KR101814024B1 - 바실러스 균주, 이 균주가 생산하는 효소 및 이의 응용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 정제염의 존재 하에서 가수분해 활성은 유지되지만, 전이 활성이 억제되는 감마-글루타밀트랜스펩티다아제를 생산하는 균주, 이 균주에 의해서 생산되는 감마-글루타밀트랜스펩티다아제 및 이 효소의 식품 공학적 응용에 관한 것이다. 본 발명의 감마-글루타밀트랜스펩티다아제를 사용하여 글루타민을 함유하는 식용 단백질 기질과 반응시켜, 기질 내의 글루탐산의 함량을 증가시킬 수 있어, 식용 단백질의 정미 특성을 향상시킬 수 있다.

Description

바실러스 균주, 이 균주가 생산하는 효소 및 이의 응용{Bacillus Strain, Enzyme Produced by the Strain and Application Thereof}

본 발명은 미생물 균주 및 이 미생물 균주가 생산하는 효소에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 새로운 특성의 감마-글루타밀트랜스펩티다아제를 생산하는 미생물 균주, 이 균주가 생산하는 감마-글루타밀트랜스펩티다아제 및 이의 산업적 응용에 관한 것이다.

천연계 조미료는 제법에 따라 크게 추출형과 분해형으로 분류된다. 그 중에서도 추출형은 다양한 식품 원료로부터 향미 성분을 추출하여 엑기스화한 제품으로 축육 엑기스, 수산 엑기스, 야채 엑기스, 및 효모 엑기스를 예로 들 수 있다. 최근에는 엑기스가 가진 독특한 풍미에 한정되지 않고 그 이상의 맛, 기능성을 요구하기 때문에 펩타이드계의 분해형 조미료 개발이 이루어지고 있다. 분해형 조미료로는 화학적 산 처리를 통한 가수분해형(HVP, Hydrolyzed Vegetable Protein), 단백질 가수분해 효소를 이용하여 단백질을 가수분해하여 얻어지는 효소가수분해형 (eHVP, enzymatically Hydrolyzed Vegetable Protein)으로 분류된다.

소맥 글루텐 등 식용 단백질을 단백질 분해 효소로 분해하여 얻어지는 효소가수분해형 조미료 (eHVP)의 개발을 위해서는 단백질을 펩타이드로 분해하는 endo protease의 처리와 더불어서 감칠맛 성분인 글루탐산(glutamatic acid)의 함량을 증가시키기 위하여 펩타이드를 아미노산으로 분해하기 위한 exo-peptidase를 처리해준다. 이때 펩타이드에 포함된 아미노산인 글루타민(glutamine)을 가수분해하여 글루탐산으로 전환하는 글루타민 가수분해효소(glutaminase, EC 3.5.1.2) 처리를 통해 최종 eHVP 제품 내 글루탐산 함량을 높일 수 있다.

감마-글루타밀트랜스펩티다아제(gamma-Glutamyltranspeptidase, EC 2.3.2.2, 이하 GGT로 약칭하는 경우가 있다)는 글루타민이나 글루타치온(glutathione)에 함유된 감마-글루타밀기를 가수분해하거나 감마-글루타밀기를 다른 아미노산 또는 펩타이드의 아미노기에 전이하는 효소이다(Tate 등, Mol . Cell . Biochem . (1981) 39:357-368). 감마-글루타밀트랜스펩티다아제는 하나의 유전자에서 발현된 후 autolysis process를 통해 38-72 kDa 크기의 large subunit과 20-66 kDa 크기의 small subunit으로 분리되는 hetero-dimer 구조를 가지고 있다. 감마-글루타밀트랜스펩티다아제의 전이 활성을 이용하여, 감마-글루타밀트랜스펩티다아제는 다양한 감마-글루타밀 화합물(대표적으로 감마-글루타밀 타우린(γ-glutamylglutamine), theanine (γ-L-glutamylethylamide))의 생산에 사용되고 있다(Suzuki 등, Enzyme Microb. Technol. (2002) 30:883-888.).

이와 더불어 감마-글루타밀트랜스펩티다아제가 가지는 글루타민에 대한 가수분해활성을 이용하는 연구가 진행되고 있다. 구체적으로, 이 효소의 가수분해활성을 통하여, 글루타민으로부터 우아미(umami) 성분인 글루탐산 염(glutamate)을 만드는 활성을 이용하여 정미성 소재의 생산에 대한 적용연구가 진행 중이다. 일예로 B. subtilis 유래 내염성 GGT를 soy source fermentation에 사용하여 글루탐산 염 의 함량 증대에 관한 연구가 진행되었으며, 전이활성으로 인해 글루탐산의 함량이 줄어드는 것을 방지하기 위하여 전이활성이 감소된 변이체 효소 개발을 진행하였다 (Kizima et al. Enzyme and Microbial Technology (2007) 41, 80-84). 그러나 이와 같은 변이체 효소의 경우 식품용 효소로 사용되는데 한계를 가지므로 글루타민의 가수분해활성과 전이활성이 반응 조건에 의해서 조절될 수 있는 신규 감마-글루타밀트랜스펩티다아제의 개발이 요구된다.

본 발명은 가수분해 활성과 전이 활성이 조절된 신규한 감마-글루타밀트랜스펩티다아제를 생산하는 미생물 균주 및 이 미생물 균주에 의해 생산되는 펩타이드를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물 균주에 의해 생산되는 펩타이드를 코딩하는 핵산, 이 핵산이 삽입된 재조합 발현 벡터 및 형질 전환체를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 형질 전환체를 이용하여 정미 특성이 개선된 소재를 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

전술한 목적을 가지는 본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 감마-글루타밀트랜스펩티다아제를 생산하는 바실러스 아밀로리퀴페시언스( Bacillus amyloliquefaciens)　 균주 S0904 (기탁번호: KFCC 11684P)를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열식별번호: 2의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드를 제공한다.

예를 들어, 상기 펩타이드는 감마-글루타밀트랜스펩티다아제의 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열식별번호:3의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공한다.

예를 들어, 상기 핵산은 서열식별번호: 3의 염기 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 핵산이 삽입된 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체에 의해 생산된 서열식별번호:2의 펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 펩타이드를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열식별번호:2의 펩타이드를 함유하는 효소액을 준비하는 단계; 상기 효소액에 식용 단백질 기질(substrate)을 첨가하는 단계; 및 상기 펩타이드에 의하여 상기 식용 단백질 기질에 포함된 글루타민의 글루타밀기를 가수분해하는 단계를 포함하는 정미성 소재를 제조하는 방법을 제공한다.

예를 들어, 상기 식용 단백질 기질은 글루텐일 수 있으며, 상기 가수분해하는 단계는 40 내지 60℃의 온도, pH 6 내지 8, 정제염 농도 1 내지 3M의 조건에서 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 형질전환체를 배양하는 단계; 상기 형질전환체에 의해 생산된 서열식별번호:2의 펩타이드를 함유하는 반응액에 식용 단백질 기질(substrate)을 첨가하는 단계; 상기 펩타이드에 의하여 상기 식용 단백질 기질에 포함된 글루타민의 글루타밀기를 가수분해하는 단계를 포함하는 정미성 소재를 제조하는 방법을 제공한다.

이때, 상기 배양하는 단계에서 사용된 배양액에 탄소원과 질소원이 포함되어 있으며, 상기 탄소원은 당밀(molasses)이고, 상기 질소원은 트립톤(typtone), 펩톤(peptone), 폴리펩톤(polypeptone), 소이톤(soytone), 옥수수 침지액(cone steep liquor) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.

본 발명에서는 새로운 감마-글루타밀트랜스펩티다아제를 생산하는 미생물 균주, 이 균주에 의하여 생성되는 감마-글루타밀트랜스펩티다아제 및 이 효소를 이용하여 정미성이 개선된 소재를 제조하는 방법을 제안한다.

본 발명에 따라 확인된 감마-글루타밀트랜스펩티다아제는 특히 정제염이 존재하는 조건에서 가수부내 활성이 손실되지 않으면서 전이 활성만이 감소된다. 따라서 글루타민을 함유하는 적절한 기질을 본 발명의 감마-글루타밀트랜스펩티다아제와 반응시키면 글루탐산의 함량이 향상된 효소 분해물로서의 정미성 소재를 생산할 수 있다. 본 발명에 따라 얻어진 효소 분해물의 경우 고함량의 글루탐산에 의한 높은 정미성의 특성을 가졌기 때문에 본 발명의 가수분해물은 천연 정미성 소재로서 응용 식품분야에 다양한 목적으로 활용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 신규한 미생물 균주가 생산하는 감마-글루타밀트랜스펩티다아제(BAGGT)가 삽입된 재조합 E. coli 플라스미드 벡터 pET28a-6xHΔBAGGT의 개열도이다.
도 2는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 재조합 E. coli BL21(DE3)/ pET28a-6xHΔBAGGT 플라스미드 벡터로부터 생산된 재조합 BAGGT의 정제 과정 별 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 사진이다. 도면에서 T는 총 단백질 분획, S는 수용성 단백질 분회, E는 정제된 BAGGT를 나타내고, M은 마커(marker)이다.
도 3은 본 발명의 다른 예시적인 실시예에 따라 재조합 BAGGT의 활성 변화를 측정한 결과를 도시한 그래프이다. (A)는 BAGGT 효소의 정제염 존재 여부 및 pH 변화에 따른 가수분해 활성 변화를 측정한 그래프이고, (B)는 BAGGT 효소의 정제염 존재 여부 및 pH 변화에 따른 전이 활성 변화를 측정한 그래프이다. ●는 정제염인 NaCl이 없는 조건이고, ○는 1.5M NaCl이 존재하는 조건을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 신규한 미생물 균주가 생산하는 감마-글루타밀트랜스펩티다아제(BAGGT)가 삽입된 재조합 B. subtilis 플라스미드 벡터 UBRTAG-BAGGT의 개열도이다.
도 5는 본 발명의 다른 예시적인 실시예에 따라 재조합된 BAGGT를 이용하여 글루탐산의 함량이 증가되어 정미 특성이 향상된 단백질 분해 산물(예를 들어 식품)을 제조하는 과정을 개략적으로 도시한 모식도이다.

