ES2652387T3 - Mutantes de hidantoinasa - Google Patents

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ES2652387T3
ES2652387T3 ES12787447.7T ES12787447T ES2652387T3 ES 2652387 T3 ES2652387 T3 ES 2652387T3 ES 12787447 T ES12787447 T ES 12787447T ES 2652387 T3 ES2652387 T3 ES 2652387T3
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seq
hydantoma
hydantoinase
amino acid
substituted
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Steffen Osswald
Heiko Schuster
Jürgen Roos
Andreas Karau
Ulrich Schwaneberg
Ronny MARTINEZ
Hemanshu MUNDHADA
Ursula HOLTER
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Evonik Technochemie GmbH
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Abstract

Hidantoinasa que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de (i) o (ii), con (i) secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, o SEQ ID NO: 119, (ii) secuencia de aminoácidos en donde en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, o SEQ ID NO: 119, de 1 a φ restos de aminoácidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido, en donde, sin embargo se mantiene/mantienen la o las sustituciones de las secuencias anteriores con respecto a las secuencia de referencia SEQ ID NO: 1, y en donde φ se define como φ >= 75 , y en donde además la actividad catalítica de la hidantoinasa es mayor en un factor de al menos ξ que la actividad catalítica de la hidantoinasa que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, y en donde ξ se define como ξ >= 1,2, y en donde la actividad catalítica de una hidantoinasa debe entenderse como la actividad catalítica de esta enzima con respecto a la transformación de un compuesto de D-hidantoína 5-sustituida en el correspondiente Dcarbamoilaminoácido.

Description

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DESCRIPCION
Mutantes de hidantoinasa.
La presente invencion se refiere en general a hidantoinasas. Mas en particular, la presente invencion se refiere a una serie de hidantoinasas modificadas que presentan actividades enzimaticas aumentadas con respecto a hidantoinasas aisladas previamente, y a su uso en procedimientos para preparar aminoacidos, en particular a su uso en catalizadores de celulas enteras
Descripcion de la tecnica relacionada
Se conocen procedimientos para producir aminoacidos usando enzimas. Ademas, hay procedimientos que implican la descomposicion asimetrica de compuestos de hidantoma 5-sustituida sintetizadas qmmicamente de modo economico como material de partida en aminoacidos opticamente activos. Estos procedimientos de produccion de aminoacidos opticamente activos a partir de compuestos de hidantoma 5-sustituida son importantes, para la produccion de preparaciones farmaceuticas, productos en la industria qmmica, aditivos de alimentos, etc.
En este procedimiento de produccion de aminoacidos a partir de compuestos de hidantoma 5-sustituida, son necesarias dos enzimas: (1) una enzima denominada hidantoinasa (enzima que hidroliza la hidantoma) que cataliza la reaccion de formacion de N-carbamoilaminoacido por transformacion del compuesto de hidantoma 5-sustituida en el respectivo N-carbamoilaminoacido por hidrolisis; (2) una enzima denominada N-carbamoilaminoacido hidrolasa que cataliza la reaccion de formacion de un aminoacido opticamente activo por transformacion del N- carbamoilaminoacido mencionado antes en el respectivo aminoacido por hidrolisis.
Las enzimas que hidrolizan la hidantoma, que se denominaran aqu “hidantoinasas” comprenden una clase diversa de enzimas que tienen una amplia variedad de especificidades y funciones biologicas. Una propiedad importante de las hidantoinasas es su enantioselectividad que las hace valiosas para la produccion de D o L-aminoacidos opticamente puros. Para producir aminoacidos opticamente puros a partir de compuestos de hidantoma 5-sustituida, la hidantoinasa y/o N-carbamoilaminoacido hidrolasa debe ser una enzima enantioselectiva. Se han descrito procedimientos de produccion de L-aminoacidos por un microorganismo que produce L-aminoacidos o mediante materiales que contienen enzimas producidos por el microorganismo, en donde se han usado microorganismos de diversos generos tales como Flavobacterium, Bacillus, Pseudomonas y Arthrobacter (J. Biotechnol. 46, 63, 1996).
Se han aislado un gen de hidantoinasa y un gen de N-carbamoilaminoacido hidrolasa de un microorganismo del genero Arthrobacter, y se han usado protemas recombinantes codificadas por estos genes para producir L- aminoacidos.
En vista de la importancia de las hidantoinasas para la produccion de aminoacidos opticamente puros, ha habido un esfuerzo concentrado en desarrollar enzimas modificadas que tengan propiedades mejoradas con respecto a la produccion de aminoacidos. Como resultado de este esfuerzo, se han aislado e identificado una serie de microorganismos que producen hidantoinasas con propiedades enzimaticas deseables. La patente de EE.UU. n° 5.516.660 describe cepas de Arthrobacter sp. que producen hidantoinasas que son capaces de producir L-alfa- aminoacidos a partir de D-, L- y/o D,L-5-monosustituidas-hidantomas.
Un desarrollo mas reciente es la produccion de D y L-aminoacidos en una escala industrial a partir de la respectiva hidantoma usando la tecnologfa de catalizador de celula entera (documentos WO 2002/077212, WO 2004/042047, WO 2000/058449, WO 2003/042412). El catalizador contiene D-hidantoinasa, hidantoma racemasa y D- carbamoilasa coexpresados en un microorganismo tal como E. coli.
La solicitud de patente internacional WO 00/58449 describe mutantes de la hidantoinasa obtenidos a partir de Arthrobacter que dan como resultado un aumento de la actividad de aproximadamente 40%.
El ensayo de estos catalizadores convencionales derivados de Arthrobacter sp. disponibles, mostro que la produccion de D-triptofano a partir de la respectiva triptofano-hidrantoma es posible, pero con tasas de transformacion muy bajas. La baja tasa de transformacion se debe a la insuficiente propiedad de la hidantoinasa de Arthrobacter sp. de tipo natural para aceptar la hidantoma como sustrato.
El objetivo de la presente invencion era proporcionar una hidantoinasa que tenga mayores tasas de transformacion con respecto a la hidantoma 5-sustituida, preferiblemente la triptofano-hidantoma y un procedimiento para producir aminoacidos, preferiblemente D-triptofano, en particular partiendo de la L-triptofano-hidantoma usando hidantoma racemasa, hidantoinasa y carbamoilasa, preferiblemente coexpresadas en un hospedante E. coli.
Por lo tanto, el objeto de la presente invencion era proporcionar una hidantoinasa mejorada con tasas de transformacion potenciadas con respecto a la triptofano-hidantoma. Ademas, podna ser beneficioso aumentar la enantioselectividad de la hidantoinasa.
Resumen de la presente invencion
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El objeto de la presente invencion se resuelve mediante una hidantoinasa que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada de (i) o (ii), con
(i) secuencia de aminoacidos seleccionada de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID

NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID

NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID

NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID

NO: 83, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID
NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, o SEQ ID NO: 119,
(ii) secuencia de aminoacidos en donde en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID
NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 73, SEQ ID
NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID
NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID
NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ
ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, o SEQ ID NO: 119, de 1 a 9 restos de aminoacidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o anadido, en donde, sin embargo, se mantiene/mantienen la o las sustituciones de aminoacidos de las secuencias anteriores con respecto a las secuencias de referencia de SEQ ID NO: 1.
y en donde 9 se define como 9 = 75,
y en donde ademas la actividad catalftica de la hidantoinasa es mayor en un factor de al menos Z que la actividad catalftica de la hidantoinasa que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1,
y en donde Z se define como Z = 1,2,
y en donde la actividad catalftica de una hidantoinasa debe entenderse como la actividad catalftica de esta enzima con respecto a la transformacion de un compuesto de D-hidantoma 5-sustituida al correspondiente D- carbamoilaminoacido.
En el contexto de la presente invencion, la enantioselectividad de una hidantoinasa se define como la relacion de Dact/Lact, con Dact = la actividad catalftica de esta enzima para la transformacion de compuestos de D-hidantoma 5- sustituida en los correspondientes D-carbamoilaminoacidos, y Lact = la actividad catalftica de esta enzima para la transformacion de los enantiomeros de los compuestos de D-hidantoma 5-sustituida en los enantiomeros de los correspondientes D-carbamoilaminoacidos, en otras palabras, Lact = la actividad catalftica de esta enzima para la transformacion de los correspondientes compuestos de L-hidantoma 5-sustituida en los correspondientes L- carbamoilaminoacidos.
En el contexto de la presente invencion, el termino adicion de aminoacidos significa la adicion de restos de aminoacidos en el extremo N o extremo C de un polipeptido.
En realizaciones preferidas de la presente invencion 9 se selecciona de 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1.
En realizaciones preferidas adicionales de la presente invencion Z se selecciona de 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 o 30.
En
realizaciones preferidas adicionales de la presente
9=
70 y Z = 1,5, 9 = 70 y Z = 2, 9 = 70 y Z = 3, 9 = 70
y Z
= 20, 9 = 70 y Z = 25, 9 = 70 y Z = 30,
9=
60 y Z = 1,5, 9 = 60 y Z = 2, 9 = 60 y Z = 3, 9 = 60
y Z
= 20, 9 = 60 y Z = 25, 9 = 60 y Z = 30,
9=
50 y Z = 1,5, 9 = 50 y Z = 2, 9 = 50 y Z = 3, 9 = 50
y Z
= 20, 9 = 50 y Z = 25, 9 = 50 y Z = 30,
9=
40 y Z = 1,5, 9 = 40 y Z = 2, 9 = 40 y Z = 3, 9 = 40
y Z
= 20, 9 = 40 y Z = 25, 9 = 40 y Z = 30,
9=
30 y Z = 1,5, 9 = 30 y Z = 2, 9 = 30 y Z = 3, 9 = 30

invencion 9 y Z se seleccionan como sigue: y Z = 4, 9 = 70 y Z = 5, 9 = 70 y Z = 10, 9 = 70 y Z = 15, 9 = 70

y Z = 4, 9 = 60 y Z = 5, 9 = 60 y Z = 10, 9 = 60 y Z = 15, 9 = 60

y Z = 4, 9 = 50 y Z = 5, 9 = 50 y Z = 10, 9 = 50 y Z = 15, 9 = 50

y Z = 4, 9 = 40 y Z = 5, 9 = 40 y Z =10, 9 = 40 y Z = 15, 9 = 40

y Z = 4, 9 = 30 y Z = 5, 9 = 30 y Z = 10, 9 = 30 y Z = 15, 9 = 30
3
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y Z = 20, 9 = 30 y Z = 25, 9 = 30 y Z = 30,
9 = 20 y Z = 1,5, 9 = 20 y Z = 2, 9 = 20 y Z = 3, 9 = 20 y Z = 4, 9 = 20 y Z = 5, 9 = 20 y Z = 10, 9 = 20 y Z = 15, 9 = 20
y Z = 20, 9 = 20 y Z = 25, 9 = 20 y Z = 30,
9 = 10 y Z = 1,5, 9 = 10 y Z = 2, 9 = 10 y Z = 3, 9 = 10 y Z = 4, 9 = 10 y Z = 5, 9 = 10 y Z = 10, 9 = 10y Z = 15, 9 = 10
y Z = 20, 9 = 10 y Z = 25, 9 = 10 y Z = 30,
9
= 9 y Z = 1 ,5, 9 = 9 y Z = 2, 9= 9 y Z = 3, 9= 9 y Z = 4,
9
=
9 y Z = 25, 9 II CD < J"N II CO 0
9
= 8 y Z = 1 ,5, 9 = 8 y Z = 2, 9= 8y Z = 3, 9= 8 y Z = 4,
9
=
8 y Z = 25, 9 II OO < J"N II CO 0
9
= 7 y Z = 1 ,5, 9 = 7 y Z = 2, 9= 7 y Z = 3, 9= 7 y Z = 4,
9
=
7 y Z = 25, 9 II -vl < J"N II CO 0
9
= 6 y Z = 1 ,5, 9 = 6 y Z = 2, 9= 6 y Z = 3, 9= 6 y Z = 4,
9
=
6 y Z = 25, 9 II O) < J"N II CO 0
9
= 5 y Z = 1 ,5, 9 = 5 y Z = 2, 9= 5 y Z = 3, 9= 5 y Z = 4,
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=
5 y Z = 25, 9 II cn < J"N II CO 0
9
= 4 y Z = 1 ,5, 9 = 4 y Z = 2, 9= 4 y Z = 3, 9= 4 y Z = 4,
9
=
4 y Z = 25, 9 II < J"N II CO 0
9
= 3 y Z = 1 ,5, 9 = 3 y Z = 2, 9= 3 y Z = 3, 9= 3 y Z = 4,
9
=
3 y Z = 25, 9 II CO < J"N II CO 0
9
= 2 y Z = 1 ,5, 9 = 2 y Z = 2, 9= 2 y Z = 3, 9= 2 y Z = 4,
9
=
2 y Z = 25, 9 II K) < J"N II CO 0
9
= 1 y Z = 1 ,5, 9 = 1 y Z = 2, 9= 1 y Z = 3, 9= 1 y Z = 4,
9
=
1 y Z = 25, Z = II < J"N II CO 0

