KR20140092835A

KR20140092835A - 히단토이나제의 돌연변이체

Info

Publication number: KR20140092835A
Application number: KR1020147012821A
Authority: KR
Inventors: 스테펜 오쓰발트; 하이코 슈스테르; 위르겐 루스; 안드레아스 카라우; 울리히 슈바네베르크; 로니 마티네즈; 헤만수 문다다; 우르술라 홀테르
Original assignee: 에보닉 인두스트리에스 아게
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2012-11-16
Publication date: 2014-07-24
Also published as: JP2014533497A; IN2014KN00866A; US20150056667A1; JP6279478B2; CA2856127A1; BR112014011664A2; EP2780451A1; KR102027201B1; US20180237814A1; CA2856127C; ES2652387T3; DK2780451T3; US9957536B2; CN109468304B; WO2013072486A1; EP2780451B1; US10822627B2; PL2780451T3; CN109468304A; CN104053772A

Abstract

본 발명은, (i) 서열 6-20 및 서열 73-119로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 (ii) 서열 6-20 및 서열 73-119의 아미노산 서열에서, 1 내지 75개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가되어 있는 것인 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제이며, 추가로 히단토이나제의 촉매 활성은 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제의 촉매 활성보다 1.2배 이상만큼 더 높은 것인 히단토이나제에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 히단토이나제를 사용하는, 아미노산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

히단토이나제의 돌연변이체 {MUTANTS OF HYDANTOINASE}

본 발명은 일반적으로 히단토이나제에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 사전 단리된 히단토이나제와 비교하여 증가된 효소적 활성을 보이는 일련의 변형된 히단토이나제, 및 아미노산을 제조하는 방법에서의 그의 용도, 특히 전세포 촉매에서의 그의 용도에 관한 것이다.

효소를 사용하여 아미노산을 제조하는 방법은 공지되어 있다. 추가로, 출발 물질로서 화학적으로 저렴하게 합성된 5-치환된 히단토인 화합물을 광학 활성인 아미노산으로 비대칭으로 분해하는 것을 포함하는 방법이 존재한다. 5-치환된 히단토인 화합물로부터의 광학 활성인 아미노산을 제조하는 상기 방법은 제약 제제, 화학 산업 제품, 식품 첨가제 등을 제조하는 데 중요하다.

5-치환된 히단토인 화합물로부터 아미노산을 제조하는 상기 방법에서는 (1) 가수분해에 의해 5-치환된 히단토인 화합물을 각 N-카르바모일아미노산으로 변환시킴으로써 N-카르바모일아미노산을 형성하는 반응을 촉매화하는, 히단토이나제 (히단토인 가수분해 효소)로 지칭되는 효소; (2) 가수분해에 의해 상기 언급된 N-카르바모일아미노산을 각 아미노산으로 변환시킴으로써 광학 활성인 아미노산을 형성하는 반응을 촉매화하는, N-카르바모일아미노산 히드롤라제로 지칭되는 효소인, 2가지 효소가 필요하다.

본원에서 '히단토이나제'로 지칭되는 히단토인 가수분해 효소는 매우 다양한 특이성 및 생물학적 기능을 갖는 다양한 부류의 효소를 포함한다. 히단토이나제의 중요한 특성은 그의 거울상이성질체 선택성(enantioselectivity)인데, 이를 통해 히단토이나제는 광학상 순수한 D- 또는 L-아미노산을 제조하는 데 있어 가치를 가지게 된다. 5-치환된 히단토인 화합물로부터 광학 활성인 아미노산을 제조하기 위해서는 히단토이나제 및/또는 N-카르바모일아미노산 히드롤라제가 거울상이성질체 선택성인 효소여야 한다. L-아미노산-생산 미생물에 의해, 또는 상기 미생물에 의해 생산된 효소-함유 물질에 의해 L-아미노산을 제조하는 방법은 기술되어 있으며, 여기서 다양한 속, 예컨대 플라보박테리움(Flavobacterium), 바실루스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 아르트로박터(Arthrobacter) (문헌 [J. Biotechnol. 46, 63, 1996])의 미생물이 사용되었다.

히단토이나제 유전자 및 N-카르바모일아미노산 히드롤라제 유전자는 아르트로박터 속 미생물로부터 단리되었고, 상기 유전자에 의해 코딩된 재조합 단백질을사용하여 L-아미노산을 제조하였다.

광학상 순수한 아미노산 제조에 있어서의 히단토이나제의 중요성을 고려해 볼 때, 아미노산 제조와 관련하여 개선된 특성을 갖는 변형된 효소를 개발하는 것에 노력이 집중되고 있다. 이러한 노력의 결과로서, 바람직한 효소적 특성을 갖는 히단토이나제를 생산하는 다수의 미생물이 단리되고 확인되었다. 미국 특허 번호 제5,516,660호에는 D-, L- 및/또는 D,L-5-일치환된 히단토인으로부터 L-알파-아미노산을 제조할 수 있는 히단토이나제를 생산하는 아르트로박터 종 균주가 개시되어 있다.

더욱 최근에는 전세포 촉매 기술을 사용하여 각 히단토인으로부터 D- 및 L-아미노산을 산업 규모로 제조하는 것이 개발되었다 (WO 2002/077212, WO 2004/042047, WO 2000/058449, WO 2003/042412). 촉매로는 미생물, 예컨대 이. 콜라이(E. coli)에서 공발현된 D-히단토이나제, 히단토인 라세마제 및 D-카르바모일라제를 포함한다.

국제 특허 출원 WO 00/58449에는 활성을 약 40% 증가시키는, 아르트로박터로부터 유래된 히단토이나제의 돌연변이체가 개시되어 있다.

이용가능한 아르트로박터 종으로부터 유래된 상기의 표준 촉매를 검사한 결과, 각 트립토판 히단토인으로부터 D-트립토판을 제조할 수는 있지만, 변환율은 매우 낮은 것으로 나타났다. 변환율이 낮은 것은 기질로서 트립토판 히단토인을 수용하는 이용가능한 야생형 아르트로박터 종 히단토이나제의 특성이 불충분하기 때문이다.

본 발명의 목표는 5-치환된 히단토인, 바람직하게는 트립토판 히단토인과 관련하여 변환율이 증가된 히단토이나제, 및 바람직하게는 이. 콜라이 숙주에서 공발현된 히단토인 라세마제, 히단토이나제 및 카르바모일라제를 사용하여, 특히 L-트립토판 히단토인으로부터 출발하여 아미노산, 바람직하게는 D-트립토판을 제조하는 방법을 제공하는 것이었다.

따라서, 본 발명의 목적은 변환율이 증진된, 특히 트립토판 히단토인과 관련하여 변환율이 증진된 개선된 히단토이나제를 제공하고자 하는 것이었다. 추가로, 히단토이나제의 거울상이성질체 선택성을 증가시키는 것이 유익할 수 있다.

본 발명의 목적은

(i) 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 73, 서열 74, 서열 75, 서열 76, 서열 77, 서열 78, 서열 79, 서열 80, 서열 81, 서열 82, 서열 83, 서열 84, 서열 85, 서열 86, 서열 87, 서열 88, 서열 89, 서열 90, 서열 91, 서열 92, 서열 93, 서열 94, 서열 95, 서열 96, 서열 97, 서열 98, 서열 99, 서열 100, 서열 101, 서열 102, 서열 103, 서열 104, 서열 105, 서열 106, 서열 107, 서열 108, 서열 109, 서열 110, 서열 111, 서열 112, 서열 113, 서열 114, 서열 115, 서열 116, 서열 117, 서열 118, 또는 서열 119로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는

(ii) 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 73, 서열 74, 서열 75, 서열 76, 서열 77, 서열 78, 서열 79, 서열 80, 서열 81, 서열 82, 서열 83, 서열 84, 서열 85, 서열 86, 서열 87, 서열 88, 서열 89, 서열 90, 서열 91, 서열 92, 서열 93, 서열 94, 서열 95, 서열 96, 서열 97, 서열 98, 서열 99, 서열 100, 서열 101, 서열 102, 서열 103, 서열 104, 서열 105, 서열 106, 서열 107, 서열 108, 서열 109, 서열 110, 서열 111, 서열 112, 서열 113, 서열 114, 서열 115, 서열 116, 서열 117, 서열 118, 또는 서열 119의 아미노산 서열에서, 1 내지 φ개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가되어 있는 것인 아미노산 서열

로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고, 여기서 φ는 φ = 75로 정의되는 것인 히단토이나제이며,

추가로 히단토이나제의 촉매 활성은 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제의 촉매 활성보다 ζ배 이상만큼 더 높고, 여기서 ζ는 ζ = 1.2로 정의되는 것인 히단토이나제에 의해 해결된다.

본 발명과 관련하여, 그리고 달리 정의되지 않는 한, 히단토이나제의 촉매 활성은 5-치환된 D-히단토인 화합물의 상응하는 D-카르바모일아미노산으로의 변환과 관련되는 상기 효소의 촉매 활성인 것으로 이해하여야 한다.

본 발명과 관련하여, 히단토이나제의 거울상이성질체 선택성은 D_활성/L_활성 비로 정의되며, 여기서 D_활성 = 5-치환된 D-히단토인 화합물을 상응하는 D-카르바모일아미노산으로 변환시키기 위한 상기 효소의 촉매 활성, 및 L_활성 = 5-치환된 D-히단토인 화합물을 상응하는 D-카르바모일아미노산의 거울상이성질체로 변환시키기 위한 상기 효소의 촉매 활성, 즉, L_활성 = 상응하는 5-치환된 L-히단토인 화합물을 상응하는 L-카르바모일아미노산으로 변환시키기 위한 상기 효소의 촉매 활성이다.

본 발명과 관련하여, 아미노산 부가라는 용어는 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 아미노산 잔기를 첨가하는 것을 의미힌다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, φ는 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1로부터 선택된다.

본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, ζ는 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30으로부터 선택된다.

본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, φ 및 ζ는 하기로부터 선택된다:

φ= 70 및 ζ = 1.5, φ= 70 및 ζ = 2, φ= 70 및 ζ = 3, φ= 70 및 ζ = 4, φ= 70 및 ζ = 5, φ= 70 및 ζ = 10, φ= 70 및 ζ = 15, φ= 70 및 ζ = 20, φ= 70 및 ζ = 25, φ= 70 및 ζ = 30,

φ= 60 및 ζ = 1.5, φ= 60 및 ζ = 2, φ= 60 및 ζ = 3, φ= 60 및 ζ = 4, φ= 60 및 ζ = 5, φ= 60 및 ζ = 10, φ= 60 및 ζ = 15, φ= 60 및 ζ = 20, φ= 60 및 ζ = 25, φ= 60 및 ζ = 30,

φ= 50 및 ζ = 1.5, φ= 50 및 ζ = 2, φ= 50 및 ζ = 3, φ= 50 및 ζ = 4, φ= 50 및 ζ = 5, φ= 50 및 ζ = 10, φ= 50 및 ζ = 15, φ= 50 및 ζ = 20, φ= 50 및 ζ = 25, φ= 50 및 ζ = 30,

φ= 40 및 ζ = 1.5, φ= 40 및 ζ = 2, φ= 40 및 ζ = 3, φ= 40 및 ζ = 4, φ= 40 및 ζ = 5, φ= 40 및 ζ = 10, φ= 40 및 ζ = 15, φ= 40 및 ζ = 20, φ= 40 및 ζ = 25, φ= 40 및 ζ = 30,

φ= 30 및 ζ = 1.5, φ= 30 및 ζ = 2, φ= 30 및 ζ = 3, φ= 30 및 ζ = 4, φ= 30 및 ζ = 5, φ= 30 및 ζ = 10, φ= 30 및 ζ = 15, φ= 30 및 ζ = 20, φ= 30 및 ζ = 25, φ= 30 및 ζ = 30,

φ= 20 및 ζ = 1.5, φ= 20 및 ζ = 2, φ= 20 및 ζ = 3, φ= 20 및 ζ = 4, φ= 20 및 ζ = 5, φ= 20 및 ζ = 10, φ= 20 및 ζ = 15, φ= 20 및 ζ = 20, φ= 20 및 ζ = 25, φ= 20 및 ζ = 30,

φ= 10 및 ζ = 1.5, φ= 10 및 ζ = 2, φ= 10 및 ζ = 3, φ= 10 및 ζ = 4, φ= 10 및 ζ = 5, φ= 10 및 ζ = 10, φ= 10 및 ζ = 15, φ= 10 및 ζ = 20, φ= 10 및 ζ = 25, φ= 10 및 ζ = 30,

φ= 9 및 ζ = 1.5, φ= 9 및 ζ = 2, φ= 9 및 ζ = 3, φ= 9 및 ζ = 4, φ= 9 및 ζ = 5, φ= 9 및 ζ = 10, φ= 9 및 ζ = 15, φ= 9 및 ζ = 20, φ= 9 및 ζ = 25, φ= 9 및 ζ = 30,

φ= 8 및 ζ = 1.5, φ= 8 및 ζ = 2, φ= 8 및 ζ = 3, φ= 8 및 ζ = 4, φ= 8 및 ζ = 5, φ= 8 및 ζ = 10, φ= 8 및 ζ = 15, φ= 8 및 ζ = 20, φ= 8 및 ζ = 25, φ= 8 및 ζ = 30,

φ= 7 및 ζ = 1.5, φ= 7 및 ζ = 2, φ= 7 및 ζ = 3, φ= 7 및 ζ = 4, φ= 7 및 ζ = 5, φ= 7 및 ζ = 10, φ= 7 및 ζ = 15, φ= 7 및 ζ = 20, φ= 7 및 ζ = 25, φ= 7 및 ζ = 30,

φ= 6 및 ζ = 1.5, φ= 6 및 ζ = 2, φ= 6 및 ζ = 3, φ= 6 및 ζ = 4, φ= 6 및 ζ = 5, φ= 6 및 ζ = 10, φ= 6 및 ζ = 15, φ= 6 및 ζ = 20, φ= 6 및 ζ = 25, φ= 6 및 ζ = 30,

φ= 5 및 ζ = 1.5, φ= 5 및 ζ = 2, φ= 5 및 ζ = 3, φ= 5 및 ζ = 4, φ= 5 및 ζ = 5, φ= 5 및 ζ = 10, φ= 5 및 ζ = 15, φ= 5 및 ζ = 20, φ= 5 및 ζ = 25, φ= 5 및 ζ = 30,

φ= 4 및 ζ = 1.5, φ= 4 및 ζ = 2, φ= 4 및 ζ = 3, φ= 4 및 ζ = 4, φ= 4 및 ζ = 5, φ= 4 및 ζ = 10, φ= 4 및 ζ = 15, φ= 4 및 ζ = 20, φ= 4 및 ζ = 25, φ= 4 및 ζ = 30,

φ= 3 및 ζ = 1.5, φ= 3 및 ζ = 2, φ= 3 및 ζ = 3, φ= 3 및 ζ = 4, φ= 3 및 ζ = 5, φ= 3 및 ζ = 10, φ= 3 및 ζ = 15, φ= 3 및 ζ = 20, φ= 3 및 ζ = 25, φ= 3 및 ζ = 30,

φ= 2 및 ζ = 1.5, φ= 2 및 ζ = 2, φ= 2 및 ζ = 3, φ= 2 및 ζ = 4, φ= 2 및 ζ = 5, φ= 2 및 ζ = 10, φ= 2 및 ζ = 15, φ= 2 및 ζ = 20, φ= 2 및 ζ = 25, φ= 2 및 ζ = 30,

φ= 1 및 ζ = 1.5, φ= 1 및 ζ = 2, φ= 1 및 ζ = 3, φ= 1 및 ζ = 4, φ= 1 및 ζ = 5, φ= 1 및 ζ = 10, φ= 1 및 ζ = 15, φ= 1 및 ζ = 20, φ= 1 및 ζ = 25, φ= 1 및 ζ = 30.

본 발명에 따라, 미생물 아르트로박터 종에 의해 생산된 야생형 히단토이나제와 비교하여 촉매 활성이 증진된 변형된 히단토이나제 (히단토인 가수분해 효소)를 제공한다. 본 발명의 히단토이나제는 추가로 미생물 아르트로박터 종에 의해 생산된 야생형 히단토이나제와 비교하여 증가된 거울상이성질체 선택성을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 히단토이나제는 5-치환된 히단토인 화합물, 특히 D-트립토판 히단토인과 관련하여 증진된 변환율을 보이고, 따라서 D-아미노산을 제조하는 방법에서 적합하다. 상기 방법은 바람직하게 특히, D-히단토이나제, D-카르바모일라제 및 임의로 히단토인 라세마제를 사용하여 각 트립토판 히단토인으로부터 출발하여 D-트립토판을 제조하는 데 적합하다. 상기 효소는 바람직하게는 미생물, 예컨대 이. 콜라이에서 공발현된다. 5-치환된 히단토인 화합물로부터 아미노산을 제조하는 상기 방법에서, 히단토이나제는 5-치환된 히단토인 화합물, 바람직하게는 (D-트립토판 히단토인)을 가수분해시킴으로써 N-카르바모일아미노산을 형성하는 반응을 촉매화함으로써 각 N-카르바모일아미노산 (바람직하게, N-카르바모일 D-트립토판)을 제조한다. 상기 N-카르바모일아미노산은 N-카르바모일아미노산 히드롤라제에 의해 가수분해되어 각 아미노산 (바람직하게, D-트립토판)을 형성한다.

트립토판 제조를 위해, 출발 물질로서는 또한 D,L-트립토판 히단토인 또는 L-트립토판 히단토인이 사용될 수 있는데, 특히 여기서 본 발명의 히단토이나제에 대한 D-트립토판 히단토인 기질을 제공하기 위해 히단토인 라세마제의 존재하에서 이루어지는 것이 바람직할 수 있다. 상기 방법은 바람직하게는 특히, 히단토인 라세마제, D-히단토이나제 및 D-카르바모일라제를 사용하여 각 D,L- 또는 L-트립토판 히단토인으로부터 출발하는 D-트립토판을 제조하는 데 적합하다. 상기 3가지 효소는 바람직하게 미생물, 예컨대 이. 콜라이에서 공발현된다.