이하, 필요한 경우에 첨부하는 도면을 참조하면서 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 전체적으로 글루타민(glutamine)을 글루탐산(glutamic acid)으로 가수분해하는 활성과 감마-글루타밀기(γ-Glutamyl group)를 다른 아미노산의 아미노기(amino group)에 전이하여 감마-글루타밀 펩타이드(?-Glutamyl peptide)를 합성하는 전이 활성을 가지는 신규한 감마-글루타밀 트랜스펩티다아제(?-Glutamyltranspeptidase)를 생산하는 미생물 균주, 이 미생물 균주가 생산하는 감마-글루타밀트랜스펩티다아제 및 이의 응용에 관한 것이다.

본 발명자들은 전통 식품인 된장에서 분리한 바실러스 속 균주 중에서 가수분해 활성이 우수한 바실러스 균주를 선별하고, 이 균주의 16s rRNA 서열(서열식별번호:1) 분석 결과 기존의 Bacillus amyloliquefaciens 균주의 16s rRNA 서열과 비교해서 완전히 동일하지 않은 것을 확인하였다. 이 균주를 바실러스 아밀로리퀴페시언스( Bacillus amyloliquefaciens)　 균주 S0904로 명명하였으며, 2016년 8월 16일 한국미생물보존센터에 기탁하였다(기탁번호: KFCC 11684P).

또한, 기탁된 바실러스 아밀로리퀴페시언스 S0904 균주에 의해 발현되는 펩타이드 중에서 Bacillus amyloliquefaciens 균주가 생산하는 감마-글루타밀트랜스펩티다아제(gamma-gluatamyltranspeptidase; GGT)에 대한 서열 성동성 분석을 통하여 기존의 감마-글루타밀트랜스펩티다아제의 아미노산 서열과 차이가 있다는 점을 확인하였다. 본 발명에 따라 바실러스 아밀로리퀴페시언스 S0904 균주가 생산하는 감마-글루타밀트랜스펩티다아제(이하, 본 명세서에서 BAGGT로 약칭하는 경우가 있다)는 서열식별번호:2의 아미노산 서열로 이루어진다. 일예로, BAGGT를 코딩하는 유전자는 서열식별번호:3의 염기 서열로 이루어지는 핵산일 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 '펩타이드(peptide)'라는 용어는 자연적으로 존재하는 것으로부터 분리하였거나, 재조합기술(recombinant techniques)에 의해 또는 화학적으로 합성된 단백질, 단백질의 절편 및 펩타이드를 모두 포함한다.

본 명세서에서 '핵산(nucleic acid)’이라는 용어는 DNA(예를 들어 cDNA) 및 RNA를 포괄적으로 포함하는 의미로서, 천연의 뉴클레오티드(아데닌, 티민, 구아닌, 사이토신, 우라실) 외에도 뉴클레오티드를 구성하는 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)를 포함하는 의미이다(예를 들어, Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)).

특히, 본 발명에 따른 BAGGT인 펩타이드나 이를 코딩하는 핵산이 전술한 서열식별번호:2에 기재된 아미노산 서열이나 서열식별번호:3에 기재된 염기 서열만으로 한정되는 것은 아니다. 주지된 것처럼, 핵산 분자의 코돈(codon)은 대부분 2개 이상의 아미노산을 코딩하도록 축퇴(degeneracy)되어 있는 관계로, 전술한 핵산의 염기 서열에서의 변이가 일어나더라도 최종적으로 동일한 단백질이 발현되는 경우가 많다. 뿐만 아니라 후술하는 것처럼 펩타이드를 구성하는 아미노산이 다른 아미노산으로 변이되더라도 동일한 기능을 가질 수 있다는 점은 잘 알려져 있다. 즉, 본 발명은 서열식별번호:3의 염기 서열로 구성되는 핵산 이외에도, 서열식별번호:2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드와 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈은 물론이고, 서열식별번호;2의 펩타이드와 생물학적으로 균등한 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 특히, 본 발명에 따른 펩타이드를 코딩하기 위해서 제공되는 핵산 서열에는 펩타이드의 발현을 위하여 필요한 전사 조절 서열 등이 포함되는 재조합 핵산일 수도 있다. 펩타이드를 코딩하는 핵산은 유전자 재조합 기술을 사용하여, 예를 들어 적절한 벡터 사이에 삽입하거나 PCR 기법 등을 통해서 제작, 증폭시킬 수 있으며, 또는 화학적 합성법에 의해서 합성할 수 있다.

특히, 단백질을 이루는 아미노산이 변형되더라도 해당 단백질의 생물학적 기능에 전혀 영향을 미치지 않거나 오히려 원래의 단백질의 기능을 강화하기도 한다는 점은 잘 알려져 있다. 이러한 의미에서 본 발명과 관련해서 사용될 수 있는 펩타이드는 서열식별번호:2의 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산이 치환 및/또는 추가된 서열로 이루어질 수 있다. 이와 같은 이른바 ‘보존적 치환(conservative substitution)’은 특히 아미노산 곁사슬(side chain) 치환기의 소수성/친수성, 크기, 전하 여부와 같은 상대적인 유사성에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 각각의 아미노산 곁사슬에 따른 소수성 인덱스(hydropathic index)라든가 친수성 값(hydrophilic value) 등을 고려하여 보존적 치환 여부를 고려해 볼 수 있다. 예를 들어 소수성 아미노산인 알라닌(A), 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 티로신(W), 트립토판(W), 프롤린(P) 사이의 변이; 친수성 아미노산인 라이신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 아스파르트산(D), 아스파라진(N), 시스테인(C), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T) 사이에서의 변이; 지방족 측쇄를 갖는 아미노산인 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 프롤린(P) 사이에서의 변이; 수산기를 포함하는 측쇄를 가지는 아미노산인 세린(S), 트레오닌(T) 및 티로신(Y) 사이에서의 변이; 염기를 포함하는 측쇄를 갖는 아미노산인 아르기닌(R), 라이신(K) 및 히스티딘(H) 사이에서의 변이, 카르복실산과 아미드를 포함하는 측쇄를 갖는 아미노산인 아스파르트산(D), 아스파라긴(N), 글루탐산(E), 글루타민(Q) 사이에서의 변이; 황 원자를 포함하는 측쇄를 갖는 아미노산인 시스테인(C) 및 메티오닌(M) 사이에서의 변이; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산인 히스티딘(H), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W) 사이에서의 변이를 갖는다. 아울러, 알라닌(A), 글리신(G) 및 세린(S)은 유사한 크기를 갖는다는 점에서 단백질의 활성에 큰 변화가 없는 변이체를 이룰 수 있다.

대표적으로는 (1) 알라닌(A)/글리신(G), (2) 아스파르트산(D)/글루탐산(E), (3) 아스파라긴(N)/글루타민(Q), (4) 라이신(K)/아르기닌(R), (5) 류신(L)/이소류신(I)/발린(V)/메티오닌(M), (6) 페닐알라닌(F)/티로신(Y)/트립토판(W), (7) 세린(S)/트레오닌(T), (8) 시스테인(C)/메티오닌(M) 사이에서의 변이이다.

서열식별번호:2의 펩타이드와 관련해서 대체가능한 변이체가 사용될 수 있다. '대체가능한 변이체(substitutional variant)' 는 아미노산 서열 중에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 대체 또는 결실되었으나 정제염이 존재하는 조건에서 감마-글루타밀트랜스펩티다아제의 가수분해 활성은 유지되지만, 전이 활성은 감소하는 분자를 의미할 수 있다. 대체가능한 변이체의 아미노산 서열은 원래의 아미노산 서열과 적어도 80%의 상동성(identity)을 갖는 것이 바람직하며 적어도 90% 이상의 동일성을 갖는 것이 더욱 바람직하다.