= 9 y Z = 5, 9 = 9 y Z = 10, 9 = 9 y Z = 15, 9 = 9 y Z = 20, 9

= 8 y Z = 5, 9 = 8 y Z = 10, 9 = 8 y Z = 15, 9 = 8 y Z = 20, 9

= 7 y Z = 5, 9 = 7 y Z = 10, 9 = 7 y Z = 15, 9 = 7 y Z = 20, 9

= 6 y Z = 5, 9 = 6 y Z = 10, 9 = 6 y Z = 15, 9 = 6 y Z = 20, 9

= 5 y Z = 5, 9 = 5 y Z = 10, 9 = 5 y Z = 15, 9 = 5 y Z = 20, 9

= 4 y Z = 5, 9 = 4 y Z = 10, 9 = 4 y Z = 15, 9 = 4 y Z = 20, 9

= 3 y Z = 5, 9 = 3 y Z = 10, 9 = 3 y Z = 15, 9 = 3 y Z = 20, 9

= 2 y Z = 5, 9 = 2 y Z = 10, 9 = 2 y Z = 15, 9 = 2 y Z = 20, 9

= 1 y Z = 5, 9 = 1 y Z = 10, 9 = 1 y Z = 15, 9 = 1 y Z = 20, 9
De acuerdo con la presente invencion, se proporcionan hidantoinasas (enzimas que hidrolizan hidantoma) modificadas que tienen mayor actividad catalttica comparada con la hidantoinasa de tipo natural producida por el microorganismo Arthrobacter sp. Las hidantoinasas de la presente invencion, pueden tener ademas mayor enantioselectividad comparadas con la hidantoinasa de tipo natural producida por el microorganismo Arthrobacter sp. Las hidantoinasas de acuerdo con la presente invencion presentan tasas de transformacion potenciadas con respecto a los compuestos de hidantoma 5-sustituida, en particular de D-triptofano-hidantoma, y por lo tanto son adecuadas en procedimientos para la produccion de D-aminoacidos. Dichos procedimientos preferiblemente son adecuados para la produccion de D-triptofano partiendo de la respectiva triptofano-hidantoma, en particular usando D-hidantoinasa, D-carbamoilasa y opcionalmente hidantoma racemasa. Estas enzimas preferiblemente son coexpresadas en un microorganismo tal como E. coli. En este procedimiento de produccion de aminoacidos a partir de compuestos de hidantoma 5-sustituida, la hidantoinasa cataliza la reaccion de formacion de N- carbamoilaminoacido por hidrolisis de compuestos de hidantoma 5-sustituida, preferiblemente (D-triptofano- hidantoma), para dar los respectivos N-carbamoilaminoacidos (preferiblemente N-carbamoil-D-triptofano). Este N- carbamoilaminoacido es hidrolizado por la N-carbamoilaminoacido hidrolasa para formar el respectivo aminoacido (preferiblemente D-triptofano).
Para la preparacion de triptofano, tambien se puede usar como material de partida D,L-triptofano-hidantoma o L- triptofano-hidantoma, en donde en particular la presencia de la hidantoma racemasa es favorable con el fin de proporcionar el sustrato D-triptofano-hidantoma para la hidantoinasa de la presente invencion. Dicho procedimiento preferiblemente es adecuado para la produccion de D-triptofano partiendo de la respectiva D,L- o L-triptofano- hidantoma en particular usando hidantoma racemasa, D-hidantoinasa y D-carbamoilasa. Estas tres enzimas preferiblemente son coexpresadas en un microorganismo tal como E. coli.
El experto en la tecnica entiende que la informacion dada con respecto a una posicion de aminoacido espedfica (p. ej. 152) de una secuencia de referencia espedfica, se puede transferir a hidantoinasas variantes y secuencias de aminoacidos homologas: el experto en la tecnica es capaz de alinear la secuencia de aminoacidos de referencia con una secuencia variante y determinar la correspondiente posicion (p. ej. posicion de aminoacido 152) en la secuencia variante. En relacion con este ejemplo, el experto en la tecnica entiende que en la secuencia variante la posicion del aminoacido que corresponde a la posicion de aminoacidos 152 de la secuencia de referencia, puede no ser necesariamente el resto de aminoacidos 152 de la secuencia de aminoacidos variante, sin embargo, tiene todavfa la misma posicion en la estructura tridimensional de la enzima variante. Los metodos de alineacion de secuencias de aminoacidos se describen con mas detalle mas adelante. Se pueden usar otros metodos con el fin de determinar las correspondientes posiciones en una secuencia variante comparada con la secuencia de referencia.
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Descripcion de las figuras
La figura 1 muestra el plasmido pAS6-HyuH que contiene el gen de tipo natural hyuH que expresa una hidantoinasa que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1 y un gen que expresa D-carbamoilasa que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 4. Las abreviaturas indicadas en el mapa de plasmido indican los siguientes elementos: D-Carb. = gen de D-carbamoilasa NRRL, Agrobacterium sp.; rhaP = promotor de ramnosa; hyuH = hidantoinasa DSM9771; rrnB = terminador de la transcripcion; bla = beta-lactamasa; ori = origen de replicacion ColEI.
Descripcion de las secuencias
En el contexto de la presente invencion, las variantes de secuencias de polipeptidos a veces se describen indicando cada sustitucion de aminoacido presente en la secuencia variante en comparacion con la secuencia original en el formato AA1XAA2, en donde AA1 indica el resto de aminoacido presente en la posicion X en la secuencia original y AA2 indica el resto de aminoacido presente en la posicion X en la secuencia de la variante.
La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de aminoacidos de hidantoinasa de tipo natural de Arthrobacter sp.
La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de nucleotidos que codifica la hidantoinasa de tipo natural de Arthrobacter sp.
La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de aminoacidos de la hidantoinasa racemasa de tipo natural de Arthrobacter sp.
La SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de aminoacidos de D-carbamoilasa de tipo natural de Arthrobacter sp.
La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoacidos como referencia, en donde los restos de aminoacidos X en las posiciones 152, 64, 71, 72, 95, 154, 181, 284, 285, 398 y 452 se definen de acuerdo con las reivindicaciones y el resto de aminoacido en la posicion 152 representa cualquier resto de aminoacido distinto de alanina.
La SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa en donde la alanina en la posicion 152 se ha sustituido por glicina.
La SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa en donde la alanina en la posicion 152 se ha sustituido por cistema.
La SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa en donde la alanina en la posicion 152 se ha sustituido por serina.
La SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa en donde la alanina en la posicion 152 se ha sustituido por treonina.
La SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa en donde la alanina en la posicion 152 se ha sustituido por valina.
La SEQ ID NO: 11 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa en donde la alanina en la posicion 152 se ha sustituido por serina y la valina en la posicion 154 se ha sustituido por isoleucina.
La SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa en donde la alanina en la
posicion 152 se ha sustituido por valina y la valina en la posicion 154 se ha sustituido por cistema.
La SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa en donde la alanina en la
posicion 152 se ha sustituido por cistema y la valina en la posicion 154 se ha sustituido por serina.
La SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa en donde la arginina en la
posicion 71 se ha sustituido por asparagina y la tirosina en la posicion 72 se ha sustituido por histidina y la alanina en la posicion 152 se ha sustituido por serina.
La SEQ ID NO: 15 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa en donde la arginina en la posicion 71 se ha sustituido por asparagina y la tirosina en la posicion 72 se ha sustituido por arginina y la alanina en la posicion 152 se ha sustituido por serina.
La SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa en donde la arginina en la posicion 71 se ha sustituido por valina y la tirosina en la posicion 72 se ha sustituido por arginina y la alanina en la posicion 152 se ha sustituido por serina.
La SEQ ID NO: 17 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa en donde la arginina en la posicion 71 se ha sustituido por serina y la tirosina en la posicion 72 se ha sustituido por arginina y la alanina en la posicion 152 se ha sustituido por cistema y la valina en la posicion 154 se ha sustituido por serina y la valina en la posicion 181 se ha sustituido por alanina.
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La SEQ ID NO: 18 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa en donde la arginina en la posicion 71 se ha sustituido por tirosina y la tirosina en la posicion 72 se ha sustituido por arginina y la alanina en la posicion 152 se ha sustituido por serina.
La SEQ ID NO: 19 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa en donde la arginina en la posicion 71 se ha sustituido por leucina y la alanina en la posicion 152 se ha sustituido por cistema y la valina en la posicion 154 se ha sustituido por serina.
La SEQ ID NO: 20 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa en donde la arginina en la posicion 71 se ha sustituido por tirosina y la tirosina en la posicion 72 se ha sustituido por histidina y la alanina en la posicion 152 se ha sustituido por serina.
Las SEQ ID NO: 21 a 72 muestran las secuencias de cebadores para la mutagenesis de una diversidad de posiciones de aminoacidos de la hidantoinasa como se indica en la tabla 1.
La SEQ ID NO: 73 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que sustitucion comparada con la SEQ ID NO: 1: I95H.
La SEQ ID NO: 74 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que sustitucion comparada con la SEQ ID NO: 1: V154G.
La SEQ ID NO: 75 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que sustitucion comparada con la SEQ ID NO: 1: V154N.
La SEQ ID NO: 76 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que sustitucion comparada con la SEQ ID NO: 1: R71D.
La SEQ ID NO: 77 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que sustitucion comparada con la SEQ ID NO: 1: R71E.
La SEQ ID NO: 78 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que sustitucion comparada con la SEQ ID NO: 1: V284F.
La SEQ ID NO: 79 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que sustitucion comparada con la SEQ ID NO: 1: V154A.
La SEQ ID NO: 80 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que sustitucion comparada con la SEQ ID NO: 1: I64T.
La SEQ ID NO: 81 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que sustitucion comparada con la SEQ ID NO: 1: I64V.
La SEQ ID NO: 82 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que sustitucion comparada con la SEQ ID NO: 1: V154S.
lleva la siguiente lleva la siguiente lleva la siguiente lleva la siguiente lleva la siguiente lleva la siguiente lleva la siguiente lleva la siguiente lleva la siguiente lleva la siguiente
La SEQ ID NO: 83 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que lleva las siguientes sustituciones comparadas con la SEQ ID NO: 1: V154A, T398A, H452L.
La SEQ ID NO: 90 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que lleva las siguientes sustituciones comparadas con la SEQ ID NO: 1: I64V, R71I, Y72N, A152S.
La SEQ ID NO: 91 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que lleva las siguientes sustituciones comparadas con la SEQ ID NO: 1: I64C, R71Y, Y72N, A152S.
La SEQ ID NO: 92 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que lleva las siguientes sustituciones comparadas con la SEQ ID NO: 1: I64C, R71D, Y72H, A152S.
La SEQ ID NO: 93 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que lleva las siguientes sustituciones comparadas con la SEQ ID NO: 1: I64C, R71D, Y72H, A152S, F448L.
La SEQ ID NO: 94 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que lleva las siguientes sustituciones comparadas con la SEQ ID NO: 1: I64C, R71D, Y72H, A152S, M417V.
La SEQ ID NO: 95 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que lleva las siguientes sustituciones comparadas con la SEQ ID NO: 1: S14G, I64C, R71D, Y72H, A152S.
La SEQ ID NO: 96 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que lleva las siguientes sustituciones comparadas con la SEQ ID NO: 1: S37R, I64C, R71D, Y72H, A152S.
La SEQ ID NO: 97 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que lleva las siguientes
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sustituciones comparadas con la SEQ ID NO: 1: S14G, I64C, R71D, Y72H, A152S, E358K.
La SEQ ID NO: 98 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que lleva sustituciones comparadas con la SEQ ID NO: 1: S37R, I64C, R71D, Y72H, A152S, V318A.
La SEQ ID NO: 99 muestra la secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que lleva sustituciones comparadas con la SEQ ID NO: 1: S37R, I64C, R71D, Y72H, A152S, N303S, Q404R.
La SEQ ID NO: 100 muestra sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 101 muestra sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 102 muestra l sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 103 muestra sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 104 muestra l sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 105 muestra sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 106 muestra l sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 107 muestra sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 108 muestra sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 109 muestra l sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 110 muestra sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 111 muestra l sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 112 muestra l sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 113 muestra sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 114 muestra sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 115 muestra l sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 116 muestra sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 117 muestra l sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 118 muestra sustituciones comparadas con
La SEQ ID NO: 119 muestra
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: S14G, I64C, R71D, Y72H, A152S, N70D.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: S14G, I64C, R71D, Y72H, A152S, V154A.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: S14A, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: S14V, I64C, R71D, Y72H, A152S.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: S14G, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: S14A, S37W, I64C, R71D, Y72H, A152S.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: S14A, S37V, I64C, R71D, Y72H, A152S.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: D15N, I64C, R71D, Y72H, A152S.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: S14V, S37R, I64C, R71D, Y72H, A152S.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: D15N, I64C, R71D, Y72H, A152S, V154C.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: D15N, I64C, R71D, Y72H, A152S, V154I.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: S14P, D15G, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: S14G, D15R, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: S14G, D15Q, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: S14F, D15A, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: D15S, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: S14P, D15G, S37G, R71D, Y72H, A152S.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que la SEQ ID NO: 1: S14P, D15G, S37G, I64C, R71D, Y72H.
a secuencia de aminoacidos de una variante de hidantoinasa que
leva
leva
leva
leva
leva
leva
leva
leva
leva
leva
leva
leva
leva
leva
leva
leva
leva
leva
leva
leva
las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes las siguientes
sustituciones comparadas con la SEQ ID NO: 1: D15S, S37G, I64C, R71D, Y72H. Descripcion detallada de la presente invencion
Como se ha descrito antes, la presente invencion proporciona nuevas hidantoinasas derivadas de la hidantoinasa de tipo natural que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1 de Arthrobactersp. con mayor actividad catalftica y opcionalmente mayor enantioselectividad para sustratos de D-hidantoma 5-sustituida, en particular para D- triptofano-hidantoma.
5 Las hidantoinasas de acuerdo con la presente invencion tienen una secuencia de aminoacidos seleccionada de (i) o (ii), con
(i) secuencia de aminoacidos seleccionada de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID

NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID

NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID

10 NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID

NO: 83, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID
NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, 15 SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, o SEQ ID NO: 119,
(ii) secuencia de aminoacidos en donde en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID
NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 73, SEQ ID
NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID
20 NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID
NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ
ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, o SEQ ID NO: 119, de 1 a 25 9 restos de aminoacidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o anadido, en donde, sin embargo, se
mantiene/mantienen la o las sustituciones de aminoacidos de las secuencias anteriores con respecto a las secuencias de referencia de SEQ ID NO: 1.
y en donde 9 se define como 9 = 75,
y en donde ademas la actividad catalftica de la hidantoinasa es mayor en un factor de al menos Z que la actividad 30 catalftica de la hidantoinasa que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1,
y en donde Z se define como Z = 1,2, y en donde
la actividad catalftica de una hidantoinasa se define como la actividad catalftica de esta enzima con respecto a la transformacion de compuestos de D-hidantoma 5-sustituida en el correspondiente D-carbamoilaminoacido.
En el contexto de la presente invencion, la enantioselectividad de una hidantoinasa se define como la relacion de 35 Dact/Lact, con Dact = la actividad catalftica de esta enzima para la transformacion de compuestos de D-hidantoma 5-
sustituida en los correspondientes D-carbamoilaminoacidos, y Lact = la actividad catalftica de esta enzima para la transformacion de los enantiomeros de los compuestos de D-hidantoma 5-sustituida en los enantiomeros de los correspondientes D-carbamoilaminoacidos, en otras palabras, Lact = la actividad catalftica de esta enzima para la transformacion de los correspondientes compuestos de L-hidantoma 5-sustituida en los correspondientes L- 40 carbamoilaminoacidos.
En realizaciones preferidas de la presente invencion 9 se selecciona de 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1.
En realizaciones preferidas adicionales de la presente invencion Z se selecciona de 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 o 30.
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En realizaciones preferidas adicionales de
9 = 70 y Z = 1,5, 9 = 70 y Z = 2, 9 = 70 y Z y Z = 20, 9 = 70 y Z = 25, 9 = 70 y Z = 30,
9 = 60 y Z = 1,5, 9 = 60 y Z = 2, 9 = 60 y Z y Z = 20, 9 = 60 y Z = 25, 9 = 60 y Z = 30,
9 = 50 y Z = 1,5, 9 = 50 y Z = 2, 9 = 50 y Z y Z = 20, 9 = 50 y Z = 25, 9 = 50 y Z = 30,
9 = 40 y Z = 1,5, 9 = 40 y Z = 2, 9 = 40 y Z y Z = 20, 9 = 40 y Z = 25, 9 = 40 y Z = 30,
la presente invencion 9 y Z se seleccionan como sigue:

= 3, 9 = 70 y Z = 4, 9 = 70 y Z = 5, 9 = 70 y Z = 10, 9 = 70 y Z

= 3, 9 = 60 y Z = 4, 9 = 60 y Z = 5, 9 = 60 y Z = 10, 9 = 60 y Z

= 3, 9 = 50 y Z = 4, 9 = 50 y Z = 5, 9 = 50 y Z = 10, 9 = 50 y Z

= 3, 9 = 40 y Z = 4, 9 = 40 y Z = 5, 9 = 40 y Z = 10, 9 = 40 y Z
15, 9 = 70 15, 9 = 60 15, 9 = 50 15, 9 = 40
5
10
15
20
25
30
35
40
45
9 = 30 y Z = 1,5, 9 = 30 y Z = 2, 9 = 30 y Z = 3, 9 = 30 y Z = 4. y Z = 20, 9 = 30 y Z = 25, 9 = 30 y Z = 30,
9 = 30 y Z = 5, 9 = 30 y Z = 10, 9 = 30 y Z = 15, 9 = 30
9 = 20 y Z = 1,5, 9 = 20 y Z = 2, 9 = 20 y Z = 3, 9 = 20 y Z = 4, 9 = 20 y Z = 5, 9 = 20 y Z = 10, 9 = 20 y Z = 15, 9 = 20 y Z = 20, 9 = 20 y Z = 25, 9 = 20 y Z = 30,
9 = 10 y Z = 1,5, 9 = 10 y Z = 2, 9 = 10 y Z = 3, 9 = 10 y Z = 4, 9 = 10 y Z = 5, 9 = 10 y Z = 10, 9 = 10 y Z = 15, 9 = 10 y Z = 20, 9 = 10 y Z = 25, 9 = 10 y Z = 30,
9
= 9 y Z = 1 ,5, 9 = 9 y Z = 2, 9 = 9 y Z = 3
=
9 y Z = 25, 9 II CD < J"N II CO 0
9
= 8 y Z = 1 ,5, 9 = 8 y Z = 2, 9 = 8 y Z = 3
=
8 y Z = 25, 9 II OO < J"N II CO 0
9
= 7 y Z = 1 ,5, 9 = 7 y Z = 2, 9 = 7 y Z = 3
=
7 y Z = 25, 9 II < J"N II CO 0
9
= 6 y Z = 1 ,5, 9 = 6 y Z = 2, 9 = 6 y Z = 3
=
6 y Z = 25, 9 II O) < J"N II CO 0
9
= 5 y Z = 1 ,5, 9 = 5 y Z = 2, 9 = 5 y Z = 3
=
5 y Z = 25, 9 II cn < J"N II CO 0
9
= 4 y Z = 1 ,5, 9 = 4 y Z = 2, 9 = 4 y Z = 3
=
4 y Z = 25, 9 II < J"N II CO 0
9
= 3 y Z = 1 ,5, 9 = 3 y Z = 2, 9 = 3 y Z = 3
=
3 y Z = 25, 9 II CO < J"N II CO 0
9
= 2 y Z = 1 ,5, 9 = 2 y Z = 2, 9 = 2 y Z = 3
=
2 y Z = 25, 9 II K) < J"N II CO 0
9
= 1 y Z = 1 ,5, 9 = 1 y Z = 2, 9 = 1 y Z = 3
=
1 y Z = 25, 9 II < J"N II CO 0
9 = 9 y Z = 4, 9 = 9 y Z = 5, 9 = 9 y Z 9 = 8 y Z = 4, 9 = 8 y Z = 5, 9 = 8 y Z 9 = 7 y Z = 4, 9 = 7 y Z = 5, 9 = 7 y Z 9 = 6 y Z = 4, 9 = 6 y Z = 5, 9 = 6 y Z 9 = 5 y Z = 4, 9 = 5 y Z = 5, 9 = 5 y Z 9 = 4 y Z = 4, 9 = 4 y Z = 5, 9 = 4 y Z 9 = 3 y Z = 4, 9 = 3 y Z = 5, 9 = 3 y Z 9 = 2 y Z = 4, 9 = 2 y Z = 5, 9 = 2 y Z 9 = 1 y Z = 4, 9 = 1 y Z = 5, 9 = 1 y Z
10, 9 = 9 y Z = 15, 9 = 9 y Z = 20, 9 10, 9 = 8 y Z = 15, 9 = 8 y Z = 20, 9 10, 9 = 7 y Z = 15, 9 = 7 y Z = 20, 9 10, 9 = 6 y Z = 15, 9 = 6 y Z = 20, 9 10, 9 = 5 y Z = 15, 9 = 5 y Z = 20, 9 10, 9 = 4 y Z = 15, 9 = 4 y Z = 20, 9 10, 9 = 3 y Z = 15, 9 = 3 y Z = 20, 9 10, 9 = 2 y Z = 15, 9 = 2 y Z = 20, 9 10, 9 = 1 y Z = 15, 9 = 1 y Z = 20, 9
En otra realizacion de la presente invencion, la hidantoinasa de la presente invencion tiene una identidad de al menos 80%, o tiene una secuencia de aminoacidos que comprende eliminacion, sustitucion, insercion y/o adicion de un maximo de 90 restos de aminoacidos, en comparacion con una hidantoinasa que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5;
en donde los restos de aminoacidos en las posiciones 152, 64, 71, 72, 95, 154, 181, 284, 285, 398 y 452 se definen como X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398 y X452 y en donde estos restos de aminoacidos se seleccionan como sigue:
X152 = cualquier resto de aminoacido distinto de alanina;
X64 = cualquier resto de aminoacido;
X71 = cualquier resto de aminoacido;
X72 = cualquier resto de aminoacido;
X95 = cualquier resto de aminoacido;
X154 = cualquier resto de aminoacido;
X181 = cualquier resto de aminoacido;
X284 = cualquier resto de aminoacido;
X285 = cualquier resto de aminoacido;
X398 = cualquier resto de aminoacido;
X452 = cualquier resto de aminoacido;
y en donde ademas la actividad catalftica de la hidantoinasa es mayor en un factor de al menos 1,2 que la actividad catalftica de la hidantoinasa que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.
En una realizacion preferida, la actividad catalftica es mayor en un factor de al menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 o
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30 que la actividad catalttica de la hidantoinasa que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.
En otra realizacion preferida, la enantioselectividad de la D-hidantoma es mayor en un factor de al menos 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100 o 150 que la enantioselectividad de la hidantoinasa que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1. En una realizacion incluso mas preferida, la enantioselectividad de la hidantoinasa para la D-5-indolilmetilhidantoma (D-triptofano-hidantoma) se ha aumentado al menos en un factor de 1,2, preferiblemente al menos un factor de 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100 o 150, comparado con la hidantoinasa que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.
El experto en la tecnica entiende que las variantes de la hidantoinasa como se describen en la presente memoria tambien estan incluidas en el alcance de la presente invencion. Estas variantes de hidantoinasas tienen una identidad de al menos 80%, o tienen una secuencia de aminoacidos que comprende eliminacion, sustitucion, insercion y/o adicion de un maximo de 90 restos de aminoacidos, en comparacion con una hidantoinasa que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5, respectivamente. En estas variantes, se mantiene/mantienen la o las sustituciones de aminoacidos espedficas con respecto a la secuencia de aminoacidos de referencia (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5, respectivamente) de acuerdo con la invencion.
Ademas, se proporcionan derivados de las protemas mencionadas antes que tienen actividad de hidantoinasa, cuyos derivados tienen al menos 80% de identidad, preferiblemente al menos 85% de identidad, mas preferido al menos 90% de identidad, todavfa mas preferido al menos 95% de identidad, mas preferido al menos 96% de identidad, mas preferido al menos 97% de identidad, todavfa mas preferido al menos 98% de identidad y lo mas preferido al menos 99% de identidad con la SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, respectivamente. Como se ha senalado antes, en estas variantes, se mantienen la o las sustituciones de aminoacidos de acuerdo con la presente invencion con respecto a la secuencia de referencia (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5, respectivamente).
Ademas, se proporcionan derivados de las protemas mencionadas antes que tienen actividad de hidantoinasa, cuyos derivados estan representados por una protema que tiene una secuencia de aminoacidos que comprende la eliminacion, sustitucion, insercion y/o adicion de un maximo de 90 restos de aminoacidos con respecto a la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20. Como se ha senalado antes, en estas variantes, se mantienen la o las sustituciones de aminoacidos de acuerdo con la presente invencion con respecto a la secuencia de referencia (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5, respectivamente).
La presente invencion se refiere tambien a hidantoinasas variantes que tienen una secuencia de aminoacidos que comprende la eliminacion, sustitucion, insercion y/o adicion de un maximo de 90 restos de aminoacidos. El alcance de "un maximo de 90 restos de aminoacidos" en la frase “que comprende la eliminacion, sustitucion, insercion y/o adicion de un maximo de 90 restos de aminoacidos" usada en la presente memoria, puede estar limitado a un maximo de 70, preferido un maximo de 45, mas preferido un maximo de 40, mas preferido un maximo de 35, mas preferido un maximo de 30, todavfa mas preferido un maximo de 25, incluso mas preferido un maximo de 20, mas preferido un maximo de 15, todavfa mas preferido un maximo de 10 y lo mas preferido un maximo de 5 restos de aminoacidos. La expresion de "un maximo de 90 restos de aminoacidos" en la frase “que comprende la eliminacion, sustitucion, insercion y/o adicion de un maximo de 90 restos de aminoacidos" usada en la presente memoria, significa preferiblemente de 1 a 70, preferido de 1 a 45, mas preferido de 1 a 40, mas preferido de 1 a 35, mas preferido de 1 a 30, todavfa mas preferido de 1 a 25, incluso ademas preferido de 1 a 20, mas preferido de 1 a 15, todavfa mas preferido de 1 a 10 y lo mas preferido de 1 a 5 restos de aminoacidos. El termino “adicion” significa la adicion N-terminal o C-terminal de restos de aminoacidos con respecto a las secuencias mencionadas antes.
Ademas, se proporcionan fragmentos de las protemas mencionadas antes que tienen la secuencia de aminoacidos de SEQ ID No: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, respectivamente, que tienen actividad de hidantoinasa, en donde preferiblemente el fragmento contiene al menos 300, mas preferido al menos 350 y particularmente preferido al menos 400 y lo mas preferido al menos 450 aminoacidos consecutivos de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, respectivamente, o sus derivados como se han definido antes.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Cys, Gly, Ser, Thr o Val;
X64 = Ile, Thr o Val;
X71 = Arg, Gin, Asp, Glu, Val, Ser, Tyr o Leu;
X72 = Tyr, His o Asn;
X95 = Ile o His;
X154 = Val, Ala, Cys, Gly, Ile, Asn o Ser;
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X181 = Val o Ala;
X284 = Val o Phe;
X285 = Ala o Asp;
X398 = Thr o Ala;
X452 = His o Leu.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Cys, Ser o Val;
X64 = Ile, Thr o Val
X71 = Arg, Gin, Asp, Glu, Val, Ser, Tyr o Leu X72 = Tyr, His o Asn X95 = Ile o His;
X154 = Cys, Ile o Ser;
X181 = Val o Ala;
X284 = Val o Phe;
X285 = Ala o Asp;
X398 = Thr o Ala;
X452 = His o Leu.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X154 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Cys, Gly, Ser, Thr o Val;
X154 = Ala, Cys, Gly, Ile, Asn o Ser.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X154 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Cys, Ser o Val;
X154 = Cys, Ile o Ser.
En otra realizacion de la presente invencion X152 esta ademas limitado como sigue:
X152 = Ser; X152 = Cys; X152 = Val; X152 = Gly o X152 = Thr.
En otra realizacion de la presente invencion X152 y X154 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Ser; X154 = Ile.
En otra realizacion de la presente invencion X152 y X154 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Val; X154 = Cys.
En otra realizacion de la presente invencion X152 y X154 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Cys; X154 = Ser.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X71, X72, X154, X181 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Ser; X71 = Asp; X72 = His; X154 = Val; X181 = Val.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X71, X72, X154, X181 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Ser; X71 = Asp; X72 = Asn; X154 = Val; X181 = Val.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X71, X72, X154, X181 estan ademas limitados como sigue:
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40
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X152 = Ser; X71 = Val; X72 = Asn; X154 = Val; X181 = Val.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X71, X72, X154, X181 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Cys; X71 = Ser; X72 = Asn; X154 = Ser; X181 = Ala.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X71, X72, X154, X181 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Ser; X71 = Tyr; X72 = Asn; X154 = Val; X181 = Val.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X71, X72, X154, X181 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Cys; X71 = Leu; X72 = Tyr; X154 = Ser; X181 = Val.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X71, X72, X154, X181 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Ser; X71 = Tyr; X72 = His; X154 = Val; X181 = Val.
En otra realizacion de la presente invencion se proporciona una hidantoinasa en donde X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Ser; X64 = Ile; X71 = Arg; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Cys; X64 = Ile; X71 = Arg; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Val; X64 = Ile; X71 = Arg; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue.
X152 = Gly; X64 = Ile; X71 = Arg; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Thr; X64 = Ile; X71 = Arg; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His;
En otra realizacion de la presente invencion X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Ser; X64 = Ile; X71 = Arg; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Ile; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Val; X64 = Ile; X71 = Arg; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Cys; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Cys; X64 = Ile; X71 = Arg; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Ser; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Ser; X64 = Ile; X71 = Asp; X72 = His; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.
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En otra realizacion de la presente invencion X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Ser; X64 = Ile; X71 = Asp; X72 = Asn; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Ser; X64 = Ile; X71 = Val; X72 = Asn; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Cys; X64 = Ile; X71 = Ser; X72 = Asn; X95 = Ile; X154 = Ser; X181 = Ala; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Ser; X64 = Ile; X71 = Tyr; X72 = Asn; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Cys; X64 = Ile; X71 = Leu; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Ser; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.
En otra realizacion de la presente invencion X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452 estan ademas limitados como sigue:
X152 = Ser; X64 = Ile; X71 = Tyr; X72 = His; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.
En otra realizacion de la presente invencion, una hidantoinasa de acuerdo con la invencion transforma al menos uno de los siguientes sustratos hidantoma, 5-metilhidantoma, 5-bencilhidantoma, 5-(4-hidroxibencil)hidantoma, 5- indolilmetilhidantoma, 5-(3,4-dihidroxibencil)hidantoma, 5-metiltioetilhidantoma, 5-isopropilhidantoma, 5-
isobutilhidantoma, 5-sec-butilhidantoma, 5-(4-aminobutil)hidantoma, 5-hidroximetilhidantoma, o un compuesto de hidantoma 5-sustituida que corresponde a un aminoacido no natural, respectivamente un derivado del mismo, en el respectivo carbamoilaminoacido, en donde la actividad catalftica de la hidantoinasa con respecto a la transformacion de dicho sustrato es al menos tan alta como la actividad catalftica de la hidantoinasa que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 con respecto a la transformacion de la D-5-indolilmetilhidantoma.
Como se ha mencionado antes, los sustratos para la hidantoinasa de acuerdo con la invencion pueden ser cualquier compuesto de D-hidantoma 5-sustituida capaces de ser hidrolizados con la especificidad de sustrato de esta enzima. Estos incluyen tambien los compuestos de hidantoma 5-sustituida que corresponden a aminoacido no natural o un derivado del mismo. Un aminoacido no natural o un derivado del mismo se refiere a un aminoacido que no es codificado por el codigo genetico estandar. Las respectivas hidantomas de aminoacidos no naturales o derivados de los mismos incluyen 5-fenilhidantoma, 5-(4-hidroxifenil)hidantoma, 5-metoximetilhidantoma, 5-
benciloximetilhidantoma, 5-(3,4-metilendioxibencil)hidantoma, dihidrouracilo. Preferiblemente, el sustrato de la hidantoinasa de acuerdo con la invencion es la D,L-5-indolilmetilhidantoma, mas preferiblemente la D-5- indolilmetilhidantoma.
La presente invencion tambien proporciona polinucleotidos que codifican hidantoinasas de la invencion.
Por consiguiente, la presente invencion proporciona un polinucleotido aislado o recombinante que hibrida en condiciones restrictivas que comprenden un lavado en una solucion de 1x cloruro sodico/citrato sodico (SSC) y dodecilsulfato sodico (SDS) al 0,1% a 65°C, con el complemento de longitud completa del polinucleotido que tiene una secuencia de nucleotidos de acuerdo con la presente invencion como se ha definido antes;
en donde la actividad catalftica de la hidantoinasa es mayor en un factor de al menos Z que la actividad catalftica de la hidantoinasa que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1, y en donde Z se define como Z = 1,2.
La presente invencion proporciona tambien un vector que comprende el polinucleotido como se ha descrito antes que codifica la hidantoinasa de acuerdo con la presente invencion. Preferiblemente, el vector comprende ademas secuencias reguladoras operativamente ligadas y adecuadas para la expresion del polinucleotido en una celula hospedante.
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La presente invencion proporciona ademas una celula hospedante aislada o transformada que comprende el polinucleotido o el vector que comprende el polinucleotido como se ha descrito antes que codifica la hidantoinasa de acuerdo con la presente invencion. Preferiblemente, la celula hospedante se selecciona del grupo que consiste en Escherichia coli, bacterias corineformes, Bacillus sp. La celula hospedante expresa la hidantoinasa de acuerdo con la presente invencion. En una realizacion preferida, la celula hospedante expresa al menos las actividades enzimaticas seleccionadas de las siguientes: hidantoinasa; hidantoinasa e hidantoma racemasa; hidantoinasa y carbamoilasa; o hidantoinasa e hidantoma racemasa y carbamoilasa.
Ademas, la presente invencion proporciona un procedimiento para preparar aminoacidos, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar actividad de hidantoinasa de una hidantoinasa de acuerdo con la presente invencion y actividad de carbamoilasa y al menos una hidantoma 5-sustituida a un medio de reaccion, y opcionalmente proporcionar actividad de hidantoma racemasa a dicho medio de reaccion;
(b) incubar el medio de reaccion con el fin de permitir la transformacion de la hidantoma 5-sustituida en los respectivos aminoacidos por las actividades enzimaticas proporcionadas en (a); y
(c) recuperar los aminoacidos obtenidos de la transformacion enzimatica de la respectiva hidantoma 5-sustituida del medio de reaccion.
En un procedimiento preferido, dicha hidantoma 5-sustituida se selecciona de D,L-hidantoma 5-sustituida, D,L-5- indolilmetilhidantoma (= D,L-triptofano-hidantoma), D-hidantoma 5-sustituida, D-5-indolilmetilhidantoma (= D- triptofano-hidantoma).
En un procedimiento todavfa mas preferido dicha hidantoma 5-sustituida proporcionada al medio de reaccion es L- hidantoma 5-sustituida o D,L-hidantoma 5-sustituida, y ademas se proporciona actividad de hidantoma racemasa al medio de reaccion en la etapa (a) para transformar la L-hidantoma 5-sustituida o D,L-hidantoma 5-sustituida en D- hidantoma 5-sustituida.
En otro procedimiento preferido mas, el aminoacido que se va a preparar es el D-triptofano y la hidantoma 5- sustituida se selecciona de D-5-indolilmetilhidantoma, L-5-indolilmetilhidantoma o D,L-5-indolilmetilhidantoma.
En el procedimiento, la hidantoma 5-sustituida se transforma mediante la hidantoinasa de la presente invencion en el respectivo carbamoilaminoacido que se transforma en el respectivo aminoacido por dicha actividad de carbamoilasa. En una realizacion particularmente preferida, dicho carbamoilaminoacido se selecciona de N-(aminocarbonil)-DL- triptofano (= N-carbamoil-DL-triptofano; = Nombre en el mdice de CA: N-(aminocarbonil)-triptofano; = Numero de registro: 98299-50-4; Formula: C12 H13 N3 O3) o N-carbamoil-L-triptofano (=Nombre en el mdice de CA: N- (aminocarbonil)-L-triptofano = Numero de registro: 89595-64-2; Formula: C12 Hl3 N3 O3).
En otro procedimiento preferido mas, el medio de reaccion es un medio que parcial o totalmente consiste en medio de cultivo celular y la actividad de hidantoinasa la proporciona una celula hospedante de acuerdo con la presente invencion, y la celula hospedante se cultiva en dicho medio de reaccion.
En un procedimiento particularmente preferido, el medio de reaccion es un medio que parcial o totalmente consiste en medio de cultivo celular y la actividad de carbamoilasa la proporciona una celula hospedante de acuerdo con la presente invencion o una segunda celula hospedante, y dicha celula o celulas hospedantes se cultivan en dicho medio de reaccion.
En una realizacion preferida, la o las celulas hospedantes que expresan actividad de hidantoinasa y actividad de carbamoilasa y opcionalmente la actividad de hidantoma racemasa, sea en celulas separadas o en la misma celula, se cultivan en un medio de cultivo celular con el fin de crear una biomasa, despues el medio de cultivo celular y la biomasa se separan y la biomasa se vuelve a suspender usando tampon o agua. El sustrato se anade a dicho tampon o agua antes, durante o despues de la adicion de la biomasa con el fin de empezar la transformacion del sustrato.
Las hidantoinasas de la presente invencion se pueden usar como se describe, por ejemplo, en “Biocatalytic Production of Amino Acids and Derivatives" (Rozzell, J. D. Y Wagner, F. eds., Hanser Publisher, NY, en paginas 75176 (1992)) para el uso en la produccion de aminoacidos opticamente puros a partir de D,L-hidantomas 5- monosustituidas. Tambien se describe el uso general de hidantoinasas en "Enzyme catalysis in organic synthesis" (Dranz, K. y Waldmann, H. eds., VCH-Verlag, Weinheim, en las paginas 409-431 (1995)) y Wagner, T. et al. (“Production of 1-methionine from D,L-5-(2-methylthioethyl) hydantoin by resting cells of a new mutant strain of Arthrobacter species DSM 7330”, Journal of Biotechnology 46: 63-68 (1996)).