당업자는 특정 참조 서열의 특정 아미노산 위치 (예컨대, 152번)와 관련하여 제공되는 정보는 변이체 히단토이나제 및 상동성 아미노산 서열에 전달될 수 있음을 이해하며, 당업자는 참조 아미노산 서열을 변이체 서열과 정렬하고, 변이체 서열 중 상응하는 위치 (예컨대, 아미노산 위치 152번)를 결정할 수 있다. 본 실시예를 참조하여, 당업자는 변이체 서열 중 참조 서열의 아미노산 위치 152번에 상응하는 아미노산 위치는 반드시 변이체 아미노산 서열의 152번째 아미노산 잔기일 필요는 없을 수도 있지만, 그러나 변이체 효소의 3차원 구조에서는 같은 위치를 가진다는 것을 이해한다. 아미노산 서열을 정렬하는 방법은 하기에서 추가로 상세하게 기술되어 있다. 참조 서열과 비교하여 변이체 서열 중 상이한 위치를 결정하기 위해 다른 방법 또한 사용될 수 있다.

도 1은 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제를 발현하는 야생형 유전자 hyuH 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 D-카르바모일라제를 발현하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pAS6-HyuH를 보여주는 것이다. 플라스미드 지도에서 표시된 약어는 하기 요소를 나타낸다: D-Carb. = D-카르바모일라제 유전자 NRRL, 아그로박테리움(Agrobacterium) 종; rhaP = 람노스 프로모터; hyuH = 히단토이나제 DSM9771; rrnB = 전사 종결인자; bla = 베타-락타마제; o = 복제 기점 ColEI.
서열 설명
본 발명과 관련하여, 폴리펩티드 서열의 변이체는 종종 포맷 AA1XAA2에서 원래 서열과 비교하여 변이체 서열 중에 존재하는 각 아미노산 치환을 나타내는 포맷으로 기술되며, 여기서 AA1은 원래 서열 중 위치 X에 존재하는 아미노산 잔기를 나타내고, AA2는 변이체 서열 중 위치 X에 존재하는 아미노산 잔기를 나타낸다.
서열 1은 아르트로박터 종으로부터의 야생형 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 2는 아르트로박터 종으로부터의 야생형 히단토이나제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 3은 아르트로박터 종으로부터의 야생형 히단토이나제 라세마제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 4는 아르트로박터 종으로부터의 야생형 D-카르바모일라제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 5는 위치 152, 64, 71, 72, 95, 154, 181, 284, 285, 398 및 452번의 아미노산 잔기 X가 특허청구범위에 따라 정의되고, 위치 152번의 아미노산 잔기는 알라닌 이외의 다른 임의의 아미노산 잔기를 나타내는 것인, 참조로서의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 6은 위치 152번의 알라닌이 글리신으로 치환된, 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 7은 위치 152번의 알라닌이 시스테인으로 치환된, 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 8은 위치 152번의 알라닌이 세린으로 치환된, 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 9는 위치 152번의 알라닌이 트레오닌으로 치환된, 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 10은 위치 152번의 알라닌이 발린으로 치환된, 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 11은 위치 152번의 알라닌이 세린으로 치환되고, 위치 154번의 발린이 이소류신으로 치환된, 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 12는 위치 152번의 알라닌이 발린으로 치환되고, 위치 154번의 발린이 시스테인으로 치환된, 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 13은 위치 152번의 알라닌이 시스테인으로 치환되고, 위치 154번의 발린이 세린으로 치환된, 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 14는 위치 71번의 아르기닌이 아스파라긴으로 치환되고, 위치 72번의 티로신이 히스티딘으로 치환되고, 위치 152번의 알라닌이 세린으로 치환된, 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 15는 위치 71번의 아르기닌이 아스파라긴으로 치환되고, 위치 72번의 티로신이 아르기닌으로 치환되고, 위치 152번의 알라닌이 세린으로 치환된, 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 16은 위치 71번의 아르기닌이 발린으로 치환되고, 위치 72번의 티로신이 아르기닌으로 치환되고, 위치 152번의 알라닌이 세린으로 치환된, 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 17은 위치 71번의 아르기닌이 세린으로 치환되고, 위치 72번의 티로신이 아르기닌으로 치환되고, 위치 152번의 알라닌이 시스테인으로 치환되고, 위치 154번의 발린이 세린으로 치환되고, 위치 181번의 발린이 알라닌으로 치환된, 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 18은 위치 71번의 아르기닌이 티로신으로 치환되고, 위치 72번의 티로신이 아르기닌으로 치환되고, 위치 152번의 알라닌이 세린으로 치환된, 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 19는 위치 71번의 아르기닌이 류신으로 치환되고, 위치 152번의 알라닌이 시스테인으로 치환되고, 위치 154번의 발린이 세린으로 치환된, 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 20은 위치 71번의 아르기닌이 티로신으로 치환되고, 위치 72번의 티로신이 히스티딘으로 치환되고, 위치 152번의 알라닌이 세린으로 치환된, 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 21 내지 72는 하기 표 1에 제시되어 있는 바와 같은 히단토이나제의 다양한 아미노산 위치에서의 돌연변이유발에 사용된 프라이머 서열을 나타낸다.
서열 73은 서열 1과 비교하여 하기 치환: I95H를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 74는 서열 1과 비교하여 하기 치환: V154G를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 75는 서열 1과 비교하여 하기 치환: V154N을 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 76은 서열 1과 비교하여 하기 치환: R71D를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 77은 서열 1과 비교하여 하기 치환: R71E를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 78은 서열 1과 비교하여 하기 치환: V284F를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 79는 서열 1과 비교하여 하기 치환: V154A를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 80은 서열 1과 비교하여 하기 치환: I64T를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 81은 서열 1과 비교하여 하기 치환: I64V를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 82는 서열 1과 비교하여 하기 치환: V154S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 83은 서열 1과 비교하여 하기 치환: V154A, T398A, H452L을 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 84은 서열 1과 비교하여 하기 치환: A152S, V154I를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 85은 서열 1과 비교하여 하기 치환: R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 86은 서열 1과 비교하여 하기 치환: R71V, Y72N, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 87은 서열 1과 비교하여 하기 치환: R71S, Y72N, A152C, V154S, V181A를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 88은 서열 1과 비교하여 하기 치환: R71D, Y72N, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 89은 서열 1과 비교하여 하기 치환: R71Y, Y72N, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 90은 서열 1과 비교하여 하기 치환: I64V, R71I, Y72N, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 91은 서열 1과 비교하여 하기 치환: I64C, R71Y, Y72N, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 92은 서열 1과 비교하여 하기 치환: I64C, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 93은 서열 1과 비교하여 하기 치환: I64C, R71D, Y72H, A152S, F448L을 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 94은 서열 1과 비교하여 하기 치환: I64C, R71D, Y72H, A152S, M417V를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 95은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S14G, I64C, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 96은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S37R, I64C, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 97은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S14G, I64C, R71D, Y72H, A152S, E358K를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 98은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S37R, I64C, R71D, Y72H, A152S, V318A를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 99은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S37R, I64C, R71D, Y72H, A152S, N303S, Q404R을 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 100은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S14G, I64C, R71D, Y72H, A152S, N70D를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 101은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S14G, I64C, R71D, Y72H, A152S, V154A를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 102은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 103은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S14A, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 104은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S14V, I64C, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 105은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S14G, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 106은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S14A, S37W, I64C, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 107은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S14A, S37V, I64C, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 108은 서열 1과 비교하여 하기 치환: D15N, I64C, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 109은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S14V, S37R, I64C, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 110은 서열 1과 비교하여 하기 치환: D15N, I64C, R71D, Y72H, A152S, V154C를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 111은 서열 1과 비교하여 하기 치환: D15N, I64C, R71D, Y72H, A152S, V154I를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 112은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S14P, D15G, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 113은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S14G, D15R, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 114은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S14G, D15Q, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 115은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S14F, D15A, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 116은 서열 1과 비교하여 하기 치환: D15S, S37G, I64C, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 117은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S14P, D15G, S37G, R71D, Y72H, A152S를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 118은 서열 1과 비교하여 하기 치환: S14P, D15G, S37G, I64C, R71D, Y72H를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 119은 서열 1과 비교하여 하기 치환: D15S, S37G, I64C, R71D, Y72H를 보유하는 변이체 히단토이나제의 아미노산 서열을 나타낸다.

상기 설명된 바와 같이, 본 발명은 촉매 활성이 증가되고, 임의로 D-5-치환된 히단토인 기질에 대한, 특히 D-트립토판 히단토인에 대한 거울상이성질체 선택성이 증가된, 아르트로박터 종으로부터의 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 히단토이나제로부터 유래된 신규한 히단토이나제를 제공한다.

본 발명에 따른 히단토이나제는

로부터 선택되는 아미노산 서열을 가기고, 여기서 φ는 φ = 75로 정의되는 것인 히단토이나제이며,

추가로 히단토이나제의 촉매 활성은 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제의 촉매 활성보다 ζ배 이상만큼 더 높고, 여기서 ζ는 ζ = 1.2로 정의된다.

본 발명과 관련하여, 그리고 달리 정의되지 않는 한, 히단토이나제의 촉매 활성은 5-치환된 D-히단토인 화합물의 상응하는 D-카르바모일아미노산으로의 변환과 관련되는 상기 효소의 촉매 활성으로 정의된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 히단토이나제는 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제와 비교하여, 그와 80% 이상의 동일성을 가지거나, 또는 최대 90개의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 가지며,

위치 152, 64, 71, 72, 95, 154, 181, 284, 285, 398 및 452의 아미노산 잔기가 X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398 및 X452로 정의되고, 여기서 상기 아미노산 잔기는 하기와 같이 선택되며:

X152 = 알라닌 이외의 임의의 아미노산 잔기;

X64 = 임의의 아미노산 잔기;

X71 = 임의의 아미노산 잔기;

X72 = 임의의 아미노산 잔기;

X95 = 임의의 아미노산 잔기;

X154 = 임의의 아미노산 잔기;

X181 = 임의의 아미노산 잔기;

X284 = 임의의 아미노산 잔기;

X285 = 임의의 아미노산 잔기;

X398 = 임의의 아미노산 잔기;

X452 = 임의의 아미노산 잔기;

추가로 히단토이나제의 촉매 활성이 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제의 촉매 활성보다 1.2배 이상만큼 더 높다.

바람직한 실시양태에서, 촉매 활성은 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제의 촉매 활성보다 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30배 이상만큼 더 높다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, D-히단토인에 대한 거울상이성질체 선택성은 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제의 거울상이성질체 선택성보다 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100 또는 150배 이상만큼 더 높다. 더욱더 바람직한 실시양태에서, D-5-인돌릴메틸히단토인 (D-트립토판 히단토인)에 대한 히단토이나제의 거울상이성질체 선택성은 서열 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제와 비교하여 1.2배 이상만큼, 바람직하게는 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100 또는 150배 이상만큼 증가된 것이다.

당업자는 본원에 기술된 히단토이나제의 변이체 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다는 것을 이해한다. 상기 변이체 히단토이나제는 각각 서열 1, 및 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제와 비교하여, 그와 80% 이상의 동일성을 가지거나, 또는 최대 90개의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 상기 변이체에서, 참조 아미노산 서열 (각각 서열 1 및 서열 5)과 관련된 본 발명에 따른 특정 아미노산 치환(들)이 유지된다.

추가로, 각각 서열 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20과 80% 이상의 동일성, 바람직하게는 85% 이상의 동일성, 추가로 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 추가로 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 바람직하게는 96% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 97% 이상의 동일성, 추가로 바람직하게는 98% 이상의 동일성 및 가장 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 가지며, 히단토이나제 활성을 갖는 상기 언급된 단백질의 유도체를 제공한다. 상기 개요된 바와 같이, 상기 변이체에서, 참조 서열 (각각 서열 1 및 서열 5)과 관련된 본 발명에 따른 아미노산 치환(들)이 유지된다.

추가로, 서열 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20에 제시된 아미노산 서열과 관련하여 최대 90개의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질로 제시되는, 히단토이나제 활성을 갖는 상기 언급된 단백질의 유도체를 제공한다. 상기 개요된 바와 같이, 상기 변이체에서, 참조 서열 (각각 서열 1 및 서열 5)과 관련된 본 발명에 따른 아미노산 치환(들)이 유지된다.

본 발명은 또한 최대 90개의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 변이체 히단토이나제에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바, "최대 90개의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는"이라는 어구에서 "최대 90개의 아미노산 잔기"라는 범주는 최대 70, 바람직하게는 최대 45, 추가로 바람직하게는 최대 40, 더욱 바람직하게는 최대 35, 추가로 바람직하게는 최대 30, 추가로 바람직하게는 최대 25, 추가로 바람직하게는 최대 20, 더욱 바람직하게는 최대 15, 추가로 바람직하게는 최대 10 및 가장 바람직하게는 최대 5개의 아미노산 잔기로 제한될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "최대 90개의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가를 포함하는"이라는 어구에서 "최대 90개의 아미노산 잔기"라는 용어는 바람직하게는 1 내지 70, 바람직하게는 1 내지 45, 추가로 바람직하게는 1 내지 40, 더욱 바람직하게는 1 내지 35, 추가로 바람직하게는 1 내지 30, 추가로 바람직하게는 1 내지 25, 추가로 바람직하게는 1 내지 20, 더욱 바람직하게는 1 내지 15, 추가로 바람직하게는 1 내지 10 및 가장 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산 잔기를 의미한다. "부가"라는 용어는 상기 언급된 서열과 관련하여 아미노산 잔기의 N-말단 또는 C-말단 첨가를 의미한다.

추가로, 바람직하게는 각각 서열 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 아미노산 서열의 300개 이상, 추가로 바람직하게는 350개 이상 및 특히 바람직하게는 400개 이상 및 가장 바람직하게는 450개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는, 히단토이나제 활성을 가지며 각각 서열 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 아미노산 서열을 갖는 상기 언급된 단백질의 단편, 또는 상기 정의된 바와 같은 그의 유도체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452는 하기와 같이 추가로 제한된다:

X152 = Cys, Gly, Ser, Thr 또는 Val;

X64 = Ile, Thr 또는 Val;

X71 = Arg, Gln, Asp, Glu, Val, Ser, Tyr 또는 Leu;

X72 = Tyr, His 또는 Asn;

X95 = Ile 또는 His;

X154 = Val, Ala, Cys, Gly, Ile, Asn 또는 Ser;

X181 = Val 또는 Ala;

X284 = Val 또는 Phe;

X285 = Ala 또는 Asp;

X398 = Thr 또는 Ala;

X452 = His 또는 Leu.

X152 = Cys, Ser 또는 Val;

X64 = Ile, Thr 또는 Val;

X71 = Arg, Gln, Asp, Glu, Val, Ser, Tyr 또는 Leu;

X72 = Tyr, His 또는 Asn;

X95 = Ile 또는 His;

X154 = Cys, Ile 또는 Ser;

X181 = Val 또는 Ala;

X284 = Val 또는 Phe;

X285 = Ala 또는 Asp;

X398 = Thr 또는 Ala;

X452 = His 또는 Leu.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, X152, X154는 하기와 같이 추가로 제한된다:

X152 = Cys, Gly, Ser, Thr 또는 Val;

X154 = Ala, Cys, Gly, Ile, Asn 또는 Ser.

X152 = Cys, Ser 또는 Val;

X154 = Cys, Ile 또는 Ser.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, X152는 하기와 같이 추가로 제한된다:

X152 = Ser; X152 = Cys; X152 = Val; X152 = Gly 또는 X152 = Thr.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, X152 및 X154는 하기와 같이 추가로 제한된다:

X152 = Ser; X154 = Ile.

X152 = Val; X154 = Cys.

X152 = Cys; X154 = Ser.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, X152, X71, X72, X154, X181는 하기와 같이 추가로 제한된다:

X152 = Ser; X71 = Asp; X72 = His; X154 = Val; X181 = Val.

X152 = Ser; X71 = Asp; X72 = Asn; X154 = Val; X181 = Val.

X152 = Ser; X71 = Val; X72 = Asn; X154 = Val; X181 = Val.

X152 = Cys; X71 = Ser; X72 = Asn; X154 = Ser; X181 = Ala.

X152 = Ser; X71 = Tyr; X72 = Asn; X154 = Val; X181 = Val.

X152 = Cys; X71 = Leu; X72 = Tyr; X154 = Ser; X181 = Val.

X152 = Ser; X71 = Tyr; X72 = His; X154 = Val; X181 = Val.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, X152, X64, X71, X72, X95, X154, X181, X284, X285, X398, X452가 하기와 같이 추가로 제한된 히단토이나제를 제공한다:

X152 = Ser; X64 = Ile; X71 = Arg; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.

X152 = Cys; X64 = Ile; X71 = Arg; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.

X152 = Val; X64 = Ile; X71 = Arg; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.

X152 = Gly; X64 = Ile; X71 = Arg; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.

X152 = Thr; X64 = Ile; X71 = Arg; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His;

X152 = Ser; X64 = Ile; X71 = Arg; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Ile; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.

X152 = Val; X64 = Ile; X71 = Arg; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Cys; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.

X152 = Cys; X64 = Ile; X71 = Arg; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Ser; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.

X152 = Ser; X64 = Ile; X71 = Asp; X72 = His; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.

X152 = Ser; X64 = Ile; X71 = Asp; X72 = Asn; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.

X152 = Ser; X64 = Ile; X71 = Val; X72 = Asn; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.

X152 = Cys; X64 = Ile; X71 = Ser; X72 = Asn; X95 = Ile; X154 = Ser; X181 = Ala; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.

X152 = Ser; X64 = Ile; X71 = Tyr; X72 = Asn; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.

X152 = Cys; X64 = Ile; X71 = Leu; X72 = Tyr; X95 = Ile; X154 = Ser; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.