결국, 전술한 아미노산 사이의 균등한 생물학적 활성을 갖는 변이를 고려한다면 본 발명과 관련된 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산이 서열목록에 기재된 것과 실질적으로 균등한 활성을 갖는 펩타이드 또는 핵산도 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열식별번호:2의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산이 삽입된 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 발명과 관련해서 전술한 펩타이드를 직접 숙주 세포 내로 트랜스펙션(transfection)할 수도 있으나, 그 펩타이드를 코딩하는 핵산이 숙주 세포 내로 도입되는 방법을 고려해 볼 수 있다. 예를 들어 본 발명에 따른 펩타이드를 코딩하는 핵산이 적절한 벡터 내에 클로닝(cloning)될 수 있도록 삽입될 수 있다.

"벡터(vector)" 는 숙주세포에 전달이 가능하며 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 목적하는 유전자 또는 서열의 발현도 가능하도록 만들어진 구조물을 의미한다. 예를 들면 벡터에는 바이러스 벡터(viral vectors), DNA 또는 RNA 발현 벡터(expression vectors), 플라스미드(plasmid), 코스미드(cosmid) 또는 파지벡터(phage vectors), CCA(cationic condensing agents)와 연결된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀(liposomes)으로 포장된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 프로듀서 세포(producer cells)와 같은 특정 진핵세포(eukaryotic cells) 등이 포함된다.

이러한 의미에서 본 발명에 따른 펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터로서는 염색체, 에피솜 및 유도된 바이러스와 같은 수많은 발현 시스템이 사용될 수 있다. 보다 구체적으로 사용할 수 있는 재조합 벡터로는 세균성 플라스미드, 트랜스포숀, 효모 에피솜, 삽입 인자, 효모 염색체 인자, 바큘로바이러스와 같은 바이러스, SV40과 같은 유두종바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노- 부속 바이러스, 레트로바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스 로부터 유래한 것이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 재조합 벡터는 또한 코스미드 또는 파지미드 유도체일 수 있다.

이때, 예를 들어 펩타이드를 코딩하는 핵산이 DNA인 경우에는 이른바 ‘naked DNA’ 방법을 활용하거나 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터를 활용할 수 있으며, 원핵세포 또는 진핵세포를 대상으로 하는 벡터로서 서열식별번호:2의 펩타이드를 코딩하는 핵산이 발현 가능한 형태로 포함될 수 있다. 본 명세서에서 ‘발현 가능한 형태로’라는 용어는 핵산이 숙주 세포에 도입되면, 서열식별번호:2의 펩타이드가 생체내에서 발현되는 것을 의미한다.

만약, 벡터를 사용하는 경우에는 전사를 진행할 수 있는 강력한 프로모터(promoter)를 사용할 수 있으며, 원핵세포를 숙주로 하는 경우라면 벡터는 펩타이드로의 번역을 개시하기 위하여 리보솜 결합 부위(RBC) 및 전사/번역 종결 서열을 포함할 수 있다. 원핵세포를 대상으로 제작되는 벡터에 포함될 수 있는 프로모터로는 tac 프로모터, lac 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터 등 일반적으로 공지된 임의의 프로모터를 사용할 수 있다. 이와 같은 플라스미드 벡터로서는 당업계에서 일반적으로 사용되는 플라스미드, 예를 들어 pSC101, pBR322, pUC19, pET-22, pET-28, pET-29, p-UBRTAG 등을 사용할 수 있다. 일례로 본 발명의 실시예에서는 E. coli BL21(DE3) 발현 벡터인 pET-28a와 Bailllus subtilis 발현 벡터인 p-UBRTAG 플라스미드 벡터를 사용하였지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

반면, 진핵세포를 숙주로 하는 경우라면 포유동물 세포에서 유래된 프로모터(메탈로티아닌 프로모터) 라든가 포유동물 바이러스에서 유래된 프로모터를 사용할 수 있다. 다시 말하면, 본 발명의 벡터로서 바이러스를 사용하고자 하는 경우, 서열식별번호:2의 펩타이드를 코딩하는 핵산을 발현시키기 위해서 백시니아(vaccinia) 또는 플로폭스(flowpox)와 같이 약독화된 바이러스는 물론이고 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated virus) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 무독성 탄저병 독소 벡터 등을 들 수 있고, 이때, 예를 들어 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터와 같은 포유동물 바이러스 유래의 프로모터가 사용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 벡터는 발현되는 펩타이드의 정제를 용이하기 위해서 다른 서열과 융합(fusion)될 수 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6 x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6 x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 펩타이드는 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다. 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 칼럼 (Novagen, USA)을 이용하여 발현된 펩타이드를 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.

즉, 본 발명과 관련해서 서열식별번호:2의 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 숙주 세포 내로 전달시키기 위해 사용되는 벡터는 일종의 유전자 전달체로서, 목적하는 핵산 분자는 발현 조절 부위에 작동가능하게 연결된다. ‘작동가능하게 연결된(operably linked)'란, 목적하는 핵산의 발현 조절 부위(프로모터, 시그널 서열, 인핸서, 전사조절인자 결합 위치)와 다른 핵산 사이의 기능적인 결합을 의미한다.

따라서 본 발명에 따르면, 펩타이드를 코딩하는 핵산을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 임의의 유전자 전달체를 포함하는데, 이 유전자 전달체는 예를 들어 naked 재조합 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 또는 naked 재조합 핵산 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 상술한 벡터를 안정적으로 발현시키기 위해서 당업계에서 통상적으로 사용되는 숙주 세포를 활용할 수 있다. 예를 들어 E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 츄린겐시스(Bacillus Thuringiensis, BT), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스 속 균주(예를 들어 B. subtilis LKS87), 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 진핵 세포로서의 숙주 세포에는 사카로미세 세레비시아(Saccharomyce cerevisiae)와 같은 yeast 세포, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다. 이 숙주 세포는 서열식별번호:2의 펩타이드를 발현시키는 분리된 세포이거나 배양된 세포일 수 있다. 이 숙주 세포는 생식 세포이거나 체세포일 수 있으며, 줄기 세포 또는 분화된 세포일 수 있으며, 일례로 포유동물의 눈에서 유래된 세포일 수 있다.

한편, 본 발명에 따라 서열식별번호:2의 펩타이드를 코딩하는 핵산을 숙주 세포 내로 운반 또는 전달하기 위해서는 이미 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어 서열식별번호:2의 펩타이드를 코딩하는 핵산을 naked 재조합 DNA의 형태로 직접 또는 플라스미드 벡터나 바이러스 벡터 등을 통해서 숙주 세포 내부로 운반하기 위해서는 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 등을 통하여 핵산 분자를 세포내로 유입시킬 수 있다. 뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 기법으로서 또한 양이온성 리포좀을 사용하는 것을 고려해 볼 수 있다(Felgner, P.L. et al., Proc Natl Acad Sci USA 84：7413-7417 (1987)). 상업적으로 구입할 수 있는 양이온성 지질 제제에는 Tfx 50 (Promega 사) 또는 Lipofectamin 2000 (Life Technologies 사) 등이 있다.

예를 들어 본 발명에 따른 벡터를 원핵세포인 숙주 세포 내부로 운반하기 위해서, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580 (1983)), 전기천공법(Dower,W.J. et al. Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145 (1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 반면, 숙주 세포가 진핵세포인 경우라면 칼슘포스페이트 침전법(Graham, F. L. & van der Eb, A. J. Virology 52: 456467 (1973)), 전기 천공법(Neueumann, E., M. Schaefer-Ridder, Y. Wang, and P. H. Hofschneider, EMBO (Eur. Mol. Biol. Organ.) J. 1:841-845 (1982)), DEAE-덱스트란 처리법(GOPAL, T. V., Mol. Cell. Biol. 5: 1188-1190 (1985)), 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등의 방법을 사용할 수 있다.

서열식별번호:2의 펩타이드는 전술한 재조합 벡터를 이용하거나 화학적 합성을 통해 제조함으로써 분리, 회수될 수 있다. 예를 들어 재조합 방법을 이용하는 경우, 서열식별번호:2를 코딩하는 핵산이 삽입된 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 적절한 숙주 세포 내에서 서열식별번호:2의 펩타이드를 발현할 수 있다. 재조합 펩타이드를 정제하기 위하여 재조합 발현 벡터에 정제를 위한 affinity 서열(예를 들어, 6x HIS)과 같은 태그 서열이 연결될 수 있으며, 수용성의 숙주/벡터 시스템에서 얻은, 배양액으로 분비된 재조합 펩타이드를 포함하는 상등액을 시판되는 필터를 이용하여 농축시키고, 이 농축액을 친화 매트릭스(affinity matrix) 또는 이온교환수지(ion exchange resin) 등의 적절한 정제 매트릭스(purification matrix)를 이용하여 정제한다. 마지막으로 한 단계 또는 여러 단계의 역상(reverse phase) HPLC를 수행함으로써 순수한 재조합 펩타이드를 분리, 회수할 수 있다.