Para la transformacion enzimatica de D,L- o L-hidantomas 5-sustituidas o D,L- o L- carbamoilaminoacidos en los respectivos D-aminoacidos, se prefiere aplicar la tecnologfa de catalizador de celula entera, que incluye la expresion de la hidantoinasa de la presente invencion y la expresion de carbamoilasa, y preferiblemente tambien la expresion de hidantoma racemasa.
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La hidantoinasa de acuerdo con la presente invencion se puede usar en este procedimiento tambien en su forma libre o inmovilizada. Tambien se pueden inmovilizar la carbamoilasa y la hidantoma racemasa. Las tecnicas para inmovilizar enzimas son bien conocidas para el experto en la tecnica. Los metodos preferidos se mencionan en Bhavender P. Sharma, Lorraine F. Bailey y Ralph A. Messing (“Immobilisierte Biomaterialien Techniken und Anwendungen”, Angew. Chem., 94, pag. 836-852 (1992)); Dordick et al. (J. Am. Chem. Soc., 116, pag. 5009-5010
(1994) ), Okahata et al., Tetrahedron Lett., 38, pag. 1971-1974 (1997)), Adlercreutz et al. (Biocatalysis, 6, 291-305 (1992)); Goto et al. (Biotechnol. Prog. 10, pag. 263-268 (1994)), Kamiya et al. (Biotechnol. Prog., 11, pag. 270-275
(1995) ), Okahata et al. (Tibtech, February 1997, 15, pag. 50-54); Fishman et al. (Biotechnol. Lett., 20, pag. 535-538 (1998)).
La transformacion de hidantomas 5-sustituidas o carbamoilaminoacidos en los respectivos aminoacidos se puede llevar a cabo en un procedimiento discontinuo o de forma continua. Ventajosamente, se usa un reactor de membrana con enzimas como recipiente de reaccion (Wandrey et al. en Jahrbuch 1998, Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI S. 151ff.; Wandrey et al. en Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds, Vol. 2, VCH 1996, pag. 832 ff.; Kragl et al., Angew. Chem., 6, pag. 684f. (1996)).
Con respecto a la produccion de aminoacidos usando el procedimiento de catalizador de celula entera, ventajosamente, se usan celulas bacterianas debido a las altas tasas de reproduccion y las condiciones de crecimiento faciles que se aplican. Los expertos en la tecnica conocen varias bacterias que se pueden usar en relacion con esto. Preferiblemente, se puede usar E. coli como la celula y el sistema de expresion en relacion con esto (Yanisch-Perron et al., Gene, 33,103-109 (1985)).
Para producir aminoacidos, se pueden usar celulas que expresan la hidantoinasa de la presente invencion, y preferiblemente ademas que expresan la carbamoilasa y mas preferiblemente que expresan ademas la hidantoma racemasa, en el medio de cultivo. Alternativamente, se pueden usar en la mezcla de reaccion las respectivas celulas aisladas, celulas lavadas, productos de tratamiento de celulas, solucion de enzimas bruta o solucion de enzimas purificada obtenida del producto de tratamiento de celulas. Para llevar a cabo la reaccion, dicho medio de cultivo o mezcla de reaccion, respectivamente, que contiene el compuesto de hidantoma 5-sustituida como sustrato, se mantiene a una temperatura de 15 a 45°C, preferiblemente de 25 a 40°C, a pH de 5 a 9, preferiblemente a pH de 6 a 8, mientras que se deja reposar o agitar durante 8 horas a 5 dfas. Dicho medio de cultivo o mezcla de reaccion, respectivamente, puede contener ademas iones de metales de transicion, preferiblemente seleccionados de Zn2+, Mn2+ y Co2+, en una concentracion de 0,02 mM a 10 mM, preferiblemente de 0,1 mM a 5 mM. Cuando se usan celulas intactas, la mezcla de reaccion puede contener ademas componentes nutrientes esenciales para el crecimiento de dicha celula transformada, tales como fuentes de carbono, fuentes de nitrogeno e iones inorganicos. Ademas, se puede anadir el sustrato (compuesto de hidantoma 5-sustituida o carbamoilaminoacido) al medio de cultivo o a la mezcla de reaccion en porciones.
Puesto que las enzimas usadas en el metodo descrito tambien son capaces de catalizar la respectiva reaccion inversa, la presente invencion proporciona tambien ademas un procedimiento para preparar D-aminoacidos como se ha descrito antes, en donde en lugar de hidantoma 5-sustituida como sustrato se usa N-carbamoil-D,L-aminoacido o N-carbamoil-L-aminoacido:
dicho N-carbamoil-D,L-aminoacido o N-carbamoil-L-aminoacido es transformado por la hidantoinasa de acuerdo con la presente invencion en el respectivo compuesto de D,L-hidantoma 5-sustituida o L-hidantoma 5-sustituida. Ademas, dicho compuesto de D,L-hidantoma 5-sustituida o L-hidantoma 5-sustituida es transformado por la hidantoma racemasa en el enantiomero D, en concreto el respectivo compuesto de D-hidantoma 5-sustituida. Despues, el compuesto de D-hidantoma 5-sustituida es transformado por la hidantoinasa de acuerdo con la presente invencion en el respectivo N-carbamoil-D-aminoacido. Posteriormente, la carbamoilasa transforma el N-carbamoil-D- aminoacido en el respectivo D-aminoacido. En una realizacion particularmente preferida de este procedimiento, el N- carbamoilaminoacido usado como sustrato es el N-(aminocarbonil)-DL-triptofano (= N-carbamoil-DL-triptofano; = Nombre en el mdice de CA: N-(aminocarbonil)-triptofano; = Numero de registro: 98299-50-4; Formula: c12 H13 N3 O3) o N-carbamoil-L-triptofano (=Nombre en el mdice de CA: N-(aminocarbonil)-L-triptofano = Numero de registro: 89595-64-2; Formula: C12 H13 N3 O3).
El aminoacido producido en el medio de cultivo o una mezcla de reaccion se puede cuantificar rapidamente por un metodo conocido. Para esto, se puede usar cromatograffa ftquida de alta presion (HPLC) usando una columna C-18 y por ejemplo una mezcla de fosfato potasico 20 mM (pH 2,3) que contiene acetonitrilo al 1% y acetonitrilo que contiene H2O al 10% como eluyente.
Los aminoacidos acumulados en el medio de cultivo o mezcla de reaccion, se pueden recoger del medio de cultivo o mezcla de reaccion por metodos convencionales. Por ejemplo, se pueden usar procedimientos tales como filtracion, centrifugacion, concentracion a vado, cromatograffa de intercambio ionico o adsorcion, cristalizacion y similares, si es necesario en combinacion entre sf.
El siguiente esquema de reaccion muestra las etapas de reaccion y las enzimas implicadas en la transformacion catalftica (ilustrada por la transformacion de D-hidantoma). La D-hidantoma se transforma en N-carbamoil-D- aminoacido por la actividad catalftica de la D-hidantoinasa, que cataliza la reaccion de hidrolisis de un compuesto de
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D-hidantoma 5-sustituida para dar un N-carbamoil-D-aminoacido. En una etapa de reaccion adicional, una enzima denominada N-carbamoilaminoacido hidrolasa cataliza la reaccion de hidrolisis de dicho N-carbamoil-D-aminoacido para dar un D-aminoacido opticamente activo. Ademas, una enzima denominada hidantoma racemasa cataliza la transformacion del compuesto L-hidantoma opticamente activo en el compuesto D-hidantoma opticamente activo y viceversa.
Esquema de reaccion
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Definiciones
Hidantoinasa: El termino “hidantoinasa” o “actividad de hidantoinasa” se define en la presente memoria como la enzima o la actividad de una enzima que hidroliza la hidantoma, en particular la hidantoma 5-sustituida. Las hidantoinasas catalizan la reaccion de hidrolisis de la hidantoma 5-sustituida para formar el respectivo N- carbamoilaminoacido. En particular, las hidantoinasas de acuerdo con la presente invencion catalizan la reaccion de hidrolisis de la D-5-indolilmetilhidantoma para formar el N-carbamoil-D-triptofano, o la reaccion de hidrolisis de la L-5- indolilmetilhidantoma para formar el N-carbamoil-L-triptofano. Un ejemplo de una hidantoinasa es una protema que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1. Un ejemplo de una actividad de hidantoinasa es la actividad catalftica de una protema que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 hacia un compuesto tal como la L-5-metilthioetilhidantoma, L-5-(4-hidroxibencil)hidantoma o L-5-bencilhidantoma, que se transforma en el respectivo N-carbamoilaminoacido por la actividad de dicha hidantoinasa.
Hidantoma racemasa: la expresion “hidantoma racemasa” o “actividad de hidantoma racemasa” se define en la presente memoria como la enzima o la actividad de una enzima que transforma la L-hidantoma en D-hidantoma y viceversa. En particular, la N-hidantoma racemasa cataliza la reaccion de transformacion de L-5- indolilmetilhidantoma para formar D-5-indolilmetilhidantoma, o cataliza la reaccion de transformacion de D-5- indolilmetilhidantoma para formar L-5-indolilmetilhidantoma. Un ejemplo para una hidantoma racemasa es una protema que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3. Un ejemplo para una actividad de hidantoma racemasa es la actividad catalftica de una protema que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3 hacia un compuesto tal como L-5-metilthioetilhidantoma, L-5-(4-hidroxibencil)hidantoma, L-5-bencilhidantoma o L-5- indolilmetilhidantoma, que se transforma en el respectivo enantiomero D por la actividad de dicha hidantoma racemasa.
N-carbamoilasa: El termino “N-carbamoilasa” o “actividad de N-carbamoilasa” se define en la presente memoria como la enzima o la actividad de una enzima que hidroliza N-carbamoilaminoacido, en particular N-carbamoil-D-
aminoacido. La N-carbamoilasa o N-carbamoilaminoacido hidrolasa, respectivamente, cataliza la reaccion de hidrolisis de dicho N-carbamoilaminoacido, en particular N-carbamoil-D-aminoacido para dar el respectivo aminoacido, en particular un D-aminoacido opticamente activo. En particular, las N-carbamoilasas catalizan la reaccion de hidrolisis del N-carbamoil-D-triptofano para dar D-triptofano, o catalizan la reaccion de hidrolisis del N- 5 carbamoil-L-triptofano para formar L-triptofano. Un ejemplo de una N-carbamoilasa es una protema que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4. Un ejemplo de una actividad de N-carbamoilasa es la actividad catalttica de una protema que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4 hacia un compuesto tal como N- carbamoil-metionina, N-carbamoil-tirosina, N-carbamoil-fenilalanina o N-carbamoil-triptofano, que se transforma en el respectivo aminoacido por la actividad de dicha N-carbamoilasa.
10 Hidantoma 5-sustituida: La expresion "hidantoma 5-sustituida" se refiere a un compuesto de acuerdo con la formula
(I) siguiente, en donde R se representa por hidrogeno, -CH3, -CH(CH3)2, -cH2-CH(CH3)2, -CH(CH3)-CH2-CH3, bencilo, 4-hidroxibencilo, indolilmetilo, -CH2-COOH, -CH2-CONH2, -CH2-CH2-COOH, -CH2-CH2-CONH2, -CH2-OH, -CH(OH)-CH3, -CH2-SH, -CH2-CH2-S-CH3, imidazolilmetilo, -CH2-CH2-CH2-NH-C(NH)NH2, -CH2-CH2-CH2-CH2-NH2, o la expresion "hidantoma 5-sustituida" se refiere a prolina hidantoma. Dichos restos corresponden a aminoacidos
15 que se encuentran de forma natural, que se obtienen tras la hidrolisis del respectivo compuesto por la hidantoinasa y posterior hidrolisis del respectivo N-carbamoilaminoacido por N-carbamoilasa. Ademas, el compuesto de hidantoma 5-sustituida puede corresponder a un aminoacido no natural o un derivado del mismo, tal como 5-fenilhidantoma, 5- (4-hidroxifenil)hidantoma, 5-metoximetilhidantoma, 5-benciloximetilhidantoma, 5-(3,4-metilendioxibencil)hidantoma, dihidrouracilo. Debe indicarse que la formula (I) muestra el enantiomero D de una hidantoma 5-sustituida.
20 Formula (I):
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Construccion de acido nucleico: La expresion “construccion de acido nucleico” como se usa en la presente memoria se refiere a una molecula de acido nucleico, monocatenaria o bicatenaria, que se afsla de un gen que se encuentra de forma natural o esta modificada para contener segmentos de acidos nucleicos de una forma que de lo contrario 25 no existina en la naturaleza. La expresion construccion de acido nucleico es sinonima de la expresion “casete de expresion” cuando la construccion de acido nucleico contiene las secuencias de control necesarias para la expresion de una secuencia codificante de la presente invencion.
Secuencia de control: La expresion “secuencia de control” se define en la presente memoria para incluir todos los componentes que son necesario o ventajosos para la expresion de un polinucleotido que codifica un polipeptido de 30 la presente invencion. Cada secuencia de control puede ser natural o extrana una de otra. Dichas secuencias de control incluyen, pero no se limitan a una secuencia lfder, secuencia de poliadenilacion, secuencia propeptido, promotor, secuencia de peptido senal, y terminador de la transcripcion. Como mmimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y senales de parada de la transcripcion y la traduccion. Las secuencias de control se pueden proporcionar con conectores con el fin de introducir sitios de reaccion espedficos que facilitan el ligado de las 35 secuencias de control con la region codificante de la secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido.
Operativamente unido: La expresion “operativamente unido” indica en la presente memoria una configuracion en la que una secuencia de control se pone en una posicion adecuada con respecto a la secuencia codificante de la secuencia de polinucleotido de modo que la secuencia de control dirige la expresion de la secuencia codificante de un polipeptido.
40 Secuencia codificante: Cuando se usa en la presente memoria, la expresion “secuencia codificante” significa una secuencia de nucleotidos, que especifica directamente la secuencia de aminoacidos de su producto protema. Los lfmites de la secuencia codificante en general estan determinados por un marco de lectura abierto, que normalmente empieza en el codon de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG y termina con un codon de parada tal como TAA, TAG y TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN, ADNc o secuencia de 45 nucleotidos recombinante.
Expresion: El termino “expresion” incluye cualquier etapa implicada en la produccion del polipeptido que incluye, pero no se limita a la transcripcion, modificacion postranscripcional, traduccion, modificacion postraduccional y secrecion.
Vector de expresion: La frase “vector de expresion” se define en la presente memoria como una molecula de ADN 50 lineal o circular que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido de la invencion, y que esta operativamente unido a nucleotidos adicionales que proporcionan su expresion.
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Celula hospedante: La expresion “celula hospedante”, como se usa en la presente memoria, incluye cualquier tipo de celula que es susceptible de transformacion, transfeccion, traduccion y similares con una construccion de acido nucleico o vector de expresion que comprende un polipeptido de la presente invencion.
Medio de cultivo celular: La expresion “medio de cultivo celular” significa en general el medio usado para el cultivo de microorganismos que incluyen bacterias, levaduras y hongos, y se puede denominar tambien “medio de fermentacion”.
Aminoacido no natural: La expresion “aminoacido no natural” se refiere a un alfa-aminoacido que tiene la formula NH2-CH(R)-COOH, en donde R representa un resto modificado de un resto de aminoacido proteinogenico, cuyo resto de aminoacido proteinogenico se selecciona de hidrogeno, -CH3, -CH(CH3)2, -CH2-CH(CH3)2, -CH(CH3)-CH2- CH3, bencilo, 4-hidroxibencilo, indolilmetilo, -CH2-COOH, -CH2-CONH2, -CH2-CH2-COOH, -CH2-CH2-CONH2, -CH2- OH, -CH(OH)-CH3, -CH2-SH, -CH2-CH2-S-CH3, imidazolilmetilo, -CH2-CH2-CH2-NH-C(NH)NH2, -CH2-CH2-CH2-CH2- NH2, o la expresion "aminoacido no natural" se refiere a un derivado de prolina, que puede estar modificado en el grupo -CH2-CH2-CH2- de su estructura de anillo. La modificacion mencionada antes puede ser sustitucion de atomo o atomos de hidrogeno por grupo alifatico, grupo aromatico, grupo heterodclico, grupo acido, grupo basico, grupo hidroxilo y/o halogeno tal como F.
Modificacion: El termino “modificacion” significa en la presente memoria cualquier modificacion qmmica del polipeptido que consiste en el polipeptido de acuerdo con la presente invencion o una secuencia homologa del mismo; asf como la manipulacion genetica del ADN que codifica dicho polipeptido. La modificacion pueden ser sustituciones, eliminaciones, inserciones y/o adiciones de uno o mas aminoacidos.
Variante: Cuando se usa en la presente memoria, el termino “variante” significa un polipeptido que tiene actividad de hidantoinasa producida por un organismo que expresa una secuencia de nucleotidos modificada del polipeptido de acuerdo con la presente invencion o una secuencia homologa al mismo. La secuencia de nucleotidos modificada se obtiene por la intervencion humana por modificacion de la secuencia de nucleotidos. Las secuencias de nucleotidos variantes tambien se pueden encontrar de forma natural. Por ejemplo, se ha descrito una hidantoinasa aislada de Microbacterium liquefaciens AJ3912 que tiene aproximadamente 83% de identidad con la hidantoinasa que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1. Esta hidantoinasa de Microbacterium liquefaciens se puede considerar como una variante (que se encuentra de forma natural) de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.
Las protemas de la presente invencion, por ejemplo, se pueden sintetizar, preparar a partir de protemas purificadas o producir usando procedimientos recombinantes y tecnicas conocidas en la materia. Aunque se describen en la presente memoria tecnicas espedficas para su preparacion, se entiende que todas las tecnicas adecuadas para la produccion de estos peptidos, se pretende que esten dentro del alcance de esta invencion. En general, estas tecnicas incluyen secuenciacion de ADN y protema, clonacion, expresion y otras tecnicas de ingeniena recombinantes, que permiten la construccion de vectores procariotas y eucariotas que codifican y expresan cada una de las protemas de la invencion.
Los terminos “peptido” y “oligopeptido” se consideran sinonimos (como se admite normalmente) y cada termino se puede usar de forma intercambiable segun requiera el contexto, indicando una cadena de al menos dos aminoacidos acoplados mediante enlaces peptidilo. La palabra “polipeptido” se usa en la presente memoria para cadenas que contienen mas de diez restos de aminoacidos. Todas las formulas o secuencias de oligopeptidos y polipeptidos en la presente memoria estan escritas de izquierda a derecha y en la direccion del extremo amino al extremo carboxi. El codigo de aminoacidos de una letra usado en la presente memoria es conocido normalmente en la tecnica y se puede encontrar en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
Por polipeptido o protema “aislada” se entiende un polipeptido o protema secado de su entorno natural. Por ejemplo, los polipeptidos y protemas producidos de forma recombinante expresados en celulas hospedantes, se consideran aislados para el proposito de la invencion, puesto que son polipeptidos naturales o recombinantes que se han purificado sustancialmente por cualquier tecnica adecuada tal como, por ejemplo, el metodo de purificacion en una etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).
La hidantoinasa de acuerdo con la invencion se puede recuperar y purificar de cultivos de celulas recombinantes por procedimientos bien conocidos, que incluyen la precipitacion con sulfato amonico o etanol, extraccion con acido, cromatograffa de intercambio anionico o cationico, cromatograffa en fosfocelulosa, cromatograffa de interaccion hidrofoba, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de hidroxilapatito y cromatograffa de lecitina. Lo mas preferiblemente, se usa la cromatograffa ffquida de alto rendimiento (“HPLC”) para la purificacion.
Los polipeptidos de la presente invencion incluyen productos naturalmente purificados, productos de procedimientos sinteticos qmmicos, y productos producidos por tecnicas recombinantes a partir de un hospedante procariota o eucariota, incluyendo, por ejemplo, celulas bacterianas, de levadura, fungicas, de plantas superiores, insectos y mairffferos. Dependiendo del hospedante usado en un procedimiento de produccion recombinante, los polipeptidos de la presente invencion pueden estar glicosilados o pueden no estar glicosilados. Ademas, los polipeptidos de la invencion pueden incluir tambien un resto de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de
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procedimientos mediados por el hospedante.
Las protemas de la presente invencion se pueden unir operativamente a un polipeptido no hidantoinasa (p. ej., secuencias de aminoacidos heterologas) para formar protemas de fusion. Como se usa en la presente memoria, una “protema quimerica” o “protema de fusion” hidantoinasa comprende un polipeptido hidantoinasa operativamente unido a un polipeptido no hidantoinasa.
Por ejemplo, en una realizacion, la protema de fusion es una protema de fusion de GST-hidantoinasa, en la que las secuencias de hidantoinasa estan fusionadas al extremo C de las secuencias de GST. Dichas protemas de fusion pueden facilitar la purificacion de la hidantoinasa recombinante. En otra realizacion, la protema de fusion es una protema hidantoinasa que contiene una secuencia senal heterologa en su extremo N. En algunas celulas hospedantes (p. ej., celulas hospedantes de mairnfero y levadura), la expresion y/o secrecion de hidantoinasa se puede aumentar por el uso de una secuencia senal heterologa.
