MXPA99003870A - Mutantes de penicilina g acilasas - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a nuevas mutantes de penicilina G acilasas preferentemente de E. coli, que exhiben actividad enzimática alterada. Estas penicilina G acilasas se obtienen por la expresión de un gen que codifica la penicilina G acilasa que tiene una secuencia de aminoácido que difiere al menos en un aminoácido de la penicilina G acilasa de tipo silvestre.
Description
MUTANTES DE PENICILINA 6 ?CILASAS
Campo de la Invención
La ' presente invención se refiere a genes mutados que codifican las penicilina G acilasas de Tipo II, a penicilina G acilasas codificadas por estos genes que resulta en las propiedades alteradas, y a métodos para la síntesis de antibióticos de ß-lactama que usan estas penicilina G acilasas.
Antecedentes de la Invención
Actualmente, los derivados de ß-lactama semis intét icos tales como ampicilina, amoxicilina, cefalexina, cefadroxil y cefprozil son, a escala industrial, preparados por métodos químicos. La síntesis de estos antibióticos catalizada por enzimas constituye un claro ejemplo de una reacción enzimática de posible importancia industrial. El método enzimático tiene varias ventajas comparado con los métodos químicos convencionales: (1) evitar reactivos y solventes químicos; (2) la especificidad enzimática hace de la protección de los grupos
REF.: 29705 carboxilo en el núcleo antibiótico innecesaria; (3) evitar las reacciones colaterales, que incluyen race ización.
En este contexto, las penicilina G acilasas ofrecen una gran ventaja. La penicilina G acilasa, también llamada penicilina G amidasa o bencilpenicilina amidohidrolasa [EC. 3.5.1.11], se refiere a un grupo de hidrolasas de microorganismos, especialmente bacterias, capaces de hidrolizar el grupo 6 acilo de penicilinas o el grupo 7 acilo de cefalosporinas que tienen las estructuras generales de I y II a sus correspondientes formas de amina libres (6-APA y sus derivados, III, y 7-ACA y sus derivados, IV) .
II III IV en donde
Ri = fenilacet ilo , fenoxiace ilo , hidroxifenilglicina, fenilglicina y sus derivados, acetilo, adipilo y sus derivados
R2/ R3 = entidades alifáticas o aromáticas con o sin uno o más átomos de 0, S, N
R4 = alcoholes alifáticos o aromáticos y sus derivados con o sin uno o más átomos de O, S, N.
El grupo acilo preferido es fenilacet ilo , aunque otros grupos acilo aromáticos y alifáticos (hidrofóbicos o cargados /polares ) también pueden hidrolizarse a varios grados (en general inferiores) . La preferencia para los diferentes grupos acilo no es necesariamente real para la reacción inversa, específicamente la formación de enlaces amida entre los grupos acilo y ß-APA y 7-ACA (III y IV) . Por ejemplo, el grupo cloroacetilo puede clocarse sobre 7-ACA mucho más rápido que la mayoría de los grupos acilo aromáticos (patente JPO 8000284 -A) . Para muchos antibióticos de ß-lactama actualmente comerciales, los grupos acilo son funciones aromáticas con grados de variación de hidrofobicidad. La penicilina G amidasa de tipo silvestre puede catalizar la semisíntesis (formación de enlace amida) de estos antibióticos, pero las reacciones raramente se completan bajo condiciones apropiadas o económicas para la producción de estos antibióticos. Se desean altamente mejoramientos en el rendimiento de producción y eficiencia de estas reacciones.
Existen muchos reportes en la literatura de las penicilina G acilasas que contienen residuos de aminoácidos alterados que exhiben especificidad del sustrato alterada o cambios en la actividad catalítica. Prieto et al. (I. Prieto et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2!3_ (1990) 553-559) reemplaza Metl68 en la penicilina G acilasa de K . cit ophila con Ala, Asp, Val, Asn y Tyr que resulta en los parámetros cinéticos modificados para la desacilación de la penicilina G y penicilina V; la sustitución de Asn con Lys375 o Tyr con His481. Martin et al. (J. Martin & I. Prieto, Biochimica et Biophysica Acta 1037 (1990) 133-139) describe una mutante de penicilina G acilasa con diferente especificidad del sustrato y estabilidad térmica mejorada cuando etl68 se cambió a Ala. Wang et al. (Wang Min et al. Shiyan Shengwu Xuebao 2_4_ (1991), 1, 51-54) reportó el reemplazamiento de Serl77 en penicilina G acilasa de E . coli con Gly, Thr, Leu, Arg, todos los cambios resultaron en las enzimas inactivas. Kyeong Sook et al. (Kyeong Sook et al. Journal of Bacteriology 174 (1992) 6270-6276) y Slade et al. (Slade et al. Eur. J. Biochem. 197 (1991) 75-80) han demostrado que Ser290 ser un residuo de aminoácido esencial de penicilina G acilasa de E . coli . La sustitución de Ser290 con Cys inactivo completamente la enzima. Niersbach et al. (Niersbach et al. Biotechnology Letters 11_, 1, (1995) 19-24) reemplazó Gly359 con ácido aspártico en la penicilina G acilasa de E . coli . La enzima mutante perdió la estabilidad a hidrolizar la penicilina G pero exhibió la nueva capacidad para hidrolizar ftalil-L-leucina y ftalil-gl ici 1-L-prolina . Una estabilidad mejorada a pH alcalino se demostró por una mutante de sitio dirigido de penicilina G acilasa de E . coli cuando Trp431 se cambió a Arg (Gabriel del Rio et al. Biotechnology and Bioengineering 4_8_ (1995) 141-148) .
Los inventores de aqui presentan mutantes de penicilina G acilasa que tienen actividades enzimáticas alteradas cuando se comparan con la enzima de tipo silvestre.