X152 = Ser; X64 = Ile; X71 = Tyr; X72 = His; X95 = Ile; X154 = Val; X181 = Val; X284 = Val; X285 = Ala; X398 = Thr; X452 = His.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 히단토이나제는 하기 기질: 히단토인, 5-메틸히단토인, 5-벤질히단토인, 5-(4-히드록시벤질)히단토인, 5-인돌릴메틸히단토인, 5-(3,4-디히드록시벤질)히단토인, 5-메틸티오에틸히단토인, 5-이소프로필히단토인, 5-이소부틸히단토인, 5-sec-부틸히단토인, 5-(4-아미노부틸)히단토인, 5-히드록시메틸히단토인, 또는 비천연 아미노산에 상응하는 5-치환된 히단토인 화합물, 각각 그의 유도체 중 하나 이상을 각각의 카르바모일 아미노산으로 변환시키며, 여기서 상기 기질의 변환과 관련하여 히단토이나제의 촉매 활성은 적어도 D-5-인돌릴메틸히단토인의 변환과 관련하여 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제의 촉매 활성만큼 높다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 히단토이나제에 대한 기질은 상기 효소의 기질 특이성으로 가수분해될 수 있는 임의의 D-5-치환된 히단토인 화합물일 수 있다. 그러한 화합물로는 비천연 아미노산에 상응하는 5-치환된 히단토인 화합물 또는 그의 유도체 또한 포함한다. 비천연 아미노산 또는 그의 유도체란 표준 유전자 코드에 의해 코딩되지 않는 아미노산을 의미한다. 비천연 아미노산 또는 그의 유도체로 된 각 히단토인으로는 5-페닐히단토인, 5-(4-히드록시페닐)히단토인, 5-메톡시메틸히단토인, 5-벤질옥시메틸히단토인, 5-(3,4-메틸렌디옥시벤질) 히단토인, 디히드로우라실을 포함한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 히단토이나제의 기질은 D,L-5-인돌릴메틸히단토인, 더욱 바람직하게는 D-5-인돌릴메틸히단토인이다.

본 발명은 또한 본 발명의 히단토이나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

따라서, 본 발명은, 65℃에서 1x 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC) 및 0.1% 소듐 도데실 술페이트 (SDS) 용액 중의 세척을 포함하는 엄격한 조건하에서 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 전장 보체에 혼성화하는 단리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드이며,

히단토이나제의 촉매 활성은 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제의 촉매 활성보다 ζ배 이상만큼 더 높고, 여기서 ζ는 ζ = 1.2로 정의되는 것인, 단리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같은, 본 발명에 따른 히단토이나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직하게, 벡터는 추가로 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결되어 있으며 그의 발현에 적합한 조절 서열을 포함한다.

본 발명은 추가로 상기 기술된 바와 같은, 본 발명에 따른 히단토이나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 단리된 또는 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게, 숙주는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 코리네형 박테리아, 바실루스 종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 숙주 세포는 본 발명에 따른 히단토이나제를 발현한다. 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 적어도 히단토이나제; 히단토이나제 및 히단토인 라세마제; 히단토이나제 및 카르바모일라제; 또는 히단토이나제 및 히단토인 라세마제 및 카르바모일라제로부터 선택되는 효소 활성을 발현한다.

추가로, 본 발명은

(a) 본 발명에 따른 히단토이나제의 히단토이나제 활성 및 카르바모일라제 활성 및 하나 이상의 5-치환된 히단토인을 반응 배지에 제공하고, 임의로 히단토인 라세마제 활성을 상기 반응 배지에 제공하는 단계;

(b) 반응 배지를 인큐베이션시켜, 5-치환된 히단토인이 (a)에서 제공된 효소 활성에 의해 각 아미노산으로 변환될 수 있도록 하는 단계; 및

(c) 각 5-치환된 히단토인의 효소적 변환으로부터 수득된 아미노산을 반응 배지로부터 회수하는 단계

를 포함하는, 아미노산을 제조하는 방법을 제공한다.

바람직한 방법에서, 상기 5-치환된 히단토인은 D,L-5-치환된 히단토인, D,L-5-인돌릴메틸히단토인 (=D,L-트립토판 히단토인), D-5-치환된 히단토인, D-5-인돌릴메틸히단토인 (=D-트립토판 히단토인)으로부터 선택된다.

추가의 바람직한 방법에서, 반응 배지에 제공되는 상기 5-치환된 히단토인은 L-5-치환된 히단토인 또는 D,L-5-치환된 히단토인이고, 추가로 L-5-치환된 히단토인 또는 D,L-5-치환된 히단토인을 D-5-치환된 히단토인으로 변환시키기 위해 히단토인 라세마제 활성을 단계 (a)의 반응 배지에 제공한다.

또 다른 바람직한 방법에서, 제조되는 아미노산은 D-트립토판이고, 5-치환된 히단토인은 D-5-인돌릴메틸히단토인, L-5-인돌릴메틸히단토인 또는 D,L-5-인돌릴메틸히단토인으로부터 선택된다.

본 방법에서, 5-치환된 히단토인은 본 발명의 히단토이나제에 의해 각 카르바모일아미노산으로 변환되고 이는 상기 카르바모일라제 활성에 의해 각 아미노산으로 변환된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 카르바모일아미노산은 N-(아미노카보닐)-DL-트립토판 (=N-카르바모일-DL-트립토판; = CA 인덱스 명칭: N-(아미노카보닐)-트립토판; = 등록 번호: 98299-50-4; 화학식: C12 H13 N3 O3) 또는 N-카르바모일-L-트립토판 (= CA 인덱스 명칭: N-(아미노카보닐)-L-트립토판 = 등록 번호: 89595-64-2; 화학식: C12 H13 N3 O3)으로부터 선택된다.

또 다른 바람직한 방법에서, 반응 배지는 부분적으로 또는 전체적으로 세포 배양 배지로 이루어진 배지이며, 히단토이나제 활성은 본 발명에 따른 숙주 세포에 의해 제공되고, 숙주 세포는 상기 세포 반응 배지에서 배양된다.

특히 바람직한 방법에서, 반응 배지는 부분적으로 또는 전체적으로 세포 배양 배지로 이루어진 배지이며, 카르바모일라제 활성은 본 발명에 따른 숙주 세포에 의해 또는 제2 숙주 세포에 의해 제공되고, 상기 숙주 세포(들)는 상기 반응 배지에서 배양된다.

바람직한 실시양태에서, 바이오매스를 제조하기 위해 별개의 세포에서, 또는 같은 세포에서 히단토이나제 활성 및 카르바모일라제 활성, 및 임의로 히단토인 라세마제 활성을 발현하는 숙주 세포(들)를 세포 배양 배지에서 배양한 후, 세포 배양 배지 및 바이오매스를 분리하고, 완충제 또는 물을 사용하여 바이오매스를 재현탁시킨다. 기질의 변환을 출발시키기 위해 바이오매스를 첨가하기 전, 첨가하는 동안, 또는 그 이후에 기질을 상기 완충제 또는 물에 첨가한다.

본 발명의 히단토이나제는 D,L-5-일치환된 히단토인으로부터 광학상 순수한 아미노산을 제조하는 데 사용하기 위해, 예를 들어 문헌 [Biocatalytic Production of Amino Acids and Derivatives (Rozzell, J. D. and Wagner, F. eds., Hanser Publisher, NY, at pages 75-176 (1992))]에 기술되어 있는 바와 같이 사용될 수 있다. 히단토이나제의 일반적인 용도는 문헌 ["Enzyme catalysis in organic synthesis" (Dranz, K. and Waldmann, H. eds., VCH-Verlag, Weinheim, at pages 409-431 (1995))] 및 [Wagner, T. et al., (Production of 1-메티오닌 from D,L-5-(2-methylthioethyl) hydantoin by resting cells of a new mutant strain of Arthrobacter species DSM 7330, Journal of Biotechnology 46: 63-68 (1996))]에도 또한 기술되어 있다.

D,L- 또는 L-5-치환된 히단토인, 또는 D,L- 또는 L-카르바모일아미노산의 D-아미노산으로의 효소적 변환을 위해, 본 발명의 히단토이나제의 발현, 카르바모일라제의 발현, 및 추가로 바람직하게는 또한 히단토인 라세마제의 발현을 포함하는 전세포 촉매 기술을 적용시키는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 히단토이나제는 본 방법에서 그의 유리 형태 또는 고정화된 형태로도 또한 사용될 수 있다. 또한, 카르바모일라제 및 히단토인 라세마제 역시 고정화될 수 있다. 효소르 고정화시키는 기법은 당업자에게 주지되어 있다. 바람직한 방법은 문헌 [Bhavender P. Sharma, Lorraine F. Bailey and Ralph A. Messing (Immobilisierte BiomateriaIlen Techniken und Anwendungen, Angew. Chem., 94, pp. 836-852 (1992))]; [Dordick et al., (J. Am. Chem. Soc, 116, pp. 5009-5010 (1994))], [Okahata et al., Tetrahedron Lett., 38, pp. 1971 -1974 (1997))], [Adlercreutz et al., (Biocatalysis, 6, 291-305 (1992))]; [Goto et al., (Biotechnol. Prog. 10, pp. 263-268 (1994))], [Kamiya et al., (Biotechnol. Prog., 11, pp. 270-275 (1995))], [Okahata et al., (Tibtech, February 1997, 15, pp. 50-54)]; [Fishman et al., (Biotechnol. Lett., 20, pp. 535-538 (1998))]에서 언급되고 있다.

5-치환된 히단토인 또는 카르바모일아미노산의 각 아미노산으로의 변환은 배치 공정으로 또는 연속 방식으로 수행될 수 있다. 이롭게는, 효소-막-반응기는 반응 용기로서 사용된다 (문헌 [Wandrey et al., in Jahrbuch 1998, Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI S. 151ff.]; [Wandrey et al., in Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds, Vol. 2, VCH 1996, pp. 832 ff.]; [KragI et al., Angew. Chem., 6, pp. 684f. (1996)]).

전세포 촉매 접근법을 사용하는 아미노산 제조와 관련하여, 이롭게는 증식률이 높고, 적용시키고자 하는 성장 조건이 용이하기 때문에 박테리아 세포가 사용된다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 수개의 박테리아가 당업자에게 공지되어 있다. 바람직하게, 이. 콜라이는 이와 관련하여 세포 및 발현 시스템으로서 사용될 수 있다 (문헌 [Yanisch-Perron et al., Gene, 33, 103-109 (1985)]).

아미노산 제조를 위해, 본 발명의 히단토이나제를 발현하고, 바람직하게는 추가로 카르바모일라제를 발현하고, 추가로 바람직하게는 히단토인 라세마제를 발현하는 세포가 배양 배지 중에서 사용될 수 있다. 별법으로, 각각의 단리된 세포, 세척된 세포, 세포 처리 생성물, 조 효소 용액 또는 세포 처리 생성물로부터 수득된 정제된 효소 용액은 반응 혼합물 중에서 사용될 수 있다. 반응 수행을 위해, 각각 기질로서 5-치환된 히단토인 화합물을 포함하는 상기 배양 배지 또는 반응 혼합물을 8시간 내지 5일 동안 방치하거나, 교반시키면서, pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8에서 15 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃의 온도에서 유지시킨다. 상기 배양 배지 또는 반응 혼합물은 각각 추가로 전이 금속 이온, 바람직하게는 Zn² ⁺, Mn² ⁺ 및 Co² ⁺로부터 선택되는 전이 금속 이온을 0.02 mM 내지 10 mM, 바람직하게는 0.1 mM 내지 5 mM의 농도로 포함할 수 있다. 무손상 세포를 사용할 때, 반응 혼합물은 추가로 형질전환된 세포의 성장에 필수적인 영양 성분, 예컨대 탄소 공급원, 질소 공급원 및 무기 이온을 포함할 수 있다. 추가로, 기질 (5-치환된 히단토인 또는 카르바모일아미노산 화합물)은 배양 배지에, 또는 반응 혼합물에 1분량씩으로 첨가될 수 있다.

기술된 방법에서 사용되는 효소는 각각의 역반응도 촉매화할 수 있는 바, 본 발명은 추가로 또한, 기질로서 상기 5-치환된 히단토인 대신 N-카르바모일-D,L-아미노산 또는 N-카르바모일-L-아미노산이 사용되고:

상기 N-카르바모일-D,L-아미노산 또는 N-카르바모일-L-아미노산이 본 발명에 따른 히단토이나제에 의해 각 D,L-5-치환된 히단토인 또는 L-5-치환된 히단토인 화합물로 변환되는, 상기 기술된 바와 같은 D-아미노산을 제조하는 방법도 제공한다. 추가로, 상기 D,L-5-치환된 히단토인 또는 L-5-치환된 히단토인 화합물은 히단토인 라세마제에 의해 D-거울상이성질체로, 즉, 각각의 D-5-치환된 히단토인 화합물로 변환된다. 이어서, D-5-치환된 히단토인 화합물은 본 발명에 따른 히단토이나제에 의해 각각의 N-카르바모일-D-아미노산으로 변환된다. 이어서, 카르바모일라제는 N-카르바모일-D-아미노산을 각각의 D-아미노산으로 변환시킨다. 본 방법의 특히 바람직한 실시양태에서, 기질로서 사용되는 N-카르바모일아미노산은 N-(아미노카보닐)-DL-트립토판 (=N-카르바모일-DL-트립토판; = CA 인덱스 명칭: N-(아미노카보닐)-트립토판; = 등록 번호: 98299-50-4; 화학식: C12 H13 N3 O3) 또는 N-카르바모일-L-트립토판 (= CA 인덱스 명칭: N-(아미노카보닐)-L-트립토판 = 등록 번호: 89595-64-2; 화학식: C12 H13 N3 O3)이다.

배양 배지 또는 반응 혼합물에서 제조되는 아미노산은 공지된 방법에 의해 신속하게 정량화될 수 있다. 이를 위해, C-18 칼럼, 및 예를 들어, 용리제로서의 1% 아세토니트릴을 포함하는 20 mM 인산칼륨 (pH 2.3) 및 10% H₂O를 포함하는 아세토니트릴의 혼합물을 사용하는 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)가 사용될 수 있다.

배양 배지 또는 반응 혼합물에 축적된 아미노산은 표준 방법에 의해 배양 배지 또는 반응 혼합물로부터 수집될 수 있다. 예를 들어, 방법, 예컨대 여과, 원심분리, 진공하의 농축, 이온 교환 또는 흡착 크로마토그래피, 결정화 등이 사용될 수 있고, 필요한 경우, 서로 조합되어 사용될 수 있다.

하기 반응식은 (D-히단토인의 변환으로 예시되는) 촉매 변환에 관여하는 효소 및 반응 단계를 보여주는 것이다. D-히단토인은 D-5-치환된 히단토인 화합물을 가수분해하여 N-카르바모일-D-아미노산을 형성하는 반응을 촉매화하는 D-히단토이나제의 촉매 활성에 의해 N-카르바모일-D-아미노산으로 변환된다. 추가의 반응 단계에서, N-카르바모일아미노산 히드롤라제로 지칭되는 효소는 상기 N-카르바모일-D-아미노산을 가수분해하여 광학 활성인 D-아미노산을 형성하는 반응을 촉매화한다. 추가로, 히단토인 라세마제로 지칭되는 효소는 광학 활성인 L-히단토인 화합물의 광학 활성인 D-히단토인 화합물로의 변환, 및 그 반대의 변환도 촉매화한다.

<반응식>

정의

히단토이나제: "히단토이나제" 또는 "히단토이나제 활성"이라는 용어는 본원에서 히단토인, 특히 5-치환된 히단토인을 가수분해하는 효소, 또는 효소의 활성으로 정의된다. 히단토이나제는 5-치환된 히단토인을 가수분해하여 각 N-카르바모일아미노산을 형성하는 반응을 촉매화한다. 특히, 본 발명에 따른 히단토이나제는 D-5-인돌릴메틸히단토인을 가수분해하여 N-카르바모일-D-트립토판을 형성하는 반응, 또는 L-5-인돌릴메틸히단토인을 가수분해하여 N-카르바모일-L-트립토판을 형성하는 반응을 촉매화한다. 히단토이나제에 대한 예로는 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 있다. 히단토이나제 활성에 대한 예로는 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의, 상기 히단토이나제의 활성에 의해 각 N-카르바모일아미노산로 변환되는, 화합물, 예컨대 L-5-메틸티오에틸히단토인, L-5-(4-히드록시벤질)히단토인 또는 L-5-벤질히단토인에 대한 촉매 활성이 있다.

히단토인 라세마제: "히단토인 라세마제" 또는 "히단토인 라세마제 활성"이라는 용어는 본원에서 L-히단토인을 D-히단토인으로, 및 그와 반대되는 경우로 변환시키는 효소, 또는 효소의 활성으로 정의된다. 특히, N-히단토인 라세마제는 L-5-인돌릴메틸히단토인을 변환시켜 D-5-인돌릴메틸히단토인을 형성하는 반응을 촉매화하거나, 또는 D-5-인돌릴메틸히단토인을 변환시켜 L-5-인돌릴메틸히단토인을 형성하는 반응을 촉매화한다. 히단토인 라세마제에 대한 예로는 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 있다. 히단토인 라세마제 활성에 대한 예로는 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의, 상기 히단토인 라세마제의 활성에 의해 각 D-거울상이성질체로 변환되는, 화합물, 예컨대 L-5-메틸티오에틸히단토인, L-5-(4-히드록시벤질)히단토인, L-5-벤질히단토인 또는 L-5-인돌릴메틸히단토인에 대한 촉매 활성이 있다.

N-카르바모일라제: "N-카르바모일라제" 또는 "N-카르바모일라제 활성"이라는 용어는 본원에서 N-카르바모일아미노산, 특히 N-카르바모일-D-아미노산을 가수분해하는 효소, 또는 효소의 활성으로 정의된다. N-카르바모일라제 또는 N-카르바모일아미노산 히드롤라제는 각각 상기 N-카르바모일아미노산, 특히 N-카르바모일-D-아미노산을 가수분해하여 각 아미노산, 특히 광학 활성인 D-아미노산을 형성하는 반응을 촉매화한다. 특히, N-카르바모일라제는 N-카르바모일-D-트립토판을 가수분해하여 D-트립토판을 형성하는 반응을 촉매화하거나, 또는 N-카르바모일-L-트립토판을 가수분해하여 L-트립토판을 형성하는 반응을 촉매화한다. N-카르바모일라제에 대한 예로는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 있다. N-카르바모일라제 활성에 대한 예로는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질의, 상기 N-카르바모일라제의 활성에 의해 각 아미노산으로 변환되는 화합물, 예컨대 N-카르바모일 메티오닌, N-카르바모일 티로신, N-카르바모일 페닐알라닌 또는 N-카르바모일 트립토판에 대한 촉매 활성이다.