Se puede usar una secuencia senal para facilitar la secrecion y aislamiento de una protema o polipeptido de la invencion. Las secuencias senal se caracterizan tfpicamente por un nucleo de aminoacidos hidrofobos que normalmente son escindidos de la protema madura durante la secrecion en uno o mas sucesos de escision. Dichos peptidos senal contienen sitios de procesamiento que permiten la escision de la secuencia senal de las protemas maduras cuando pasan por la ruta secretora. La secuencia senal dirige la secrecion de la protema, tal como de un hospedante eucariota en el que el vector de expresion se transforma y la secuencia senal posteriormente o simultaneamente se escinde. Despues la protema se puede purificar facilmente del medio extracelular por procedimientos reconocidos en la tecnica. Alternativamente, la secuencia senal se puede unir a una protema de interes usando una secuencia que facilite la purificacion, tal como con un dominio GST. Asf, por ejemplo, la secuencia que codifica el polipeptido se puede fusionar con una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un peptido, que facilita la purificacion del polipeptido fusionado. En algunas realizaciones preferidas de este aspecto de la invencion, la secuencia marcadora es un peptido de hexa-histidina, tal como el marcador proporcionado en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales estan disponibles en el mercado. Como se describe en Gentz et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona la purificacion conveniente de la protema de fusion. El marcador HA es otro peptido util para la purificacion, que corresponde a un epftopo derivado de la protema hemaglutinina de influenza, que han descrito Wilson et al., Cell 37:767 (1984), por ejemplo.
Preferiblemente, una protema quimerica o de fusion de la invencion se produce por tecnicas de ADN recombinante convencionales. Por ejemplo, se ligan fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipeptidos juntas de acuerdo con tecnicas convencionales, por ejemplo, usando extremos romos o extremos escalonados para el ligado, digestion con enzimas de restriccion para proporcionar extremos adecuados, relleno de extremos cohesivos segun sea adecuado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la union no deseada, y ligado enzimatico. En otra realizacion, el gen de fusion se puede sintetizar por tecnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN convencionales. Alternativamente, se puede llevar a cabo la amplificacion por PCR de fragmentos de genes usando cebadores de anclaje que dan lugar a extremos salientes complementarios entre dos fragmentos de genes consecutivos que posteriormente se pueden asociar y volver a amplificar para generar una secuencia de gen quimerica (vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Ademas, estan disponibles en el mercado muchos vectores de expresion que ya codifican un resto de fusion (p. ej., un polipeptido GST). Se puede clonar un acido nucleico de acuerdo con la invencion en dicho vector de expresion, de modo que el resto de fusion esta unido en el marco al resto de fusion con el fin de expresar una protema de fusion que comprende una protema de acuerdo con la invencion.
La expresion “sustitucion conservadora” o sustitucion por restos de aminoacidos “homologos” se pretende que signifique una sustitucion en la que el resto de aminoacido se sustituye por un resto de aminoacido que tiene una cadena lateral similar. Estas familias se conocen en la tecnica e incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (p. ej., lisina, arginina e histidina), cadenas laterales acidas (p. ej. acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparaginas, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistema), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales ramificadas en beta (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (p. ej., tirosina, fenilalanina triptofano, histidina).
Las sustituciones conservadoras de aminoacidos normalmente tienen un impacto mmimo en la actividad de la protema resultante. Dichas sustituciones se describen mas adelante. Las sustituciones conservadoras sustituyen un aminoacido por otro aminoacido que es similar en tamano, hidrofobicidad, carga, polaridad, caractensticas estericas, aromaticidad, etc. Dichas sustituciones en general son conservadoras cuando se desea modular finalmente las caractensticas de la protema.
Restos de aminoacidos “homologos” como se usa en la presente memoria se refiere a restos de aminoacidos que tienen propiedades qmmicas similares en relacion con la hidrofobicidad, carga, polaridad, caractensticas estericas, aromaticidad, etc. Los ejemplos de aminoacidos que son homologos entre sf incluyen, en terminos de carga positiva: lisina, arginina, histidina; en terminos de carga negativa: acido glutamico, acido aspartico; en terminos de hidrofobicidad: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina; en terminos de polaridad: serina,
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treonina, cistema, metionina, triptofano, tirosina, asparagina, glutamina; en terminos de aromaticidad: fenilalanina, tirosina, triptofano; en terminos de grupos laterales qmmicamente similares: serina y treonina; o glutamina y asparaginas; o leucina e isoleucina.
Los ejemplos de aminoacidos que pueden sustituir a un aminoacido original en una protema y que se consideran como sustituciones conservadoras incluyen: Ala por Ser; Arg por Lys; Asn por Gln o His; Asp por Glu; Cys por Ser; Gln por Asn; Glu por Asp; Gly por Pro; His por Asn o Gln; Ile por Leu o Val; Leu por Ile o Val; Lys por Arg o Gln Met; por Leu o Ile; Met, Phe por Leu o Tyr; Ser por Thr; Thr por Ser; Trp por Tyr; Tyr por Trp o Phe; y Val por Ile o Leu.
Por ejemplo, se proporciona una grna de como hacer sustituciones de aminoacidos fenotipicamente silenciosas en Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-1310 (1990), en donde los autores indican que hay dos procedimientos principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoacidos al cambio. El primer procedimiento se basa en el proceso de evolucion, en el que las mutaciones son aceptadas o rechazadas por seleccion natural. El segundo procedimiento usa ingeniena genetica para introducir cambios de aminoacidos en posiciones espedficas de un gen clonado y selecciona o criba para identificar secuencias que mantienen la funcionalidad. Como exponen los autores, estos estudios han puesto de manifiesto que las protemas son sorprendentemente tolerantes a sustituciones de aminoacidos. Los autores indican ademas que es probable que los cambios sean permisivos en una determinada posicion de la protema. Por ejemplo, la mayona de los restos de aminoacidos enterrados requieren cadenas laterales no polares, mientras que en general se conservan pocas caractensticas de cadenas laterales de la superficie. Otras de dichas sustituciones fenotipicamente silenciosas se describen en Bowie et al., vease antes, y las referencias citadas en el mismo.
Como se define en la presente memoria, la expresion “sustancialmente homologa” se refiere a una secuencia de aminoacidos que contiene un numero suficiente o mmimo de aminoacidos identicos o equivalentes (p. ej., con cadena lateral similar) respecto a una segunda secuencia de aminoacidos de modo que la primera y la segunda secuencias de aminoacidos tienen un dominio comun. Por ejemplo, las secuencias de aminoacidos que contienen un dominio comun que tiene una identidad de aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o mas, se definen en la presente memoria como suficientemente identicas, con la condicion de que se mantienen la o las sustituciones de las posiciones de aminoacidos de acuerdo con la presente invencion como se definen en la presente memoria.
Tambien los acidos nucleicos que codifican otros miembros de la familia de hidantoinasas, que por lo tanto tienen una secuencia de nucleotidos que difiere de una secuencia de nucleotidos de la presente invencion, estan dentro del alcance de la invencion, con la condicion de que se mantienen la o las sustituciones de las posiciones de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos codificada de acuerdo con la presente invencion como se definen en la presente memoria. Dichas moleculas de acidos nucleicos que corresponden a variantes (p. ej., variantes alelicas naturales) y homologos del ADN de acuerdo con la invencion se pueden aislar basandose en su homologfa con los acidos nucleicos descritos en la presente memoria usando los ADNc descritos en la presente memoria o un fragmento adecuado de los mismos, como una sonda de hibridacion de acuerdo con tecnicas de hibridacion convencionales preferiblemente en condiciones de hibridacion altamente restrictivas.
Ademas de variantes alelicas de las secuencias proporcionadas en la presente memoria que se encuentran de forma natural, el experto en la tecnica reconocera que se pueden introducir cambios adicionales por mutacion en las secuencias de nucleotidos de acuerdo con la presente invencion, conduciendo asf a cambios en la secuencia de aminoacidos de la protema hidantoinasa sin alterar sustancialmente la funcion de la protema, con la condicion de que se mantienen la o las sustituciones de las posiciones de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos codificada de acuerdo con la presente invencion como se definen en la presente memoria.
De acuerdo con la presente invencion se proporcionan hidantoinasas mejoradas. Las hidantoinasas mejoradas son protemas en donde se mejora la actividad catalttica y/o la enantioselectividad. Dichas protemas se pueden obtener introduciendo mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagenesis por saturacion, y los mutantes resultantes pueden ser expresados de forma recombinante y cribados segun su respectiva actividad biologica. Por ejemplo, la tecnica proporciona ensayos estandar para medir la actividad catalftica de hidantoinasas y por lo tanto se pueden seleccionar facilmente protemas mejoradas.
Como se usa en la presente memoria, los terminos “gen” y “gen recombinante” se refieren a moleculas de acido nucleico que se pueden aislar del ADN cromosomico, que incluye un marco de lectura abierto que codifica una protema, p. ej., hidantoinasa. Un gen puede incluir secuencias codificantes, secuencias no codificantes, intrones y secuencias reguladoras. Ademas, un gen se refiere a una molecula de acido nucleico aislada como se define en la presente memoria.
Una molecula de acido nucleico de la presente invencion o un equivalente funcional de la misma, se puede aislar usando tecnicas de biologfa molecular convencionales y la informacion de secuencia proporcionada en la presente memoria. Por ejemplo, usando toda o una parte de la secuencia de acido nucleico descrita en la presente memoria como una sonda de hibridacion, se pueden aislar moleculas de acido nucleico de acuerdo con la invencion, usando tecnicas de hibridacion y clonacion estandar (p. ej., como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory
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Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
Ademas, se puede aislar una molecula de acido nucleico que abarca toda o una parte de la secuencia de acido nucleico de acuerdo con la presente invencion, por la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores oligonucleotidos sinteticos disenados basandose en la informacion de secuencia contenida en las secuencias descritas.
Una molecula de acido nucleico de la invencion se puede amplificar usando ADNc, ARNm o alternativamente, ADN genomico, como un molde y cebadores oligonucleotidos adecuados de acuerdo con tecnicas de amplificacion por PCR convencionales. El acido nucleico asf amplificado se puede clonar en un vector adecuado y caracterizar por analisis de secuencia de ADN.
Ademas, los oligonucleotidos que corresponden o que pueden hibridar con las secuencias de nucleotidos de acuerdo con la invencion, se pueden preparar por tecnicas sinteticas convencionales, p. ej., usando un sintetizador de ADN automatico.
Una molecula de acido nucleico que es complementaria de otra secuencia de acido nucleico es una que es suficientemente complementaria de las otras secuencias de modo que puede hibridar con la otra secuencia de nucleotidos forman asf un duplex estable.
Un “polinucleotido aislado” o “acido nucleico aislado” es un ADN o ARN que no es inmediatamente contiguo a ambas secuencias codificantes con las que es inmediatamente contiguo (una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma natural del organismo del que se obtiene. Por lo tanto, en una realizacion, un acido nucleico aislado incluye algunas o todas las secuencias 5' no codificantes (p. ej., promotor) que son inmediatamente contiguas a la secuencia codificante. Por lo tanto, el termino incluye, por ejemplo, un aDn recombinante que se incorpora en un vector, en un plasmido de replicacion autonoma o virus, o en ADN genomico de una procariota o eucariota, o que existe como una molecula separada (p. ej., un ADNc o un fragmento de ADN genomico producido por la PCR o tratamiento con endonucleasas de restriccion) independientemente de otras secuencias. Tambien esta incluido un ADN recombinante que es parte de un gen tnbrido que codifica un polipeptido adicional que carece sustancialmente de material celular, material vmco o medio de cultivo (cuando se produce por tecnicas de ADN recombinante), o precursores qmmicos u otros productos qmmicos (cuando se sintetizan qmmicamente). Ademas, un “fragmento de acido nucleico aislado” es un fragmento de acido nucleico que no se encuentra de forma natural como un fragmento y no se encontrana en el estado natural.
Como se usa en la presente memoria, los terminos “polinucleotido” o “molecula de acido nucleico” se pretende que incluyan moleculas de ADN (p. ej., ADNc o ADN genomico) y moleculas de ARN (p. ej., ARNm) y analogos de ADN o aRn generados usando analogos de nucleotidos. La molecula de acido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario. El acido nucleico se puede sintetizar usando analogos o derivados de oligonucleotidos (p. ej., nucleotidos inosina o fosforotioato). Dichos oligonucleotidos se pueden usar, por ejemplo, para preparar acidos nucleicos que tienen las capacidades de emparejamiento de bases alteradas o mayor resistencia a nucleasas.
Tambien estan incluidas dentro del alcance de la invencion las cadenas complementarias de las moleculas de acidos nucleicos descritas en la presente memoria.
La informacion de secuencia proporcionada en la presente memoria no debe interpretarse de forma muy concreta para requerir la inclusion de bases identificadas de forma erronea. Las secuencias espedficas descritas en la presente memoria se pueden usar facilmente para aislar el gen completo de Arthrobacter sp. que a su vez se puede someter facilmente a analisis de secuencia adicional identificando asf errores de secuenciacion.
Salvo que se indique de otra forma, todas las secuencias de nucleotidos determinadas por secuenciacion de una molecula de ADN en la presente memoria, se determinaron usando un secuenciador de ADN automatico y todas las secuencias de aminoacidos de los polipeptidos codificados por moleculas de ADN determinadas en la presente memoria se predijeron por traduccion de una secuencia de ADN determinada como antes. Por lo tanto, como se conoce en la tecnica, para cualquier secuencia de ADN determinada por este procedimiento automatico, cualquier secuencia de nucleotidos determinada en la presente memoria puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleotidos determinadas por este procedimiento automatico, tfpicamente son al menos aproximadamente 90% identicas, mas tfpicamente de al menos aproximadamente 95% a al menos aproximadamente 99,9% identicas con la secuencia de nucleotidos real de la molecula de ADN secuenciada. La secuencia real se puede determinar de forma mas precisa por otros procedimientos que incluyen procedimientos de secuenciacion de ADN manual bien conocidos en la tecnica. Como tambien se conoce en la tecnica, una sola insercion o eliminacion en una secuencia de nucleotidos determinada comparada con la secuencia real producira un desplazamiento del marco en la traduccion de la secuencia de nucleotidos de modo que la secuencia de aminoacidos prevista codificada por una determinada secuencia de nucleotidos sera completamente diferente de la secuencia de aminoacidos codificada realmente por la molecula de ADN secuenciada, empezando en el punto de dicha insercion o eliminacion.
El experto en la tecnica es capaz de identificar dichas bases identificadas de forma erronea y sabe como corregir dichos errores.
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Los terminos “homologfa” o “porcentaje de identidad” se usan de forma intercambiable en la presente memoria. Para el proposito de esta invencion, se define aqu que con el fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoacidos o de dos secuencias de acido nucleico, las secuencias se alinean para fines de comparacion optimos (p. ej., se pueden introducir huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoacidos o acido nucleico para el alineamiento optimo con una segunda secuencia de aminoacidos o acido nucleico). Se comparan despues estos restos de aminoacidos o nucleotidos en las correspondientes posiciones de aminoacidos o posiciones de nucleotidos. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo resto de aminoacido o nucleotido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = numero de posiciones identicas/numero total de posiciones (es decir, posiciones que solapan)*100). Preferiblemente, las dos secuencias tienen la misma longitud.
El experto en la tecnica sera consciente del hecho de que estan disponibles varios programas informaticos diferentes para determinar la homologfa entre dos secuencias. Por ejemplo, se puede llevar a cabo una comparacion de secuencias y determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias usando un algoritmo matematico. En una realizacion preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de programas GCG (disponible en
http://www.gcg.com), usando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El experto en la tecnica apreciara que todos estos parametros diferentes daran resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje de identidad total de las dos secuencias no se altera significativamente cuando se usan diferentes algoritmos.
En otra realizacion mas, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleotidos se determina usando el programa GAP en el paquete de programas GCG (disponible en
http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 o 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En otra realizacion, el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoacidos o nucleotidos se determina usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989) que se ha incorporado en el programa ALIGN (version 2.0) (disponible en:
http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) usando una tabla de pesos de restos PAM120, una penalizacion por longitud de hueco de 12 y una penalizacion por hueco de 4.
Las secuencias de acidos nucleicos y protemas de la presente invencion se pueden usar ademas como una “secuencia de consulta” para llevar a cabo una busqueda en bases de datos publicas, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas busquedas se pueden llevar a cabo usando los programas BLASTN y BLASTX (version 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las busquedas de nucleotidos con BLAST se pueden llevar a cabo con el programa BLASTN, puntuacion=100, longitud de palabra=12 para obtener secuencias de nucleotidos homologas a moleculas de acido nucleico PLP03 de la invencion. Las busquedas de protemas con BLAS se pueden llevar a cabo con el programa BLASTX, puntuacion=50, longitud de palabra=3 para obtener secuencias de aminoacidos homologas a moleculas de protema PLP03 de la invencion. Para obtener alineamientos con huecos para fines de comparacion, se puede usar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se usan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parametros por defecto de los respectivos programas (p. ej., BLASTX y BLASTN). Vease
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
El “porcentaje de identidad de aminoacidos” o “porcentaje de identidad de secuencia de aminoacidos” se refiere a una comparacion de los aminoacidos de dos polipeptidos que, cuando se alinean de forma optima, tienen aproximadamente el porcentaje designado de los mismos aminoacidos. Por ejemplo, “95% de identidad de aminoacidos” se refiere a una comparacion de los aminoacidos de dos polipeptidos que cuando se alinean de forma optima tienen 95% de identidad de aminoacidos. Preferiblemente, las posiciones de los restos que no son identicos difieren por sustituciones conservadoras de aminoacidos. Por ejemplo, no es probable que la sustitucion de los aminoacidos que tienen propiedades qmmicas similares tales como la carga o polaridad, afecte a las propiedades de una protema. Los ejemplos incluyen glutamina por asparagina o acido glutamico por acido aspartico.