본 발명에서 확인한 바에 따르면, 서열식별번호:2의 펩타이드는 감마-글루타밀트랜스펩티다아제의 활성을 갖는다. 서열식별번호:2의 BAGGT는 pH 6 내지 8의 범위 및/또는 40 내지 60℃의 범위에서 양호한 활성을 나타낸다. 특히, BAGGT는 적절한 농도의 정제염, 예를 들어 1 내지 3 M 농도의 정제염이 존재하는 조건에서 글루타민을 함유하는 식용 단백질 기질과 반응하면, 기질 내에 존재하는 감마-글루타밀기를 가수분해하는 가수분해 활성은 유지되는 반면, 감마-글루타밀기를 다른 아미노산에 전이하는 전이 활성은 크게 억제, 감소된다. 이처럼 가수분해 활성은 유지되는 반면에 전이 활성이 억제되므로, 전이 활성으로 인하여 글루탐산의 함량이 감소되는 것을 방지할 수 있다.

따라서 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열식별번호:2의 펩타이드를 이용하여 식용 단백질 기질로부터 글루탐산의 함량이 증가된 정미성 소재를 제조하는 방법에 관한 것이다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 서열식별번호:2의 펩타이드를 함유하는 효소액을 준비하고, 이 효소액에 식용 단백질 기질을 첨가하면, 펩타이드에 의하여 식용 단백질 기질에 포함된 글루타민의 글루타밀기를 가수분해하여 기질 내에 함유된 글루탐산의 함량을 증가시키는 방법으로 정미성 소재를 제조할 수 있다.

식용 단백질 기질은 그 내부에 글루타민을 가지는 것이면 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들어 글루텐(gluten)이거나 탈지 대두와 같은 것을 들 수 있다.

또한, 식용 단백질 기질을 가수분해할 때, 본 발명에 따른 감마-글루타밀트랜스펩티다아제 이외에도 단백질 펩타이드로 분해하는 endo protease 및/또는 펩타이드를 아미노산으로 분해하는 exp-peptidase와 같은 단백질 분해효소(protease)가 추가적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질 분해 효소는 델보라아제(delvorase), 플라보자임(flavourzyme), 뉴트라아제(neutrase), 프로타멕스(protamex), 알칼라아제(Alcalase), 우마미자임(umamizyme), 키모트립신(?-chymotrypsin), 펩신(pepsin), 트립신(trypsin), 파파인(papain), 단백질분해효소 M(Protease M) 등이 사용될 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

일예로 식용 단백질 기질과 서열식별번호:2의 펩타이드의 반응을 통하여 식용 단백질 기질 내에 함유된 글루타밀기를 가수분해할 때, 40 내지 6060℃의 온도, pH 6 내지 8, 정제염 농도 1 내지 3M의 조건에서 대략 15 내지 80 시간 동안 수행될 수 있다. 이러한 조건에서 본 발명에 따른 감마-글루타밀트랜스펩티다아제의 활성이 최적으로 유지될 수 있으며, 특히 가수분해 활성은 유지되는 반면에 전이 활성이 억제되어 글루탐산의 함량이 증가된 정미성 소재를 제조할 수 있다. 본 발명에 따라 글루탐산 함량이 증가된 정미성 소재, 예를 들어 식품 소재는 액체 상태로 유통될 수도 있고, 농축시켜 페이스트 상태로 또는 건조시켜 분말 상태로, 이들의 기타 과립 상태 등의 적절한 형태로 유통될 수 있다.

다른 예시적인 실시형태에서, 서열식별번호:2의 펩타이드가 삽입된 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 배양하고, 이 형질전환체에 의해 생산된 서열식별번호:2의 펩타이드를 함유하는 반응액에 식용 단백질 기질을 첨가한 뒤, 펩타이드와 식용 단백질의 반응 과정에서 서열식별번호:2의 펩타이드에 의하여 식용 단백질 기질에 포함된 글루타민의 글루타밀기를 가수분해하여 기질 내의 글루탐산의 함량을 증기시킴으로써, 정미성 소재를 제조할 수 있다.

필요한 경우에, 형질전환체를 배양하는 배양액에 적절한 탄소원, 질소원 및 보조인자가 사용될 수 있다. 형질전환체가 미생물과 같은 원핵생물에서 유래한 경우, 이들 미생물에 의하여 신속하게 이용되는 임의의 탄소원을 사용할 수 있지만, 특히 바람직하게는 당밀(molasses)이 탄소원에 포함될 수 있다. 탄소원의 농도는 형질전환체의 배양 과정에서 낮게 유지될 필요가 있으며, 배양액 중에 2.0%(w/v) 이하이고, 바람직하게는 0.2 내지 2.0%(w/v)일 수 있다. 이에 따라 형질전환체에 의한 이화 대사산물이 억제되지 않아 고농도의 감마-글루타밀트랜스펩티다아제를 생산할 수 있다.

또한, 배양액 내에 사용될 수 있는 질소원은 무기 질소원(예: 질산나트륨, 아질산나트륨, 염화암모늄 및 황산암모늄), 유기 질소원(예: 카사미노산, 폴리펩톤, 박토-펩톤, 대두 단백질, 분리 대두단백, 탈지 대두, 카제인 및 옥수수 침지액(corn steep liquor)), 아미노산(예: 나트륨 L-글루타메이트, 나트륨 L-아스파르테이트, L-프롤린, L-알라닌, 글라이신 및 L-글루타민) 및 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 질소원의 양은 대략 배양액 중에 5.0%(w/v)이고, 바람직하게는 0.2 내지 5.0%(w/v)일 수 있다. 필요한 경우에, 배양액은 황산마그네?? 7-수화물, 인산수소일나트륨, 인산수소이나트륨 및/또는 고기 추출물과 같은 보조 인자를 포함할 수 있다.

형질전환체를 배양할 때, 배양 조건은 통상적으로 호기적 배양 조건일 수 있다. pH는 4.5 내지 9.0, 바람직하게 5.5 내지 8.5이다. 온도는 15 내지 40℃, 바람직하게는 25 내지 35℃이다. 추가로, 교반 속도 및 통기량은 호기적 배양 환경이 유지될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.

식용 단백질 기질과 서열식별번호:2의 펩타이드의 반응을 통하여 식용 단백질 기질 내에 함유된 글루타밀기를 가수분해할 때, 40 내지 60℃의 온도, pH 6 내지 8, 정제염 농도 1 내지 3M의 조건에서 대략 15 내지 80 시간 동안 수행될 수 있다. 이러한 조건에서 본 발명에 따른 감마-글루타밀트랜스펩티다아제의 활성이 최적으로 유지될 수 있으며, 특히 가수분해 활성은 유지되는 반면에 전이 활성이 억제되어 글루탐산의 함량이 증가된 정미성 소재를 제조할 수 있다.

식용 단백질 기질을 가수분해할 때, 본 발명에 따른 감마-글루타밀트랜스펩티다아제 이외에도 단백질 펩타이드로 분해하는 endo protease 및/또는 펩타이드를 아미노산으로 분해하는 exp-peptidase와 같은 단백질 분해효소(protease)가 추가적으로 사용될 수 있다.

이하, 예시적인 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 감마- 글루타밀트랜스펩티다아제 고생산 균주 분리 및 동정

된장에서 분리한 바실러스 균주를 50 mL LB 배지에 접종하여 48시간 배양한 후 원심분리를 통해 배양상등액을 세포 외 조효소액으로 확보하였다. 효소활성 측정을 통해 pNA-Glu를 기질로 하여 가수분해활성이 가장 우수한 균주를 선별하였다. 이 바실러스 균주에 대한 16s rRNA(서열식별번호:1) 동정 결과 Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum CAU B946 (Genbank accession number HE617159)의 16s rRNA 서열과 98%의 동일성을 나타내었다. 이를 바탕으로 바실러스 S0904 균주를 Bacillus amyloliquefaciens로 동정하였으며, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 S0904 균주를 2016년 8월 16일 서울특별시 서대문구 소재의 한국미생물보존센터에 기탁하였다(기탁번호: KFCC 11684P)

실시예 2: 형질전환

2-1. E. coli 형질전환

형질전환을 위하여, 5 ㎖ LB 액체 배지에 숙주 세포인 E. coli TOP10 (Invitrogen, USA)를 접종하여 37에서 12시간 배양하고, 배양액 1.0 ㎖을 새로운 LB 액체 배지(1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl) 50 ㎖에 접종하여 600 ㎚에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양하였다. 상기 흡광도를 확인한 배양액 1.5 ㎖를 4에서 7000 x g의 조건으로 5분간 원심분리하여 균체를 회수한 뒤, 0.75 ㎖의 형질전환용액 I (50 mM CaCl₂)으로 현탁하고 얼음 속에서 30분간 방치하였다. 이후 4에서 6000 x g의 조건으로 2분간 원심분리하여 균체를 회수하고, 회수된 균체를 0.15 ㎖의 형질전환용액 II (100 mM CaCl₂)로 현탁하여 얼음 속에서 30분간 방치하였다. 형질전환 할 DNA 시료를 상기 형질전환용 E. coli TOP10 0.2 ㎖과 혼합하고, 1시간 방치한 후 42에서 2분간 열 충격을 주었다. 상기 열 충격을 준 혼합액에 0.8 ml의 LB 액체 배지를 혼합한 후, 37에서 1시간 배양시켰다. 상기 1시간 동안 배양한 배양액을 암피실린(최종농도 20 ㎍/㎖)을 함유한 LB 한천 배지에 평판 도말하여 내성을 보이는 균주를 1차 선별하였다.

