para
la producción de amino ácidos enantiomericamente enriquecidos, el
cual utiliza un catalizador de célula entera de acuerdo a la
invención.
Es adicionalmente preferido en este aspecto que
los amino ácidos como la metionina, treonina, lisina o tert.-leucina
son producidos por la adición del catalizador de célula entera.
La transformación discutida en esta instancia
puede ser conducida en un proceso batch o de forma continua.
Ventajosamente, un reactor de membrana de enzimas es usado como
recipiente de reacción (Wandrey y otros en Jahrbuch 1998,
Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI S. 151ff.; Wandrey y
otros en Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic
Compounds, Vol. 2, VCH 1996, S832 ff.; Kragl y otros, Angew. Chem.
1996, 6, 684f; DE 19910691.6).
Existe un aspecto de la invención, el cual está
dirigido a un proceso para la producción de un catalizador de célula
entera de la invención. En adición cebadores de las SEQ. NO. 17,
SEQ. NO. 18, SEQ. NO. 15 y/o SEQ. NO. 16 son usados con respecto a
la producción del catalizador de célula entera.
Los Ejemplos de Práctica son los siguientes:
El siguiente ejemplo proporciona detalles
adicionales en relación con los procedimientos usados para
identificar y aislar las hidantoinasas modificadas de acuerdo a la
presente invención.
La hidantoinasa a partir del Arthrobacter
sp. DSM 9771 (Pat. U.S. No. 5,714,355) fue clonada por medio de
una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La secuencia de
nucleótidos fue determinada y comparada con otras hidantoinasas a
partir de cepas de Arthrobacter estrechamente relacionadas.
Las secuencias de amino ácidos y de nucleótidos para las
hidantoinasas están establecidas en SEQ. ID. NOS. 1 y 2,
respectivamente. Las enzimas clonadas a partir de Arthrobacter
sp. DSM 9771 comparten alrededor del 97.5% de identidad basada
en su secuencia de nucleótidos (que corresponde a 7 cambios de amino
ácidos) con las enzimas del Arthrobacter aurescens DSM 3747 y
DSM 3745. Las enzimas fueron expresadas en E. coli JM109
usando una construcción de un vector inducible de ramnosa el cual
fue proporcionado por el Instituto de Genética Industrial,
Universität Stuttgart (Alemania).
La hidantoinasa fue sometida a mutagénesis
aleatoria usando la PCR propensa a error. Aproximadamente 10,000
clones fueron investigados usando un ensayo indicador de pH como es
descrito a continuación:
- 1.
- Placas de cultivo de semillas: las placas que contienen 100 \mul/cavidad de LB-ampicilina fueron inoculadas con colonias individuales/cavidad e incubadas por 24 horas a 30ºC, 250 rpm.
- 2.
- Placas de cultivo principal: células de las placas de cultivo de semillas fueron transferidas con un replicador de 96 pines en placas que contienen 200 \mul de LB-ampicilina + 0.2% de ramnosa. Las placas fueron incubadas por 24 horas a 30ºC, 250 rpm.
- 3.
- Ensayo: usando un robot de pipeteo, el cultivo de cada cavidad fue mezclado pipeteando hacia arriba y hacia abajo (3x) y transfiriendo (75 \mul cada una) en dos nuevas placas. Las dos placas son llenadas con 100 \mul/cavidad de solución de substrato recientemente preparada (80 mM D-MTEH y L-MTEH respectivamente, en 0.05 g/l de rojo de cresol pH 8.6). La absorbencia en 580 nm es medida inmediatamente después que el substrato fue adicionado a la placa y después de 3 horas de incubación a temperatura ambiente. La actividad fue calculada como sigue:
Actividad =
(A580(0 h) - A580(3 h))/((A580(0 h) -
0.8))
- (Nota:0.8 es la absorbencia sin células)
Para los propósitos de investigación, el rango de
actividades para los L- y D-enantiomeros es tomado
como un iniciador de la enantioselectividad cambiada.