Como se usa en la presente memoria, el termino “hibridar” se pretende que describa condiciones para la hibridacion y el lavado en las que secuencias de nucleotidos al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos aproximadamente 95%, incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente 96%, mas preferiblemente al menos 98% homologas entre sf, tfpicamente permanecen hibridadas entre sf. El experto en la tecnica entiende que se aplica una condicion adicional, en concreto que se mantienen la o las sustituciones de las posiciones de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos codificada de acuerdo con la presente invencion como se define en la presente memoria.
Un ejemplo no limitante preferido de dichas condiciones de hibridacion, son la hibridacion en 6x cloruro sodico/citrato sodico (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de uno o mas lavados en 1xSSC, SDS al 0,1% a 50°C, preferiblemente a 55°C, mas preferido a 60°C e incluso preferiblemente a 65°C.
Las condiciones altamente restrictivas incluyen, por ejemplo, hibridacion a 68°C, en 5xSSC/5xsolucion de
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Denhardt/SDS al 1,0% y lavado en 0,2*SSC/SDS al 0,1% a temperature ambiente. Alternativamente, el lavado se puede llevar a cabo a 42°C.
El experto en la tecnica sabra que condiciones aplicar para las condiciones de hibridacion restrictivas y altamente restrictivas. Se encuentra facilmente disponible en la tecnica directrices relativas a dichas condiciones, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.).
Por supuesto, un polinucleotido que hibrida solo con una secuencia de poli A (tal como el tramo de poli(A) 3' terminal de los ARNm), o con un tramo complementary de restos de T (o U), no estana incluido en un polinucleotido de la invencion usado espedficamente para hibridar con una parte de un acido nucleico de la invencion, puesto que dicho polinucleotido hibridana con cualquier molecula de acido nucleico que contenga un tramo de poli(A) o el complementario del mismo (p. ej., practicamente cualquier clon de ADNc bicatenario).
La presente invencion se refiere tambien a construcciones de acido nucleico que comprenden un polinucleotido aislado de la presente invencion operativamente unido a una o mas secuencias de control que dirigen la expresion de la secuencia codificante en una celula hospedante adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control.
Un polinucleotido aislado que codifica un polipeptido de la presente invencion se puede manipular en una variedad de formas para proporcionar la expresion del polipeptido. La manipulacion de la secuencia de polinucleotido antes de su insercion en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresion. Las tecnicas para modificar secuencias de polinucleotidos usando procedimientos de ADN recombinante son bien conocidas en la tecnica.
La secuencia de control puede ser una secuencia promotora adecuada, una secuencia de nucleotidos que es reconocida por una celula hospedante para la expresion de un polinucleotido que codifica un polipeptido de la presente invencion. La secuencia promotora contiene secuencias de control de la transcripcion que median la expresion del polipeptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleotidos que muestre actividad transcripcional en la celula hospedante de eleccion, incluyendo promotores mutantes, truncados e hfbridos, y se puede obtener a partir de genes que codifican polipeptidos extracelulares o intracelulares sean homologos o heterologos para la celula hospedante.
Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripcion de construcciones de acidos nucleicos de la presente invencion, en especial en una celula hospedante bacteriana, son los promotores obtenidos del operon lac de E. coli, gen de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), gen de levansucrasa Bacillus subtilis (sacB), gen de alfa-amilasa Bacillus licheniformis (amyL), gen de amilasa maltogenica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gen de penicilasa Bacillus licheniformis (penP), genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, y gen de beta-lactamasa procariota (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), asf como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Se describen promotores adicionales en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, vease antes.
Como secuencia de union al ribosoma, se puede usar casi cualquier secuencia siempre que pueda ser expresada en una celula hospedante. Sin embargo, se prefiere usar un plasmido en el que se ajusten una secuencia de Shine- Dalgarno y un codon de inicio para tener una distancia adecuada (p. ej., de 6 a 18 bases) entre ellos.
Con el fin de llevar a cabo eficazmente la transcripcion y traduccion, se puede expresar una protema, en la que el extremo N-terminal de una protema que tiene actividad de la protema o una protema derivada de dicha protema por eliminacion de una parte de la misma, se fusiona con el extremo N-terminal de una protema codificada por un vector de expresion.
Las secuencias de control tambien pueden ser una secuencia terminadora de la transcripcion adecuada, una secuencia reconocida por una celula hospedante para terminar la transcripcion. Aunque no siempre es necesaria una secuencia de terminacion de la transcripcion para la expresion de una protema de interes, normalmente es parte de vectores disponibles en el mercado. La secuencia de terminacion esta operativamente unida al extremo 3' de la secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido. Es preferible poner una secuencia de terminacion de la transcripcion directamente debajo de un gen estructural. Se puede usar cualquier terminador que sea funcional en la celula hospedante de eleccion en la presente invencion.
La secuencia de control tambien puede ser una secuencia lfder adecuada, una region no traducida de un ARNm que es importante para la traduccion por la celula hospedante. La secuencia lfder esta operativamente unida al extremo 5' de la secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido. Se puede usar en la presente invencion cualquier secuencia lfder que sea funcional en la celula hospedante de eleccion.
La secuencia de control tambien puede ser una secuencia de poliadenilacion, una secuencia operativamente unida al extremo 3' de la secuencia de nucleotidos y que, cuando se transcribe es reconocida por la celula hospedante como una senal para anadir restos de poliadenosina al ARNm transcrito. Se puede usar en la presente invencion
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cualquier secuencia de poliadenilacion que sea funcional en la celula hospedante de eleccion.
La secuencia de control tambien puede ser una region que codifica un peptido senal que codifica una secuencia de aminoacidos unida al extremo amino de un polipeptido y dirige el polipeptido codificado en la ruta secretora de la celula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de nucleotidos puede contener inherentemente una region codificante de un peptido senal naturalmente unido en el marco de lectura de traduccion con el segmento de la region codificante que codifica el polipeptido secretado. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una region que codifica un peptido senal que es extrano para la secuencia codificante. La region que codifica un peptido senal extrano puede ser necesaria donde la secuencia codificante no contiene de forma natural una region que codifica un peptido senal. Alternativamente, la region que codifica un peptido senal extrano puede sustituir simplemente la region que codifica un peptido senal natural con el fin de potenciar la secrecion del polipeptido. Sin embargo, se puede usar en la presente invencion cualquier region que codifica un peptido senal que dirija al polipeptido expresado a la ruta secretora de una celula hospedante de eleccion, es decir, en un medio de cultivo.
La secuencia de control tambien puede ser una region que codifica un propeptido que codifica una secuencia de aminoacidos situada en el extremo amino de un polipeptido. El polipeptido resultante se conoce como una proenzima o propolipeptido (o un zimogeno en algunos casos). Un propolipeptido en general es inactivo y se puede transformar en un polipeptido activo maduro por escision catalftica o autocatalftica del polipeptido a partir del propolipeptido. La region que codifica el propeptido se puede obtener a partir de los genes para la proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), proteasa neutral de Bacillus subtilis (nprT), factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspartica Rhizomucor miehei, y lacasa Myceliophthora thermophila.
Cuando estan presentes tanto las regiones de peptido senal como de propeptido en el extremo amino de un polipeptido, la region propeptido esta colocada cerca del extremo amino de un polipeptido y la region del peptido senal esta colocada cerca del extremo amino de la region de propeptido. Tambien puede ser conveniente anadir secuencias reguladoras que permitan la regulacion de la expresion del polipeptido con respecto al crecimiento de la celula hospedante. Los ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que hacen que la expresion del gen se active o desactive en respuesta a un estfmulo qmmico o ffsico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procariotas incluyen los sistemas operadores lac, tac y trp. En levaduras, se puede usar el sistema de ADH2 o el sistema de GAL1. En hongos filamentosos, se pueden usar el promotor de alfa- amilasa TAKA, promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae, como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son las que permiten la amplificacion de genes. En sistemas eucariotas, estos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa que es amplificado en presencia de metotrexato y los genes de metalotionema que son amplificados con metales pesados. En estos casos, la secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido estana operativamente unida con la secuencia reguladora.
La presente invencion tambien se refiere a vectores de expresion recombinantes que comprende un polinucleotido de la presente invencion, un promotor y senales de parada de transcripcion y traduccion. Los diferentes acidos nucleicos y secuencias de control descritas en la presente memoria se pueden unir entre sf para producir un vector de expresion recombinante que puede incluir uno o mas sitios de restriccion convenientes para permitir la insercion o sustitucion de la secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido en dichos sitios. Alternativamente, la secuencia de nucleotidos de la presente invencion se puede expresar insertando la secuencia de nucleotidos o una construccion de acido nucleico que comprende la secuencia en un vector adecuado para la expresion. Al crear el vector de expresion, la secuencia codificante esta situada en el vector de modo que la secuencia codificante esta operativamente unida con las secuencias de control adecuadas para la expresion.
El vector de expresion recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plasmido o virus) que se puede someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y puede llevar a cabo la expresion de la secuencia de nucleotidos. La eleccion del vector dependera tipicamente de la compatibilidad del vector con la celula hospedante en la que se va a introducir el vector. Los vectores pueden ser plasmidos lineales o circulares cerrados.
El vector puede ser un vector de replicacion autonoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosomica, cuya replicacion es independiente de la replicacion cromosomica, p. ej., un plasmido, un elemento extracromosomico, un minocromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicacion. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la celula hospedante, se integra en el genoma y es replicado junto con el o los cromosomas en el que se ha integrado. Ademas, se puede usar un solo vector o plasmido o dos o mas vectores o plasmidos que juntos contienen el ADN total que se va a introducir en el genoma de la celula hospedante, o un transposon.
Con el fin de identificar y seleccionar estos transformantes, generalmente se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (p. ej., resistencia a antibioticos) en las celulas hospedantes junto con el gen de interes. Los vectores de la presente invencion contienen preferiblemente uno o mas marcadores seleccionables que permiten la seleccion facil de celulas transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vmca, resistencia a metales pesados, prototroffa a auxotrofos, y similares. Los ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren resistencia a antibioticos tales como resistencia a ampicilina, kanamicina,
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cloramfenicol, o tetraciclina. Las celulas transformadas con el acido nucleico introducido se pueden identificar por seleccion de farmacos (p. ej., celulas que han incorporado el gen de marcador seleccionable sobreviviran, mientras que las otras moriran). Los marcadores adecuados para celulas hospedantes de levaduras son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Los marcadores seleccionables para usar en una celula hospedante de hongo filamentoso incluyen, pero no se limitan a amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'- fosfato descarboxilasaa), sC (sulfato adeniltransferasa), y trpC (antranilato sintasa), asf como sus equivalentes.
Los vectores de la presente invencion pueden contener un elemento o elementos que permiten la integracion del vector en el genoma de la celula hospedante o la replicacion autonoma del vector en la celula independiente del genoma.
Para la integracion en el genoma de la celula hospedante, el vector se puede basar en la secuencia de polinucleotido que codifica el polipeptido o cualquier otro elemento del vector para la integracion en el genoma por recombinacion homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de nucleotidos adicionales para dirigir la integracion por recombinacion homologa en el genoma de la celula hospedante en una situacion o situaciones precisas en el o los cromosomas. Para aumentar la probabilidad de la integracion en una situacion precisa, los elementos de integracion debenan contener preferiblemente un numero suficiente de acidos nucleicos. Los elementos de integracion pueden ser cualquier secuencia que es homologa con la secuencia diana en el genoma de la celula hospedante. Ademas, los elementos de integracion pueden ser secuencias de nucleotidos no codificantes o codificantes. Por otra parte, el vector se puede integrar en el genoma de la celula hospedante por recombinacion no homologa.
Para la replicacion autonoma, el vector puede comprender ademas un origen de la replicacion que permite al vector replicarse de forma autonoma en la celula hospedante en cuestion. El origen de la replicacion puede ser cualquier replicador de plasmido que media la replicacion autonoma que funciona en una celula. La expresion “origen de replicacion” o “replicador de plasmido” se define en la presente memoria como una secuencia de nucleotidos que permite que el plasmido o vector se replique in vivo.
Los ejemplos de ongenes de replicacion bacterianos son los ongenes de replicacion de los plasmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicacion en E. coli, y pUB110, pE194, pTAl060, y pAMRI que permiten la replicacion en Bacillus.
Los ejemplos de ongenes de replicacion para usar en una celula hospedante de levadura son el origen de replicacion de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinacion de ARS1 y CEN3, y la combinacion de ARS4 y CEN6.
Se puede insertar mas de una copia de un polinucleotido de la presente invencion en la celula hospedante para aumentar la produccion del producto genico. Un aumento en el numero de copias del polinucleotido se puede obtener integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la celula hospedante o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleotido donde las celulas contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por lo tanto se pueden seleccionar copias adicionales del polinucleotido para cultivar las celulas en presencia del agente seleccionable adecuado.
Los procedimientos usados para ligar los elementos descritos antes para construir los vectores de expresion recombinantes de la presente invencion, son bien conocidos para el experto en la tecnica (vease, p. ej., Sambrook et al., 1989, vease antes).
Los vectores de expresion recombinantes de la invencion comprenden un acido nucleico de la invencion en una forma adecuada para la expresion del acido nucleico en una celula hospedantes, que significa que el vector de expresion recombinante incluye una o mas secuencias reguladoras seleccionadas basandose en las celulas hospedantes que se van a usar para la expresion, que estan operativamente unidas a la secuencia de acido nucleico que se va a expresar. Dentro de un vector de expresion recombinante, “operativamente unido” se pretende que signifique que la secuencia de nucleotidos de interes esta unida a la o las secuencias reguladoras de una forma que permita la expresion de la secuencia de nucleotidos (p. ej., en un sistema de transcripcion/traduccion in vitro o en una celula hospedante cuando el vector se introduce en la celula hospedante). La expresion “secuencia reguladora” se pretende que incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresion. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; “Gene Expression Technology: Methods in Enzymology” 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresion constitutiva o inducible de una secuencia de nucleotidos en muchos tipos de celulas hospedantes.
El inserto de ADN debena estar operativamente unido a un promotor adecuado, tal como el promotor PL del fago lambda, los promotores lacI y lacZ de E. coli, los promotores T3 y T7, el promotor gpt, los promotores lambda PR, PL y el promotor trp, el promotor de HSV timidina quinasa, los promotores temprano y tardm de SV40, los promotores de LTR retrovmcos, tales como los del virus del sarcoma de Rous ("RSV"), promotores de CMV (citomegalovirus) y metalotionema, tales como el promotor de la metalotionema-I de raton. El experto en la tecnica conocera otros promotores adecuados. La expresion de protemas en procariotas a menudo se lleva a cabo en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresion de protemas. En una realizacion
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espedfica, se prefieren promotores que sean capaces de dirigir un nivel de expresion alto de hidantoinasas en microorganismos, preferiblemente en E. coli, bacterias corineformes Bacillus sp. Dichos promotores son conocidos en la tecnica. Las construcciones de expresion pueden contener sitios para el inicio, terminacion de la transcripcion, y en la region transcrita, un sitio de union al ribosoma para traduccion. La parte codificante de los transcritos maduros expresados por las construcciones incluiran una traduccion que empieza en AUG al principio y un codon de terminacion colocado de forma adecuada al final del polipeptido que se va a traducir.
El vector de ADN se puede introducir en celulas procariotas o eucariotas por tecnicas de transformacion o transfeccion convencionales. Como se usa en la presente memoria, los terminos “transformacion” y “transfeccion” se pretende que se refieran a una variedad de tecnicas reconocidas en la materia para la introduccion de acido nucleico extrano (p. ej., ADN) en una celula hospedante, que incluyen coprecipitacion con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, transduccion, infeccion, lipofeccion, transfeccion o electroporacion mediada por lfpido cationico. Se pueden encontrar procedimientos adecuados para la transformacion o trasfeccion de celulas hospedantes en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y otros manuales de laboratorio.
Entre los vectores preferidos para usar en bacterias estan pQE70, pQE60 y PQE-9, disponibles en Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, disponibles en Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles en Pharmacia. Entre los vectores eucariotas preferidos estan pWlNEO, pSV2CAT, pOG44, pZT1 y pSG disponibles en Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles en Pharmacia. Otros vectores adecuados seran facilmente evidentes para el experto en la tecnica.
La presente invencion tambien se refiere a celulas hospedantes recombinantes, que comprenden un polinucleotido de la presente invencion, que se usan ventajosamente en la produccion recombinante de los polipeptidos de hidantoinasa. Se introduce un vector que comprende un polinucleotido de la presente invencion en una celula hospedante de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosomico o como un vector extracromosomico autorreplicante. La expresion “celula hospedante” abarca tambien cualquier progenie de una celula original que no es identica a la celula original debido a mutaciones que se producen durante la replicacion. La eleccion de una celula hospedante dependera en gran medida del gen que codifica el polipeptido y su fuente.
Tambien se hace referencia a una “celula transformada” o “celula recombinante” que es una celula (hospedante) en la que (o en un antecesor de la cual) se ha introducido, por medio de tecnicas de ADN recombinante, un acido nucleico de acuerdo con la invencion.