2-2. B. subtilis 형질전환

B. subtilis ISW1214(Takara. Co. 일본)를 5 ㎖의 LB 배지에 접종하여 37에서 12시간 배양하고, 배양액 1.0 ml을 새로운 SP Ⅰ 배지 (0.5% glucose, 0.02% casamino acid, 0.05% yeast extract, 0.2% (NH₄)₂SO₄, 1.4% K₂HPO₄, 0.6% KH₂PO₄, 0.1% Na-citrate, 0.02% MgSO₄, pH 7.5) 50 ㎖에 접종하여 600 ㎚에서 흡광도를 측정하면서 균체의 성장이 대수기에 접어들 때까지 교반하며 배양하였다. 상기 배양액 1 ㎖을 5 ㎖의 SP Ⅱ 배지(0.5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂를 포함하는 SP Ⅰ 배지)에 접종하고 다시 37에서 90분간 교반하며 배양하였다. 상기 배양액 1 ㎖을 4에서 7000 x g의 조건으로 5분간 원심분리한 후, 0.8 ㎖의 상등액을 제거하고, 균체를 남은 0.2 ㎖에 현탁하였다. 형질전환할 DNA 시료를 상기 형질전환용 B. subtilis 50 ?l와 혼합하고, 37에서 30분간 교반 배양하였다. 상기 준 혼합액에 0.8 ㎖의 LB 액체 배지를 혼합한 후, 37에서 1시간 배양시켰다. 상기 1시간 동안 배양한 배양액을 가나마이신(최종농도 20 ㎍/㎖)을 함유한 LB 한천 배지에 평판 도말하여 내성을 보이는 균주를 1차 선별하였다.

실시예 3: B. amyloliquefaciens S0904 균주 유래 감마- 글루타밀트랜스펩티다아제 유전자 클로닝

3-1. B. amyloliquefaciens S904 주 염색체 분리

B. amyloliquefaciens S0904 균주를 LB 배지 (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) 50 ㎖에 접종하여 37에서 배양하고 원심분리하여 균체를 회수하고 QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN Co.)를 이용하여 염색체 DNA를 분리하였다.

3-2. B. amyloliquefaciens S904 유래 감마- 글루타밀트랜스펩티다아제 유전자 클로닝

실시예 1에서 분리, 동정된 B. amyloliquefaciens S0904 균주가 생산하는 효소에 대하여 펩타이드-매스 분석을 수행하여 16s rRNA 서열이 유사한 Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum CAU B946의 감마-글루타밀트랜스펩티다아제(GGT)와 상동성을 비교하였다. 바실러스 균주 S0904 균주가 생산하는 효소 중에서 Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum CAU B946의 GGT와 상동성이 있는 효소(이하, BAGGT라 함)는 서열식별번호:2의 아미노산 서열로 구성되고, 이 효소를 코딩하는 핵산은 서열식별번호:3의 염기 서열로 구성된다. Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum CAU B946이 전사 개시 코돈의 196-bp 업스트림(upstream) 영역에 프로모터가 존재한다는 점에 근거하여, BAGGT의 프로모터와 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편을 증폭하기 위하여 2개의 합성 프라이머를 각각 제작하였다. 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 하기 표 1에 표시되어 있다.

B. amyloliquefaciens S0904 유래 감마-글루타밀트랜스펩티다아제 클로닝을 위한 프라이머

프라이머	서열	서열식별번호
정방향 프라이머 flakBAGGT-Nde-Fw	5'- GCTCACGTTCCTTTCATATGTCATGTGAGTGAA- 3’	4
역방향 프라이머 flakBAGGT-Xho-Rv	5’-CACTCATCCTCGAGCAGTGCAGAATAAACA- 3’	5

BAGGT 유전자를 분리하기 위하여 실시예 2-1의 B. amyloliquefaciens S0904 염색체 DNA에 대해 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하였으며, 50 ㎕ 반응액 기준 정방향 프라이머(upstream primer)와 역방향 프라이머(downstream primer)를 각각 0.025 ?mole, dNTP 0.2 mM을 첨가한 후 ExTaq polymerase (Takara, Japan)를 1.25 U 첨가한 후, Thermocycler (DNA Engine Peltier Thermal Cycler, BIO-RAD)를 이용하여 PCR을 실시하여 PCR 산물을 획득하였다. 전기영동을 통하여 상기 PCR 산물의 크기가 2 kb임을 확인하였다(결과 미도시). PCR의 조건은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.

유전자 클로닝을 위한 PCR 반응 사이클

단계		온도	반응시간
First denaturation		94	2 min
cycle 0 cycles	Denaturation	94	15 sec
	Annealing	55	30 sec
	Extension	72	1 min 10 sec.
Final extension		72	7 min

표 2의 조건으로 PCR을 수행하여 얻어진 PCR 산물을 pCR4-TOPO® vector(Invitrogen)와 라이게이션하였다. 상기 라이게이션 용액을 상기 실시예 2-1과 동일한 조건으로 E. coli에 형질전환하고, 암피실린(ampicillin) 내성을 보이는 형질전환체를 선발하였다. 플라스미드분리 키트 Mini-prep plasmid DNA purifiacation kit (iNtRon)를 이용하여 플라스미드를 분리하고, 상기 분리된 플라스미드를 NdeI과 XhoI으로 절단하여 2 kb의 DNA 절편을 포함하는 플라스미드를 선발하였다. 상기 라이게이션을 통하여 하여 재조합 벡터 pCR-BAGGT 벡터를 제조하였다. pCR-BAGGT에 클로닝 된 전체 유전자 서열은 5'-gctcacgttcctttCATATGtcatgtgagtgaattctgttttgtttattgtagcttattttttgtctttatgcttgtttcacagctttttcagtccggtttcccatttagcctatttgcgactgattacattcacacagaaaccccaactttttgcacaccggactattccgtttgtcacttgtgaaaacagcacattttacttactctataattgtaagcggaaaacaaaggaggcagact-서열식별번호:3- caagataaaaagcctcgtttctcaagctgagaaatgaggcttttgtttattctgcactgCTCGAGgatgagtg-3'이었다.

실시예 4: 재조합 E. coli 를 이용한 재조합 BAGGT 생산

4-1: 재조합 E. coli 를 이용한 재조합 플라스미드 제작

E. coli를 이용하여 재조합 B. amyloliquefaciens S0904 감마-글루타밀트랜스펩타아제를 생산하기 위하여 E. coli 발현용 벡터인 pET 벡터로 BAGGT 유전자 클로닝을 위하여 정방향 프라이머 BAGGT-d30-Nd-Fw와 역방향 프라이머 BAGGT-stop-Xh-Rv를 각각 제작하였으며, 상기 프라이머는 하기 표 3과 같다.

E. coli 발현 벡터용 BAGGT 유전자 클로닝을 위한 프라이머

프라이머	서열	서열식별번호
정방향 프라이머 BAGGT-d30-Nd-Fw	5'-GCATCCCTTATCAGCATATGGCTAAGAAACATC- 3’	6
역방향 프라이머 BAGGT-stop-Xh-Rv	5'-GTGCTCGAGTTATTTCTTATATTGTTTCAAGTTTACGCCGATTGCGGC-3'	7

상기 실시예 3-2를 통해 제작한 재조합 플라스미드 벡터 (pCR-BAGGT)에 대해 표 3의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 PCR 산물을 획득하였으며, 전기영동을 통하여 상기 PCR 산물의 크기가 1.7 kb임을 확인하였다. PCR 조건은 상기 표 2에 기재된 바와 같다. 본 실시예를 통해 제작된 재조합 플라스미드를 pET28a-6xHΔBAGGT라고 명명하였으며, 상기 플라스미드의 제한효소 자리 개열도는 도 1에 도시되어 있다.