Ya que el rango de actividades para diferentes
enantiomeros en las pruebas de investigación es solamente un primer
indicio de la enantioselectividad, los mutantes identificados fueron
confirmados por HPLC quiral usando el substrato racémico como sigue.
2 ml de cultivos después de una noche fueron adicionados a 2 ml 80
mM DL-MTEH en 0.1 M Tris pH8.5 e incubados a 37ºC.
Después de 1 h y 2 h respectivamente, la mezcla de reacción fue
centrifugada por 2 minutos, 14000 rpm. 20 \mul del sobrenadante
fueron aplicados en la columna HPLC y lixiviadas las diferentes
fracciones.
Alrededor del 2% de la población mostró una
actividad significativamente más alta (>50%) comparada con la DSM
9771 natural. Aunque un número considerable de aquellos clones
pudieran ser falsos positivos debido a la variación común del nivel
de expresión en una población, alrededor del 50% de los clones
reinvestigados fueron realmente mutantes con actividad más alta. El
número más alto indica que la hidantoinasa tiene un gran potencial
de evolución (su actividad y enantioselectividad puede ser por eso
mejorada). Esto puede ser racionalizado ya que un valor Km alto
(alrededor de 15 mM), una actividad específica bastante baja
(alrededor de 12 U/mg) y un nivel de expresión bajo (<10% del
total de proteínas) deja espacio para el mejoramiento de esta
enzima.
La Tabla 3 muestra los resultados de los mutantes
analizados. El mutante 1CG7 muestra un incremento dramático de (D-)
selectividad. Comparado con el natural, el exceso enantiomerico del
producto está incrementado 4 veces. La enantioselectividad de los
clones 11DH7 y 19AG11 fue cambiada a la dirección opuesta ya que
ambos mutantes son absolutamente no selectivos. La actividad del
mutante 1BF7 posee la misma enantioselectividad que el
natural.
natural.
| Clon | Conversión | exceso enantiomerico[%] |
| Natural | 42% después de 2 horas | 19 |
| 1CG7 | 42% después de 2 horas | 90 |
| 11DH7 | 42% después de 2 horas | 0 |
| 19AG11 | 37% después de 2 horas | 0 |
| 1BF7 | 45% después de 1 hora | 19 |
Todos los mutantes fueron secuenciados y las
secuencias de amino ácidos y de nucleótidos establecidas como se
muestra en la Tabla 4.
| Secuencia De Nucleótidos | Secuencia de Amino Ácidos | |
| (SEQ. ID. NO.) | (SEQ. ID. NO.) | |
| 1CG7 | 3 | 4 |
| 11DH7 | 5 | 6 |
| 1BF7 | 7 | 8 |
| 19AG11 | 11 | 12 |
Una segunda ronda de mutagénesis aleatoria fue
conducida usando el mutante de la primera generación 11DH7 como
madre.
Dos diferentes bibliotecas con diferentes rangos
de error (20% y 50% de clones inactivos) fueron producidas y 10,000
clones de cada biblioteca fueron investigados usando el método
indicador de pH descrito anteriormente. Ninguno de los clones
investigados mostró L-selectividad
significativamente más alta pero fueron encontrados mutantes con
actividad mejorada y D-selectividad más alta. Se
encontró que un mutante (22CG2) que difiere del madre en solamente
un amino ácido (V180A) es 4 veces más activo comparado con el madre
11DH7.
Secuenciar los mutantes de la primera generación
11DH7 y 19AG11 reveló que una mutación única (I95L) es responsable
de su D-selectividad disminuida. Introducir todos
los 20 diferentes amino ácidos en la posición 95 de amino ácidos del
mutante 22CG2 por mutagénesis de saturación e investigación de
alrededor de 400 clones reveló un nuevo mutante (Q2H4) con
L-selectividad significativamente mejorada
(ee_{L}=20%) y actividad mejorada en 1.5 veces comparada con su
madre 22CG2. Las secuencias de amino ácidos y de nucleótidos para
22CG2 son establecidas en SEQ. ID. NOS. 11 y 12, respectivamente.