5-치환된 히단토인: "5-치환된 히단토인"이라는 용어는 하기 화학식 I에 따른 화합물을 의미하는 것으로, 여기서 R은 수소, -CH₃, -CH(CH₃)₂, -CH₂-CH(CH₃)₂, -CH(CH₃)-CH₂-CH₃, 벤질, 4-히드록시벤질, 인돌릴메틸, -CH₂-COOH, -CH₂-CONH₂, -CH₂-CH₂-COOH, -CH₂-CH₂-CONH₂, -CH₂-OH, -CH(OH)-CH₃, -CH₂-SH, -CH₂-CH₂-S-CH₃, 이미다졸릴메틸, -CH₂-CH₂-CH₂-NH-C(NH)NH₂, -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂를 나타내거나, 또는 "5-치환된 히단토인"이라는 용어는 프롤린 히단토인을 의미한다. 상기 잔기는 천연적으로 발생된 아미노산에 상응하고, 이는 히단토이나제에 의한 각 히단토인 화합물의 가수분해 및 N-카르바모일라제에 의한 각 N-카르바모일아미노산의 가수분해시에 수득된다. 추가로, 5-치환된 히단토인 화합물은 비천연 아미노산 또는 그의 유도체, 예컨대 5-페닐히단토인, 5-(4-히드록시페닐)히단토인, 5-메톡시메틸히단토인, 5-벤질옥시메틸히단토인, 5-(3,4-메틸렌디옥시벤질) 히단토인, 디히드로우라실에 상응할 수 있다. 하기 화학식 I은 5-치환된 히단토인의 D-거울상이성질체를 나타낸다는 것에 주목하여야 한다.

<화학식 I>

핵산 구축물: 본원에서 사용되는 바, "핵산 구축물"이라는 용어는 천연적으로 발생된 유전자로부터 단리되거나, 다르게는 자연 상태에는 존재하지 않는 방식으로 핵산의 절편을 포함하도록 변형된, 단일 또는 이중 가닥의 핵산 분자를 의미한다. 핵산 구축물이라는 용어는 상기 핵산 구축물이 본 발명의 코딩 서열의 발현에 필요한 제어 서열을 포함할 경우, "발현 카세트"라는 용어와 동의어이다.

제어 서열: "제어 서열"이라는 용어는 본원에서 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 데 필요하거나, 유익한 모든 성분을 포함하는 것으로 정의된다. 각 제어 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대하여 천연적인 것이거나, 외래의 것일 수 있거나, 또는 서로에 대해 천연적인 것이거나, 외래의 것일 수 있다. 상기 제어 서열로는 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열, 및 전사 종결인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 최소한도로, 제어 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함한다. 제어 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역과 제어 서열과의 결찰이 용이하게 이루어지도록 하는 특이적인 제한 부위를 도입하기 위한 목적으로 링커와 함께 제공될 수 있다.

작동가능하게 연결된: "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 본원에서 제어 서열이 폴리펩티드의 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있도록 제어 서열이 폴리뉴클레오티드 서열의 코딩 서열에 대해 상대적으로 적절한 위치에 배치되어 있는 배열 형태를 의미한다.

코딩 서열: 본원에서 사용될 때, "코딩 서열"이라는 용어는 그의 단백질 생성물의 아미노산 서열을 직접적으로 명시하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 코딩 서열의 경계는 일반적으로는, 보통 ATG 출발 코돈 또는 대체 출발 코돈, 예컨대 GTG 및 TTG로 시작되고, 종결 코돈, 예컨대 TAA, TAG 및 TGA로 종결되는 오픈 리딩 프레임에 의해 결정된다. 코딩 서열은 DNA, cDNA, 또는 재조합 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

발현: "발현"이라는 용어는 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형, 및 분비를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 폴리펩티드 생산에 관여하는 임의 단계를 포함한다.

발현 벡터: "발현 벡터"라는 용어는 본원에서 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 그가 발현될 수 있도록 하는 추가의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되어 있는 것인, 선형 또는 환형 DNA 분자로서 정의된다.

숙주 세포: 본원에서 사용되는 바, "숙주 세포"라는 용어는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구축물 또는 발현 벡터로 쉽게 형질전환, 형질감염, 형질도입 등이 쉽게 이루어지는 모든 세포 종류를 포함한다.

세포 배양 배지: "세포 배양 배지"라는 용어는 일반적으로 박테리아, 효모 및 진균을 비롯한 미생물을 배양하는 데 사용되는 배지를 의미하고, 이는 "발효 배지"로도 또한 지칭될 수 있다.

비천연 아미노산: "비천연 아미노산"이라는 용어는 화학식 NH₂-CH(R)-COOH (여기서 R은 단백질 생성 아미노산 잔기의 변형된 잔기를 나타내며, 상기 단백질 생성 아미노산 잔기는 수소, -CH₃, -CH(CH₃)₂, -CH₂-CH(CH₃)₂, -CH(CH₃)-CH₂-CH₃, 벤질, 4-히드록시벤질, 인돌릴메틸, -CH₂-COOH, -CH₂-CONH₂, -CH₂-CH₂-COOH, -CH₂-CH₂-CONH₂, -CH₂-OH, -CH(OH)-CH₃, -CH₂-SH, -CH₂-CH₂-S-CH₃, 이미다졸릴메틸, -CH₂-CH₂-CH₂-NH-C(NH)NH₂, -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂로부터 선택된다)를 갖는 알파 아미노산을 의미하거나, 또는 "비천연 아미노산"이라는 용어는 그의 고리 구조의 -CH₂-CH₂-CH₂- 기에서 변형된 것일 수 있는, 프롤린의 유도체를 의미한다. 상기 언급된 변형은 지방족 기, 방향족 기, 헤테로시클릭 기, 산성 기, 염기성 기, 히드록실 기 및/또는 할로겐, 예컨대 F에 의한 수소 원자(들)의 치환일 수 있다.

변형: "변형"이라는 용어는 본원에서 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 그의 상동성 서열로 이루어진 폴리펩티드의 임의의 화학적 변형 뿐만 아니라; 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 유전자 조작을 의미한다. 변형은 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가일 수 있다.

변이체: 본원에서 사용될 때, "변이체"라는 용어는 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 그의 상동성 서열의 변형된 뉴클레오티드 서열을 발현하는 유기체에 의해 생산된, 히단토이나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 변형된 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열의 변형에 의한 인간 개입을 통해 수득된다. 변이체 폴리펩티드 서열은 또한 천연적으로 발생된 것일 수 있다. 예를 들어, 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제와 약 83%의 동일성을 갖는, 마이크로박테리움 리퀘파시엔스(Microbacterium liquefaciens) AJ3912로부터 단리된 히단토이나제는 기술된 바 있다. 상기 마이크로박테리움 리퀘파시엔스 히단토이나제는 서열 1의 아미노산 서열의 (천연적으로 발생된) 변이체인 것으로 간주될 수 있다.

본 발명의 단백질은 예를 들어, 당업계에 공지되어 있는 재조합 방법 및 기법을 사용하여 합성되거나, 정제된 단백질로부터 제조되거나, 또는 생산될 수 있다. 비록 그를 제조하는 구체적인 기법이 본원에 기술되어 있기는 하지만, 상기 펩티드를 제조하는 데 적합한 모든 적절한 기법도 본 발명의 범주 내 포함되는 것으로 한다. 일반적으로, 이러한 기법으로는 DNA 및 단백질 서열 분석, 클로닝, 발현 및 본 발명의 각각의 단백질을 코딩하고 발현하는 원핵 및 진핵 벡터의 구축을 허용하는 다른 재조합 공학 기법을 포함한다.

"펩티드" 및 "올리고펩티드"라는 용어는 (통상 인식되는 바와 같이) 동의어로 간주되며, 각 용어는 문맥상 요구되는 바와 같이, 상호교환적으로 사용될 수 있고, 이는 펩티딜 연결에 의해 커플링된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 쇄를 나타낸다. "폴리펩티드"라는 단어는 10개 초과의 아미노산 잔기를 포함하는 쇄인 것으로 본원에서 사용된다. 본원에서 모든 올리고펩티드 및 폴리펩티드 화학식 또는 그의 서열은 좌측에서 우측으로, 및 아미노산 말단에서부터 카르복시 말단 방향으로 기록된다. 본원에서 사용되는 아미노산에 대한 1문자 코드는 당업계에 보편적으로 알려져 있으며, 이는 문헌 [Sambrook, et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)]에서 살펴볼 수 있다.

"단리된" 폴리펩티드 또는 단백질이란, 그의 천연 환경으로부터 제거된 폴리펩티드 또는 단백질인 것으로 한다. 예를 들어, 숙주 세포에서 발현된, 재조합적으로 제조된 폴리펩티드 및 단백질은, 임의의 적합한 기법, 예를 들어, 문헌 [Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988)]에 개시되어 있는 단일 단계 정제 방법에 의해 실질적으로 정제된, 천연 또는 재조합 폴리펩티드인 것인 바, 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.

본 발명에 따른 히단토이나제는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 비롯한, 주지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 더욱 바람직하게, 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")가 정제에 사용된다.

본 발명의 폴리펩티드는 천연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 방법의 생성물, 및 예를 들어, 박테리아, 효모, 진균, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 비롯한 원핵 또는 진핵 숙주로부터 재조합 기법에 의해 생산된 생성물을 포함한다. 재조합 생산 방법에서 사용되는 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 당화될 수 있거나, 당화되지 않을 수 있다. 추가로, 본 발명의 폴리펩티드는 또는 일부 경우에서, 숙주-매개 방법의 결과로서, 변형된, 초기 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다.

본 발명의 단백질은 비-히단토이나제 폴리펩티드 (예컨대, 이종성 아미노산 서열)에 작동적으로 연결됨으로써 융합 단백질을 형성할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 히단토이나제 "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 비-히단토이나제 폴리펩티드에 작동적으로 연결된 히단토이나제 폴리펩티드를 포함한다.

예를 들어, 한 실시양태에서, 융합 단백질은, 히단토이나제 서열이 GST 서열의 C-말단에 융합되어 있는, GST-히단토이나제 융합 단백질이다. 상기 융합 단백질을 통해 재조합 히단토이나제의 정제는 쉽게 이루어질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 그의 N-말단에 이종성 신호 서열을 함유하는 히단토이나제 단백질이다. 특정 숙주 세포 (예컨대, 포유동물 및 효모 숙주 세포)에서, 히단토이나제의 발현 및/또는 분지는 이종성 신호 서열의 사용으로 증가될 수 있다.

신호 서열은 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드가 쉽게 분비 및 단리되도록 하는 데 사용될 수 있다. 신호 서열은 전형적으로 일반적으로는 1회 이상의 절단 사례에서 분비 동안 성숙 단백질로부터 절단되는 소수성 아미노산의 코어를 특징으로 한다. 상기 신호 펩티드는 그가 분비 경로를 통과함에 따라 성숙 단백질로부터 신호 서열이 절단될 수 있도록 하는 프로세싱 부위를 포함한다. 신호 서열은 예컨대, 발현 벡터가 형질전환되는 진핵성 숙주로부터의 단백질 분비를 지시하고, 신호 서열은 후속하여 또는 동시에 절단된다. 이어서, 단백질은 당업계에 인지된 방법에 의해 세포외 배지로부터 쉽게 정제될 수 있다. 별법으로, 신호 서열은 정제가 쉽게 이루어지도록 하는 서열을 사용하여, 예컨대 GST 도메인을 이용함으로써 관심 단백질에 연결될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 마커 서열, 예컨대 융합된 폴리펩티드의 정제가 쉽게 이루어지도록 하는 펩티드를 코딩하는 서열에 융합될 수 있다. 본 발명의 상기 측면의 특정 바람직한 실시양태에서, 마커 서열은 특히 헥사-히스티딘 펩티드, 예컨대 pQE 벡터 (퀴아젠, 인크.(Qiagen Inc.))에 제공된 태그이며, 이들 다수는 상업적으로 이용가능하다. 문헌 [Gentz et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)]에 기술되어 있는 바와 같이, 예를 들어, 헥사-히스티딘은 융합 단백질이 편리하게 정제되 수 있도록 한다. 인플루엔자 헤마글루티딘 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 HA 태그는 정제에 유용한 또 다른 펩티드로서, 이는 예를 들어, 문헌 [Wilson et al., Cell 37:767 (1984)]에 기술되었다.

바람직하게, 본 발명의 키메라 또는 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기법에 의해 제조된다. 예를 들어, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 단편을 예를 들어, 결찰을 위해 평활 단부 또는 엇갈림 형상의(stagger) 단부 말단을 사용하고, 적절한 말단을 제공하기 위해 제한 효소 분해를 사용하고, 적절할 경우, 응집성 단부 충전, 원치않는 결합을 피하기 위해 알칼리성 포스파타제 처리, 및 효소적 결찰을 사용함으로써 종래 기법에 따라 프레임 내에서 함께 결찰시킨다. 또 다른 실시양태에서, 융합 유전자는 자동 DNA 합성 장치를 비롯한 종래 기법에 의해 합성될 수 있다. 별법으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은, 이어서 어닐링되고 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있는 두 연속적인 유전자 단편 사이에 상보적인 오버행이 생성되도록 하는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992] 참조). 또한, 이미 융합 모이어티 (예컨대, GST 폴리펩티드)를 코딩하는 많은 발현 벡터가 상업적으로 이용가능하다. 본 발명에 따른 단백질을 포함하는 융합 단백질이 발현되도록 하기 위해 융합 모이어티가 프렘임 내에서 융합 모이어티에 연결되도록 본 발명에 따른 핵산은 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.

"보존적 치환" 또는 "상동성" 아미노산 잔기에 의한 치환은 아미노산 잔기가, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환을 의미하는 것으로 한다. 이러한 패밀리는 당업계에 공지되어 있고, 이는 염기성 측쇄 (예컨대, 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄 (예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예컨대, 티로신, 페닐알라닌 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다.

보존적 아미노산 치환은 보통 생성된 단백질의 활성에는 최소의 영향을 미친다. 그러한 치환은 하기에 기술된다. 보존적 치환은 한 아미노산을, 크기, 소수성, 전하, 극성, 입체적 특징, 방향족성 등이 유사한 또 다른 아미노산으로 대체하는 것이다. 상기 치환은 일반적으로 단백질의 특징을 미세하게 조절하는 것이 바람직한 경우에 보존적인 것이다.

본원에서 사용되는 바, "상동성" 아미노산 잔기란 소수성, 전하, 극성, 입체적 특징, 방향족 특성과 관련하여 화학적 특성이 유사한 아미노산 잔기를 의미한다. 서로 상동성인 아미노산의 예로는 양전하인 것에 관해서, 리신, 아르기닌, 히스티딘; 음전하인 것에 관해서, 글루탐산, 아스파르트산; 소수성인 것에 관해서, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌; 극성인 것에 관해서, 세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 트립토판, 티로신, 아스파라긴, 글루타민; 방향족성인 것에 관해서, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판; 화학적으로 유사한 측쇄 기인 것에 관해서, 세린 및 트레오닌; 또는 글루타민 및 아스파라긴; 또는 류신 및 이소류신을 포함한다.

단백질에서 원래의 아미노산을 대신하여 치환될 수 있고, 보존적 치환으로 간주되는 아미노산의 예로는 Ala 대신 Ser; Arg 대신 Lys; Asn 대신 Gln 또는 His; Asp 대신 Glu; Cys 대신 Ser; Gln 대신 Asn; Glu 대신 Asp; Gly 대신 Pro; His 대신 Asn 또는 Gln; Ile 대신 Leu 또는 Val; Leu 대신 Ile 또는 Val; Lys 대신 Arg 또는 Gln; Met 대신 Leu 또는 Ile; Phe 대신 Met, Leu 또는 Tyr; Ser 대신 Thr; Thr 대신 Ser; Trp 대신 Tyr; Tyr 대신 Trp 또는 Phe; 및 Val 대신 Ile 또는 Leu인 것을 포함한다.

예를 들어, 표현형상 침묵 아미노산 치환을 수행하는 것에 관한 가이던스는 문헌 [Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-1310 (1990)]에 제공되어 있는데, 여기서 저자는 아미노산 서열의 변이에 대한 내성을 연구하기 위한 것으로 2가지 주요 접근법이 존재한다고 언급하였다. 제1 방법은 진화 과정에 의존하는 것으로서, 여기서 돌연변이는 자연 도태에 의해 수용되거나, 거부된다. 제2 접근법은 유전 공학을 이용하여 클로닝된 유전자의 특정 위치에 아미노산 변이를 도입하고, 선별 또는 스크리닝하여 관능성을 유지하는 서열을 확인한다. 저자가 언급한 바오 같이, 상기 연구를 통해 단백질은 놀랍게도 아미노산 치환에 대해 내성을 띤다는 것이 밝혀졌다. 저자는 추가로 어떤 변이가 단백질의 특정 위치에서 허용될 가능성이 있는지를 언급하였다. 예를 들어, 대부분의 매립된 아미노산 잔기는 비-극성 측쇄를 필요로 하는 반면, 표면 측쇄의 소수의 특성은 일반적으로 보존된다. 다른 상기와 같은 표현형상 침묵 치환은 문헌 [Bowie et al., 상기 문헌 동일], 및 상기 문헌에서 인용된 참조 문헌에 기술되어 있다.