Breve Descripción de la Invención
En un aspecto de la invención la secuencia de ADN de la penicilina G acilasa de tipo silvestre de Tipo II, preferentemente de organismos procarióticos (la estructura de la enzima de E . coli se da en las Figuras ÍA a ID), es alterada para codificar las mutantes de la penicilina G acilasas. Las acilasas de Tipo II comparten una estructura molecular común. Las acilasas de Tipo II son het erodimeros compuestos de una pequeña subunidad (alfa; 16-26 kilodaltons (kDa)) y una grande subunidad (beta; 54-66 kDa) . Como se usa aqui el término "penicilina G acilasa" se refiere a la acilasa de Tipo II procariótica además de sus formas de preenzima y preproenzima . La secuencia de ADN (SEC. ID. NO.: 1) y la correspondiente secuencia de aminoácido SEC. ID. NO. : 2) para la subunidad alfa de la penicilina G acilasa de tipo silvestre de E . col i se muestran en la Figura 1A. La secuencia de ADN (SEC. ID. NO.: 3) y la correspondiente secuencia de aminoácido (SEC. ID. NO.: 4) para la subunidad beta de la penicilina G acilasa de tipo silvestre de E . coli se muestran en las Figuras IB a ID. De acuerdo con la • presente invención, uno o más residuos de aminoácidos seleccionados se sustituyen con diferentes residuos de aminoácidos del grupo de aminoácidos naturales. Por supuesto, en las secuencias de ADN mutadas de la invención que corresponden a los cambios en la secuencia de ADN se hacen para codificar los aminoácidos deseados en las posiciones deseadas. Los cambios estructurales se determinaron basados en la estructura cristalográfica de rayos X de la penicilina G acilasa de tipo silvestre. Los cambios de ADN y la secuencia de aminoácido para cada sustitución de acuerdo con la presente invención se muestran en la Figura 2.
De acuerdo con la invención se proporcionan las siguientes sustituciones en uno o más sitios designados :
1. En la subunidad alfa pares de bases de ADN: A424-426 (MetAl42 - Ala) pares de bases de ADN: A436-438 (PheA146 - Ala)
2 En la subunidad beta:
pares de bases: B70-72 (PheB24 - Ala, Leu, Val, Pro, Tyr, Met, Ser, Cys, Asp, Lys, Arg, Tyr, Thr, lie, Glu, Gln, Asn, o His) .
pares de bases de ADN: B166-168 (ValB56 - Ser o
Thr) pares de bases de ADN: B529-531 (IleB177 - Phe)
En la nomenclatura usada anteriormente, "A" representa la subunidad alfa, " B" representa la subunidad beta; las posiciones numeradas son términos amino convencionales a términos carboxi para las secuencias de aminoácidos, y 5' a 3' para secuencias de ADN; el aminoácido que precede al número de la posición aminoácido representa el aminoácido de tipo silvestre y el aminoácido que sigue al número de posición de aminoácido representa el aminoácido sustituido, por ejemplo, "ValB56 - Ser o Thr" significa que el aminoácido en la posición 56 en la subunidad beta de tipo silvestre es valina la cual se sustituye con serina o treonina para hacer una acilasa mutante de la invención.
Las acilasas alteradas de la invención tienen actividades enzimáticas alteradas cuando se comparan con la correspondiente penicilina G acilasa de tipo silves re .
La penicilina G acilasa (mutante) alterada más preferida tiene una sola alteración de aminoácido
( PheB24 -Ala ) , y es capaz de sintetizar antibióticos de ß-lactama con rendimiento y eficiencia significativamente mayor que la enzima de tipo si 1 ves t re .
En otros aspectos la presente invención también se refiere a vectores que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos alteradas de la invención, y células huésped de microorganismos transformados con dichos vectores. La invención también se refiere a procesos para la producción de las acilasas alteradas que comprenden cultivar las células huésped de la invención, preferentemente seguido del aislamiento de la acilasa
En aún otro aspecto, la invención proporciona métodos para usar la mutante de penicilina G acilasa para la semisintesis de los antibióticos de ß-lactama (p. ej . , cefadroxil, cefprozil, amoxicilina) . Las condiciones, tales como las concentraciones del sustrato, los valores de pH y las temperaturas, se presentan posteriormente. Los rendimientos y eficiencias de las reacciones semisintéticas que usan las mutantes de penicilina G acilasas se mejoran preferentemente cuando se comparan con la enzima de tipo silvestre.
Breve Descripción de los Dibujos
Figura ÍA: Secuencia nucleótida (ADN) de la subunidad alfa del gen de penicilina G amidasa de tipo silvestre de E . coli y la correspondiente secuencia de aminoácido codificada por la secuencia nucleótida .
Figura IB: secuencia nucleótida (ADN) de la subunidad beta del gen de penicilina G amidasa de tipo silvestre de E . coli y la correspondiente secuencia de aminoácido codificada por la secuencia nucleótida .
Figura 1C: continuación de la Figura IB.
Figura ID: continuación de la Figura 1C.
Figura 2: ADN y secuencias de aminoácidos de los fragmentos relevantes de la penicilina G acilasa que ilustran los sitios exactos de las mutaciones de acuerdo con la invención. El fragmento de ADN 1 es la
SEC. ID. NO.: 5, el fragmento de aminoácido 1 es la
SEC. ID. NO.: 6 , el fragmento de ADN 2 es la SEC. ID. NO. : 7, fragmento de aminoácido 2 es la SEC. ID. NO. :
8, el fragmento de ADN 3 es la SEC. ID. NO.: 9, el fragmento de aminoácido 3 es la SEC. ID. NO. : 10, el fragmento de ADN 4 es la SEC. ID. NO.: 11, el fragmento de aminoácido 4, es la SEC. ID. NO. : 12, y el fragmento de ADN 5 es la SEC. ID. NO.: 13, el fragmento de aminoácido 5 es la SEC. ID. NO.: 14.
Figura 3: Ilustración del vector PBM referido en el Ejemplo 1 que contiene las secuencias de ADN mutadas de penicilina G acilasas
Figura 4 : imágenes de gráficos por computadora de la estructura del sitio de enlace del sustrato de penicilina G acilasa. Por claridad, no se muestra en trazo de la estructura de la proteina. Los aminoácidos aislados que constituyen el sitio se muestran como diagramas estructurales de barra. Los tipos de átomos se codifican por diferentes sombras de gris, p. ej . , carbonos de la estructura de polipéptido, blanco; carbonos de la cadena lateral, gris claro; nitrógenos, gris obscuro; oxígenos, negro. El sustrato cortado, el ácido fenilacético, se marca por una flecha en el centro del sitio. La cadena lateral de fenilalanina B24 también se marca con una flecha. Como puede observarse, la cadena lateral aromática del residuo B24 ocupa una posición central importante para el sitio, en contacto con el sustrato, y protege el sustrato del solvente. La imagen de preparó de los coordinados cristalográficos por rayos X del complejo de ácido fenilacético -penicilina G acilasa.