Las secuencias de amino ácidos y de nucleótidos para Q2H4 son
establecidas en SEQ. ID. NOS. 13 y 14, respectivamente.
En adición a los mejoramientos proporcionados por
los mutantes descritos anteriormente, la actividad del catalizador
de célula entera pudiera ser incrementada por un factor de 10 por la
adición de 1 mM de manganeso al medio de crecimiento y a la solución
de substrato. Bajo esas condiciones la actividad del mutante 22CG2
fue determinada de alrededor de 380 U/gCDW el cual tiene un
incremento de la actividad en 50 veces comparado con la actividad
descrita para el Arthrobacter sp. DSM 9771.
Todas las enzimas modificadas identificadas de
acuerdo con la presente invención tienen actividades y/o
enantioselectividad que son mejores que la hidantoinasa DSM 9771 no
modificada. Cuando fue analizado bajo condiciones estándar por medio
de HPLC, el mutante Q2H4 mostró enantioselectividad invertida para
la hidrólisis de D,L-MTEH. El Q2H4 produjo
N-carbamil-L-metionina
con un exceso enantiomérico (ee) de 20% en alrededor del 30% de
conversión. En adición, el mutante Q2H4 fue aproximadamente 1.5
veces más activo que su madre 22CG2.
En un ejemplo adicional, la
L-metionina fue producida con un catalizador de
célula entera recombinante. Los catalizadores de célula entera
recombinantes fueron preparados co-expresando la
hidantoinasa evolucionada o natural con una hidantoina racemasa y
una L-carbamilasa en E. coli como sigue.
Cepas y vectores de expresión. La
L-carbamilasa y el vector de expresión de la
hidantoinasa pOM17 y pOM18 fueron construidos por amplificación PCR
del gen hyuC y hyuH, respectivamente, a partir de
Arthrobacter sp. DSM 9771 usando el siguiente cebador: para
amplificación de hyuC:
5'-AGGCGACATATGACCCTGCAGAAAGCGCAA-3'
(SEQ. ID. NO. 17),
5'-ATGGGATCCCCGGTCAAGTGCCTTCATTAC-3'
(SEQ. ID. NO. 18); para amplificación de hyuH:
5'-AGAACATATGTTTGACGTAATAGTTAAGAA-3'
(SEQ. ID. NO. 15),
5'-AAAAGGATCCTCACTTCGACGCCTCGTA-3'
(SEQ. ID. NO. 16). Los fragmentos amplificados fueron escindidos con
las enzimas de restricción Ndel y BamHI e insertados usando las
mismas enzimas de restricción aguas abajo del promotor rha
BAD (promotor de ramnosa) en el vector pJOE2702 (Volff, J.-N.,
Eichenseer, C., Viell, P., Piendl, W. y Altenbuchner, J. (1996)
Secuencia de nucleótidos y papel en la amplificación del DNA de las
repeticiones directas que componen el elemento amplificable AUDI de
Streptomyces lividans 66. Mol. Microbiol.
21,1037-1047). El plásmido de
co-expresión pOM20 que comprende el gen de la
L-carbamilasa y de la hidantoinasa, ambos
separadamente bajo el control de un promotor de ramnosa, fue
derivado del Plásmido pOM17 y pOM18. El pOM17 fue digerido por SaII
y tratado con el fragmento de Klenow para formar extremos romos. El
pOM18 fue digerido por BamHI y también tratado con el fragmento de
Klenow para formar extremos romos. Ambos fragmentos fueron
subsecuentemente digeridos a partir de HindII. El fragmento 1521 kb
que comprende el gen de la carbamilasa y el promotor de ramnosa
derivado del pOM17 fue ligado con el fragmento 5650kb del pOM18
digerido para producir pOM20. Las mutaciones de la hidantoinasa
L-selectiva fueron introducidas en el pOM20 usando
las enzimas de restricción RsrII y KasI las cuales produjeron el
pOM22. El vector de expresión de la racemasa pOM21 fue derivado de
pACYC184 (Rose, R.E. La secuencia de nucleótidos del pACYC184,
Nucleic Acids Res. 16, 355 (1988)) y porta un
marcador de selección del cloranfenicol y el gen de la racemasa
hyuR a partir del Arthrobacter sp. DSM 3747 bajo el
control del promotor de ramnosa. Todos los plásmidos fueron
rutinariamente transformados en E. coli JM109
(Yanish-Perron, C., Viera, J. y Messing, J. (1984)
Fago M13 mejorado que clona cepas hospederas y vectores: secuencias
de nucleótidos de los vectores pUC y M13 mp18. Gene
33, 103-109). La ruta que convierte la
hidantoina fue instalado en E. coli JM109 por medio de la
transformación del pOM20 y el pOM22, repectivamente en E.