본원에서 정의되는 바, "실질적으로 상동성"이라는 용어는 제1 아미노산 서열이 제2 아미노산 서열과 충분한 개수 또는 최소 개수의 동일한 또는 등가인 (예컨대, 유사 측쇄를 갖는) 아미노산을 포함함에 따라 제1 및 제2 아미노산 서열은 공통된 도메인을 가진다는 것을 의미한다. 예를 들어, 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 공통된 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 본원에서 충분히 동일한 것으로 정의되되, 단, 본원에서 정의되는 바, 본 발명에 따른 아미노산 위치의 치환(들)은 유지된다.

또한, 다른 히단토이나제 패밀리 구성원을 코딩하는 바, 따라서 본 발명의 뉴클레오티드 서열과는 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산은 본 발명의 범주내 포함되되, 단, 본원에서 정의되는 바, 본 발명에 따른 코딩된 아미노산 서열 중의 아미노산 위치의 치환(들)은 유지된다. 본 발명에 따른 DNA의 변이체 (예컨대, 천연 대립유전자 변이체) 및 상동체에 상응하는 상기 핵산 분자는 바람직하게 고도로 엄격한 혼성화 조건하에서 표준 혼성화 기법에 따라 혼성화 프로브로서 본원에 개시된 cDNA 또는 그의 적합한 단편을 사용함으로써 본원에 개시된 핵산과의 그의 상동성에 기초하여 단리될 수 있다.

본원에서 제공된 서열의 천연적으로 발생된 대립유전자 변이체 이외에도, 당업자는 추가의 변이가 돌연변이에 의해 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 도입될 수 있고, 이로써, 단백질의 기능은 실질적으로 변경시키지 않으면서, 히단토이나제 단백질의 아미노산 서열을 바꿀 수 있되, 단, 본원에서 정의되는 바, 본 발명에 따른 코딩된 아미노산 서열 중의 아미노산 위치의 치환(들)은 유지된다는 것을 인지할 것이다.

본 발명에 따라, 개선된 히단토이나제를 제공한다. 개선된 히단토이나제는 촉매 활성 및/또는 거울상이성질체 선택성이 개선된 단백질이다. 상기 단백질은 예컨대, 포화 돌연변이유발에 의해 코딩 서열 모두 또는 그의 일부와 함께 돌연변이를 무작위적으로 도입함으로써 수득될 수 있고, 생성된 돌연변이체는 재조합적으로 발현될 수 있고, 각각 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 당업계에는 히단토이나제의 촉매 활성을 측정할 수 있는 표준 검정법이 제공되어 있으며, 따라서 개선된 단백질을 쉽게 선별할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "유전자" 및 "재조합 유전자"라는 용어는 염색체 DNA로부터 단리될 수 있으며, 단백질, 예컨대 히단토이나제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산 분자를 의미한다. 유전자는 코딩 서열, 비-코딩 서열, 인트론 및 조절 서열을 포함할 수 있다. 추가로, 본원에서 정의되는 바, 유전자는 단리된 핵산 분자를 의미한다.

본 발명에 따른 핵산 분자 또는 그의 기능적 등가물은 표준 분자 생물학적 기법 및 본원에서 제공된 서열 정보를 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 혼성화 프로브로서 본원에 기술된 핵산 서열 모두 또는 그의 일부를 사용함으로써 본 발명에 따른 핵산 분자를 (예컨대, 문헌 [Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]에 기술된 바와 같이) 표준 혼성화 및 클로닝 기법을 이용하여 단리시킬 수 있다.

추가로, 본원에 기술된 핵산 서열 모두 또는 그의 일부를 포함하는 핵산 분자는 기술된 서열에 포함된 서열 정보에 기초하여 디자인된 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 단리시킬 수 있다.

본 발명의 핵산은 표준 PCR 증폭 기법에 따라 cDNA, mRNA, 또는 별법으로, 주형으로서의 게놈 DNA, 및 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 상기와 같이 증폭된 핵산을 적절한 벡터로 클로닝시킬 수 있고, DNA 서열 분석에 의해 특징을 규명할 수 있다.

추가로, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열에 상응하거나, 또는 그에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드는 표준 합성 기법에 의해, 예컨대 자동 DNA 합성 장치를 사용함으로써 제조할 수 있다.

또 다른 뉴클레오티드 서열에 상보적인 핵산 분자는 다른 뉴클레오티드 서열에 충분히 상보적이며, 이로써 다른 뉴클레오티드 서열에 혼성화함으로써 안정된 이중체를 형성할 수 있는 핵산 분자이다.

"단리된 폴리뉴클레오티드" 또는 "단리된 핵산"은 그의 유래의 기점이 되는 유기체의 천연적으로 발생된 게놈 중에서는 바로 인접해 있는 (5' 단부에 하나 및 3' 단부에 하나) 두 코딩 서열 둘 모두와 바로 인접해 있지 않은 DNA 또는 RNA이다. 따라서, 한 실시양태에서, 단리된 핵산은 코딩 서열에 바로 인접해 있는 5' 비-코딩 (예컨대, 프로모터) 서열 중 일부 또는 그 모두를 포함한다. 따라서, 상기 용어는 예를 들어, 벡터 내로, 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스 내로, 또는원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 도입되는 재조합 DNA를 포함하거나, 또는 다른 서열과는 상관없이 별개의 분자 (예컨대, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 제조된 cDNA 또는 게놈 DNA 단편)로서 존재하는 것을 포함한다. 이는 또한 실질적으로 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지 (재조합 DNA 기법에 의해 제조되었을 때), 또는 화학 전구체 또는 다른 화학 물질 (화학적으로 합성되었을 때)을 함유하지 않는 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 혼성 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다. 또한, "단리된 핵산 단편"은 단편으로서는 천연적으로 발생되지 않으며, 자연 상태에서는 발견되지 않는 핵산 단편이다.

본원에서 사용되는 바, "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 분자"라는 용어는 DNA 분자 (예컨대, cDNA 또는 게놈 DNA) 및 RNA 분자 (예컨대, mRNA) 및 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA 유사체를 포함하는 것으로 한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 이중 가닥 DNA가 바람직하다. 핵산은 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 유도체 (예컨대, 이노신 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드)를 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 염기쌍 형성 능력이 변경되거나, 또는 뉴클레아제에 대한 내성이 증가된 핵산을 제조하기 위하여 상기 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다.

본원에 기술된 핵산 분자의 보체 가닥 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.

본원에서 제공된 서열 정보는 잘못 확인된 염기가 포함되는 것을 필요로 하는 것으로 협의적으로 해석되서는 안된다. 본원에 개시된 특정 서열은 아르트로박터 종으로부터의 완전한 유전자를 단리시키는 데 쉽게 사용될 수 있고, 이는 결국 추가의 서열 분석에 쉽게 이용될 수 있으며, 이로써 서열 분석 오류를 확인할 수 있다.

달리 명시되지 않는 한, 본원에서 DNA 분자의 서열을 분석함으로써 결정되는 모든 뉴클레오티드 서열은 자동 DNA 서열 분석기를 사용함으로써 결정되었고, 본원에서 결정된 DNA 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드의 모든 아미노산 서열은 상기와 같이 결정된 DNA 서열의 번역에 의해 예측되었다. 따라서, 이러한 자동 접근법에 의해 결정된 임의의 DNA 서열에 대해 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 본원에서 결정된 임의의 뉴클레오티드 서열은 얼마간의 오류를 포함할 수 있다. 자동화에 의해 결정된 뉴클레오티드 서열은 전형적으로 서열 분석된 DNA 분자의 실제 뉴클레오티드 서열과 약 90% 이상 동일, 더욱 전형적으로는 약 95% 이상 내지 약 99.9% 이상 동일하다. 실제 서열은 당업계에 주지된 수동 DNA 서열 분석 방법을 비롯한 다른 접근법에 의해 보다 정확하게 결정될 수 있다. 또한 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 실제 서열과 비교하여, 결정된 뉴클레오티드 서열 중의 단일의 삽입 또는 결실은 뉴클레오티드 서열의 번역에서 프레임 쉬프트를 일으킬 것이며, 이로써, 결정된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 예측 아미노산 서열은 상기 삽입 또는 결실이 이루어진 지점을 시작으로 하여, 서열 분석된 DNA 분자에 의해 실제로 코딩된 아미노산과는 완전하게 상이할 것이다.

당업자는 상기와 같이 잘못 확인된 염기를 확인할 수 있고, 상기와 같은 오류를 보정하는 방법을 알고 있다.

"상동성" 또는 "동일성 (%)"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적을 위해, 본원에서는 두 아미노산 서열 또는 두 핵산 서열의 동일성 (%)을 측정하기 위해서는 최적의 비교 목적을 위해 서열을 정렬하는 것 (예컨대, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과 최적으로 정렬될 수 있도록 하기 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열 중에 갭이 도입될 수 있다)으로 정의된다. 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열의 위치가 제2 서열 중의 상응하는 위치에 있는 것과 같은 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드로 점유되었다면, 분자는 상기 위치에서 동일한 것이다. 두 서열 사이의 동일성 (%)은 서열이 공유되는 동일 위치의 개수의 함수이다 (즉, 동일성 (%) = 동일한 위치의 개수/위치의 총 개수 (즉, 중복 위치)*100). 두 서열의 길이는 동일한 것이 바람직하다.

당업자는 두 서열 사이의 상동성을 측정하는 데 수개의 상이한 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다는 사실을 이해할 것이다. 예를 들어, 두 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 (%) 측정은 수학적 알고리즘을 사용함으로써 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 두 아미노산 서열 사이의 동일성 (%)은 (http://www.gcg.com에서 이용가능한) GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램에 도입된 니들만(Needleman) 및 운쉬(Wunsch) (문헌 [J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)]) 알고리즘을 사용하여, 블로섬(Blossom) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 하나, 및 갭 가중치 = 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 가중치 = 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 이용하여 측정된다. 당업자는 이들 상이한 파라미터들 모두, 그로 인해 결과는 약간씩 상이할 수 있지만, 상이한 알고리즘을 사용할 때 두 서열의 전반적인 동일성 (%)은 유의적으로 변경되지 않는다는 것을 이해할 것이다.

또 다른 실시양태에서, 두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 (%)은 (http://www.gcg.com에서 이용가능한) GCG 소프트웨어 패키지 중의 GAP 프로그램을 사용하여 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 갭 가중치 = 40, 50, 60, 70, 또는 80 및 길이 가중치 = 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 이용하여 측정된다. 또 다른 실시양태에서, 두 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 동일성 (%)은 (http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi에서 이용가능한) ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 도입된 E. 메이어스(E. Meyers) 및 W. 밀러(W. Miller) (문헌 [CABIOS, 4:11 -17 (1989)])의 알고리즘을 사용하여, PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 패널티 = 12 및 갭 패널티 = 4를 이용하여 측정된다.

본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 추가로 예를 들어, 다른 패밀리 구성원 또는 관련 서열을 확인하기 위해 공개 데이터베이스에 대하여 검색을 실행하는 데 있어서 "질의 서열"로서 사용될 수 있다. 상기 검색은 문헌 [Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 BLASTN 및 BLASTX 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLASTN 프로그램, 점수=100, 워드 길이=12를 사용하여 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행함으로써 본 발명의 PLP03 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. BLASTX 프로그램, 점수=50, 워드 길이=3을 사용하여 BLAST 단백질 검색을 수행함으로써 본 발명의 PLP03 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기술된 바와 같이 갭트 BLAST(Gapped BLAST)를 사용할 수 있다. BLAST 및 갭트 BLAST 프로그램을 사용할 ?, 각 프로그램 (예컨대, BLASTX 및 BLASTN)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조할 수 있다.

"~%의 아미노산 동일성" 또는 "~%의 아미노산 서열 동일성"은 최적으로 정렬되었을 때, 같은 아미노산을 대략적으로 지정된 백분율로 갖는 두 폴리펩티드의 아미노산 비교를 나타낸다. 예를 들어, "95%의 아미노산 동일성"은 최적으로 정렬되었을 때, 95%의 아미노산 동일성을 갖는 두 폴리펩티드의 아미노산 비교를 나타낸다. 바람직하게, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환만큼 차이를 보인다. 예를 들어, 유사한 화학적 특성, 예컨대 전하 또는 극성을 갖는 아미노산의 치환은 단백질의 특성에 영향을 줄 가능성은 없다. 예로는 아스파라긴 대신 글루타민, 또는 아스파르트산 대신 글루탐산인 것을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "혼성화하는"이라는 용어는 서로에 대하여 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 더욱더 바람직하게는 약 96% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상으로 상동성인 뉴클레오티드 서열이 서로 혼성화된 상태로 유지되는 혼성화 및 세척 조건을 기술하는 것으로 한다. 당업자는 추가 규정이 적용된다는, 즉, 본원에서 정의되는 바, 본 발명에 따른 코딩된 아미노산 서열 중의 아미노산 위치의 치환(들)은 유지된다는 것을 이해할 것이다.

상기 혼성화 조건의 바람직한 비-제한적 예는 약 45℃에서 6x 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC) 중에서 혼성화한 후, 50℃, 바람직하게는 55℃, 추가로 바람직하게는 60℃ 및 더욱더 바람직하게는 65℃에서 1 x SSC, 0.1% SDS 중에서 1회 이상 세척하는 것이다.

고도로 엄격한 조건은 예를 들어, 68℃에서 5xSSC/5x덴하르트 용액/1.0% SDS 중에서 혼성화한 후, 실온에서 0.2*SSC/0.1% SDS 중에서 세척하는 것을 포함한다. 별법으로, 세척은 42℃에서 수행될 수 있다.

당업자는 엄격한 및 고도로 엄격한 혼성화 조건에 대하여 어떤 조건을 적용시켜야 하는지 알 것이다. 상기 조건에 관한 추가의 가이던스는 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.]; 및 [Ausubel et al., (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.)]에서와 같이, 당업계에서 쉽게 이용될 수 있다.

물론, 오직 폴리 A 서열 (예컨대, mRNA의 3' 말단 폴리(A) 트랙)에만, 또는 T (또는 U) 잔기로 된 상보적인 스트레치에만 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 핵산의 일부에 특이적으로 혼성화하는 데 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않게 되는데, 그 이유는 상기 폴리뉴클레오티드가 폴리 (A) 스트레치를 포함하는 임의의 핵산 분자 또는 그의 보체에 혼성화하기 때문이다 (예컨대, 실제로 임의의 이중 가닥 cDNA 클론).

본 발명은 또한 제어 서열과 화합성인 조건하에 적합한 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 지시하는 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된 단리된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구축물에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드를 발현하도록 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열을 벡터 내로 삽입하기 전에 조작하는 것은 발현 벡터에 따라 바람직할 수 있거나, 필요할 수 있다. 재조합 DNA 공정을 사용하여 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 기법은 당업계에 주지되어 있다.

제어 서열은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 뉴클레오티드 서열인, 적절한 프로모터 서열일 수 있다. 프로모터 서열은 폴리펩티드의 발현을 매개하는 전사 제어 서열을 포함한다. 돌연변이형, 절두형, 및 혼성형 프로모터를 비롯한, 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 보이는 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있고, 이는 숙주 세포에 대해 동종성 또는 이종성인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 수득될 수 있다.

특별힌 박테리아 숙주 세포에서 본 발명의 핵산 구축물의 전사를 지시하는 데 적합한 프로모터의 예로는 이. 콜라이 lac 오페론, 스트렙토미세스 코엘리콜라(Streptomyces coelicolor) 아가라제 유전자 (dagA), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 레반슈크라제 유전자 (sacB), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 알파-아밀라제 유전자 (amyL), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus) 말토제닉 아밀라제 유전자 (amyM), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 알파-아밀라제 유전자 (amyQ), 바실루스 리케니포르미스 페니실리나제 유전자 (penP), 바실루스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자, 및 원핵세포 베타-락타마제 유전자 (문헌 [Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731])로부터의 프로모터 뿐만 아니라, tac 프로모터 (문헌 [DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25])가 있다. 추가의 프로모터는 문헌 ["Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74-94]; 및 [Sambrook et al., 1989, 상기 문헌 동일]에 기술되어 있다.

리보솜 결합 서열로서는 어느 서열이든 숙주 세포에서 발현될 수 있는 한, 사용될 수 있다. 그러나, 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 및 개시 코돈이 그 사이에 적절한 거리 (예컨대, 6 내지 18개의 염기)를 두도록 조정된 상태로 포함되어 있는 플라스미드를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

전사 및 번역이 효율적으로 수행될 수 있도록 하기 위해, 단백질의 활성을 갖는 단백질의 N-말단, 또는 단백질의 일부의 결실에 의해 상기 단백질로부터 유도된 단백질이 발현 벡터에 의해 코딩된 단백질의 N-말단과 융합되어 있는 단백질이 발현될 수 있다.

제어 서열은 또한 전사를 종결하도록 하는 숙주 세포에 의해 인식되는 서열인 적합한 전사 종결인자 서열일 수 있다. 비록 관심 단백질의 발현을 위해 항상 전사 종결 서열이 필요한 것은 아니지만, 상기 서열은 보통 상업적으로 이용가능한 벡터의 일부이다. 종결인자 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. 뉴클레오티드 서열을 구조 유전자 바로 아래에 배치하는 것이 바람직할 수 있다. 선택된 숙주 세포에서 기능성인 임의의 종결인자가 본 발명에서 사용될 수 있다.

제어 서열은 숙주 세포에 의한 번역에 중요한, mRNA의 비번역 영역인, 적합한 리더 서열일 수 있다. 리더 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 의 5' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택된 숙주 세포에서 기능성인 임의의 리더 서열은 본 발명에서 사용될 수 있다.

제어 서열은 또한 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결되어 있고, 전사시, 신호로서 숙주 세포에 의해 인식되어 전사된 mRNA에 폴리아데노신 잔기를 부가하는 서열인, 폴리아데닐화 서열일 수 있다. 선택된 숙주 세포에서 기능성인 임의의 폴리아데닐화 서열은 본 발명에서 사용될 수 있다.