Descripción Detallada de la Invención
Las penicilina G acilasas las cuales son el asunto de esta invención tienen especificidad del sustrato alterada y/o actividad especifica alterada cuando se comparan con la enzima de tipo silvestre. Las enzimas de la invención exhiben preferentemente rendimiento mejorado y/o eficiencia cuando se comparan con las enzimas de tipo silvestre. Es posible que la experimentación rutinaria podria requerirse para determinar las condiciones óptimas para el uso de las enzimas alteradas de la invención. La enzima de tipo silvestre utilizada aqui para preparar las enzimas alteradas de la invención se obtiene de procariotas tales como Escherichea coli, Kluyvera citrophila , Providencia rettgeri ,
Pseudomonas sp . , Alcaligenes faecalis. Bacillus megaterium , Arthrobacter viscosus , y similares. Preferentemente la acilasa tiene las siguientes características: (1) se aisla de la procariota E. colí (p. ej . , ATCC 11105 (2) se translada como un precursor de cadena peptidica simple (3) se procesa después de la translación que resulta en un heterodimero con un pequeño dominio N-terminal (la subunidad alfa) y un dominio C-terminal mayor (la subunidad beta) . El peso molecular de la subunidad alfa preferida es de aproximadamente 24000 y el peso molecular de la subunidad beta preferida es de aproximadamente 62000. La forma activa de la enzima preferida se encuentra típicamente en el periplásmico de E . col i .
Los resultados de LC-MS actuales sugieren que durante el procesamiento t ranslacional en E . col i la subunidad alfa se trunca en el término C por aproximadamente 10 a 15 aminoácidos, más probablemente por 12 o 13 aminoácidos. Similarmente, los mismos resultados indican que durante el procesamiento trans lacional la subunidad alfa se trunca en el término N por 1 o 2 aminoácidos. De esta manera, la presente invención incluye mutantes de penicilina G acilasas en donde la subunidad alfa se ha truncado en el término N por 1 o 2 aminoácidos y/o en donde la subunidad alfa se ha truncado en el término C por 10 a 15 aminoácidos, preferentemente por 12 o 13 aminoácidos.
La alteración de la especificidad del sustrato de penicilina G acilasas se logra de tal manera que las enzimas mutantes son capaces de cortar o sintetizar derivados de penicilina y cefalosporina que poseen cadenas laterales a parte de fenilacetilo, la cual es la cadena natural de la penicilina G. Los ejemplos de cadenas laterales que actualmente no son afectadas significativamente por las penicilina G acilasas son los grupos acilo derivados de ácido succinico de ácidos dicarboxilicos , ácido adipico de ácido glutárico, ácido aminoadipico y similares.
Las enzimas mutadas de la invención podrían exhibir estereoespecificidad aumentada la cual puede resultar en el exceso enantiomérico mejorado en la conversión con mezclas racémicas de compuesto quirales. Tal propiedad podria hacer las acilasas muy útiles para la síntesis de antibióticos semisintét icos enantioméricamente puros de mezclas racémicas de cadenas laterales de fenilacetilo o derivados activados de las cadenas laterales de fenilacetilo (p. ej . , fenilglicina-amidas o esteres de las mismas, p-hidroxi feni Ígl icina-amidas o esteres de las mismas y similares) que contienen un carbono quiral alfa debido a la presencia de un grupo amino (p. e j . , como en, por ejemplo, ampicilina, cefalexina, amoxicilina, cefadroxilo, cefaclor) o un grupo hidroxilo (como en, por ejemplo cefamandol) .
La presente invención también se refiere a la identificación de mutantes de penicilina G derivadas de la enzima de tipo silvestre por via de la metodología de ADN recombinante conocida en arte que sustituye un residuo aminoácido para un nuevo residuo. Las mutantes se analizaron para la actividad hidrolitica y sintética. Se prefieren las variantes de penicilina G acilasa en las cuales la actividad de transferasa se mejora con respecto a la actividad de hidrolasa. Esto hace que la enzima sea más útil en las conversiones de síntesis. Se prefieren las mutantes con desarrollo mejorado en la síntesis enzimática de antibióticos tales como amoxicilina, cefadroxil, cefprozil y cefalexina.
La introducción de una mutación en los sitios determinados de un gen puede llevarse a cabo mediante la modificación de un sitio definido de una secuencia de ADN que usa oligonucleótidos sintéticos. Las mutantes de penicilina G acilasa en la presente invención pueden prepararse mediante un proceso que comprende :
(1) introducir una mutación en sitios específicos del gen que codifica la penicilina G acilasa por mutagénesis de sitio dirigido de reacción en cadena de polimerasa estándar. Los oligodesoxinucleót idos específicos para estas mutaciones se sintetizaron mediante una fuente comercial. Los oligonucleótidos son homólogos a la secuencia a ser mutagenizada excepto para una porción interna que determina la mutac ion.
(2) clonar el gen mutagenizado en un vector de clonación .
(3) transformar una cepa huésped con el vector recombinante .
(4) cultivar la cepa huésped en un medio de cultivo apropiado.
(5) separar e inmovilizar la mutante de penicilina G acilasa así obtenida.
(6) probar las mutantes con respecto a la actividad hidrolítica y sintética.
La mutagénesis de la penicilina G acilasa de acuerdo aqui introduce nueva especificidad del sustrato y/o actividad enzimática alterada. Para introducir las mutaciones puntuales, se toma un método racional, que depende la cristalografía de la proteína, la formación del modelo molecular, la biología molecular y las técnicas químicas de proteínas. De acuerdo a la presente invención, las posiciones de aminoácidos específicos se han identificado como posiciones importantes con respecto a las propiedades catalíticas de la enzima. Estos residuos incluyen MetA142, PheA146, PheB24, ValBl56 y IleB177. La identificación de estos residuos se basa en la estructura cristalográfica por rayos X.
Para comparar las enzimas de la invención con la enzima de tipo silvestre, la mutantes de penicilina G acilasas y de tipo silvestre están en la forma de lisados celulares crudos o sólidos inmovilizados, preferentemente los últimos. La enzima de la invención que tiene la mutación PheB24 - Ala demuestra una actividad de síntesis mejorada para los antibióticos de ß-lactama y por lo tanto se prefiere.