4-2. 재조합 E. coli 를 이용한 재조합 BAGGT 생산

실시예 4-1을 통해 제작한 재조합 플라스미드 벡터 (pET28a-6xHΔBAGGT)를 각각 상기 실시예 2-1과 동일한 절차에 따라 E. coli BL21(DE3)(Intron)에 형질전환 후 카나마이신 내성 여부를 확인하여 상기 벡터가 형질전환 된 균주를 선별하였다. 얻어진 E. coli 형질전환체(E. coli BL21(DE3)/pET28a-6xHΔBAGGT)를 가나마이신 (10 ㎍/㎖)를 함유하는 LB 배지에 접종하고 37에서 24시간 배양하였다. 20 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유한 새로운 100 ㎖의 LB 배지에 1%가 되도록 배양액을 재접종한 후 37에서 배양하면서 O.D값이 0.5에 도달하면 IPTG를 최종 0.2 mM이 되도록 넣고 20에서 20 시간 배양하였다. 원심분리 (10,000 rpm, 5 min)를 통해 배양상등액을 제거한 후, cell을 10 ㎖의 1x Binding buffer (50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, + 10 mM imidazole + 300 mM NaCl)에 현탁한 후, sonicator를 이용하여 세포를 파쇄하였다. (Amp, 30%; Pulse, 5 sec; Time, 5 min × 3 cycle) 세포 파쇄액을 원심분리 (10,000 rpm, 15 mnin)를 통해 상등액을 회수하여 조효소액을 확보하였다. 회수된 조효소액을 Ni-NTA HisTrap™ FF column (GE Healthcare Life Sciences)에 주입한 후, 1x Washing buffer (50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, + 20 mM imidazole + 300 mM NaCl) 5 mL로 washing한 후, 1x Elution buffer (50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, + 250 mM imidazole + 300 mM NaCl) 5 mL (0.5 mL × 6, 1 mL × 2)을 주입하면서 정제된 효소액을 분획하여 얻었다. SDS-PAGE 결과에서 알 수 있듯이 GGT에 해당하는 두 개의 단백질 밴드(protein band)가 대량 생산되었으며, 성공적으로 정제된 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

실시예 5. BAGGT 의 활성 측정

5-1. 글루타민 가수분해 활성 측정

50 mM Na-phosphate buffer (pH 7.0)를 이용하여 0.2 mM pNA-Glu 기질 용액을 제조하였다. 기질 용액 100 ㎕과 phosphate buffer 80 ㎕를 섞은 후, 55에서 5분간 예열시켰다. 적절하게 희석된 효소액 20㎕를 넣고 55에서 10 분 반응 후 200 ㎕ NaHCO₃를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이 중 200 ㎕를 96 well-plate로 옮긴 후 microplate reader (Versamax, Molecular Devices, USA)를 이용하여 410 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. p-Nitroanilide (pNA)를 표준물질로 사용한 표준곡선을 이용하여 측정된 흡광도를 pNA 농도로 환산하였다 계산하였다. 1 유닛의 BAGGT 활성은 분당 1 ?mole의 기질을 분해하는 효소량으로 결정하였다.

5-2. 감마- 글루타밀 기 전이 활성 측정

최종 농도 0.1 mM glutamyl-p-nitroanilide (pNA-Glu, SigmaAldrich)와 4 mM Gly-Gly(SigmaAldrich)를 함유한 100 mM Na-phosphate buffer (pH 7.0)를 기질용액으로 하여 적절하게 희석된 효소액과 섞고 55에서 10 분 반응 후 NaHCO₃를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이 중 200 ㎕를 96 well-plate로 옮긴 후 microplate reader (Versamax, Molecular Devices, USA)를 이용하여 410 ㎚에서 흡광도를 (흡광도 A) 측정하였다. 전이 활성만을 측정하기 위해 감마-글루타밀기 수용체인 Gly-Gly 없이 pNA-Glu만이 있는 기질 용액에서 동일한 효소액으로 동일한 조건에서 반응하여 흡광도 (흡광도 B)를 측정한 후, 흡광도 A에서 흡광도 B간의 흡광도 차를 계산하였다. p-Nitroanilide (pNA)를 표준물질로 사용한 표준곡선을 이용하여 측정된 흡광도를 pNA 농도로 환산하였다 계산하였다. 1 유닛의 BAGGT의 전이 활성은 전이 반응에 의해 분당 1 ?mole의 pNA를 유리하는 효소량으로 결정하였다.

5-3. 최적 pH 및 온도

재조합 BAGGT 효소의 최적 반응 pH를 결정하기 위해, 실시예 4-2에서 얻어진 정제 효소액을 이용하여 다양한 pH 범위의 완충액(pH 4, 5, 6 sodium acetate buffer; pH 6, 7, 8 sodium phosphate buffer; pH 8, 9 sodium borate buffer)를 이용하여 실시예 5-1의 방법으로 가수분해 활성을 측정하고 최고 흡광도 값을 기준으로 상대적 활성을 측정하였다. 그 결과 값을 하기 표 4에 나타내었으며, BAGGT의 활성은 pH 6 내지 8에서 양호하였으며, 최적 효소 활성은 pH7에서 나타났다.

pH에 따른 BAGGT의 효소활성

pH	4	5	6	7	8	9
효소상대활성a	5	44	82	100	98	79
a. pH7에서의 활성에 대한 활성 비율 = (각 pH에서의 활성/pH 7에서의 활성)X100 (%)

재조합 BAGGT의 최적 반응 온도를 결정하기 위해, 상기 실시예 4-2에서 얻어진 정제 효소액을 이용하여 최적 버퍼용액인 100 mM Potassium phosphate 완충액 (pH 7.0)을 이용하여 상기 실시예 5-1의 방법으로 20 내지 70의 다양한 온도범위에서 효소 역가를 측정하고 최고 흡광도 값을 기준으로 상대적 활성을 측정하였다, 그 결과 값은 하기 표 5에 나타내었으며, BAGGT의 효소 활성은 40 내지 60℃의 온도에서 양호하였으며, BAGGT의 최적 활성은 55로 측정되었다.

온도에 따른 BAGGT의 효소활성

온도 (℃)	20	30	40	50	55	60	65
효소상대활성a	18	33	56	83	100	72	25
a. 55에서의 활성에 대한 활성 비율 = (각 온도에서의 활성/55에서의 활성)X100 (%)

5.4. 내염성

효소의 내염성을 결정하기 위해서 NaCl의 농도가 각각 1 M, 2 M, 2.5 M이 첨가 sodium phosphate buffer(pH 7.0)를 이용하였다. NaCl 존재하지 않은 조건에서의 효소 활성을 100%로 정했을 때 NaCl의 농도가 1 내지 2.5 M일 때 상대적 효소 활성을 비교한 결과, 정제염 농도가 2.5 M이 될 때까지 효소의 활성을 실질적으로 감소하지 않아, 2.5 M NaCl 존재 하에서 99.4%의 활성을 나타내는 것으로 확인되었다(결과 미도시).

5-5. 가수분해 활성 및 전이 활성에 대한 정제염의 영향

정제염의 존재에 따른 가수분해 활성과 전이 활성의 변화를 비교하기 위하여 NaCl 1.5 M이 존재하는 조건과 존재하지 않는 조건에서 pH 변화에 따른 BAGGT 활성변화를 상기 실시예 6-3의 방법에 따라 측정하였다. 측정 결과를 도 3 및 하기 표 6에 나타냈다.

도 3의 (A)는 BAGGT 효소의 정제염 존재 여부 별 pH 변화에 따른 가수분해 활성의 변화를 나타낸 것으로, 가수분해 활성의 경우 pH 6 내지 8 범위에서 NaCl의 존재여부와 무관하게 최고활성의 80% 이상의 역가를 유지하였다.(: NaCl 없는 조건; : 1.5 M NaCl이 존재하는 조건).

도 3의 (B)는 BAGGT 효소의 정제염 존재 여부 별 pH 변화에 따른 전이 활성 활성의 변화를 나타낸 것으로, 정제염의 존재 여부와 상관없이 염기 조건일수록 전이 활성이 증가하였다 (: NaCl 없는 조건; : 1.5 M NaCl이 존재하는 조건). 가수분해 활성과는 달리 정제염이 존재하는 조건에서 전이 활성은 정제염이 없는 조건에 비해 큰 폭으로 감소함을 확인하였다(도 3 (B)의 , 1.5 M NaCl이 존재하는 조건).

BAGGT는 pH 6 조건에서는 정제염 존재 시 전이활성 대비 20 배 높은 활성을 가지는 가수분해 활성이 나타나며, pH 7과 pH 8 조건에서 정제염이 있는 조건에서 가수분해 활성이 전이 활성에 비해 각각 1.6배와 1.3배 높음을 확인하였다(표 6). 따라서 BAGGT는 정제염을 첨가할 경우, pH 6-7 범위에서 가수분해 활성은 최대 활성의 80% 수준을 유지하면서 전이활성만이 선택적으로 저해되는 신규한 효소 특성을 가지는 효소임을 확인하였다.

1.5 M NaCl 존재 시 가수분해 및 전이활성 비교

	가수분해 활성 (U/㎖)		전이 활성 (U/㎖)
	무첨가	1.5 M NaCl	무첨가	1.5 M NaCl
pH 6	26,000	29,000	3,300	1,200
pH 7	31,000	29,250	29,450	18,050
pH 8	29,900	32,500	47,500	24,700

실시예 6: 재조합 B. subtilis 를 이용한 재조합 BAGGT 생산

6-1. 재조합 B. subtilis 를 이용한 재조합 플라스미드 제작

실시예 3-2에서 제작된 pCR-BAGGT 클로닝 벡터를 NdeI과 XhoI으로 절단하여 BAGGT의 프로모터와 유전자를 포함하는 DNA 절편을 확보하였으며, 같은 제한효소 처리로 절단한 약 6.7 kb 크기의 pUBRTA vector (J Sci Food Agric. 2013, 93(11):2683-2690)에 라이게이션 하였다. 상기 과정을 통해 제작된 플라스미드는 amyR2 프로모터와 ggt promoter를 연속적으로 가지는 dual promoter system을 가지며, 이를 pUBRTAG-BAGGT라 명명하였으며 제한효소 개열도를 도 4에 나타내었다.