제어 서열은 또한 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된 아미노산 서열을 코딩하고, 코딩된 폴리펩티드를 세포의 분비 경로로 유도하는 신호 펩티드 코딩 영역일 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 코딩 서열의 5' 단부는 본질적으로, 분비된 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역의 절편와 함께 번역 리딩 프레임 내에서 천연적으로 연결된 신호 펩티드 코딩 영역을 포함할 수 있다. 별법으로, 코딩 서열의 5' 단부는 코딩 서열에 대하여 외래의 것인 신호 펩티드 코딩 영역을 포함할 수 있다. 코딩 서열이 천연적으로 신호 펩티드 코딩 영역을 포함하지 않을 경우, 외래 신호 펩티드 코딩 영역이 요구될 수 있다. 별법으로, 외래 신호 펩티드 코딩 영역은 폴리펩티드의 분비를 증진시키기 위해 간단하게 천연 신호 펩티드 코딩 영역을 대체할 수 있다. 그러나, 발현된 폴리펩티드를 선택된 숙주 세포의 분비 경로로 유도하는, 즉, 배양 배지로 분비하는 임의의 신호 펩티드 코딩 영역은 본 발명에서 사용될 수 있다.

제어 서열은 또한 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치하는 아미노산 서열을 코딩하는 프로펩티드 코딩 영역일 수 있다. 생성된 폴리펩티드는 프로효소 또는 프로폴리펩티드로서 (또는 일부 경우에는 지모겐으로) 알려져 있다. 프로폴리펩티드는 일반적으로 불활성이고, 프로펩티드의 촉매적 또는 자가촉매적 절단에 의해 프로폴리펩티드로부터 성숙한 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 코딩 영역은 바실루스 서브틸리스 알칼리성 프로테아제 (aprE), 바실루스 서브틸리스 중성 프로테아제 (nprT), 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 알파-인자, 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 아스파르틱 프로테이나제, 및 마이셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila) 락카제에 대한 유전자로부터 수득될 수 있다.

신호 펩티드 및 프로펩티드 영역 둘 모두가 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재할 경우, 프로펩티드 영역은 폴리펩티드의 아미노 말단 옆에 배치되고, 신호 펩티드 영역은 프로펩티드 영역의 아미노 말단 옆에 배치된다. 숙주 세포의 성장에 상대적으로 폴리펩티드의 발현을 조절할 수 있는 조절 서열을 첨가하는 또한 바람직할 수 있다. 조절 시스템의 예로는 조절 화합물의 존재를 비롯한, 화학적 또는 물리적 자극에 대한 반응으로 유전자의 발현이 가동 또는 비가동되도록 하는 것이다. 원핵세포 시스템에서의 조절 시스템으로는 lac, tac, 및 trp 오퍼레이터 시스템을 포함한다. 효모에서, ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템이 사용될 수 있다. 사상 진균에서, TAKA 알파-아밀라제 프로모터, 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 글루코아밀라제 프로모터, 및 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae) 글루코아밀라제 프로모터가 조절 서열로서 사용될 수 있다. 조절 서열의 다른 예로는 유전자 증폭을 허용하는 것이 있다. 진핵세포 시스템에서는, 메토트렉사트의 존재하에서 증폭되는 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자, 및 중금속으로 증폭되는 메탈로티오네인 유전자를 포함한다. 이러한 경우, 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 조절 서열과 작동가능하게 연결될 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프로모터, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 하나 이상의 종래 제한 부위를 포함함에 따라 상기 부위에서의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 삽입 또는 치환을 허용할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제조하기 위해 본원에 기술된 다양한 핵산 및 제어 서열을 함께 연결시킬 수 있다. 별법으로, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 서열을 포함하는 핵산 구축물을 발현을 위해 적절한 벡터 내로 삽입함으로써 발현될 수 있다. 발현 벡터 제조시, 코딩 서열이 발현을 위해 적절한 제어 서열과 함께 작동가능하게 연결되도록 코딩 서열을 벡터 중에 위치시킨다.

재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 방법이 편리하게 수행될 수 있고, 뉴클레오티드 서열을 발현시킬 수 있는 임의의 벡터 (예컨대, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터 선택은 전형적으로는 벡터와, 벡터를 그 내부로 도입시키고자 하는 숙주 세포와의 화합성에 의존할 것이다. 벡터는 선형 또는 폐환형 플라스미드일 수 있다.

벡터는 자율 복제 벡터, 즉, 그의 복제가 염색체 복제와는 독립적인 것인 염색체외 엔티티로서 존재하는 벡터, 예컨대 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체, 또는 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자기 복제가 확실하게 이루어지도록 하는 임의 수단을 포함할 수 있다. 별법으로, 벡터는 숙주 세포 내로 도입되었을 때, 게놈 내로 통합되고, 그가 그 내부로 통합되어 있는 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 추가로, 숙주 세포의 게놈 내로 도입시키고자 하는 전체 DNA를 함께 포함하는 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드, 또는 트랜스포존이 사용될 수 있다.

이들 형질전환체를 확인하고, 선별하기 위해, 일반적으로는 선별가능한 마커 (예컨대, 항생제에 대한 내성)를 코딩하는 유전자를 관심 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입한다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 형질전환된, 형질감염된, 형질도입된 세포 등이 쉽게 선별될 수 있도록 하나 이상의 선별가능한 마커를 포함한다. 선별가능한 마커는 그의 생성물이 살생 또는 바이러스 내성, 중금속 내성, 독립영양성 내지 영양요구성 등을 제공하는 것인 유전자이다. 박테리아성 선별가능한 마커의 예로는 바실루스 서브틸리스 또는 바실루스 리케니포르미스로부터의 dal 유전자, 또는 항생제 내성, 예컨대 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 또는 테트라사이클린 내성을 부여하는 마커가 있다. 도입된 핵산으로 형질전환된 세포는 약물 선별에 의해 확인될 수 있다 (예컨대, 선별가능한 마커 유전자가 혼입되어 있는 세포는 생존하는 반면, 그 나머지 세포는 사멸하게 된다). 효모 숙주 세포에 적합한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3이다. 사상 진균 숙주 세포에서 사용하기 위한 선별가능한 마커로는 amdS (아세트아미다제), argB (오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제), bar (포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제), hph (히그로마이신 포스포트랜스퍼라제), niaD (니트레이트 리덕타제), pyrG (오로티딘-5'-포스페이트 데카르복실라제), sC (술페이트 아데닐트랜스퍼라제), 및 trpC (안트라닐레이트 신타제) 뿐만 아니라, 그의 등가물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 벡터는 벡터의 숙주 세포의 게놈 내로의 통합, 또는 상기 게놈과는 상관없이 세포에서 이루어지는 벡터의 자율 복제가 이루어지도록 허용하는 요소(들)를 포함할 수 있다.

숙주 세포 게놈 내로의 통합을 위해, 벡터는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 상동성 또는 비-상동성 재조합에 의한 게놈 내로의 통합을 위한 임의의 다른 벡터 요소에 의존할 수 있다. 별법으로, 벡터는 상동성 재조합에 의한 염색체(들) 중 정확한 위치(들)에서의 숙주 세포의 게놈 내로의 통합을 지시하는 추가의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 정확한 위치에의 통합의 가능성을 증가시키기 위해, 통합 요소는 바람직하게는 충분한 개수의 핵산을 포함하여야 한다. 통합 요소는 숙주 세포의 게놈 중의 표적 서열과 상동성인 임의 서열일 수 있다. 추가로, 통합 요소는 비-코딩 또는 코딩 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 한편, 벡터는 비-상동성 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.

자율 복제를 위해, 벡터는 해당 숙주 세포에서 벡터가 자율적으로 복제될 수 있도록 하는 복제 기점을 추가로 포함할 수 있다. 복제 기점은 세포에서 작용하는, 자율 복제를 매개하는 임의의 플라스미드 복제자(replicator)일 수 있다. "복제 기점" 또는 "플라스미드 복제자"라는 용어는 본원에서 플라스미드 또는 벡터가 생체내에서 복제될 수 있도록 하는 뉴클레오티드 서열인 것으로 정의된다.

박테리아성 복제 기점의 예로는 이. 콜라이에서의 복제를 허용하는 플라스미드 pBR322, pUC19, pACYC177, 및 pACYC184의 복제 기점, 및 바실루스에서의 복제를 허용하는 pUB110, pE194, pTA1060, 및 pAMR1의 복제 기점이 있다.

효모 숙주 세포에서 사용하기 위한 복제 기점의 예로는 2 마이크론 복제 기점, ARS1, ARS4, ARS1 및 CEN3의 조합, 및 ARS4 및 CEN6의 조합이 있다.

유전자 생성물의 생산을 증가시키기 위해 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 카피가 1개 초과로 숙주 세포내로 삽입될 수 있다. 서열의 추가의 카피를 1개 이상 숙주 세포 내로 통합시킴으로써 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가시킬 수 있거나, 또는 폴리뉴클레오티드와 함께 증폭가능한 선별가능한 마커 유전자를 포함시킴으로써 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가시킬 수 있는데, 이러한 경우, 선별가능한 마커 유전자의 증폭된 카피, 및 이로써 폴리뉴클레오티드의 추가의 카피를 함유하는 세포는 적절한 선별가능한 작용제의 존재하에서 세포를 배양함으로써 선별될 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터를 구축하기 위해 상기 기술된 요소를 결찰시키는 데 사용되는 방법은 당업자에게 주지되어 있다 (예컨대, 문헌 [Sambrook et al., 1989, 상기 문헌 동일] 참조).

본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 핵산의 발현을 위해 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함하며, 이는 재조합 발현 벡터가, 발현을 위해 사용되는 숙주 세포에 기초하여 선택된 하나 이상의 조절 서열로서, 발현시키고자 하는 핵산에 작동적으로 연결되는 것인 조절 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동적으로 연결된"이란, 관심 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열(들)에 연결되어 있다는 것을 의미하는 것으로 한다 (예컨대, 시험관내 전사/번역 시스템에서, 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포에서). "조절 서열"이라는 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소를 포함하는 것으로 한다. 그러한 조절 서열은 예를 들어, 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기술되어 있다. 조절 서열은 많은 숙주 세포 종류에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 또는 유도성 발현을 지시하는 것을 포함한다.

DNA 삽입체는 적절한 프로모터, 예컨대 파지 람다 PL 프로모터, 이. 콜라이 lacI 및 lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR, PL 프로모터 및 trp 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 조기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스 LTR의 프로모터, 예컨대 라우스 육종 바이러스 ("RSV"), CMV (시토메갈로바이러스)의 것, 및 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터에 작동적으로 연결되어야 한다. 당업자는 다른 적합한 프로모터에 대해 알 것이다. 원핵생물에서의 단백질 발현은 대개 단백질 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터를 포함하는 이. 콜라이에서 수행된다. 구체적인 실시양태에서, 미생물, 바람직하게는 이. 콜라이, 바실루스 종 코리네형 박테리아에서 히단토이나제의 고도한 발현 수준을 지시할 수 있는 프로모터가 바람직하다. 그러한 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 발현 구축물은 전사 개시, 종결 부위를, 및 전사된 영역 중에서는 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 포함할 수 있다. 구축물에 의해 발현된 성숙한 전사체의 코딩부는 개시점에 번역 개시 AUG 및 번역시키고자 하는 폴리펩티드의 단부에 적절하게 배치된 종결 코돈을 포함할 것이다.

벡터 DNA는 종래 형질전환 또는 형질감염 기법을 통해 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "형질전환" 및 "형질감염"이라는 용어는 외래 핵산 (예컨대, DNA)을 숙주 세포 내로 도입하는 데 사용되는 당업계에 공지된 다양한 기법을 의미하는 것으로, 이는 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 형질도입, 감염, 리포펙션, 양이온 지질 매개 형질감염 또는 전기천공을 포함한다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 데 적합한 방법은 문헌 [Sambrook, et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)], [Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)] 및 다른 실험실용 매뉴얼에서 살펴볼 수 있다.

벡터들 중 박테리아에서 사용하기에 바람직한 것은 퀴아젠(Qiagen)으로부터 이용가능한 pQE70, pQE60 및 PQE-9; 스트라타진(Stratagene)으로부터 이용가능한 pBS 벡터, 파지스크립트(Phagescript) 벡터, 블루스크립트(Bluescript) 벡터, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A; 및 파마시아(Pharmacia)로부터 이용가능한 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5이다. 바람직한 진핵세포 벡터 중에는 스트라타진으로부터 이용가능한 PWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pZT1 및 pSG; 및 파마시아로부터 이용가능한 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL이 있다. 다른 적합한 벡터는 당업자에게 쉽게 자명해질 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것으로서, 이는 히단토이나제 폴리펩티드를 재조합적으로 제조하는 데 유리하게 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는, 벡터가 염색체 통합체로서, 또는 자율 복제 세포외 벡터로서 유지되도록 숙주 세포 내로 도입된다. "숙주 세포"라는 용어는 또한 복제 동안에 발생하는 돌연변이에 기인하여 모체 세포와 동일하지 않은 모체 세포의 임의의 자손을 포함한다. 숙주 세포 선택은 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 미 그의 공급원에 매우 크게 의존할 것이다.

또한, "형질전환된 세포" 또는 "재조합 세포"란, 본 발명에 따른 핵산이 재조합 DNA 기법에 의해 그 내부로 (또는 그의 조상 내부로) 도입되어 있는 (숙주) 세포를 의미한다.

예컨대, 박테리아, 진균, 효모 등과 같은 원핵 및 진핵 세포, 이 둘 모두가 포함된다. 특히, 숙주 세포로서 유용한 미생물은 바실루스 종, 예컨대 바실루스 서브틸리스, 스트렙토미세스 종, 이. 콜라이, 슈도모나스 종, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 코리네형 박테리아, 및 또한 악티노미세테스(Actinomycetes)를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 박테리아 세포, 예컨대 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아, 진균 세포, 예컨대 효모, 동물 세포 및 식물 세포이다.

벡터의 박테리아 숙주 세포 내로의 도입은 예를 들어, 원형질체 형질전환에 의해 (예컨대, 문헌 [Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115] 참조), 적격 세포 (예컨대, 문헌 [Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829], 또는 [Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221] 참조), 전기천공 (예컨대, [Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751] 참조), 또는 컨쥬게이션 (예컨대, [Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278])을 사용하여 수행될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명에 따른 변형된 히단토이나제를 확인하고 단리시키는 데 사용되는 방법과 관련된 추가의 상세한 설명을 제공한다. 본 발명은 실시예에 관한 설명으로 제한되지 않는다.

실시예

실시예 1: 히단토이나제의 클로닝 및 발현

서열 1의 아미노산 서열을 갖는 아르트로박터 종 히단토이나제 (HyuH)를 pOM18 벡터로 공급받았다. 추가로 조작하기 위해서는 HyuH 유전자를 올바른 배향으로 서브클로닝하여야 했다. pOM18 벡터의 이중 분해를 위해 NdeI 및 Hind III을 사용하였다. 벡터 골격, pAS6으로부터의 carbA 유전자 (카르바모일라제) 및 pOM18로부터의 HyuH 유전자를 겔 추출하고, PCR하였다. 3개의 겔 추출된 생성물 모두를 칼럼 정제시키고 (마체리 나겔(Machery Nagel)), 결찰시킨 후, 이. 콜라이 DH5α에서 형질전환시켰다. 클론을 LB-amp 중에서 밤새도록 성장시키고, carbA로부터의, 유전자 특이적 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 배양물을 PCR하여 올바른 배향에 대해 체크하였다. 수득된 플라스미드 pAS6-HyuH는, 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 발현하는 야생형 히단토이나제 유전자, 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 발현하는 카르바모일라제 유전자를 포함하였다. 발현 및 활성 체크를 위해 원하는 클론의 플라스미드를 제조하고, (히단토인 라세마제를 발현하는 플라스미드인) pOM21c를 포함하는 JM109 세포에 형질전환시켰다. 발현 분석을 위해, 사전 배양물을 37℃에서 밤새도록 (적절한 항생제를 포함하는) LB 배지 중에서 성장시켰다. 10 ㎕의 사전 배양물을 3 ml 유도 배지 (LB 배지 + 2 mg/ml 람노스)에 첨가하였다. 배양물을 30℃에서 20 h 동안 성장시켰다. 5 ㎕의 세포에 대해 SDS PAGE 분석을 수행하였다. 형광 기반 스크리닝 검정법을 사용하여 효소의 활성을 체크하였다.

실시예 2: 히단토이나제 돌연변이체

야생형 아르트로박터 종 히단토이나제 (서열 1) 내의 여러 부위를 돌연변이유발에 대해 측정하였다. 선별된 아미노산 위치에서의 포화 돌연변이유발에 의해 돌연변이체 라이브러리를 제조하였다. 이어서, 고처리량 스크리닝 검정법을 사용하여 활성 증가에 대해 합리적인 돌연변이체 라이브러리를 스크리닝하였다. 부위 포화를 위해 5개의 부위 (Y72, I95, V154, P155, H316) 및 돌연변이유발을 위해 2개의 부위 (A152G, S153G)를 선택하였다. 결정된 아미노산 위치에 대해, 5개 부위 포화 돌연변이유발 및 1개 부위 지정 돌연변이를 수행하였다.

실시예 2.1: 집중 돌연변이체 돌연변이체 라이브러리 구축 ( SSM & SDM )

야생형 히단토이나제를 발현하는, 실시예 1에서 수득된 플라스미드 (pAS6-HyuH; 도 1), 또는 후속 단계에서, 상기 히단토이나제의 돌연변이체를 보유하는 플라스미드를 사용하는 부위 포화 돌연변이유발 (ssm) 및 부위 지정 돌연변이유발 (sdm)에 퓨젼(Phusion) 폴리머라제를 적용시켰다.

부위 포화/지정 돌연변이유발을 위해, 집중 돌연변이체 라이브러리를 생성하는 데 2 단계 PCR 접근법을 적용시켰다. PCR 생성물을 칼럼 정제시키고, 밤새도록 DpnI 분해하여 모체 플라스미드를 제거하였다. 이어서, pAS6-HyuH의 모든 요소를 갖는 전장의 플라스미드를 나타내는 생성물을, pOM21c를 포함하는 JM109 세포에 형질전환시켰다.