La presente invención también incluye un vector de expresión que contiene una secuencia de ácido nucleico de la invención enlazado operablemente a una secuencia promotora capaz de dirigir su expresión en una célula huésped. Los vectores preferidos son plásmidos tales como PBMPGA plásmido mostrado en la Figura 3. Los vectores de expresión útiles en la presente invención contienen típicamente un origen de replicación, un promotor localizado enfrente de (p. ej . , corriente arriba de) la secuencia de ADN y seguido por la secuencia de ADN que codifica todo o parte de la acilasa mutante es seguido por la transcripción de las secuencias de terminación y el vector restante. Los vectores de expresión también podrían incluir otras secuencias de ADN conocidas en el arte, por ejemplo, secuencias líderes de estabilidad las cuales proporcionan estabilidad del producto de expresión, secuencias líderes secretoras las cuales proporcionan secreción del producto de expresión, secuencias que permiten la expresión del gen estructural a ser modulado (p. ej . , por la presencia o ausencia de nutrientes u otros inductores en el medio de crecimiento) , marcar las secuencias que son capaces de proporcionar la selección fenotípica en las células huésped transformadas, y las secuencias que proporcionan sitios para cortar por la restricción de endonucleasas . Las características del vector de expresión actual usado deben ser compatibles con la célula huésped que va a emplearse. Por ejemplo, cuando se clona en un sistema de célula de E . col i , el vector de expresión debería contener promotores aislados del genoma de células de E . col i (p. ej . , tac, lac y trp) . Los orígenes apropiados de la replicación en varios huéspedes de E . col i incluyen, por ejemplo, un origen de replicación del plásmido ColEl. Los promotores apropiados incluyen, por ejemplo, tac, lac y trp y el gen promotor neo-r de E . col i . Las secuencias de terminación apropiadas incluyen, por ejemplo, penicilina G acilasa, gen 10 del fago T7, y los terminadores del gen neo-r de E . col i . También se prefiere que el vector de expresión incluya una secuencia que codifica un marcador seleccionable. El marcador seleccionable es preferentemente resistente a antibiótico. Como marcadores seleccionables, resistentes a ampicilina y resistentes a neomicina pueden emplearse convenientemente. Todos estos materiales se conocen en el arte y están comercialmente disponibles.
Los vectores de expresión apropiados que contienen la codificación deseada y las secuencias de control podrían construirse usando las técnicas estándar de ADN recombinante conocidas en el arte, muchas de las cuales se describen en Sambrook et al. Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) .
La presente invención adicionalmente se refiere a células huésped que contienen un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica todo o parte de la acilasa mutante. Las células huésped contienen preferentemente un vector de expresión que comprende todo o parte de una de las secuencias de ADN que tienen una o más mutaciones mostradas en la Figura 2. Se prefieren además células que contienen un vector de expresión que comprende una o más secuencias de ADN reguladoras capaces de dirigir la replicación y/o la expresión de, y enlazada operativamente a una secuencia de ADN que codifica, todo o parte de la acilasa mutante. Las células huésped apropiadas incluyen, por ejemplo, HB101 de E . col i (ATCC 33694) disponibles en Life Technologies, Inc., P.O. Box 6009, Gaithersburg, MD 20897; BL21 disponible en Novagen, Inc., 597 Science Drive, Madison, Wl 53711; y similares.
Los vectores de expresión podrían introducirse en las células huésped mediante varios métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, la transfección de células huésped con vectores de expresión puede llevarse a cabo por el polietilen glicol mediado por el método de transformación de protoplasto. Sin embargo, también pueden emplearse otros métodos para introducir los vectores de expresión en las células huésped, por ejemplo, electroporación, inyección biolística, o fusión de protoplasto.
Una vez que un vector de expresión se ha introducido en una célula huésped apropiada, la célula huésped podría cultivarse bajo condiciones que permiten la expresión de la acilasa mutante deseada.
Una célula huésped, E . col i BL21, que contiene el plásmido pBMPGA ( (pBMFlPGA) + ) se depositó con la
American Type Culture Collection, Rockville, Maryland
•20852, bajo los suministros del Tratado de Budapest el 4 de septiembre, 1997 y tiene la designación ATCC
98537.
Las células huésped que contienen un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN que codifica todo o parte de la acilasa mutante podrían identificarse por uno o más de los siguientes métodos generales: (a) hibridación ADN-ADN; (b) la presencia o ausencia de las funciones del gen marcador; (c) verificación del nivel de transcripción conforme se mide por la producción de las transcripciones de ARNm de penicilina G acilasa en la célula huésped; (d) detección del producto de gen inmunológicamente; y (e) prueba de enzima (detección colorimétrica, etc.) .
Las secuencias de ADN de los vectores de expresión, plásmidos o moléculas de ADN de la presente invención podrían determinarse por varios métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, el método de terminación de cadena de didesoxi como se describe en Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74 , 5463-5467 (1977), o podría emplearse el método de Maxam-Gilbert como se describe en Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977).
Debería entenderse, por supuesto, qué no todos los vectores de expresión y las secuencias reguladoras de ADN funcionarán igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de la presente invención. Ni todas las células huésped funcionarán igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto ordinario en el arte podría hacer una selección entre los vectores de expresión, las secuencias reguladoras de ADN, y las células huésped que' usan la guía proporcionada aquí sin la indebida experimentación i sin salir del alcance de la presente invención.
Todos los residuos de aminoácidos identificados aquí están el la configuración natural L. Manteniendo la nomenclatura de polipéptido estándar, J. Biol. Chem. 243, 3557-3559 (1969), las abreviaciones para los residuos de aminoácidos son como se muestran en la siguiente Tabla de Correspondencia:
TABLA DE CORRESPONDENCIA
SÍMBOLO AMINOÁCIDO Letra ' 3 Letras
Y Tyr L-tirosina G Gly L-glicina
F Phe L-fenilalanina
M Met L-metionina
A Ala L-alanina
S Ser L-serina
I lie L-isoleucina
L Leu L-leucina
T Thr L-treonina
V Val L-valina P Pro L-prolina K Lys L-lisina
H His L-histidina
Q Gln L-glutamina
E Glu Ácido L-glutámico
W Trp L-triptofan
R Arg L-arginina
D Asp Ácido L-aspárti?o
N Asn L-asparagina C Cys L-cisteína
Todas las secuencias de aminoácidos se representan aquí por las fórmulas cuya orientación izquierda a derecha es en la dirección convencional del término amino al término carboxi.
Los polipéptidos de la presente invención podrían obtenerse por medios sintéticos, p. ej . síntesis química del polipéptido de sus aminoácidos componentes, por métodos conocidos para aquellos expertos ordinarios en el arte. Por ejemplo, podria emplearse el procedimiento en fase sólida descrito en Houghton et al., Proc. Nati. Sci. 8_2, 5131-5135 (1985) . Se prefiere que los polipéptidos sean obtenidos por la producción en células huésped procariotas que expresan una secuencia de ADN que codifica la acilasa mutante, o por translación in vitro del ARNm codificado por una secuencia de ADN que codifica la acilasa mutante. Por ejemplo, la secuencia de ADN podría sintetizarse usando PCR como se describió anteriormente e insertarse en un vector de expresión apropiado, que en cambio podría usarse para transformar una célula huésped apropiada. La célula huésped recombinante después podría cultivarse para producir la enzima. Las técnicas para la producción de polipéptidos por estos medios se conocen en el arte, y se describen aquí.