coli JM109 (pOM21). Las células fueron cultivadas en un medio
líquido LB o en placas de LB agar (Luria, S.E., Adams, J.N. y Ting,
R.C. (1960) Transducción de la capacidad de utilización de la
lactosa entre las cepas de Escherichia coli y Shigella
dysenteriae y propiedades de las partículas del fago.
Virology 12, 348-390), ambas
suplementadas con los respectivos antibióticos para el crecimiento y
el medio de expresión (100 \mug/ml ampicilina, 50 \mug/ml de
cloranfenicol) y adición de 2 mg/ml de ramnosa para el medio de
expresión.
PCR propensa a error. La mutagéneisis
aleatoria del gen de la hidantoinasa fue ejecutada en una mezcla de
reacción de 100 \mul que contiene 0.25 ng del DNA del plásmido
como patrón, buffer PCR de Boehringer (10 mM Tris, 1.5 mM
MgCl_{2}, 50 mM KCI, pH 8.3), 200 \muM dATP, 200 \muM dTTP,
200 \muM dGTP, 200 \muM dCTP, 50 pmol de cada cebador, y 2.5 U
Taq polimerasa (Boehringer). Después de 30 ciclos, el
producto de amplificación 1667 fue extraído del gel usando el kit de
extracción de gel QiaexII (Qiagen, Valencia, CA) y subclonado en el
vector pJOE2702 usando los sitios de restricción HindIII y
EcoRI. La frecuencia de religación del vector tratado con
fosfatasa alcalina estaba por debajo de 1%.
Mutagénesis de saturación. Para la
randomización del codón para la posición 95 de los amino ácidos, el
protocolo QuickChange^{TM} (Stratagene, La Jolla, CA) fue usado.
Alrededor de 10 ng de plásmido del clon 22CG2 fueron amplificados
por medio de PCR usando dos oligonucleótidos complementarios
(5'-CATCGAGATGCCGNNNACCTTCCCGCCCAC-3',
5-GTGGGCGGGAAGGTNNNCGGCATCTCGATG-3').
Después de la amplificación PCR la mezcla de reacción fue tratada
por 2 horas con 20 U de enzima de restricción Dpnl. La
transformación de 10 \mul de la mezcla de reacción digerida con
Dpnl en células competentes produjo una biblioteca de más de 2000
mutantes de los cuales alrededor de 400 fueron investigados.
Preparación de la biblioteca e
investigación. Colonias individuales de E. coli
transformada fueron transferidas a placas de 384 cavidades (placas
master) usando el sistema robot Qbot (Genetix, Dorset, UK). Después
de 20 horas de crecimiento a 37ºC las placas fueron almacenadas a
-80ºC. Para la investigación subsiguiente, las placas fueron
congeladas y replicadas en placas de 96 cavidades que contienen 200
\mul por cada medio inductor de cavidad. Una estación de trabajo
de pipeteo Biomek 1000 (Beckman, Fullerton, CA) fue usada para
dividir la placa incubada a 30ºC por 24 horas en dos nuevas placas
de 96 cavidades una conteniendo 100 \mul 80 mM
L-MTEH y otra 100 \mul 80 mM
D-MTEH en 50 mg/l de solución de rojo de cresol
ajustada a un pH de 8.5. La absorbencia inicial a 580 nm y después
de 3 horas de incubación a temperatura ambiente fueron medidas
usando un lector de placa THERMOmax (Molecular Devices, Sunnyvale,
CA). La actividad fue calculada a partir de la diferencia de la
absorbencia inicial y después de 3 horas de incubación dividida por
la densidad de las células de cada cavidad. Para la biblioteca de la
mutagénesis de saturación el tiempo de incubación fue reducido a 1.5
horas. El rango de actividad con respecto al D- y
L-enantiomero fue tomado como un primer indicador
para la enantioselectividad. Los clones identificados fueron
entonces analizados usando el substrato racémico bajo las
condiciones descritas a continuación.