Estan incluidas tanto las celulas procariotas como las eucariotas, p. ej., bacterias, hongos, levadura y similares. En particular, los microorganismos utiles como celulas hospedantes son celulas bacterianas tales como bacterias gram positivas o gram negativas, que incluyen, pero no se limitan a Bacillus sp. p. ej., Bacillus subtilis, Streptomyces sp., E. coli, Pseudomonas sp., Salmonella typhimurium, bacterias corineformes, y tambien actinomicetos, celulas fungicas tales como levaduras, celulas animales y celulas vegetales.
La introduccion de un vector en una celula hospedante bacteriana se puede llevar a cabo, por ejemplo, por transformacion de protoplaso (vease, p. ej., Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando celulas competentes (vease, p. ej., Young y Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporacion (vease, p. ej., Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugacion (vease, p. ej., Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).
Los siguientes ejemplos proporcionan detalles adicionales relacionados con los procedimientos usados para identificar y aislar hidantoinasas modificadas de acuerdo con la presente invencion. La presente invencion no esta limitada a la descripcion de los ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Clonacion y expresion de hidantoinasa
La hidantoinasa de Arthrobacter sp. (HyuH) que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 se suministro en un vector pOM18. Para la manipulacion adicional, era necesaria la subclonacion con la orientacion correcta del gen HyuH. Se usaron Ndel y HindIII para la doble digestion de vectores pOM18. La cadena principal del vector, gen carbA (carbamoilasa) de pAS6 y gen HyuH de pOM18 se extrajeron del gel de la PCR. Los tres productos extrafdos del gel se purificaron por columna (Machery Nagel) y se sometieron a ligado y posterior transformacion en DH5a de E. coli. Los clones se cultivaron durante la noche en LB-amp y se llevo a cabo la PCR del cultivo usando el cebador directo espedfico del gen de carbA y el cebador inverso para comprobar la orientacion correcta. El plasmido pAS6- HyuH obtenido contema el gen de hidantoinasa de tipo natural, que expresaba la protema que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 y el gen de carbamoilasa que expresaba la protema que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4. Los plasmidos del clon deseado se prepararon y se transformaron en celulas JM109 que conteman pOM21c (plasmido que expresa la hidantoma racemasa) para la comprobacion de la expresion y de la actividad. Para el analisis de expresion, el precultivo se cultivo en medio LB (con antibioticos adecuados) durante
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la noche a 37. Se anadieron 10 |jl del precultivo a 3 ml de medio inductor (medio LB + ramnosa 2 mg/ml). El cultivo se cultivo durante 20 h a 30°C. 5 jl de celulas se sometieron a analisis de SDS PAGE. Se uso en el ensayo de cribado basado en fluorescencia para comprobar la actividad de la enzima.
Ejemplo 2: Mutantes de hidantoinasa
Se determinaron varios sitios dentro de la hidantoinasa de Arthrobacter sp. de tipo natural (SEQ ID NO: 1) para la mutagenesis. Se preparo una biblioteca mutante por mutagenesis de saturacion en las posiciones de aminoacidos elegidas. Despues, se cribo en la biblioteca mutante racional la mayor actividad usando el ensayo de cribado de alta capacidad. Se seleccionaron 5 sitios para saturacion del sitio (Y72, I95, V154, P155, H316) y 2 sitios para mutagenesis (A152G, S153G). Para las posiciones de aminoacidos determinadas se llevaron a cabo 5 mutagenesis de saturacion de sitio y 1 mutacion de sitio dirigido.
Ejemplo 2.1: Construccion de bibliotecas mutantes enfocadas (SSM y SDM)
Se aplico la polimerasa Phusion para la mutagenesis de saturacion de sitio (ssm) y la mutagenesis de sitio dirigido (sdm) usando el plasmido obtenido en el ejemplo 1 (pAS6-HyuH; Fig. 1) que expresa la hidantoinasa de tipo natural o en una etapa posterior un plasmido que lleva un mutante de dicha hidantoinasa.
Para la mutagenesis de saturacion/dirigida de sitio se aplico un procedimiento de PCR de dos etapas para la generacion de bibliotecas mutantes enfocadas. El producto de la PCR se purifico por columna y se sometio a digestion por Dpnl durante la noche para eliminar el plasmido original. El producto que representa un plasmido de longitud completa que tiene todos los elementos de pAS6-HyuH despues se transformo en celulas JM109 que conteman pOM21c.
En detalle: se siguio un protocolo de la PCR de dos etapas para la mutagenesis de sitio de saturacion/dirigida (SSM). 50 jl de la mezcla de reaccion de la PCR conteman 1 ng/jl de molde de plasmido, 1x tampon de Phusion (New England Biolabs, Frankfurt, Alemania), 1 U de polimerasa de Phusion y dNTP 300 jM. La mezcla de reaccion se dividio en dos volumenes iguales y se anadieron 400 nM de cebador directo y cebador inverso para la saturacion de sitio de la respectiva posicion de aminoacido (vease la tabla 1) a las mezclas de reaccion separadas. El programa de la PCR era 98°C durante 45 s (1 ciclo); 98°C durante 15 s; 65°C durante 30 s; 72°C durante 3 min 30 s (5 ciclos); 72°C durante 5 min (1 ciclo). Despues de la primera etapa, se juntaron ambas reacciones y se llevo a cabo el mismo programa con 18 repeticiones mas.
La tabla 1 resume los cebadores (F = cebador directo; R = cebador inverso) usados para los metodos de la PCR descritos, indicando tambien la posicion de aminoacido de la SEQ ID NO: 1 que se va a modificar.
Ejemplo 2.2: Construccion de bibliotecas mutantes aleatorias de hidantoinasa de Arthrobacter sp. (HyuH)
Para la generacion de la biblioteca de mutantes por epPCR se generaron condiciones propensas al error usando MnCl2. La PCR se llevo a cabo inicialmente variando la concentracion de MnCh (0,05 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,5 mM). La mezcla de reaccion contema 0,3 ng/jl de molde de plasmido (usando el plasmido obtenido en el ejemplo 1 [pAS6-HyuH; Fig. 1] que expresa la hidantoinasa de tipo natural o en una etapa posterior de los estudios un plasmido que lleva un mutante de dicha hidantoinasa obtenida), 1x tampon de Taq SeSaM® (SeSaM-Biotech GmbH, Bremen, Alemania), 1 U de polimerasa de Taq SeSaM®, 200 jM dNTPs y cebadores HyuH_GS_F y HyuH_R 250 nM mostrados en la tabla 1 cada uno junto con una concentracion variable de MnCl2. El programa de la PCR era 94°C durante 2 min (1 ciclo); 94°C durante 30 s; 56°C durante 30 s; 72°C durante 50 s (25 ciclos); 72°C durante 5 min (1 ciclo). Se uso el protocolo de SeSaM® (Mundhada et al. "SeSaM-Tv-II generates a protein sequence space that is unobtainable by epPCR" Chembiochem. 2011 Jul 4; 12(10):1595-601) para construir la biblioteca de mutantes desplazada de transversion. Los productos de la PCR se purificaron por columna y se sometieron a Megawhop para la clonacion. 50 jl de mezclas de reaccion de la PCR conteman molde de plasmido 1 ng/jl, 1 x tampon de Phusion (New England Biolabs, Frankfurt, Alemania), 1 U de polimerasa de Phusion, dNTP 300 jM y 5 ng/jl de molde mutado de epPCR o SeSaM®. El programa de la PCR para Megawhop era 72°C 3 min (1 ciclo); 98°C 45 s (1 ciclo); 98°C durante 15 s; 62°C durante 30 s; 72°C durante 5 min (25 ciclos); 72°C durante 5 min (1 ciclo). Despues, la mezcla de la PCR se purifico en columna y se sometio a digestion por Dpnl (10 U) durante la noche. El producto de la PCR que representa un plasmido de longitud completa que tiene todos los elementos de pAS6-HyuH se transformo en celulas JM109 qmmicamente competentes (Promega, Mannheim, Alemania) para la expresion de protemas y posterior analisis.
Ejemplo 2.3: Construccion de bibliotecas mutantes enfocadas Omnichange
El protocolo de Omichange permite la mutagenesis de saturacion de sitio en posiciones remotas en la secuencia. Procede en cuatro etapas, empezando por la generacion de fragmentos por PCR con cebadores que contienen codones NNK y enlaces fosforotiodiester, despues la reaccion de escision de ADN con yodo elemental para la generacion de segmentos protuberantes 5', en tercer lugar, la hibridacion de ADN y finalmente la transformacion y reparacion de mella.
En detalle, 50 jl de mezcla de reaccion de la PCR contema molde de plasmido 0,5 ng/jl, 1 x tampon de Phusion
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(New England Biolabs, Frankfurt, Alemania), 5 U de polimerasa de Phusion, dNTP 200 pM y cebador directo e inverso espedfico de fragmento 400 pM. El programa de la PCR para el fragmento corto era 94°C durante 3 min (1 ciclo); 94°C durante 30 s; 55°C durante 30 s; 72°C durante 30 s (25 ciclos); 72°C durante 1 min (1 ciclo). Para el fragmento de vector el programa de la PCR se cambio a 94°C durante 3 min (1 ciclo); 94°C durante 30 s; 55°C durante 30 s; 72°C durante 1,5 min (25 ciclos); 72°C durante 3 min (1 ciclo). Las mezclas de la PCR despues se purificaron por columna y se sometieron a digestion por Dpnl (10U) durante la noche, se purificaron por columna y se diluyeron a 0,05 pmol/pl. Se llevaron a cabo la escision con yodo y la hibridacion del fragmento de ADN de acuerdo con el protocolo original de Omnichange (Dennig et al. "OmniChange: The Sequence Independent Method for Simultaneous Site-Saturation of Five Codons" PLoS ONE, 2011, 6(10): e26222). Los productos de la hibridacion despues se transformaron en celulas JM109 qmmicamente competentes (Promega, Mannheim, Alemania) para la expresion y posterior analisis de protemas.
Ejemplo 3: Ensayo de cribado basado en fluorescencia para placas de microvaloracion (MTP)
Precultivo y expresion: se inocularon 100 pl de medio LB que contema el antibiotico adecuado en placas de microvaloracion de 96 pocillos (MTP) con controles positivos y negativos asf como con clones obtenidos, usando un palillo. Las placas se incubaron a 37°C (900 rpm) durante la noche. Para preparar las placas de cribado, se transfirieron clones a una nueva MTP con 200 pl/pocillo de medio con antibiotico y ramnosa 2 mg/ml usando un replicador de 96 pocillos. Al resto del material de las placas se anadieron 100 pl de glicerol al 50% (p/p), se mezclo brevemente y las placas se almacenaron a -80°C.
Biotransformacion: Despues de incubacion a 30°C (900 rpm) durante la noche, se anadieron 100 pl/pocillo de suspension de L o D-triptofano-hidantoma homogeneizada (5 mg/ml en tampon de PBS a pH 7,4) a las placas de cribado. Las placas se incubaron a 30°C y 900 rpm y se midio la fluorescencia a 300/350 nm con un lector de placa adecuado en diferentes tiempos de medicion.
Ejemplo 4: Resultados
Las hidantoinasas mutantes obtenidas del experimento de mutagenesis de saturacion de sitio y la biblioteca de mutagenesis aleatoria de acuerdo con el ejemplo 2, se cribaron con respeto a su actividad usando el ensayo de fluorescencia descrito en el ejemplo 3. La lectura se refena a la medicion diferencial entre 40 min y 60 min. Cada medicion se llevo a cabo por triplicado. Como se ha descrito antes, se llevo a cabo el ensayo de las hidantoinasas mutantes con respecto a su actividad usando como sustratos L-5-indolilmetilhidantoma ( = L-triptofano-hidantoma) y D-5-indolilmetilhidantoma ( = D-triptofano-hidantoma), respectivamente, y sus actividades se compararon con la actividad de la hidantoinasa de tipo natural que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1.
En la tabla 2 se resumen los resultados obtenidos. Como se muestra en ella, se obtuvieron una serie de mutantes mejorados que mostraban mayor actividad catalttica y/o mayor enantioselectividad comparado con la hidantoinasa de tipo natural producida por el microorganismo Arthrobacter sp. que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.
En la tabla 2, la columna “ciclos de mutagenesis” indica de que tipo de mutagenesis deriva el mutante (SSM = mutagenesis de saturacion de sitio; epPCR; PCR propensa a error; SSM combi = mutagenesis por saturacion de sitio combinatoria, una mutagenesis en mas de una posicion de aminoacido). En la columna indicada “sustituciones” se indica la sustitucion de un resto de aminoacido en la posicion dada en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.
La columna designada "Relacion de actividad de D-Trp-hyd a HyuH nat" muestra el numero de veces de mejora de la actividad catalttica con respeto a la hidantoinasa de tipo natural usando D-5-indolilmetilhidantoma ( = D-triptofano- hidantoma) como sustrato. La columna designada "Relacion de actividad de L-Trp-hyd a HyuH nat" muestra el numero de veces de mejora de la actividad catalttica con respeto a la hidantoinasa de tipo natural usando L-5- indolilmetilhidantoma ( = L-triptofano-hidantoma) como sustrato.
La columna de "Relacion de actividad de D-Trp-hyd a L-Trp-hyd" indica la relacion de la actividad catalttica de la hidantoinasa mutante para transformar la D-5-indolilmetilhidantoma frente a la actividad de la hidantoinasa mutante para transformar la L-5-indolilmetilhidantoma y muestra el numero de veces de exceso de preferencia por cada enantiomero. En otras palabras, la columna "Relacion de actividad de D-Trp-hyd a L-Trp-hyd" indica la enantioselectividad de la respectiva hidantoinasa.
La hidantoinasa de acuerdo con la presente invencion mostraba mayores tasas de transformacion con respecto a los compuestos de hidantoma 5-sustituida, en particular la D-triptofano-hidantoma. Por lo tanto, los mutantes de hidantoinasa de acuerdo con la presente invencion descritos en la presente memoria se consideraban adecuados en un procedimiento para la produccion de D-aminoacidos, en particular D-triptofano, partiendo de la D-triptofano- hidantoma usando la hidantoinasa mutante de acuerdo con la presente invencion, asf como la D-carbamoilasa.
Tabla 1. Lista de los cebadores y sus secuencias. El nombre del cebador indica el sitio diana para las bibliotecas mutantes enfocadas.
Posicion(es) de aminoacido (F = cebador directo; R = cebador inverso)
SEQ ID NO: Proposito Secuencia
Y72 (F)
21 ssm ATC TGA AGA ACC GGN NKG GCC GCT TCG AAC T
Y72 (R)
22 ssm AGT TCG AAG CGG CCM NNC CGG TTC TTC AGA T
I95 (F)
23 ssm CAT CGA GAT GCC GNN KAC CTT CCC GCC CAC
I95 (R)
24 ssm GTG GGC GGG AAG GTM NNC GGC ATC TCG ATG
V154(F)
25 ssm TGA TGG CAG CCT CAN NKC CGG GCA TGT TCG
V154 (R)
26 ssm CGA ACA TGC CCG GMN NTG AGG CTG CCA TCA
P155(F)
27 ssm TGG CAG CCT CAG TTN NKG GCA TGT TCG ACG
P155(R)
28 ssm GCG TCG AAC ATG CCM NNA ACT GAG GCT GCC A
G156 (F)
29 ssm CAG CCT CAG TTC CGN NKC AGC CTC AGT TCC G
G156(R)
30 ssm CGG AAC TGA GGC TGM NNC GGA ACT GAG GCT G
H316 (F)
31 ssm CCC TTG GGT CAG ACN NKG GCG GAC ATC CTG
H316(R)
32 ssm CAG GAT GTC CGC CMN NGT CTG ACC CAA GGG
A285(F)
33 ssm CGT ATA TGA AGG TCN NKC CGC CCG TCC GCT CA
A285(R)
34 ssm TGA GCG GAC GGG CGG MNN GAC CTT CAT ATA CG
V284(F)
35 ssm GAC CGT ATA TGA AGN NKG CGC CGC CCG TC
V284 (R)
36 ssm GAC GGG CGG CGC MNN CTT CAT ATA CGG TC
P94 (F)
37 ssm CAC CAT CAT CGA GAT GNN KAT AAC CTT CCC G
P94 (R)
38 ssm CGG GAA GGT TAT MNN CAT CTC GAT GAT GGT G
P98 (F)
39 ssm TGC CGA TAA CCT TCN NKC CCA CCA CCA CTT TGG
P98(R)
40 ssm CCA AAG TGG TGG TGG GMN NGA AGG TTA TCG GCA
P99 (F)
41 ssm CGA TAA CCT TCC CGN NKA CCA CCA CTT TGG AC
P99(R)
42 ssm GTC CAA AGT GGT GGT MNN CGG GAA GGT TAT CG
R71 (F)
43 ssm GGA TCT GAA GAA CNN KTA TGG CCG CTT CGA AC
R71 (R)
44 ssm GTT CGA AGC GGC CAT AMN NGT TCT TCA GAT CC
A152(F)
45 ssm CAA GTC AAT GAT GGC ANN KTC AGT TCC GGG C
A152 (R)
46 ssm GCC CGG AAC TGA MNN TGC CAT CAT TGA CTT G
F158(F)
47 ssm CAG TTC CGG GCA TGN NKG ACG CCG TCA GCG AC
F158(R)
48 ssm GTC GCT GAC GGC GTC MNN CAT GCC CGG AAC TG
R71 Y72 (F)
49 ssm combinatoria CAT GGA TCT GAA GAA CND TND TGG CCG CTT CGA ACT C
R71 Y72 (R)
50 ssm combinatoria GAG TTC GAA GCG GCC AHN AHN GTT CTT CAG ATC CAT G
A152 V154 (F)
51 ssm combinatoria GCT TCA AGT CAA TGA TGG CAN DTT CAN DTC CGG GCA TGT TCG AC
A152 V154 (R)
52 ssm combinatoria GTC GAA CAT GCC CGG AHN TGA AHN TGC CAT CAT TGA CTT GAA GC
V284 A285 (F)
53 ssm combinatoria GGA CCG TAT ATG AAG NDT NDT CCG CCC GTC CGC TC
V284 A285 (R)
54 ssm combinatoria GAG CGG ACG GGC GGA HNA HNC TTC ATA TAC GGT CC
I65 (F)
55 ssm GAA CAT GTG CAT ATC NNK GAC ATG GAT CTG AAG
I65 (R)
56 ssm CTT CAG ATC CAT GTC MNN GAT ATG CAC ATG TTC
Posicion(es) de aminoacido (F = cebador directo; R = cebador inverso)
SEQ ID NO: Proposito Secuencia
HyuH_R
57 cebador inverso espedfico de gen de HyuH TCA CTT CGA CGC CTC GTA GTC G
HyuH_GS_F
58 cebador directo espedfico de gen para epPCR ATG TTT GAC GTA ATA GTT AAG AAC TGC CG
SeSaMR_HyuHR2
59 construccion de biblioteca SeSaM GTG TGA TGG CGT GAG GCA GCC TAC TGC CGC CAG GCA AAT TCT
SEeSaMF_carbAF
60 construccion de biblioteca SeSaM CAC ACT ACC GCA CTC CGT CGC GTC AGC CAC AGC ACT ACG G
S14 (F)
61 OmniChange cgtatggtgtccNNKGACGGAATCACCGAG
S14 (R)
62 OmniChange ggacaccatacgGCA GTT CTT AAC TAT TAC G
S37(F)
63 OmniChange agctcggacacaNNKGATGTTGAGGCGAG
S37(R)
64 OmniChange tgt gtc cga get GAT TGC GGC G
S153 V154 (F)
65 ssm combi GTCAATGATGGCAAGTNDTDNYCCGGGCATGTTCGACG
S153 V154 (R)
66 ssm combi CGT CGA ACA TGC CCG GRN HAH NAC TTG CCA TCA TTG AC
S14 D15(F)
67 ssm combi CCGTATGGTGTCCBBTNNKGGAATCACCGAGG
S14 D15 (R)
68 ssm combi CCT CGG TGA TTC CMN NAV VGG ACA CCA TAC GG
C64I (F)
69 sdm GAACATGTGCATATCATCGACATGGATCTGAAGA
C64I(R)
70 sdm TCT TCA GAT CCA TGT CGA TGA TAT GCA CAT GTT C
S152A (F)
71 sdm CAA GTC AAT GAT GGC AGC CTC AGT TCC GGG CAT G
S152A (R)
72 sdm CAT GCC CGG AAC TGA GGC TGC CAT CAT TGA CTT G
Tabla 2: Resumen de la actividad y selectividad de todos los mutantes HyuH.
Nombre del mutante
ciclo de mutagenesis Sustituciones Relacion de actividad de D-Trp-hyd a HyuH nat Relacion de actividad de L-Trp-hyd a HyuH nat Relacion de actividad de D-Trp-hyd a L-Trp-hyd
P2.2
SSM -195 I95H —1,2 -1,2 -1
P3.1
SSM - V154 V154G -1,3 -1,3 -1
P6.1
SSM - V154 V154N —1,3 -1,3 -1
P15.2
SSM - R71 R71Q 1,0 1,0 0,97
P24.3
SSM - R71 R71D 1,9 1,9 1,76
P25.2
SSM - R71 R71E 1,9 1,2 1,58
P32.2
SSM - A152 A152G 4,0 0,9 4,61
P33.18
SSM - A152 A152T 3,3 1,0 3,21
P34.8
SSM - V284 V284F 1,8 1,1 1,60
P37.1
SSM - A285 A285D 1,1 0,2 6,19
P3.11
SSM - V154 V154A 2,0 0,67 3,03
P7.3
epPCR I64T 2,1 0,31 6,87
P7.4
epPCR I64V 1,9 0,54 3,49
P10.1
epPCR V154S 1,6 0,34 4,84
P18.1
epPCR V154A, T398A, H452L 1,4 0,29 4,89
Nombre del mutante
ciclo de mutagenesis Sustituciones Relacion de actividad de D-Trp-hyd a HyuH nat Relacion de actividad de L-Trp-hyd a HyuH nat Relacion de actividad de D-Trp-hyd a L-Trp-hyd
P52.2
SSM combi A152S, V1541 7,26 0,43 16,76
P52.7
SSM combi A152V, V154C 1,38 0,23 6,07
P53.2
SSM combi A152C, V154S 6,49 0,44 14,86
P53.3
SSM combi A152S 5,09 0,95 5,34
P56.3
SSM combi R71D, Y72H, A152S 5,26 0,37 14,33
P56.9
SSM combi R71V, Y72N, A152S 4,03 0,19 20,74
P59.1
SSM combi R71S, Y72N,A152C, V154S, V181 A 3,73 0,13 29,79
P60.5
SSM combi R71D, Y72N, A152S 3,73 0,07 54,61
P61.1
SSM combi R71Y, Y72N, A152S 4,13 0,03 131,16
P62.1
SSM combi R71L, A152C, V154S 4,79 0,13 36,85
P62.2
SSM combi R71Y, Y72H, A152S 3,66 0,06 57,15
P76.1
SSM5 -164 I64V, R71I, Y72N, A152S 10,97 0,04 245,23
P83.2
SSM5 -164 I64C, R71Y, Y72N, A152S 6,76 0,08 89,72
P84.1
SSM5 -164 I64C, R71D, Y72H, A152S 4,48 0,13 34,57
P106.2
epPCR2 I64C, R71D, Y72H, A152S, F448L 6,05 0,06 93,63
P110.1
epPCR2 I64C, R71D, Y72H, A152S, M417V 5,62 0,14 39,90
P111.1
epPCR2 S14G, I64C, R71D, Y72H, A152S 3,50 0,15 23,11
P112.1
epPCR2 S37R, I64C, R71D, Y72H, A152S 3,74 0,14 26,68
P119.1
epPCR2 S14G, I64C, R71D, Y72H, A152S, E358K 9,12 0,05 181,46
P121.1
epPCR3 S37R, I64C, R71D, Y72H, A152S, V318A 10,15 0,08 120,79
P128.1
epPCR3 S37R, I64C, R71D, Y72H, A152S, N303S, Q404R 9,50 0,07 136,72
P130.1
epPCR3 S14G, I64C, R71D, Y72H, A152S, N70D 4,93 0,06 76,53
P132.3
epPCR3 S14G, I64C, R71D, Y72H, A152S, V154A 5,31 0,01 480,31
P137.1
Omnichange S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S 21,47 0,20 150,97
P138.1
Omnichange S14A, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S 21,13 0,20 180,00
P140.1
Omnichange S14V, I64C, R71D, Y72H, A152S 21,42 0,20 186,89
P140.2
Omnichange S14G, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S 21,49 0,20 187,98
P143.1
Omnichange S14A, S37W, 164C, R71D, Y72H, A152S 17,06 0,16 230,36
P143.2
Omnichange S14A, S37V, I64C, R71D, Y72H, A152S 19,97 0,19 187,91
P143.3
Omnichange D15N, I64C, R71D, Y72H, A152S 20,61 0,19 160,71
P143.4
Omnichange S14V, S37R, I64C, R71D, Y72H, A152S 20,58 0,19 171,64
P146.1
SSM combi 3 D15N, I64C, R71D, Y72H, A152S, V154C 4,61 0,04 129,72
P148.3
SSM combi 3 D15N, I64C, R71D, Y72H, A152S, V154I 4,18 0,07 60,60
P152.4
SSM combi 4 S14P, D15G, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S 11,63 0,21 56,37
P152.5
SSM combi 4 S14G, D15R, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S 16,92 0,06 277,95
P153.2
SSM combi 4 S14G, D15Q, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S 12,75 0,00 5069,66
P153.3
SSM combi 4 S14F, D15A, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S 10,46 0,10 110,01
P156.1
SSM combi 4 D15S, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S 6,75 0,17 38,67
P161.7
SDM C64I S14P, D15G, S37G, R71D, Y72H, A152S 4,01 0,08 52,00
P161.9
SDM S152A S14P, D15G, S37G, I64C, R71D, Y72H 2,42 0,06 41,82
Nombre del mutante
ciclo de mutagenesis Sustituciones Relacion de actividad de D-Trp-hyd a HyuH nat Relacion de actividad de L-Trp-hyd a HyuH nat Relacion de actividad de D-Trp-hyd a L-Trp-hyd
P162.9
SDM S152A D15S, S37G, I64C, R71D, Y72H 3,19 0,10 31,84