Los polipéptidos producidos de esta manera después podrían aislarse y purificarse a algún grado usando varias técnicas de purificación de proteínas. Por ejemplo, podrían emplearse los procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y cromatografía de inmunoafinidad .
Los polipéptidos de la presente invención se han definido por medio del ADN determinado y la secuenciación de aminoácido deducida. Debido a la naturaleza de degeneración del código genético, lo cual resulta de más de un codón para la mayoría de los residuos de aminoácidos y las señales de paro, podrían usarse otras secuencias de ADN que codifican la misma secuencia de aminoácido como se representan en la Figura 1 para la producción de los polipéptidos de la presente invención. Además, se entenderá que las variaciones alélicas de estas secuencias de ADN y aminoácidos existen naturalmente, o podrían introducirse intencionalmente usando los métodos conocidos en el arte. Estas variaciones podrían demostrarse por una o más diferencias de aminoácidos en la secuencia global, o por eliminaciones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de uno o más aminoácidos en la secuencia. Tales sustituciones de aminoácidos podrían hacerse, por ejemplo, en la base de similaridad en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados o grupos de cabeza no polar que tienen similares valores de hidrofilicidad incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina, tirosina. Otras variaciones contempladas incluyen sales y esteres de los polipéptidos mencionados anteriormente, además de precursores de los polipéptidos mencionados anteriormente, por ejemplo, precursores que tienen los sustituyentes N-terminal tales como metionina, N-formilmet ionina usados como •secuencias líderes. Todas las variaciones se incluyen dentro del alcance de la presente invención.
La invención también contempla un proceso para producir una mutante de penicilina G acilasa de la invención que comprende cultivar una célula huésped de la invención bajo condiciones apropiadas para la producción de la acilasa mutante de la invención. Para las células huésped bacterianas, las condiciones de cultivo típicas son el medio liquidó que contiene el antibiótico y el agente de inducción apropiado. Los cultivos se agitan a una temperatura apropiada para la producción óptima de la enzima, p. ej . , aproximadamente 28°C a aproximadamente 29 C. Los antibióticos típicos apropiados incluyen canamicina, cloroanfenicol , tetrocilina y similares. Los agentes de inducción típicos incluyen IPTG, lactosa y s imilares .
La presente invención también incluye un proceso para producir un ácido penicilánico 6-acilado semisintético, un ácido cefalosporánico 7-acilado o una sal o éster del mismo que comprende poner en contacto ß-lactama 6-amino correspondiente o 7-ACA o la sal o éster de la misma, respectivamente, y un agente de acilación con una acilasa mutante de la invención bajo condiciones apropiadas para que se presente la acilación. Los agentes de acilación típicos incluyen esteres o amidas de cadenas laterales de amoxicilina, cefdroxil, cefprozil, etc. Los agentes de acilación típicos incluyen, pero no se limitan a, fenilglicina , parahidroxifenilglicina, ácido fenilacético, ácido fenoxiacético, sus esteres o amidas. La forma preferida del agente de acilación es el éster de los ácidos mencionados anteriormente. La porción de alcohol de estos esteres incluye, pero no se limita a, metanol y sus análogos de cadena más larga y sus estereoisómeros, etilen glicol y sus análogos de cadena más larga y sus estereoisómeros. Los más preferidos son los esteres de etilen glicol. Las condiciones de acilación típicas son en amortiguadores acuosos a pH neutro o inferior, con agitación constante. Una temperatura típica es de aproximadamente 0°C a aproximadamente 35°C. La acilasa mutante para usar en el proceso anterior puede elaborarse in si t u mediante las células huésped o puede pre-elaborarse mediante las células huésped. Si se usa la acilasa mutante libre de células, puede ser en un lisado celular crudo, puede ser parcialmente purificado, o puede purificarse a homogeneidad. Se prefiere que la acilasa mutante se inmovilice. Los soportes de inmovilización típicos para uso aquí incluyen celita, dicalita o cuentas UOP.
Los siguientes ejemplos son además ilustrativos de la presente invención. Estos ejemplos no se pretenden que limiten el alcance de la presente invención, pero proporcionan el entendimiento adicional de la invención.
En los siguientes ejemplos, algunos reactivos, enzimas de restricción, y otros materiales se obtuvieron de las fuentes comerciales y se usan de acuerdo a la indicación por los suministradores. Las operaciones empleadas para la purificación, caracterización y la clonación del ADN son bien conocidas en el arte y pueden adaptarse a partir de la literatura publicada.
Ejemplo 1
Mutagénesis de Sitio específico
En las posiciones seleccionadas, las mutaciones de aminoácidos se generaron usando el método de PCR de sitio dirigido descrito anteriormente. Los oligonucleótidos usados para introducir las mutaciones deseadas se obtuvieron comercialmente. En particular los oligonucleótidos tienen las siguientes secuencias :
( 1 ) 5 ' CAGAGAAGCGGTTTGCCGCGGTGCCCCACAAATATC3 ' SEC. ID. NO.: 15)- A: 142 MET - ALA
(2) 5' CGCTAGTGCTATCAGAGGCGCGGTTTGCCATGGTGCC3' (SEC. ID. NO.: 16) - A: 146 PHE - ALA
(3) 5' AGCCAGGCCCATACCAGCCCTGCGGACCATTTACCATG3' (SEC. ID. NO.: 17) - B: 24 PHE - ALA
(4 ) 5' AGCCAGGCCCATACCAGCCCAACTGCGGACCATTTACCATG3' (SEC. ID. NO.: 18) - B: 24 PHE - VAL ( 5 ) 5 ' AGCCAGGCCCATACCAGCCGAACTGCGGACCATTTACCATG3 ' (SEC. ID. NO.: 19) - B: 24 PHE - LEU