Caracterización de la actividad y la
enantioselectividad. El plásmido del mutante encontrado positivo
en la investigación fue secuenciado y transformado en E.
coli. Un cultivo de E. coli retransformada fue cultivado
por 16-18 horas (hasta OD10) en un medio inductor
suplementado con 1 mM MnCl_{2}. 2 ml de solución de substrato que
consiste de 80 mM D,L-MTEH, 0.1 M Tris pH 8.5, 1 mM
MnCL_{2} (pre-incubado a 37ºC) fueron adicionados
a 2 ml de cultivo de células (OD600-7). La mezcla de
reacción fue inmediatamente incubada a 37ºC en un baño de agua.
Después de diferentes períodos de tiempo (como se especificó en el
texto) muestras de 1 ml fueron tomadas y centrifugadas por 5 minutos
a 14000 rpm. 20 \mul de sobrenadante fueron analizados por HPLC
quiral usando una columna producida por
Degussa-Huels AG. La actividad fue calculada a
partir de la cantidad de
N-carbamil-D,L-metionina
producida y expresada como U/ml de cultivo de células de U/mg de
peso seco de la célula (CDW) donde 1 U es la cantidad del
catalizador de célula entera para producir 1 \mumol de
N-carbamil-D,L-metionina
en un minuto bajo condiciones de reacción establecidas. La
enantioselectividad de la hidantoinasa y sus mutantes fueron
comparadas calculando el porcentaje de ee_{D}
((D-L)/(D+L)) y ee_{L}
((L-D)/(L+D)) respectivamente para el producto en
diferentes extensiones de la conversión. Una determinación
convencional de E (rango enantiomerico) a partir de los valores ee y
la extensión de la conversión como fue descrito por Chen y otros
(Chen, C.S., Fujimoto, Y., Girdaukas, G. y Sih, C.J. (1982) Análisis
cuantitativo de las resoluciones cinéticas bioquímicas de los
enantiomeros. J. Am. Chem. Soc. 104,
7294-7299) no es posible debido a la rápida
racemización del substrato.
Conversión de D,L-MTEH en
L-met. 8 mg de masa seca de células de E.
coli JM109 (pOM20 y pOM21) y E. coli JM109 (pOM22 y
pOM21) fueron adicionados a 4 ml 100 mM D,L-MTEH en
0.1 M Tris pH 7.8 suplementada con 1 mM MnCl_{2}. La mezcla de
reacción fue incubada a 37ºC. Las muestras fueron analizadas después
de los periodos de tiempo indicados y analizados por HPLC para MTEH,
D,L-C met, y D,L-met como se
describió en Völkel, D. y Wagner, F. (1995) Mecanismo de reacción
para la conversión de hidantoinas 5-monosustituidas
a L-amino ácidos enantiomericamente puros. Ann.
NY Acad. Sci. 750, 1-9. La pureza óptica
de los compuestos fue analizada por HPLC quiral como se describió
anteriormente.
La conversión de D,L-MTEH en
L-met es significativamente mejorada por el
catalizador con la hidantoinasa evolucionada. Después de tres horas,
aproximadamente 60 mM L-met fueron producidos a
partir de 100 mM D,L-MTEH, donde el catalizador de
célula entera con la ruta natural produjo solamente 10 mM de amino
ácido. La concentración del D-C met intermedia fue
reducida por un factor de 4 y la productividad para la producción de
L-amino ácidos fue incrementada en 8 veces durante
la primera hora de la reacción.