6-2. 재조합 B. subtilis 를 이용한 재조합 BAGGT 생산

상기 실시예 6-1을 통해 제작한 재조합 플라스미드 벡터 (pUBRTAG-BAGGT)를 각각 상기 실시예 2-2에 따라 B. subtilis LKS87 (DB104, amyE , his ⁺ , nprR ₂ , nprR ₁₂ , Δ aprA ₃ )로 형질전환 후 카나마이신 내성여부를 확인하여 상기 벡터가 형질전환 된 균주를 선별하였다. 얻어진 B. subtilis 형질전환체(B. subtilis LKS87/pUBRTAG-BAGGT)를 가나마이신 (10 ㎍/㎖)를 함유하는 LB 배지에 접종하고 37에서 24시간 배양하였다. 배양과정에서 배양액을 적절한 시간대에 50 mL씩 회수한 후, 4에서 7,000 x g의 조건으로 30분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 조효소액을 제조하였다. 상기 B. subtilis 형질전환체의 조효소액으로부터 상기 실시예 4-2의 방법에 따라 효소활성을 검출함으로써 재조합 BAGGT가 배양상등액으로 분비되어 생산되었음을 확인하였다.

실시예 7: 배지 최적화

7-1. 탄소원 선정

배지 최적화를 위한 최적 배지를 선정하기 위해 LB 배지(1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl)를 기준으로 하여 탄소원으로 Glucose, Sucrose, Molasses, Glycerol 4가지를 각각 1% 씩 첨가하여 실험을 진행하였다. LB 배지 20 ㎖ 기준으로 각 성분들이 추가로 첨가된 modified 배지에 전-배양된 재조합 B. subtilis 배양액을 1%가 되도록 접종한 후 37℃에서 48시간 배양하면서 12 시간 간격으로 상기 실시예 5-1에 따라 효소 활성을 분석하였다. 분석 결과를 하기 표 7에 나타낸다. 포도당(Glucose), 자당(Sucrose) 또는 글리세롤(Glycerol)이 첨가된 배지의 경우 효소 생산성이 LB 배지와 비교하여 효소 생산성이 현저히 낮아지는 결과를 얻었다. 반면 당밀(Molasses)이 첨가된 배지의 경우에는 효소 생산성이 LB 배지보다 높은 결과값을 나타내었으므로 추후 실험에서 탄소원으로 당밀을 선정하였다.

탄소원에 따른 효소 생산성 비교

배지	탄소원	24시간 효소 활성(U/mL)
LB 배지	없음	4,300
C1 배지	1% glucose	1,100
C2 배지	1% scrose	80
C3 배지	1% glycerol	30
C4 배지	1% molasses	6,750

7-2. 질소원 선정

배지 최적화를 위한 최적 배지를 선정하기 위해 LB 배지를 기준으로 하여 질소원으로써 Tryptone, Peptone, Polypeptone, Soytone, 및 corn steep liquor (CSL, 40 Brix, 대상)을 선택하여 실험을 진행하였다. 분석 결과를 하기 표 8에 나타낸다. 대부분 LB 배지와 유사하거나 낮은 효소 생산성을 보였으나 3% CSL이 첨가된 배지의 경우 효소 생산성이 LB 배지와 비교하여 우수한 결과를 보이는 것을 확인하였다.

질소원에 따른 효소 생산성 비교

배지	질소원	24시간 후 효소 활성(U/mL)
LB 배지	1% tryptopane	4,100
N1 배지	1% peptone	3,200
N2 배지	1% polypeptone	3,200
N3 배지	1% soytome	3,800
N4 배지	1% CSL	2,600
N5 배지	2% CSL	3,850
N6 배지	3% CSL	7,600

7-3. 발효조를 이용한 효소 생산

상기 실시예 7-1과 7-2 결과를 바탕으로 yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%에 당밀 1.5%와 3% CSL이 첨가된 배지를 기본 배지로 하여 발효조를 이용하여 효소 생산성을 높이기 위한 배지 최적화를 진행하였다. 당밀과 CSL의 농도를 조절하여 발효조를 이용하여 재조합 B. subtilis (B. subtilsi LKS87/pUBRTAG-BAGGT)를 48시간 배양하고, 원심분리를 통해 얻어진 배양상등액을 조효소액으로 하여 효소활성을 측정하였다. 측정 결과를 하기 표 9에 나타낸다. 그 결과, 가장 높은 효소 생산성을 보인 배지의 농도는 Molasses 1.5%와 CSL 1.5%으로 확인되었다.

발효조를 이용한 효소 생산성 비교

배지	탄소원	질소원	48시간 후효소 활성(U/mL)
M1 배지	1% 당밀	3% CSL	4,000
M1 배지	1.5% 당밀	1.5% CSL	12,300
M1 배지	1.5% 당밀	2% CSL	10,900
M1 배지	1.5% 당밀	3% CSL	8,000

실시예 8: 정미성 소재 생산

상기 실시예 7-3을 통해 얻어진 효소액을 초여과장치 (Ultrafiltration)을 이용하여 농축한 후 소맥글루텐을 이용한 정미성 소재 생산에 적용하였다. 기질로서 밀 글루텐을 상온 상태의 물에 조성물 총 중량을 기준으로 고형분 10 내지 20% 첨가비로 투입 후 교반하고, 프로타제 (ProteAX, Novo Nordisk)와 BAGGT 효소를 고형분 대비 각각 0.5-2% 및 0.1-2.0% 투입 후 정제염이 고형분 대비 50% 첨가한 것과 첨가하지 않은 상태에서 45, 72시간, pH 7 내지 8에서 효소분해를 실시하였다. 효소분해 후 90, 1시간 이상 살균 후 원심분리기를 사용하여 순수한 수용성 반응액을 얻었다. 반응액 내 유리아미노산 함량을 표 10에 나타내었다. HPLC를 이용하여 반응액 내 글루탐산의 함량을 분석한 결과 BAGGT 효소처리 전 건조중량 대비 9.08%에서 10.73%로 향상되었음을 확인하였다.

정제염 첨가에 따른 정미성 소재 내 유리아미노산 함량

유리 아미노산	정제염 부재 시 함량(%)*	정제염 존재 시 함량(%)*
Aspartate	0.35	0.29
Glutamate	9.08	10.73
Serine	2.68	2.81
Histidine	0.35	0.49
Glycine	1.25	1.05
Thronine	0.62	0.69
Arginine	0.76	0.95
alanine	0.85	0.90
Tryosine	0.44	0.39
Valine	1.17	1.34
Methionine	0.35	0.62
Phenylalanine	1.58	1.82
Isoleucine	1.06	1.64
Leucine	2.43	2.86
Lysine	0.54	0.54
Proline	1.44	1.63
Total	24.95	28.66