(6) 5' AGCCAGGCCCATACCAGCCCCACTGCGGACCATTTACCATG3' (SEC. ID. NO.: 20) - B: 24 PHE - GLY
(7) 5' AGCCAGGCCCATACCAGCCATCCTGCGGACCATTTACCATG3' (SEC. ID. NO.: 21) - B: 24 PHE - MET
(8) 5 ' AGCCAGGCCCATACCAGCCACACTGCGGACCATTTACCATG3 ' (SEC. ID. NO.: 22) - B : 24 PHE - CYS
(9) 5?GCCAGGCCCATACCAGCCAGACTGCGGACCATTTACCATG3'
(SEC. ID. NO.: 23) - B: 24 PHE - SER
(10) 5' AGCCAGGCCCATACCAGCCGGTCTGCGGACCATTTACCATG3' (SEC. ID. NO.: 24) - B: 24 PHE - PRO
(11) 5' AGCCAGGCCCATACCAGCCCTGCTGCGGACCATTTACCATG3' (SEC. ID. NO.: 25) - B: 24 PHE - ASP
(12) 5 ' AGCCAGGCCCATACCAGCCCTGCTGCGGACCATTTACCATG3 ' (SEC. ID. NO.: 26) - B: 24 PHE - HIST 13) 5' AGCCAGGCCCATACCAGCCATACTGCGGACCATTTACCATG3 '
(SEC. ID. NO.: 27) - B: 24 PHE - TYR
(14 ) 5' AGCCAGGCCCATACCAGCCTTTCTGCGGACCATTTACCATG3' (SEC. ID. NO.: 28) - B: 24 PHE - LYS
(15) 5?GCCAGGCCCATACCAGCCCCTCTGCGGACCATTTACCATG3' (SEC. ID. NO.: 29) - B: 24 PHE - ARG
(16) 5 ' CACACCATTATGACCAAAAGACAGCCCAGGATAGGCAAAT3 ' (SEC. ID. NO.: 30) - B: 56 VAL - SER
(17) 5' CACACCATTATGACCAAAAGTCAGCCCAGGATAGGCAAAT3' (SEC. ID. NO.: 31) - B: 56 VAL - THRE
(18) 5' GCGAAACAAGCACTGGACCTTCAAACTGGTACTATGCTG3' (SEC. ID. NO. : 32) - B: 177 ILE - PHE
(19) 5?GCCAGGCCCATACCAGCCAATCTGCGGACCATTTACCATG3' (SEC. ID. NO. : 33) - B: 24 PHE - ILE
(20) 5'AGCCAGGCCCATACCAGCCAGT_CTGCGGACCATTTACCATG3' (SEC. ID. NO. : 34) - B: 24 PHE - THR (21) 5' AGCCAGGCCCATACCAGCCTTGCTGCGGACCATTTACCATG3' (SEC. ID. NO.: 35) - B: 24 PHE - GLN
( 22 ) 5 ' AGCCAGGCCCATACCAGCCATTCTGCGGACCATTTACCATG3 ' (SEC. ID. NO.: 36) - B: 24 PHE - ASN
(23) 5 ' AGCCAGGCCCATACCAGCCTTCCTGCGGACCATTTACCATG3' (SEC. ID. NO.: 37) - B: 24 PHE - GLU
(24) 5?GCCAGGCCCATACCAGCCCCACTGCGGACCATTTACCATG3' (SEC. ID. NO.: 38) - B: 24 PHE - TYRP
(1) El gen para la penicilina G acilasa se inserta en el plásmido PBM (Figura 3) el cual se usa como un molde para la síntesis del gen mutado.
(2) Un oligonucleótido se designa el cual es complementario a la secuencia a ser mutagenizada excepto para una porción interna la cual determina la mutación .
(3) Usar las técnicas PCR estándar, el oligonucleótido sintético se alinea al molde y el molde se amplifica. El producto del megacebador se purifica para ser usado durante una segunda ronda de PCR para generar la mutante de doble hebra. El ADN mutante después se purifica con un gel de agarosa preparativo .
Ejemplo 2
Clonación y Expresión de Penicilina G acilasas Mutantes
El gen de penicilina G acilasa mutado se clona en el plásmido PBM el cual contiene el promotor tac y se induce por lactosa o IPTG. Los plásmidos recombinantes pueden introducirse en un organismo huésped seleccionado del grupo de E . co l i . Estos microorganismos después se cultivan bajo las condiciones apropiadas y se seleccionan las colonias.
(1) El plásmido PBM y la secuencia de ADN que codifica la enzima mutagenizada se digieren con las enzimas de restricción HindIII y BamHl. Los productos se purifican en gel.
(2) Las secuencias de ADN digeridas se ligan y una alícuota de la reacción de ligación se usa para transformar las células de E . col i competentes. Las transformaciones se seleccionaron subsecuentemente en placas LB que contienen canamicina y lactosa.
(3) Para probar, las colonias individuales se eligieron y crecieron toda la noche a 28°C en el medio LB que contiene lactosa y canamicina.
(4) Para verificar las mutaciones, se utilizó un estuche de A bion Inc. Este método se basa en el hecho de que ciertos RNasas pueden cortar selectivamente el ARN de doble hebra en una posición con un par de bases simples desiguales, que indican que la mutación se ha presentado.
Ejemplo 3
Cultivo de Microorganismos
Las colonias de E . col i transformadas se usan para inocular los cultivos de semillas en matraces Erlenmeyer de 500 ml que contienen 100 ml de suero de medio de Luria Bertuni suplementado con 30 µl/ml de canamicina. Los matraces de las semillas se cultivan durante 5 horas a 28°C. 50 ml del cultivo se usa para inocular recipientes de 2 litros. El medio base es 0.3% de K2HP04, 0.2% de KH2P04, 0.2% de MgS04, 0.05% de (NH4)2S0 , 0.003% de FeS04, 0.001% de MnS04, 0.3% de extracto de levadura y 30 µl/ml de canamicina. El pH es 6.8-7.2. Los recipientes se corrieron en un perfil de alimentación de pH regulado. Los recipientes se suplementan con 20% de NZ amina, 20% de glucosa y canamicina. El suero fermentador se cultivó durante 4 4 horas a 30 C con alta aereación.
Ejemplo 4
Aislamiento e Inmovilización de Penicilina G acilasa de E . col i
El suero entero se microfluidi zó para romper las células. Se adicionó 10% de celita y se adicionó 0.2-0.25% de PEÍ para clarificar el suero. La mezcla se agitó durante una hora, se filtró y se lavó con un volumen igual de agua para dar una suero clarificado. El suero clarificado se ultrafiltró a través de una membrana de 30,000 MWCO a 5% de su volumen original.
(1) Inmovilización con cuentas de UOP-aluminio
Agitar el suero ultrafiltrado con cuentas UOP durante toda la noche a 10°C. Lavar las cuentas con agua y almacenar a 4 ° C .
(2) Inmovilización con Diacelita
Se adicionaron 4% de Tritón X-100, Biocrilo al 5% e isopropanol al 30% al suero ultrafiltrado y la mezcla se agitó durante 1 hora y se filtró. Al filtrado se adicionó 1% de Speedplus y se adicionó 50% de PEG a una concentración final de 15%, la mezcla se agitó durante 15 minutos y se adicionó 50% de glutaraldehído a una concentración final de 0.4%. La inmovilización se dejó que procediera durante 15 minutos a temperatura ambiente. La enzima se filtró y se lavó con agua hasta que el lavado fue incoloro. El pH se mantuvo entre 7.2 y 7.6 a través de todo el procedimiento.