상세하게, 부위 포화/지정 돌연변이유발 (SSM)을 위해 2단계 PCR 프로토콜을 따라 진행하였다. 50 ㎕ PCR 반응 혼합물은 1 ng/㎕의 플라스미드 주형, 1x 퓨젼 완충제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs: 독일 프랑크푸르트)), 1 U의 퓨젼 폴리머라제 및 300 μM dNTP를 포함하였다. 반응 혼합물 같은 부피 2개로 나누고, 각 아미노산 위치 (하기 표 1 참조)의 부위 포화를 위해 400 nM의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 별개의 반응 혼합물에 첨가하였다. PCR 프로그램은 98℃에서 45 sec 동안 (1회 사이클); 98℃에서 15 sec; 65℃에서 30 sec; 72℃에서 3 min 30 sec 동안 (5회 사이클); 72℃에서 5 min 동안 (1회 사이클)인 것이었다. 제1 단계 후, 두 반응물 모두를 풀링하고, 같은 프로그램을 18회 더 반복 수행하였다.

하기 표 1에는 기술된 PCR 방법에 사용된 프라이머 (F = 정방향 프라이머; R = 역방향 프라이머)와, 변형시키고자 하는 서열 1의 아미노산 위치 또한 제시되어 있다.

실시예 2.2: 아르트로박터 종 히단토이나제 ( HyuH )의 무작위 돌연변이체 라이브러리의 구축

epPCR 돌연변이체 라이브러리 생성을 위해, MnCl₂를 사용하여 오류 유발 조건을 생성하였다. MnCl₂ 농도를 달리하여 (0.05 mM, 0.1 mM, 0.2 mM, 0.5 mM) PCR을 먼저 수행하였다. 반응 혼합물은 가변 농도의 MnCl₂와 함께, 야생형 히단토이나제를 발현하는 실시예 1에서 수득된 플라스미드 [pAS6-HyuH; 도 1], 또는 연구의 추후 단계에서 수득된 상기 히단토이나제의 돌연변이체를 보유하는 플라스미드를 사용하는) 0.3 ng/㎕의 플라스미드 주형, 1 x SeSaM® Taq 완충제 (SeSaM-바이오테크 게엠베하(SeSaM-Biotech GmbH: 독일 브레멘)), 1 U의 SeSaM® Taq 폴리머라제, 200 μM dNTP 및 각각 표 1에 제시되어 있는 250 nM의 HyuH_GS_F 및 HyuH_R 프라이머를 포함하였다. PCR 프로그램은 94℃에서 2 min 동안 (1회 사이클); 94℃에서 30 sec; 56℃에서 30 sec; 72℃에서 50 sec 동안 (25회 사이클); 72℃에서 5 min 동안 (1회 사이클)인 것이었다. SeSaM® 프로토콜 (문헌 [Mundhada et al. "SeSaM-Tv-II generates a protein sequence space that is unobtainable by epPCR" Chembiochem. 2011 Jul 4;12(10):1595-601])을 사용하여 전환 편향성 돌연변이체 라이브러리를 구축하였다. PCR 생성물을 칼럼 정제시키고, 클로닝을 위해 메가왑(Megawhop)을 수행하였다. 50 ㎕ PCR 반응 혼합물은 1 ng/㎕의 플라스미드 주형, 1 x 퓨젼 완충제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스: 독일 프랑크푸르트), 1 U의 퓨젼 폴리머라제, 300 μM dNTP 및 5 ng/㎕의, epPCR 또는 SeSaM®로부터 돌연변이화된 주형을 포함하였다. 메가왑을 위한 PCR 프로그램은 72℃에서 3 min 동안 (1회 사이클); 98에서 45 sec 동안 (1회 사이클); 98℃에서 15 sec; 62℃에서 30 sec; 72℃에서 5 min 동안 (25회 사이클); 72℃에서 5 min 동안 (1회 사이클)인 것이었다. 이어서, PCR 믹스를 칼럼 정제시키고, 밤새도록 DpnI (10 U) 분해를 수행하였다. 단백질 발현 및 후속되는 분석을 위해 pAS6-HyuH의 모든 요소를 갖는 전장의 플라스미드를 나타내는 PCR 생성물을 화학적으로 적격인 JM109 세포 (프로메가(Promega: 독일 만하임))에 형질전환시켰다.

실시예 2.3: 집중 옴니체인지 ( Omnichange ) 돌연변이체 라이브러리의 구축

옴니체인지 프로토콜을 통해 서열 중 원거리에 있는 위치에서 다중 부위 포화 돌연변이유발을 수행할 수 있다. 이는 NNK-코돈을 포함하는 프라이머와 포스포로티오디에스테르 결합을 이용한 PCR에 의한 단편 생성을 출발로 하여, 이어서, 상보적인 5'-오버행의 생성을 위한 원소 아이오딘을 이용하여 DNA-절단 반응, 세번째로, DNA-혼성화 및 마지막으로 형질전환 및 닉 수복인, 4단계로 진행된다.

상세하게, 50 ㎕ PCR 반응 혼합물은 0.5 ng/㎕의 플라스미드 주형, 1 x 퓨젼 완충제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스: 독일 프랑크푸르트), 5 U의 퓨젼 폴리머라제, 200 μM dNTP 및 400 μM 단편 특이적 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하였다. 짧은 단편을 위한 PCR 프로그램은 94℃에서 3 min 동안 (1회 사이클); 94℃에서 30 sec; 55℃에서 30 sec; 72℃에서 30 sec 동안 (25회 사이클); 72℃에서 1 min 동안 (1회 사이클)인 것이었다. 벡터 단편을 위해, PCR 프로그램을 94℃에서 3 min 동안 (1회 사이클); 94℃에서 30 sec; 55℃에서 30 sec; 72℃에서 1.5 min 동안 ( 25회 사이클); 72℃에서 3 min 동안 (1회 사이클)인 것으로 변경시켰다. PCR 믹스를 칼럼 정제시키고, 밤새도록 DpnI (10 U) 분해를 수행하고, 칼럼 정제시키고, 0.05 pmol/㎕로 희석시켰다. 아이오딘 절단 및 DNA-단편 혼성화를 원래의 옴니체인지 프로토콜에 따라 수행하였다 (문헌 [Dennig et al., "OmniChange: The Sequence Independent Method for Simultaneous Site-Saturation of Five Codons" PLoS ONE, 2011, 6(10): e26222]). 이어서, 단백질 발현 및 후속되는 분석을 위해 혼성화 생성물을 화학적으로 적격인 JM109 세포 (프로메가: 독일 만하임)에 형질전환시켰다.

실시예 3: 마이크로타이터 플레이트 ( MTP )에 대한 형광 기반 스크리닝 검정

사전 배양 및 발현: 이쑤시개를 사용하여 양성 및 음성 대조군 뿐만 아니라, 수득된 클론을 96-웰 마이크로타이터 플레이트 중의 적절한 항생제를 함유하는 100 ㎕의 LB 배지에 접종하였다. 플레이트를 37℃ (900 rpm)에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 스크리닝 플레이트를 제조하기 위해, 항생제 및 2 mg/mL 람노스를 함유하는 200 ㎕/웰의 배지를 포함하는 새 MTP로 클론을 96-웰 복제기를 사용하여 옮겨 놓았다. 플레이트의 남아있는 물질에 100 ㎕의 50% 글리세롤 (w/w)을 첨가하고, 단시간 혼합하고, 플레이트를 -80℃에서 보관하였다.

생체내 형질전환: 30℃ (900 rpm)에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 100 ㎕/웰의 균질화된 L- 또는 D-트립토판 히단토인 현탁액 (PBS 완충제 (pH 7.4) 중 5 mg/mL)을 스크리닝 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 30℃ 및 900 rpm에서 인큐베이션시키고, 상이한 시점에 적합한 플레이트 판독기를 사용하여 300/350 nm에서 형광을 측정하였다.

실시예 4: 결과

실시예 3에 기술된 형광 검정법을 이용하여 실시예 2에 따른 부위 포화 돌연변이유발 실험 및 무작위 돌연변이유발 라이브러리로부터 수득된 돌연변이체 히단토이나제를 그의 활성에 대해 스크리닝하였다. 판독값은 40 min 내지 60 min에서 차등적인 측정치를 나타내었다. 각 측정은 3중으로 수행되었다. 상기 기술된 바와 같이, 돌연변이체 히단토이나제를 각각 기질로서 L-5-인돌릴메틸히단토인 (=L-트립토판 히단토인) 및 D-5-인돌릴메틸히단토인 (=D-트립토판 히단토인)을 사용하여 그의 활성과 관련하여 검정하고, 그의 활성을 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 히단토이나제의 활성과 비교하였다.

하기 표 2에 수득된 결과가 요약되어 있다. 표 2에 제시되어 있는 바와 같이, 서열 1의 아미노산 서열을 갖는, 미생물 아르트로박터 종에 의해 생산된 야생형 히단토이나제와 비교하여 더 높은 촉매 활성 및/또는 더 높은 거울상이성질체 선택성을 보이는 일련의 개선된 돌연변이체를 수득하였다.

표 2에서, "돌연변이유발 라운드"인 세로행은 돌연변이체 유래의 기점이 되는 돌연변이 유발의 유형을 나타낸다 (SSM = 부위 포화 돌연변이유발; epPCR = 오류 유발 PCR; 조합 SSM = 1개 초과의 아미노산 위치에서의 돌연변이유발인, 조합 부위 포화 돌연변이유발). "치환"이라고 지정된 세로행에는, 서열 1의 아미노산 서열 중의 주어진 위치에서의 아미노산 잔기의 치환이 제시되어 있다.

"HyuH wt에 대한 D-Trp-hyd의 활성비"로 지정된 세로행에는 기질로서 D-5-인돌릴메틸히단토인 (=D-트립토판 히단토인)을 사용한 것의, 야생형 히단토이나제에 대해 상대적인 촉매 활성의 개선 배수가 제시되어 있다. "HyuH wt에 대한 L-Trp-hyd의 활성비"로 지정된 세로행에는 기질로서 L-5-인돌릴메틸히단토인 (=L-트립토판 히단토인)을 사용한 것의, 야생형 히단토이나제에 대해 상대적인 촉매 활성의 개선 배수가 제시되어 있다.

"L-Trp-hyd에 대한 D-Trp-hyd의 활성비"로 지정된 세로행에는 D-5-인돌릴메틸히단토인을 변환시키는 돌연변이체 히단토이나제의 촉매 활성 대 L-5-인돌릴메틸히단토인을 변환시키는 돌연변이체 히단토이나제의 활성의 비가 제시되어 있고, 거울상이성질체에 대한 과선호 배수가 나타나 있다. 다시 말해, "L-Trp-hyd에 대한 D-Trp-hyd의 활성비"인 세로행에는 각 히단토이나제의 거울상이성질체 선택성이 제시되어 있다.

본 발명에 따른 히단토이나제는 5-치환된 히단토인 화합물, 특히 D-트립토판 히단토인과 관련하여 증진된 변환율을 나타내었다. 그러므로, 본원에 기술된 본 발명에 따른 히단토이나제 돌연변이체는 본 발명에 따른 돌연변이체 히단토이나제 뿐만 아니라, D-카르바모일라제를 사용하여, D-트립토판 히단토인을 출발로 하여, D-아미노산, 특히 D-트립토판을 제조하는 방법에서 적합한 것으로 간주되었다.