El siguiente ejemplo muestra que la producción de
L-metionina fue significativamente mejorada con una
hidantoinasa evolucionada del mutante 22CG2 el cual ha mejorado la
actividad y no es enantioselectivo (0% de excesos enantiomerico a
42% de conversión, ver Tabla 3). Las mutaciones de la hidantoinasa
evolucionada a partir del mutante 22CG2 fueron introducidas en pOM20
como fue previamente descrito usando las enzimas de restricción
RsrII y KasI, las cuales produjeron el pOM23. Este vector de
co-expresión fue transformado en E. coli
JM109 (pOM21). Los catalizadores de célula entera resultante E.
coli JM109 (pOM21/pOM23) y E. coli JM109 (pOM21/pOM20)
fueron usados para la conversión de D,L-MTEH en
metionina. 125 mg de masa seca de células de las respectivas células
fueron adicionadas a la solución de substrato de 5 ml (100 mM
D,L-MTEH en 0.9% NaCl, 1 mM MnCl_{2}, pH 7.8) e
incubadas por 1 hora a 37ºC. La Fig. 6 muestra la producción de
metionina (Met) y
N-carbamil-metionina
(C-Met) a partir de D,L-MTEH para
ambos catalizadores. El catalizador de célula entera con la
hidantoinasa mejorada a partir del clon 22CG2 produjo alrededor de
65 mM de metionina durante una hora mientras que el catalizador de
célula entera con la hidantoinasa natural produjo sólo 8 mM durante
el mismo tiempo de reacción. Esto demuestra que la hidantoinasa
evolucionada sin enantioselectividad significativa pero actividad
mejorada conduce a un mejoramiento significativo en la producción de
metionina.
Habiendo descrito así las realizaciones
ejemplares de la presente invención. Debe ser notado por aquellos
versados en el arte que las divulgaciones de aquí dentro son a modo
de ejemplo solamente y que varias otras alternativas, adaptaciones,
y modificaciones pueden ser hechas dentro del alcance de las
presentes reivindicaciones.
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Claims (30)
1. Una hidantoinasa modificada que tiene
enantioselectividad cambiada y/o actividad enzimática mejorada con
relación a la hidantoinasa no modificada de SEQ. ID. NO. 2, donde
dicha hidantoinasa no modificada ha sido modificada por una
sustitución de amino ácidos en una o más posiciones de amino ácidos
seleccionadas del grupo que consiste de los números de posición de
amino ácidos 95, 154, 180, 251 y 295.
2. Una hidantoinasa modificada de acuerdo a la
reivindicación 1 donde dichas una o más sustituciones de amino
ácidos son seleccionadas del grupo que consiste de I95F, V154A,
V180A, y V295A.
3. Una hidantoinasa modificada de acuerdo a la
reivindicación 1 donde dicha hidantoinasa no modificada es
modificada por las sustituciones de amino ácidos I95F, V180A y
Q251R.
4. Una hidantoinasa modificada de acuerdo a la
reivindicación 1 donde dicha hidantoinasa no modificada es
modificada por las sustituciones de amino ácidos I95L y Q251R.
5. Una hidantoinasa modificada de acuerdo a la
reivindicación 1 donde dicha hidantoinasa no modificada es
modificada por la sustitución del amino ácido V154A.
6. Una hidantoinasa modificada de acuerdo a la
reivindicación 1 donde dicha hidantoinasa no modificada es
modificada por la sustitución del amino ácido V295A.
7. Un segmento de ácido nucleico que comprende
una región que codifica una hidantoinasa modificada que tiene
enantioselectividad cambiada y/o actividad enzimática mejorada con
relación a la hidantoinasa no modificada de SEQ. ID. NO. 2, donde
dicha hidantoinasa no modificada ha sido modificada por una
sustitución de amino ácidos en una o más posiciones de amino ácidos
seleccionadas del grupo que consiste de los números de posición de
amino ácidos 95, 154, 180, 251 y 295.