Ejemplo 5
Prueba de la Actividad Hidrolítica de Penicilina G acilasas
(1) Probar con el sustrato comercial, ácido 6-nitro-3- (fenil -acetamido) benzoico
µl de muestras del cultivo celular se adicionan a los pozos de una placa de microtitulación de 96 pozos la cual contiene 0.1% del sustrato en amortiguador de fosfato de potasio 0.2 M, pH 7.4. La reacción se sigue espectrofotométricamente a 405 nm.
2. Probar con p-dimet i 1-aminobenzaldehído (p-DAB) :
Sonicar una muestra de cultivo celular de 1 ml y adicionar 1 ml de 4.5% K de penicilina G en amortiguador de fosfato de potasio 200 mM (pH 7.5) . Incubar 15 minutos a 37°C con agitación. Adicionar 1 ml de acetonitrilo al 99.0% y ácido acético al 1.0%. Mezclar y centrifugar. A 1 ml de sobrenadante adicionar 3 ml del reactivo p-DAB. (Para preparar el reactivo p-DAB; combinar 1 parte de 10 mg/ml de p-DAB y 6 partes de amortiguador de acetato de sodio) . Incubar 4 minutos y leer a - 415 nm . Calcular IU/ml usando un factor estándar de 100 µg/ml de 6APA.
Ej emplo 6
Prueba de la Actividad Sintética de Penicilina G acilasas
(1) Cefadroxil
Disolver 10.5 g de la sal de hidroxietilo de p-hidroxifenilglicina en 37.5 ml de agua. Ajustar el pH a 8.0 con hidróxido de amonio. Adicionar 4.8 g de 7-ADCA y disolver (pH 7.5) . Ajustar el pH a 7.0 con HCl 6N . Llevar el volumen a 60 ml . Dividir la mezcla de reacción en 12 partes iguales de 5 ml cada una. Adicionar la penicilina G acilasa inmovilizada a una concentración final de 40 I U/ml. Remover las alícuotas a los tiempos deseados para la prueba de HPLC.
(2) Síntesis de Cefproxil
Adicionar 4.5 g de la sal de éster a 60 ml de agua, pH a 8.26. Adicionar 3.6 g de 7-PACA. Adicionar 1.72 ml de hidróxido de amonio a pH 8.26. Adicionar 4.5 g del éster, pH a 7.56. Dividir la mezcla de reacción en 12 partes iguales. Adicionar la penicilina G acilasa inmovilizada a concentraciones finales de 40 IU/ml.
(3) Prueba de Amoxicilina
Adicionar 3.5 g de la sal de éster a 12.5 ml de agua. pH a 8.0 con hidróxido de amonio. Adicionar 1.6 g de 6-APA, disolver y pH a 7.0. Llevar el volumen a 20 ml . Dividir la mezcla de reacción en 4 partes iguales de 5 ml . Adicionar la penicilina G acilasa inmovilizada a una concentración final de 40 IU/ml. Remover las alícuotas a los tiempos designados para la prueba de HPLC.
(4) Pruebas de HPLC
Las muestras se manipulan como sigue:
A 200 µl de la muestra, adicionar 1 ml de amortiguador KP 20 mM, pH 7.4, agitar y remover 20 µl del sobrenadante para ampolletas HPLC. Adicionar 800 µl del amortiguador e inyectar 10 µl para la prueba. Las pruebas por HPLC para cada reacción se ilustran en la Tabla 1.
Tabla 1
Los procedimientos de HPLC para el análisis de la composición de las mezclas de reacción de la enzima para la síntesis de antibióticos de ß-lactama
La mutante de penicilina G acilasa con una alanina sustituida para la fenilalanina 24 en la subunidad beta se encontró que demuestra la síntesis superior para los antibióticos de ß-lactama aunque exhibió 25% de la actividad hidrolítica. Esta mutante de penicilina G acilasa se designará como Fl. Estos resultados se demuestran en las Tablas 2-12.
Tabla 2
Síntesis vs actividad de hidrólisis de la penicilina G acilasas mutantes y de tipo silvestre
'MUTANTE ÍHIDRÓLISIS SÍNTESIS 1 'Tipo silvestre :?oo% 100% Met 142-Ala 10% 0% .Val 56-Thr 4 <i % o 127% ? Phel46-Ala 5% 0% 'Phe24-Ala 25% 330% Phe24-Val 36% 3% i Phe24-Leu 80% 1 229%
ml de cultivos se inocularon en suero de Lur ia-Berta i ni que contuvo 30 µg/ml de canamicina y se agitó durante toda la noche a 28 C. Los cultivos se inducieron con 800 µm de IPTG durante 4 horas. Las células se concentraron 10 pliegues y se sonicaron.
La hidrólisis se determinó por la prueba de la placa de microtitulación. El sustrato fue ácido nitro ( fenil-acetamido) benzoico al 0.1% en amortiguador de fosfato de potasio 0-0.2 M. Los resultados se expresan como % de tipo silvestre.
La síntesis se determinó mediante la formación de cefadroxil después de 4 horas de incubación con éster de hidroxi etilo y 7 ADCA. La prueba se desarrolló por HPLC. La actividad se expresa como % de tipo silvestre .
Tabla 3
La posición 24 beta (fenilalanina) en la Penicilina G acilasa se ha sustituido con cada posible aminoácido. La actividad síntesis e hidrólisis para cada construcción se ha analizado en tres experimentos separados. Los resultados promediados se listan posteriormente:
Cambio de aminoácido Hidrólisis Síntesis
Alanina 22% 330%
Valina 36% 3% Leucina 80% 227%
Ácido aspártico 10% 4% Histidina 7% 6% Lisina 5% 0 Metionina 7% 0 Prolina 31% Serina 39% 23% Tirosina 2% 0 Arginina 7% 4% Asparagina 8% 6% Ácido glutámico 7% 0 Glutamina ,3% 28% Isoleucina 'e* 4% Treonina '20% 6% Triptofan 9% 9% Glicina 27% 19% Cisteína 26% 0% Alanina+Val (B) 56-Thr 0% 0% Leucina+Val (B) 56-Thr 6% 0% Tabla 4
Efectos de la Temperatura sobre el Rendimiento Sintético de Cefprozil
La reacción se corre a pH 7.5 con 2.3 equivalentes molares de éster a 7-PACA
Se reporta el por ciento de conversión de 7-PACA a cefprozil en 120 minutos.
Tabla 5
Efectos de la Temperatura sobre el Rendimiento de Síntesis de Cefadroxil La reacción se corre a pH 7.0 con 1.9 equivalentes molares de éster a 7-ADCA
Se reporta el por ciento de conversión de 7-ADCA a cefadroxil en 120 minutos.