SEQUENCE LISTING <110> Evonik Industries AG <120> Mutants of Hydantoinase <130> 201100405 <160> 119 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 458 <212> PRT <213> Arthrobacter sp. <400> 1 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ala Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 2 <211> 1377 <212> DNA <213> Arthrobacter sp. <400> 2 atgtttgacg taatagttaa gaactgccgt atggtgtcca gcgacggaat caccgaggca 60 gacattctgg tgaaagacgg caaagtcgcc gcaatcagct cggacacaag tgatgttgag 120 gcgagccgaa ccattgacgc gggtggcaag ttcgtgatgc cgggcgtggt cgatgaacat 180 gtgcatatca tcgacatgga tctgaagaac cggtatggcc gcttcgaact cgattccgag 240 tctgcggccg tgggaggcat caccaccatc atcgagatgc cgataacctt cccgcccacc 300 accactttgg acgccttcct cgaaaagaag aagcaggcgg ggcagcggtt gaaagttgac 360 ttcgcgctct atggcggtgg agtgccggga aacctgcccg agatccgcaa aatgcacgac 420 gccggcgcag tgggcttcaa gtcaatgatg gcagcctcag ttccgggcat gttcgacgcc 480 gtcagcgacg gcgaactgtt cgaaatcttc caggagatcg cagcctgtgg ttcagtcgtc 540 gtggtccatg ccgagaatga aacgatcatt caagcgctcc agaagcagat caaagccgct 600 ggtcgcaagg acatggccgc ctacgaggca tcccaaccag ttttccagga gaacgaggcc 660 attcagcgtg cgttactact gcagaaagaa gccggctgtc gactgattgt gcttcacgtg 720 agcaaccctg acggggtcga gctgatacat caggcgcaat ccgagggcca ggacgtccac 780 tgcgagtcgg gtccgcagta tctgaatatc accacggacg acgccgaacg aatcggaccg 840 tatatgaagg tcgcgccgcc cgtccgctca gccgagatga acgtcagatt atgggaacaa 900 cttgagaacg ggctcatcga cacccttggg tcagaccacg gcggacatcc tgtcgaggac 960 aaagaacccg gctggaagga cgtgtggaaa gccggcaacg gtgcgctggg ccttgagaca 1020 tccctgccta tgatgctgac caacggagtg aataaaggca ggctatcctt ggaacgcctc 1080 gtcgaggtga tgtgcgagaa acctgcgaag ctctttggca tctatccgca gaagggcacg 1140 ctacaggttg gttccgacgc cgatctgctc atcctcgatc tggatattga caccaaagtg 1200 gatgcctcgc agttccgatc cctgcataag tacagcccgt tcgacgggat gcccgtcacg 1260 ggtgcaccgg ttctgacgat ggtgcgcgga acggtggtgg cagagaaggg agaagttctg 1320 gtcgagcagg gattcggcca gttcgtcacc cgtcacgact acgaggcgtc gaagtga 1377 <210> 3 <211> 236 <212> PRT <213> Agrobacterium sp. <400> 3 Met Arg Ile Leu Val Ile Asn Pro Asn Ser Ser Ser Ala Leu Thr Glu 1 5 10 15 Ser Val Ala Asp Ala Ala Gln Gln Val Val Ala Thr Gly Thr Ile Ile 20 25 30 Ser Ala Ile Asn Pro Ser Arg Gly Pro Ala Val Ile Glu Gly Ser Phe 35 40 45 Asp Glu Ala Leu Ala Thr Phe His Leu Ile Glu Glu Val Glu Arg Ala 50 55 60 Glu Arg Glu Asn Pro Pro Asp Ala Tyr Val Ile Ala Cys Phe Gly Asp 65 70 75 80 Pro Gly Leu Asp Ala Val Lys Glu Leu Thr Asp Arg Pro Val Val Gly 85 90 95 Val Ala Glu Ala Ala Ile His Met Ser Ser Phe Val Ala Ala Thr Phe 100 105 110 Ser Ile Val Ser Ile Leu Pro Arg Val Arg Lys His Leu His Glu Leu 115 120 125 Val Arg Gln Ala Gly Ala Thr Asn Arg Leu Ala Ser Ile Lys Leu Pro 130 135 140 Asn Leu Gly Val Met Ala Phe His Glu Asp Glu His Ala Ala Leu Glu 145 150 155 160 Thr Leu Lys Gln Ala Ala Lys Glu Ala Val Gln Glu Asp Gly Ala Glu 165 170 175 Ser Ile Val Leu Gly Cys Ala Gly Met Val Gly Phe Ala Arg Gln Leu 180 185 190 Ser Asp Glu Leu Gly Val Pro Val Ile Asp Pro Val Glu Ala Ala Cys 195 200 205 Arg Val Ala Glu Ser Leu Val Ala Leu Gly Tyr Gln Thr Ser Lys Ala 210 215 220 Asn Ser Tyr Gln Lys Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Leu 225 230 235 <210> 4 <211> 306 <212> PRT <213> Agrobacterium sp. <400> 4 Met Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Ala 1 5 10 15 Arg Ala Glu Thr Arg Glu Gln Val Val Gly Arg Leu Leu Asp Met Leu 20 25 30 Thr Asn Ala Ala Ser Arg Gly Val Asn Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr Asp Glu Ala Glu 50 55 60 Leu Asp Ser Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Val Val Arg Pro 65 70 75 80 Leu Phe Glu Thr Ala Ala Glu Leu Gly Ile Gly Phe Asn Leu Gly Tyr 85 90 95 Ala Glu Leu Val Val Glu Gly Gly Val Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser 100 105 110 Ile Leu Val Asp Lys Ser Gly Lys Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile 115 120 125 His Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His 130 135 140 Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr 145 150 155 160 Asp Val Asp Ala Ala Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg 165 170 175 Trp Pro Glu Thr Trp Arg Val Met Gly Leu Lys Gly Ala Glu Ile Ile 180 185 190 Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Pro Val Pro Gln His 195 200 205 Asp His Leu Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser 210 215 220 Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Met Glu 225 230 235 240 Glu Gly Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly 245 250 255 Glu Ile Val Ala Leu Thr Thr Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala 260 265 270 Ala Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His Ile Phe Asn 275 280 285 Phe Lys Ala His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu Ile Ala Glu Phe 290 295 300 Gly Ile 305 <210> 5 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (71)..(72) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (95)..(95) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (152)..(152) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (154)..(154) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (181)..(181) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (284)..(285) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (398)..(398) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (452)..(452) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 5 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Xaa 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Xaa Xaa Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Xaa Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Xaa Ser Xaa Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Xaa Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Xaa Xaa Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Xaa Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg Xaa Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 6 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <220> <221> VARIANT <222> (152)..(152) <223> A replaced by G <400> 6 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Gly Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 7 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <220> <221> VARIANT <222> (152)..(152) <223> A replaced by C <400> 7 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Cys Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 8 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <220> <221> VARIANT <222> (152)..(152) <223> A replaced by S <400> 8 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 9 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <220> <221> VARIANT <222> (152)..(152) <223> A replaced by T <400> 9 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Thr Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 10 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <220> <221> VARIANT <222> (152)..(152) <223> A replaced by V <400> 10 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Val Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 11 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <220> <221> VARIANT <222> (152)..(152) <223> A replaced by S <220> <221> VARIANT <222> (154)..(154) <223> V replaced by I <400> 11 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Ile Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 12 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <220> <221> VARIANT <222> (152)..(152) <223> A replaced by V <220> <221> VARIANT <222> (154)..(154) <223> V replaced by C <400> 12 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Val Ser Cys Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 13 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <220> <221> VARIANT <222> (152)..(152) <223> A replaced by C <220> <221> VARIANT <222> (154)..(154) <223> V replaced by S <400> 13 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Cys Ser Ser Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 14 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <220> <221> VARIANT <222> (71)..(71) <223> R replaced by D <220> <221> VARIANT <222> (72)..(72) <223> Y replaced by H <220> <221> VARIANT <222> (152)..(152) <223> A replaced by S <400> 14 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 15 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <220> <221> VARIANT <222> (71)..(71) <223> R replaced by D <220> <221> VARIANT <222> (72)..(72) <223> Y replaced by N <220> <221> VARIANT <222> (152)..(152) <223> A replaced by S <400> 15 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp Asn Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 16 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <220> <221> VARIANT <222> (71)..(71) <223> R replaced by V <220> <221> VARIANT <222> (72)..(72) <223> Y replaced by N <220> <221> VARIANT <222> (152)..(152) <223> A replaced by S <400> 16 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Val Asn Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 17 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <220> <221> VARIANT <222> (71)..(71) <223> R replaced by S <220> <221> VARIANT <222> (72)..(72) <223> Y replaced by N <220> <221> VARIANT <222> (152)..(152) <223> A replaced by C <220> <221> VARIANT <222> (154)..(154) <223> V replaced by S <220> <221> VARIANT <222> (181)..(181) <223> V replaced by A <400> 17 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Ser Asn Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Cys Ser Ser Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Ala Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 18 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <220> <221> VARIANT <222> (71)..(71) <223> R replaced by Y <220> <221> VARIANT <222> (72)..(72) <223> Y replaced by N <220> <221> VARIANT <222> (152)..(152) <223> A replaced by S <400> 18 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Tyr Asn Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 19 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <220> <221> VARIANT <222> (71)..(71) <223> R replaced by L <220> <221> VARIANT <222> (152)..(152) <223> A replaced by C <220> <221> VARIANT <222> (154)..(154) <223> V replaced by S <400> 19 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Leu Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Cys Ser Ser Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 20 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <220> <221> VARIANT <222> (71)..(71) <223> R replaced by Y <220> <221> VARIANT <222> (72)..(72) <223> Y replaced by H <220> <221> VARIANT <222> (152)..(152) <223> A replaced by S <400> 20 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Tyr His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 21 atctgaagaa ccggnnkggc cgcttcgaac t 31 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 22 agttcgaagc ggccmnnccg gttcttcaga t 31 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 23 catcgagatg ccgnnkacct tcccgcccac 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 24 gtgggcggga aggtmnncgg catctcgatg 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 25 tgatggcagc ctcannkccg ggcatgttcg 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 26 cgaacatgcc cggmnntgag gctgccatca 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 27 tggcagcctc agttnnkggc atgttcgacg 30 <210> 28 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 28 gcgtcgaaca tgccmnnaac tgaggctgcc a 31 <210> 29 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 29 cagcctcagt tccgnnkcag cctcagttcc g 31 <210> 30 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 30 cggaactgag gctgmnncgg aactgaggct g 31 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 31 cccttgggtc agacnnkggc ggacatcctg 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 32 caggatgtcc gccmnngtct gacccaaggg 30 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 33 cgtatatgaa ggtcnnkccg cccgtccgct ca 32 <210> 34 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 34 tgagcggacg ggcggmnnga ccttcatata cg 32 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 35 gaccgtatat gaagnnkgcg ccgcccgtc 29 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 36 gacgggcggc gcmnncttca tatacggtc 29 <210> 37 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 37 caccatcatc gagatgnnka taaccttccc g 31 <210> 38 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 38 cgggaaggtt atmnncatct cgatgatggt g 31 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 39 tgccgataac cttcnnkccc accaccactt tgg 33 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 40 ccaaagtggt ggtgggmnng aaggttatcg gca 33 <210> 41 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 41 cgataacctt cccgnnkacc accactttgg ac 32 <210> 42 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 42 gtccaaagtg gtggtmnncg ggaaggttat cg 32 <210> 43 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 43 ggatctgaag aacnnktatg gccgcttcga ac 32 <210> 44 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 44 gttcgaagcg gccatamnng ttcttcagat cc 32 <210> 45 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 45 caagtcaatg atggcannkt cagttccggg c 31 <210> 46 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 46 gcccggaact gamnntgcca tcattgactt g 31 <210> 47 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 47 cagttccggg catgnnkgac gccgtcagcg ac 32 <210> 48 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 48 gtcgctgacg gcgtcmnnca tgcccggaac tg 32 <210> 49 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 49 catggatctg aagaacndtn dtggccgctt cgaactc 37 <210> 50 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 50 gagttcgaag cggccahnah ngttcttcag atccatg 37 <210> 51 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a, c, g, or t <400> 51 gcttcaagtc aatgatggca ndttcandtc cgggcatgtt cgac 44 <210> 52 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a, c, g, or t <400> 52 gtcgaacatg cccggahntg aahntgccat cattgacttg aagc 44 <210> 53 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 53 ggaccgtata tgaagndtnd tccgcccgtc cgctc 35 <210> 54 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 54 gagcggacgg gcggahnahn cttcatatac ggtcc 35 <210> 55 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 55 gaacatgtgc atatcnnkga catggatctg aag 33 <210> 56 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 56 cttcagatcc atgtcmnnga tatgcacatg ttc 33 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 57 tcacttcgac gcctcgtagt cg 22 <210> 58 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 58 atgtttgacg taatagttaa gaactgccg 29 <210> 59 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 59 gtgtgatggc gtgaggcagc ctactgccgc caggcaaatt ct 42 <210> 60 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 60 cacactaccg cactccgtcg cgtcagccac agcactacgg 40 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 61 cgtatggtgt ccnnkgacgg aatcaccgag 30 <210> 62 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 62 ggacaccata cggcagttct taactattac g 31 <210> 63 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 63 agctcggaca cannkgatgt tgaggcgag 29 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 64 tgtgtccgag ctgattgcgg cg 22 <210> 65 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 65 gtcaatgatg gcaagtndtd nyccgggcat gttcgacg 38 <210> 66 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 66 cgtcgaacat gcccggrnha hnacttgcca tcattgac 38 <210> 67 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 67 ccgtatggtg tccbbtnnkg gaatcaccga gg 32 <210> 68 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 68 cctcggtgat tccmnnavvg gacaccatac gg 32 <210> 69 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 69 gaacatgtgc atatcatcga catggatctg aaga 34 <210> 70 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 70 tcttcagatc catgtcgatg atatgcacat gttc 34 <210> 71 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 71 caagtcaatg atggcagcct cagttccggg catg 34 <210> 72 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <400> 72 catgcccgga actgaggctg ccatcattga cttg 34 <210> 73 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 73 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro His Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ala Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 74 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 74 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ala Ser Gly Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 75 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 75 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ala Ser Asn Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 76 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 76 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ala Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 77 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 77 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Glu Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ala Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 78 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 78 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ala Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Phe Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 79 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 79 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ala Ser Ala Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 80 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 80 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Thr 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ala Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 81 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 81 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Val 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ala Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 82 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 82 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ala Ser Ser Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 83 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 83 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ala Ser Ala Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Ala Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg Leu Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 84 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 84 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Ile Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 85 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 85 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 86 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 86 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Val Asn Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 87 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 87 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Val Asn Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Cys Ser Ser Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Ala Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 88 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 88 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp Asn Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 89 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 89 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Tyr Asn Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 90 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 90 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Ile Asn Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 91 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 91 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Tyr Asn Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 92 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 92 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 93 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 93 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Leu 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 94 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 94 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Val Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 95 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 95 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Gly Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 96 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 96 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Arg Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 97 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 97 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Gly Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Ala Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 98 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 98 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Arg Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Lys Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 99 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 99 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Arg Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Ser Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Arg Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 100 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 100 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Gly Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asp Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 101 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 101 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Gly Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Ala Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 102 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 102 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Gly Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 103 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 103 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ala Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Gly Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 104 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 104 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Val Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 105 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 105 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Gly Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Gly Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 106 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 106 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ala Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Trp Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 107 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 107 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ala Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Val Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 108 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 108 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asn Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 109 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 109 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Val Asp Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Arg Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 110 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 110 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asn Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Cys Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 111 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 111 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Asn Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Ser Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Ile Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 112 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 112 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Gly Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 113 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 113 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Gly Arg Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Gly Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 114 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 114 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Gly Gln Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Gly Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 115 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 115 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Phe Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Gly Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 116 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 116 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Ser Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Gly Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 117 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 117 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Gly Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Ile 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ser Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 118 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 118 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Gly Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ala Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455 <210> 119 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutant sequence <400> 119 Met Phe Asp Val Ile Val Lys Asn Cys Arg Met Val Ser Ser Ser Gly 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ala Asp Ile Leu Val Lys Asp Gly Lys Val Ala Ala Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Thr Gly Asp Val Glu Ala Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Phe Val Met Pro Gly Val Val Asp Glu His Val His Ile Cys 50 55 60 Asp Met Asp Leu Lys Asn Asp His Gly Arg Phe Glu Leu Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Gly Gly Ile Thr Thr Ile Ile Glu Met Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Pro Pro Thr Thr Thr Leu Asp Ala Phe Leu Glu Lys Lys Lys Gln 100 105 110 Ala Gly Gln Arg Leu Lys Val Asp Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Val 115 120 125 Pro Gly Asn Leu Pro Glu Ile Arg Lys Met His Asp Ala Gly Ala Val 130 135 140 Gly Phe Lys Ser Met Met Ala Ala Ser Val Pro Gly Met Phe Asp Ala 145 150 155 160 Val Ser Asp Gly Glu Leu Phe Glu Ile Phe Gln Glu Ile Ala Ala Cys 165 170 175 Gly Ser Val Val Val Val His Ala Glu Asn Glu Thr Ile Ile Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Lys Gln Ile Lys Ala Ala Gly Arg Lys Asp Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Ala Ser Gln Pro Val Phe Gln Glu Asn Glu Ala Ile Gln Arg Ala 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Lys Glu Ala Gly Cys Arg Leu Ile Val Leu His Val 225 230 235 240 Ser Asn Pro Asp Gly Val Glu Leu Ile His Gln Ala Gln Ser Glu Gly 245 250 255 Gln Asp Val His Cys Glu Ser Gly Pro Gln Tyr Leu Asn Ile Thr Thr 260 265 270 Asp Asp Ala Glu Arg Ile Gly Pro Tyr Met Lys Val Ala Pro Pro Val 275 280 285 Arg Ser Ala Glu Met Asn Val Arg Leu Trp Glu Gln Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Leu Ile Asp Thr Leu Gly Ser Asp His Gly Gly His Pro Val Glu Asp 305 310 315 320 Lys Glu Pro Gly Trp Lys Asp Val Trp Lys Ala Gly Asn Gly Ala Leu 325 330 335 Gly Leu Glu Thr Ser Leu Pro Met Met Leu Thr Asn Gly Val Asn Lys 340 345 350 Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Glu Val Met Cys Glu Lys Pro 355 360 365 Ala Lys Leu Phe Gly Ile Tyr Pro Gln Lys Gly Thr Leu Gln Val Gly 370 375 380 Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ile Asp Thr Lys Val 385 390 395 400 Asp Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu His Lys Tyr Ser Pro Phe Asp Gly 405 410 415 Met Pro Val Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Met Val Arg Gly Thr Val 420 425 430 Val Ala Glu Lys Gly Glu Val Leu Val Glu Gln Gly Phe Gly Gln Phe 435 440 445 Val Thr Arg His Asp Tyr Glu Ala Ser Lys 450 455

Claims

(i) 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 73, 서열 74, 서열 75, 서열 76, 서열 77, 서열 78, 서열 79, 서열 80, 서열 81, 서열 82, 서열 83, 서열 84, 서열 85, 서열 86, 서열 87, 서열 88, 서열 89, 서열 90, 서열 91, 서열 92, 서열 93, 서열 94, 서열 95, 서열 96, 서열 97, 서열 98, 서열 99, 서열 100, 서열 101, 서열 102, 서열 103, 서열 104, 서열 105, 서열 106, 서열 107, 서열 108, 서열 109, 서열 110, 서열 111, 서열 112, 서열 113, 서열 114, 서열 115, 서열 116, 서열 117, 서열 118, 또는 서열 119로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는
(ii) 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 73, 서열 74, 서열 75, 서열 76, 서열 77, 서열 78, 서열 79, 서열 80, 서열 81, 서열 82, 서열 83, 서열 84, 서열 85, 서열 86, 서열 87, 서열 88, 서열 89, 서열 90, 서열 91, 서열 92, 서열 93, 서열 94, 서열 95, 서열 96, 서열 97, 서열 98, 서열 99, 서열 100, 서열 101, 서열 102, 서열 103, 서열 104, 서열 105, 서열 106, 서열 107, 서열 108, 서열 109, 서열 110, 서열 111, 서열 112, 서열 113, 서열 114, 서열 115, 서열 116, 서열 117, 서열 118, 또는 서열 119의 아미노산 서열에서, 1 내지 φ개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가되어 있는 것인 아미노산 서열
로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고, 여기서 φ는 φ = 75로 정의되는 것인 히단토이나제이며,
추가로 상기 히단토이나제의 촉매 활성은 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제의 촉매 활성보다 ζ배 이상만큼 더 높고, 여기서 ζ는 ζ = 1.2로 정의되는 것인 히단토이나제.
제1항에 있어서, φ가 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1로부터 선택되는 것인 히단토이나제.
제1항에 있어서, ζ가 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30으로부터 선택되는 것인 히단토이나제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 히단토이나제가 하기 기질: 히단토인, 5-메틸히단토인, 5-벤질히단토인, 5-(4-히드록시벤질)히단토인, 5-인돌릴메틸히단토인, 5-(3,4-디히드록시벤질)히단토인, 5-메틸티오에틸히단토인, 5-이소프로필히단토인, 5-이소부틸히단토인, 5-sec-부틸히단토인, 5-(4-아미노부틸)히단토인, 5-히드록시메틸히단토인, 또는 비천연 아미노산에 상응하는 5-치환된 히단토인 화합물, 각각 그의 유도체 중 하나 이상을 각각의 카르바모일 아미노산으로 변환시키며, 여기서 상기 기질의 변환과 관련하여 히단토이나제의 촉매 활성은 적어도 D-5-인돌릴메틸히단토인의 변환과 관련하여 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제의 촉매 활성만큼 높은 것인 히단토이나제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, D-히단토인에 대한 거울상이성질체 선택성(enantioselectivity)이 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제의 거울상이성질체 선택성보다 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100 또는 150배 이상만큼 더 높은 것인 히단토이나제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 히단토이나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
65℃에서 1x 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC) 및 0.1% 소듐 도데실 술페이트 (SDS) 용액 중의 세척을 포함하는 엄격한 조건하에서 제6항에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 전장 보체에 혼성화하는 단리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드이며,
히단토이나제의 촉매 활성은 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 히단토이나제의 촉매 활성보다 ζ배 이상만큼 더 높고, 여기서 ζ는 ζ = 1.2로 정의되는 것인, 단리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
제6항 또는 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제6항 또는 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 제8항에 따른 벡터를 포함하는, 단리된 또는 형질전환된 숙주 세포.
제9항에 있어서, 적어도 히단토이나제; 히단토이나제 및 히단토인 라세마제; 히단토이나제 및 카르바모일라제; 또는 히단토이나제 및 히단토인 라세마제 및 카르바모일라제로부터 선택되는 효소 활성을 발현하는 숙주 세포.
(a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 히단토이나제의 히단토이나제 활성 및 카르바모일라제 활성 및 하나 이상의 5-치환된 히단토인을 반응 배지에 제공하고, 임의로 히단토인 라세마제 활성을 상기 반응 배지에 제공하는 단계;
(b) 반응 배지를 인큐베이션시켜, 5-치환된 히단토인이 (a)에서 제공된 효소 활성에 의해 각 아미노산으로 변환될 수 있도록 하는 단계; 및
(c) 각 5-치환된 히단토인의 효소적 변환으로부터 수득된 아미노산을 반응 배지로부터 회수하는 단계
를 포함하는, 아미노산을 제조하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 5-치환된 히단토인이 D,L-5-치환된 히단토인, D,L-5-인돌릴메틸히단토인 (=D,L-트립토판 히단토인), D-5-치환된 히단토인, D-5-인돌릴메틸히단토인 (=D-트립토판 히단토인)으로부터 선택되는 것인 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 반응 배지에 제공되는 상기 5-치환된 히단토인이 L-5-치환된 히단토인 또는 D,L-5-치환된 히단토인이고, 추가로 L-5-치환된 히단토인 또는 D,L-5-치환된 히단토인을 D-5-치환된 히단토인으로 변환시키기 위해 히단토인 라세마제 활성을 단계 (a)의 반응 배지에 제공하는 것인 방법.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제조되는 아미노산이 D-트립토판이고, 5-치환된 히단토인이 D-5-인돌릴메틸히단토인, L-5-인돌릴메틸히단토인 또는 D,L-5-인돌릴메틸히단토인으로부터 선택되는 것인 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 반응 배지가 부분적으로 또는 전체적으로 세포 배양 배지로 이루어진 배지이고, 히단토이나제 활성이 제9항 또는 제10항에 따른 숙주 세포에 의해 제공되고, 숙주 세포가 상기 반응 배지에서 배양되는 것인 방법.
제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 배지가 부분적으로 또는 전체적으로 세포 배양 배지로 이루어진 배지이고, 카르바모일라제 활성이 제9항 또는 제10항에 따른 숙주 세포에 의해 또는 제2 숙주 세포에 의해 제공되고, 상기 숙주 세포(들)이 상기 반응 배지에서 배양되는 것인 방법.