8. Un segmento de ácido nucleico de acuerdo a la
reivindicación 7 donde dichas una o más sustituciones de amino
ácidos son seleccionadas del grupo que consiste de I95F, V154A,
V180A, y V295A.
9. Un vector de expresión que contiene un
segmento de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 7.
10. Un vector de expresión que contiene un
segmento de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 8.
11. Una célula hospedera que comprende un
segmento de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 7.
12. Una célula hospedera que comprende un
segmento de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 8.
13. Un método para producir una hidantoinasa
modificada donde dicho método comprende las etapas de:
expresar un segmento de ácido nucleico que
codifica dicha hidantoinasa modificada de acuerdo a la
reivindicación 7 en una célula hospedera apropiada para producir
hidantoinasa modificada; y
recuperar dicha hidantoinasa modificada producida
por dicha etapa de expresión.
14. Un método para producir una hidantoinasa
modificada donde dicho método comprende las etapas de:
expresar un segmento de ácido nucleico que
codifica dicha hidantoinasa modificada de acuerdo a la
reivindicación 8 en una célula hospedera apropiada para producir
hidantoinasa modificada; y
recuperar dicha hidantoinasa modificada producida
por dicha etapa de expresión.
15. Proceso para la producción de amino ácidos
utilizando una hidantoinasa modificada de acuerdo a la
reivindicación 1.
16. Proceso de acuerdo a la reivindicación 15
caracterizado en que una hidantoinasa modificada de acuerdo
a la reivindicación 2 es utilizada.
17. Proceso de acuerdo a la reivindicación 15
caracterizado en que acompañada con la hidantoinasa una
carbamilasa y una hidantoina racemasa es usada.
18. Proceso de acuerdo a la reivindicación 15
caracterizado en que hidantoinasa libre o inmovilizada es
usada.
19. Proceso de acuerdo a la reivindicación 15
caracterizado en que alanina, leucina, isoleucina,
metionina, valina o tert.-leucina o neopentil glicina son
producidas.
20. Proceso de acuerdo a la reivindicación 15
caracterizado en que el proceso es ejecutado en un reactor
de membrana de enzima.
21. Catalizador de célula entera que comprende un
gen que codifica para una hidantoinasa donde la hidantoinasa es
considerada aquella de acuerdo a la reivindicación 1.
22. Un catalizador de célula entera de acuerdo a
la reivindicación 21 el cual además comprende un gen que codifica
para una carbamilasa.
23. Un catalizador de célula entera de acuerdo a
la reivindicación 22 el cual además comprende un gen que codifica
para una racemasa.
24. Un catalizador de célula entera de acuerdo a
la reivindicación 21 caracterizado en que una bacteria es
usada como una célula entera.
25. Un catalizador de célula entera de acuerdo a
la reivindicación 21 caracterizado en que una Escherichia
coli es usada como una célula entera.
26. Proceso para la producción de amino ácidos
utilizando catalizadores de célula entera de acuerdo a la
Reivindicación 21.
27. Proceso de acuerdo a la reivindicación 26
caracterizado en que metionina, valina, treonina, lisina o
tert.-leucina es producida.
28. Proceso de acuerdo a la reivindicación 26
caracterizado en que el proceso es ejecutado en un reactor
de membrana de enzima.
29. Proceso para la producción de un catalizador
de célula entera de acuerdo a la reivindicación 21 donde los
cebadores de la SEQ. ID. NO. 17, SEQ. ID. NO. 18, SEQ. ID. NO. 15
y/o SEQ. ID. NO. 16 son usados.
30. Un proceso para la producción de alfa amino
ácidos usando un catalizador de célula entera que contiene una
hidantoinasa mejorada de la Reivindicación 1 donde el
N-carbamil-D-amino
ácido o
N-carbamil-L-amino
ácido que es producido por la acción de la hidantoinasa es además
químicamente o enzimáticamente hidrolizado para producir el amino
ácido y donde la racemización de la hidantoina es lograda tanto
químicamente como enzimáticamente.
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