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    1. - Hidantoinasa que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada de (i) o (ii), con
    (i) secuencia de aminoacidos seleccionada de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID

    NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID

    NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID

    NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID

    NO: 83, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID
    NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, o SEQ ID NO: 119,
    (ii) secuencia de aminoacidos en donde en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID
    NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 73, SEQ ID
    NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID
    NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID
    NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ
    ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, o SEQ ID NO: 119, de 1 a 9 restos de aminoacidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o anadido, en donde, sin embargo se mantiene/mantienen la o las sustituciones de las secuencias anteriores con respecto a las secuencia de referencia SEQ ID NO: 1,
    y en donde 9 se define como 9 = 75,
    y en donde ademas la actividad catalftica de la hidantoinasa es mayor en un factor de al menos Z que la actividad catalftica de la hidantoinasa que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1,
    y en donde Z se define como Z = 1,2,
    y en donde la actividad catalftica de una hidantoinasa debe entenderse como la actividad catalftica de esta enzima con respecto a la transformacion de un compuesto de D-hidantoma 5-sustituida en el correspondiente D- carbamoilaminoacido.
  2. 2. Hidantoinasa segun la reivindicacion 1, en donde 9 se selecciona de 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1.
  3. 3. Hidantoinasa segun la reivindicacion 1, en donde Z se selecciona de 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 o 30.
  4. 4. Hidantoinasa segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la hidantoinasa transforma al menos
    una de los siguientes sustratos hidantoma, 5-metilhidantoma, 5-bencilhidantoma, 5-(4-hidroxibencil)hidantoma, 5- indolilmetilhidantoma, 5-(3,4-dihidroxibencil)hidantoma, 5-metiltioetilhidantoma, 5-isopropilhidantoma, 5-
    isobutilhidantoma, 5-sec-butilhidantoma, 5-(4-aminobutil)hidantoma, 5-hidroximetilhidantoma, o un compuesto de hidantoma 5-sustituida que corresponde a un aminoacido no natural, respectivamente un derivado del mismo, en el respectivo carbamoilaminoacido, en donde la actividad catalftica de la hidantoinasa con respecto a la transformacion de dicho sustrato es al menos tan alta como la actividad catalftica de la hidantoinasa que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1 con respecto a la transformacion de la D-5-indolilmetilhidantoma.
  5. 5. Hidantoinasa segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la enantioselectividad para la D- hidantoma es mayor en un factor de al menos 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100 o 150 que la enantioselectividad de la hidantoinasa que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.
  6. 6. Polinucleotido que codifica cualquiera de las hidantoinasas de las reivindicaciones 1 a 5.
  7. 7. Vector que comprende el polinucleotido segun la reivindicacion 6.
  8. 8. Celula hospedante aislada o transformada que comprende el polinucleotido segun la reivindicacion 6, o el vector segun la reivindicacion 7.
  9. 9. Celula hospedante segun la reivindicacion 8, que expresa al menos las actividades enzimaticas seleccionadas de las siguientes: hidantoinasa; hidantoinasa e hidantoma racemasa; hidantoinasa y carbamoilasa; o hidantoinasa e hidantoma racemasa y carbamoilasa.
  10. 10. Procedimiento para preparar aminoacidos que comprende las etapas de
    5
    10
    15
    20
    25
    (a) proporcionar actividad de hidantoinasa de una hidantoinasa segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y actividad de carbamoilasa y al menos una hidantoma 5-sustituida al medio de reaccion, y opcionalmente proporcionar actividad de hidantoma racemasa a dicho medio de reaccion;
    (b) incubar el medio de reaccion con el fin de permitir la transformacion de la hidantoma 5-sustituida en los respectivos aminoacidos mediante las actividades enzimaticas proporcionadas en (a); y
    (c) recuperar los aminoacidos obtenidos de la transformacion enzimatica de la respectiva hidantoma 5-sustituida del medio de reaccion.
  11. 11. Procedimiento segun la reivindicacion 10, en donde dicha hidantoma 5-sustituida se selecciona de D,L- hidantoma 5-sustituida, D,L-5-indolilmetilhidantoma ( = D,L-triptofano-hidantoma), D-hidantoma 5-sustituida, D-5- indolilmetilhidantoma ( = D-triptofano-hidantoma).
  12. 12. Procedimiento segun la reivindicacion 10 u 11, en donde dicha hidantoma 5-sustituida proporcionada al medio de reaccion es L-hidantoma 5-sustituida o D,L-hidantoma 5-sustituida, y en donde ademas se proporciona actividad de hidantoma racemasa al medio de reaccion en la etapa (a) para transformar la L-hidantoma 5-sustituida o D,L- hidantoma 5-sustituida en D-hidantoma 5-sustituida.
  13. 13. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde el aminoacido que se va a preparar es el D-triptofano y en donde la hidantoma 5-sustituida se selecciona de D-5-indolilmetilhidantoma, L-5- indolilmetilhidantoma o D,L-5-indolilmetilhidantoma.
  14. 14. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, en donde el medio de reaccion es un medio que consiste parcial o enteramente en medio de cultivo celular y en donde la actividad de hidantoinasa es proporcionada por una celula hospedante segun la reivindicacion 8 o 9, y en donde la celula hospedante se cultiva en dicho medio de reaccion
  15. 15. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en donde el medio de reaccion es un medio que consiste parcial o enteramente en medio de cultivo celular y la actividad de carbamoilasa es proporcionada por una celula hospedante segun la reivindicacion 8 o 9 o por una segunda celula hospedante, en donde dicha celula o celulas hospedantes se cultivan en dicho medio de reaccion.
    imagen1
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