한국미생물보존센터(국내) KFCC11684 20160816

<110> NONGSHIM CO.,LTD <120> Bacillus Strain, Enzyme Produced by the Strain and Application Thereof <130> 2289 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 992 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 1 gggtgacgtg tcgggatttg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg 60 aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag 120 gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc 180 gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg 240 attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg 300 ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact 360 gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 420 gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc 480 cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 540 tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca 600 ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg 660 ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg 720 cgaggttaag ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact 780 gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcgggtgaa atacgttccc 840 gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg 900 taacctttta ggagccagcc gccgaaggtg ggacagatga ttggggtgaa tctagaggga 960 aaacccccca tatatataaa ggccccattg tg 992 <210> 2 <211> 591 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 2 Met Lys Lys Lys Lys Phe Met Asn Leu Cys Phe Ile Val Leu Leu Ser 1 5 10 15 Thr Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ile Pro Tyr His Ala Gln Ala Lys Lys 20 25 30 His Pro Phe Ser Tyr Asp Asp Tyr Lys Gln Val Asp Val Gly Lys Asp 35 40 45 Gly Met Val Ala Thr Ala His Pro Leu Ala Ser Gln Ile Gly Ala Asp 50 55 60 Val Leu Lys Lys Gly Gly Asn Ala Ile Asp Ala Ala Val Ala Ile Gln 65 70 75 80 Phe Ala Leu Asn Val Thr Glu Pro Met Met Ser Gly Ile Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Phe Met Met Val Tyr Asp Ala Lys Thr Lys Asp Thr Thr Ile Ile 100 105 110 Asp Ser Arg Glu Arg Ala Pro Ala Gly Ala Thr Pro Asp Met Phe Leu 115 120 125 Asp Glu Asn Gly Lys Ala Ile Pro Phe Ser Glu Arg Val Thr Lys Gly 130 135 140 Thr Ala Val Gly Val Pro Gly Thr Leu Lys Gly Leu Glu Lys Ala Leu 145 150 155 160 Asp Lys Trp Gly Thr Arg Ser Met Lys Gln Leu Ile Thr Pro Ser Ile 165 170 175 Lys Leu Ala Ser Lys Gly Phe Pro Ile Asp Ser Ala Leu Ala Asp Ala 180 185 190 Ile Ser Asp Tyr Lys Asp Lys Leu Ser His Thr Ala Ala Lys Asp Val 195 200 205 Phe Leu Pro Asp Gly Glu Pro Leu Lys Glu Gly Asp Thr Leu Ile Gln 210 215 220 Lys Asp Leu Ala Lys Thr Phe Thr Ala Ile Lys Tyr Lys Gly Thr Lys 225 230 235 240 Ala Phe Tyr Asp Gly Ala Phe Ser Lys Lys Leu Ala Glu Thr Val Gln 245 250 255 Glu Phe Gly Gly Ser Met Thr Glu Lys Asp Ile Lys Asn Phe Asn Val 260 265 270 Thr Ile Asp Glu Pro Ile Trp Gly Asp Tyr Gln Gly Tyr His Ile Ala 275 280 285 Thr Ala Pro Pro Pro Ser Ser Gly Gly Val Phe Leu Leu Gln Met Leu 290 295 300 Asn Leu Leu Asp Asp Phe Lys Leu Ser Gln Tyr Asp Ile Arg Ser Trp 305 310 315 320 Gln Lys Tyr Gln Leu Leu Ala Glu Thr Met His Leu Ala Tyr Ala Asp 325 330 335 Arg Ala Ala Phe Ala Gly Asp Pro Glu Phe Val Asn Val Pro Leu Lys 340 345 350 Gly Leu Leu Asn Pro Asp Tyr Ile Asn Ala Arg Arg Gln Leu Ile Asp 355 360 365 Ile Asp Lys Val Asn Lys Lys Pro Lys Ala Gly Asp Pro Trp Ser Tyr 370 375 380 Gln Glu Gly Ser Ala Asn Tyr Lys Gln Val Glu Gln Pro Thr Asp Lys 385 390 395 400 Gln Glu Gly Gln Thr Thr His Phe Thr Val Thr Asp Arg Phe Gly Asn 405 410 415 Val Val Ser Tyr Thr Thr Thr Ile Glu Gln Leu Phe Gly Ser Gly Ile 420 425 430 Met Val Pro Gly Tyr Gly Val Val Leu Asn Asn Glu Leu Thr Asp Phe 435 440 445 Asp Ala Val Pro Gly Gly Ala Asn Glu Val Gln Pro Asn Lys Arg Pro 450 455 460 Leu Ser Ser Met Thr Pro Thr Ile Leu Phe Lys Asn Asn Glu Pro Val 465 470 475 480 Leu Thr Val Gly Ser Pro Gly Gly Ala Thr Ile Ile Ser Ser Val Leu 485 490 495 Gln Thr Ile Leu Asn Lys Val Glu Tyr Gly Met Asp Leu Lys Ala Ala 500 505 510 Val Glu Glu Pro Arg Ile Tyr Thr Asn Ser Met Thr Ser Tyr Arg Tyr 515 520 525 Glu Lys Gly Val Pro Glu Glu Ala Arg Thr Lys Leu Asn Glu Met Gly 530 535 540 His Lys Phe Gly Ser Ser Pro Val Asp Ile Gly Asn Val Gln Ser Ile 545 550 555 560 Leu Ile Asp Arg Glu Asn Gly Thr Phe Thr Gly Val Ala Asp Ser Ser 565 570 575 Arg Asn Gly Ala Ala Ile Gly Val Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Lys 580 585 590 <210> 3 <211> 1776 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 3 atgaaaaaga aaaagtttat gaatctctgt tttatcgttc tgctcagtac tttgctcgcg 60 gccggaagca tcccttatca cgctcaggct aagaaacacc cgttttccta tgacgactac 120 aaacaggtag atgtcggcaa agacggcatg gttgccaccg cccatcctct cgcttcacaa 180 atcggtgccg acgtgctgaa aaaaggcggc aatgcaattg acgccgcggt tgccattcaa 240 ttcgcattaa acgtaactga acctatgatg tctggaatcg gcggcggcgg atttatgatg 300 gtttatgatg cgaagacgaa agacaccacc attatcgaca gcagggaacg cgcaccggca 360 ggcgcaacac cggatatgtt ccttgacgaa aacggcaaag ccattccttt ctccgaacgc 420 gttacgaaag ggactgcagt cggtgttccg ggaacattaa aaggacttga aaaagcgcta 480 gacaaatggg gcacacgctc catgaaacaa ctcatcaccc cttccattaa acttgcctca 540 aaaggctttc cgatcgattc ggctttagct gatgccatct cagattataa agacaaatta 600 tcacacactg ctgcaaaaga cgtgtttctt ccggacggag aacctctgaa agaaggagac 660 acactcatcc aaaaagactt agccaaaaca tttacagcta ttaagtacaa aggcacaaaa 720 gcattctatg acggtgcatt ctccaaaaag cttgcagaaa cagtgcagga attcggcggc 780 tcaatgacag aaaaagacat taaaaacttc aatgtgacga ttgacgaacc gatctgggga 840 gattaccagg gctatcatat cgcaactgct cctcctccaa gctcgggcgg tgttttcctg 900 ttgcaaatgc tgaacctcct ggatgatttt aagctttctc aatatgatat ccgttcttgg 960 caaaaatatc agcttctcgc agaaacgatg catttggctt atgctgaccg cgccgcattt 1020 gccggggacc cagaattcgt caacgtccct ctcaaaggtc tcttgaatcc agattatatc 1080 aatgcccgca gacagctgat agatattgat aaagtcaata aaaaaccgaa agccggcgat 1140 ccttggtcct atcaggaagg ttctgcaaac tataaacaag tggagcagcc gactgacaaa 1200 caggaaggtc aaacgactca cttcacggta accgaccgct tcggcaatgt cgtatcttat 1260 acgacaacaa ttgaacagct gttcggttcc ggcattatgg ttcccggata cggcgttgtg 1320 ctgaataatg agttaacaga cttcgatgcg gtgcctggcg gcgcaaatga agtgcagccg 1380 aataaacgtc cgctcagcag catgactccg actattttat tcaaaaataa cgaaccagtc 1440 ctgactgtcg gctcccccgg cggagcaacg atcatttctt ccgtcctgca aacgatcctg 1500 aacaaagttg agtacggcat ggatctgaaa gcggcggtcg aagagccgag aatttacaca 1560 aacagcatga catcctatcg atatgaaaaa ggagtgccgg aagaagcccg cacaaaactg 1620 aacgaaatgg ggcataaatt cggcagcagc ccggttgata tcggtaatgt gcaaagcatc 1680 ctgatcgacc gtgaaaacgg caccttcacc ggagttgccg actcaagccg aaacggagcc 1740 gcaatcggcg taaacttgaa aaattataaa aaataa 1776 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for cloning BAGGT <400> 4 gctcacgttc ctttcatatg tcatgtgagt ga 32 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for cloning BAGGT <400> 5 cactcatcct cgagcagtgc agaataaaca 30 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for cloning BAGGT <400> 6 gcatccctta tcagcatatg gctaagaaac atc 33 <210> 7 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for cloning BAGGT <400> 7 gtgctcgagt tatttcttat attgtttcaa gtttacgccg attgcggc 48

Claims (15)

1. 서열식별번호: 2의 펩타이드를 함유하는 효소액을 준비하는 단계;
   상기 효소액에 식용 단백질 기질(substrate)을 첨가하는 단계; 및
   상기 펩타이드에 의하여 상기 식용 단백질 기질에 포함된 글루타민의 글루타밀기를 가수분해하는 단계로서, 55℃의 온도, pH 7 내지 8, 정제염 농도 1 내지 3M의 조건에서 수행되는 단계를 포함하는 정미성 소재를 제조하는 방법.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 식용 단백질 기질은 글루텐인 정미성 소재를 제조하는 방법.
   
3. 서열식별번호:2의 펩타이드를 코딩하는 핵산이 삽입된 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 배양하는 단계로서, 탄소원으로서 배지 중에 1.5 중량%의 당밀과, 질소원으로서 1.5~2.0 중량%의 옥수수 침출액(corn steep liquor)를 사용하여 배양하는 단계;
   상기 형질전환체에 의해 생산된 서열식별번호:2의 펩타이드를 함유하는 반응액에 식용 단백질 기질(substrate)을 첨가하는 단계; 및
   상기 펩타이드에 의하여 상기 식용 단백질 기질에 포함된 글루타민의 글루타밀기를 가수분해하는 단계로서, 55℃의 온도, pH 7 내지 8, 정제염 농도 1 내지 3M의 조건에서 수행되는 단계를 포함하는 정미성 소재를 제조하는 방법.
   
4. 제 3항에 있어서, 상기 식용 단백질 기질은 글루텐인 정미성 소재를 제조하는 방법.
   
5. 제 3항에 있어서, 상기 핵산은 서열식별번호: 3의 염기 서열로 이루어지는 정미성 소재를 제조하는 방법.
6. 삭제
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15. 삭제

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