Tabla 6
Efectos de las Concentraciones de la Enzima sobre el
Rendimiento de Síntesis de Cefprozil
La reacción se corre a pH 7.5, con 2.3 equivalentes molares de éster a 7-PACA.
Se reporta el por ciento de conversión de 7-PACA a cefprozil en 120 minutos.
Tabla 7
Efectos de las Concentraciones de la Enzima sobre el Rendimiento de Síntesis de Cefadroxil
La reacción se corre a pH 7.0, temperatura ambiente con 1.9 equivalentes molares de éster a 7-ADCA.
Se reporta el por ciento de conversión de 7-PACA a cefprozil en 120 minutos.
Efectos de la Concentración del Donador de Acilo sobre el Rendimiento de Síntesis de Cefprozil
La reacción se corre a pH 6.5 y a temperatura ambiente .
0.2 g de la enzima inmovilizada se adiciona a las reacciones .
Se reporta el por ciento de conversión de 7-PACA a cefprozil en 120 minutos.
Tabla 9
Efectos de la Concentración del Donador de Acilo sobre el Rendimiento de Síntesis de Cefadroxil
La reacción se corre a pH 7.0 y a temperatura ambiente .
0.2 g de la enzima inmovilizada se adiciona a las reacciones
Se reporta el por ciento de conversión de 7-ADCA a cefadroxil en 120 minutos.
Tabla 10
Semisíntesis de Amoxicilina de Penicilina G acilasa de Tipo silvestre vs Mutante WT PGA Fl PGA
Tabla 11
Condiciones Optimizadas para la Semisíntesis de Cefprozil
Temperatura Temperatura ambiente pH 6.5 1.2-1.3 equivalentes
Concentración de Ester molares Concentración de la 0.2 g en un volumen de 5 ml
Enzima
Tabla 12
Condiciones Optimizadas para la Semisíntesis de Cefadroxil
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes .
Claims (31)
1. Una penicilina G acilasa procariota mutante, caracterizada porque tiene una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones que corresponden a A142, A146, B24, B560 B177.
2. La acilasa mutante de la reivindicación 1, caracterizada porque se origina de E . col i .
3. La acilasa mutante de la rei indicación 2, caracterizada porque la sustitución de aminoácido es una o más de las siguientes: Met er. A142 a Ala; Phe en A146 a Ala; Phe en B 24 a Ala, Leu, Val, Pro, Tyr, Met, Ser, Cys, Gly, Asp, Lys, Arg, Tyr, Thr, lie, Glu, Gln, Asn o His; Val en B56 a Ser o Thr; He en B177 a Phe.
4. La acilasa mutante de la reivindicación 1, caracterizada porque la sustitución de aminoácido es Met en A142 a Ala.
5. La acilasa mutante de la reivindicación 1, caracterizada porque la sustitución de aminoácido es Phe en A146 a Ala.
6. La acilasa mutante de la reivindicación 1, caracterizada porque la sustitución de aminoácido es Phe en B24 a Ala, Leu, Val, Pro, Tyr, Met, Ser, Cys, Gly, Asp, Lys, Arg, Typ, Thr, He, Glu, Gln, Asa o Hist.
7. La acilasa mutante de la reivindicación 1, caracierizada porque la sustitución de aminoácido es Val en B56 a Ser o Thr.
8. La acilasa mutante de la reivindicación 1, caracterizada porque la sustitución de aminoácido es He en B177 a Phe.
9. La acilasa mutante de la reivindicación 1, caracterizada porque la sustitución de aminoácido es Phe en B24 a Ala.
10. Una mutante de penicilina G acilasa de E . col i de tipo II, caracterizada porque tiene una sustitución de aminoácido de PheB24-Ala.
11. La acilasa mutante de la reivindicación 1, caracterizada porque el término N de la subunidad alfa se trunca por 1 o 2 aminoácidos; el término C de la subunidad alfa se trunca por 10 a 15 aminoácidos; o el término N de la subunidad alfa se trunca por 1 o 2 aminoácidos y el término C de la subunidad alfa se trunca por 10 a 15 aminoácidos.
12. La acilasa mutante de la reivindicación 11, caracterizada porque el término C de la subunidad alfa se trunca pof 12 o 13 aminoácidos.
13. Una secuencia de ácido nucleico, caracterizada porque codifica la acilasa mutante de la rei indicación 1.
14. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 13, caracterizada porque codifica la acilasa mutante de la reivindicación 2.
15. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 13, caracterizada porque codifica la acilasa mutante de la reivindicación 3.
16. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 13, caracterizada porque codifica la acilasa mutante de la reivindicación 4.
17. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 13, caracterizada porque codifica la acilasa mutante de la reivindicación 5.
18. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 13, caracterizada porque codifica la acilasa mutante de la reivindicación 6.
19. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 13, caracterizada porque codifica la acilasa mutante de la reivindicación 7.
20. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 13, caracterizada porque codifica la acilasa mutante de la reivindicación 8.
21. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 13, caracterizada porque codifica la acilasa mutante de la reivindicación 9.
22. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 13, caracterizada porque codifica la acilasa mutante de la reivindicación 10.
23. El ácido nucleico de la reivindicación 13, caracterizado porque codifica la acilasa mutante de la reivindicación 11.
24. El ácido nucleico de la reivindicación 13, caracterizado porque codifica la acilasa mutante de la reivindicación 12.
25. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 13, caracterizada porque es ADN.
26. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico como se define en la reivindicación 13 enlazado operablemente a una secuencia promotora capaz de dirigir su expresión en una célula huésped.
27. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de expresión de la reivindicación 26.
28. Un proceso para producir una mutante de penicilina G acilasa, caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 27 bajo condiciones apropiadas para la producción de la acilasa mutante.
29. Un proceso para producir un ácido penicilánico 6-acilado semi-sintético, un ácido cefalosporánico 7-acilado o una sal ' o éster del mismo, caracterizado porque comprende poner en contacto ß-lactama 6-amino correspondiente o la sal o éster de la misma, respectivamente, 7-ACA y un agente de acilación con una acilasa mutante como se define en la reivindicación 1 bajo condiciones apropiadas para que la acilación se presente.
30. El proceso de la reivindicación 29, caracterizado porque la acilasa mutante se inmovi liza.
31. El proceso de la reivindicación 30, caracterizado porque la acilasa mutante tiene la sustitución de aminoácido en B24(Phe) a Ala.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US030365 | 1996-11-05 | ||
| US60/030365 | 1996-11-05 |
Publications (1)
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