JP4251446B2

JP4251446B2 - アルデヒド脱水素酵素をコードする遺伝子

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Inventors: 匡藤井; 仁上松
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Publication date: 2009-04-08
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Description

本発明は、組換えＤＮＡ技術、より具体的には、微生物タンパク質をコードする分離された遺伝子に関する。

Ｌ−２−アミノアジピン酸（またはホモグルタミン酸とも称されている。）は細菌であるコレラビブリオ（Cholera vibrio）、トウモロコシ（Zea mays）をはじめとする植物体、カエルの胚など、生物界に広く見いだされている。真菌類などにおいてはリジン生合成の中間体として、そしてβ−ラクタム系抗生物質の生合成においては前駆体としての位置を占めている。また、Ｌ−２−アミノアジピン酸およびその誘導体は、メトトレキセート誘導体（例えば、特許文献１参照。）を始めとする各種医薬品の合成中間体としても有用である。そのため、効率よくＬ−２−アミノアジピン酸を製造すべく、有機化学合成法やＬ−リジンからの生物学的変換法が提案されている。これらのうち、目的とする化合物が光学活性物質であることから、有利な方法として生物学的変換法に興味がもたれる。例えば、Ｌ−リジンのα−アミノ基保護誘導体を含有する培地でストレプトミセスモデラタス（Streptomyces moderatus）ＩＦＯ１３４３２を培養することにより、Ｌ−２−アミノアジピン酸誘導体を培地中に蓄積する方法（例えば、特許文献２参照。）およびＬ−リジンからＬ−２−アミノアジピン酸への生合成または異化に関与する特定の遺伝子の増強を目差した該特定の遺伝子の単離（例えば、特許文献３参照。）も提案されている。なお、後者では、下記の経路（例えば、非特許文献１参照。）に示されるリジン６−アミノトランスフェラーゼ（以下、ＬＡＴと略記する）およびデルタ１−ピペリジン−６−カルボン酸（Ｐ６Ｃと略記される）脱水素酵素を、それぞれコードする遺伝子が、フラボバクテリウムルテセンス（Flavobacterium lutescens）ＩＦＯ３０８４から単離されている。

他方、セファマイシンＣ生産菌であるストレプトミセスクラブリゲラス（Streptomyces clavuligerus）において、Ｌ−リジンがＰ６Ｃ（α−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドの環状体）を経てＬ−２−アミノアジピン酸へ変換されることが知られている（例えば、非特許文献２参照。）。
国際公開（ＷＯ）第９２／０９４３６号パンフレット特開平７−２９８８９２号公報国際公開（ＷＯ）第００／０８１７０号パンフレット Soda et al.,Biochemistry ７（１９６８）４１０２−４１０９，同４１１０−４１１９ Fuente et al.,Biochemical Journal（１９９７）３２７，５９−６４

例えば、特許文献３に記載されたＬＡＴをコードする遺伝子およびＰ６Ｃ脱水素酵素をコードする遺伝子を、目的に応じて増強したＬ−リジンからＬ−２−アミノアジピン酸への変換系を構築することもできるが、必ずしも、α−アミノ基の保護体については上記の変換を効果的に進行することができない。

したがって、α−アミノ基が保護されたＬ−リジンから対応するＬ−２−アミノアジピン酸誘導体への変換を効果的に行うには、特に、α−アミノ基がアミノ保護基により保護された（Ｐ６Ｃのごとく分子内での保護された形態にあるのでなく）α−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド誘導体を対応するＬ−２−アミノアジピン酸へ変換できるデヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）をコードする遺伝子を単離することが必要となろう。

本発明者らは、かようなニーズに応えるべく、ストレプトミセスモデラタス（S. moderatus）ＩＦＯ１３４３２から、例えば、α−アミノ基がベンジルオキシカルボニル基（以下、Ｚ−ともいう。）で保護されたＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドを対応する２−アミノアジピン酸へ変換しうる酵素をコードする遺伝子のクローニングを試みた。これは、S. moderatus ＩＦＯ１３４３２がＺ−Ｌ−リジンをＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸へ変換しうること、ならびに上記のストレプトミセスクラブリゲラス（S. clavuligerus）およびフラボバクテリウムルテセンス（F. lutescens）にＰ６Ｃ脱水素酵素をコードする遺伝子が存在することを考慮したことによる。こうして本発明者らは、まず、S. clavuligerus や F. lutescensのＰ６Ｃ脱水素酵素をコードする遺伝子の塩基配列に従ってプライマーを設計し、S. moderatus のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行ったが、目的とする、少なくとも基質として、Ｚ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドを対応する２−アミノアジピン酸へ変換しうるアルデヒド脱水素酵素（以下、アルデヒド脱水素酵素ともいう。）をコードする遺伝子の取得に失敗した。そのことから、既知のＰ６Ｃ脱水素酵素（なお、上述したとおり、Ｐ６Ｃはα−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドと平衡関係にある。）は、存在するとしても、S. moderatus ＩＦＯ１３４３２のアルデヒド脱水素酵素と異なることが予測される。

したがって、本発明者は第二のアプローチとして、該アルデヒド脱水素酵素を上記のＩＦＯ１３４３２株から精製し、得られる酵素のＮ末端アミノ酸配列の情報からプライマーを設計し、目的の遺伝子を取得することを検討した。しかし、該酵素を精製するには酵素活性を測定することが必要であるが、例えば、Ｚ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドは、本発明者が調査した範囲では文献未載であった。なお、非特許文献２第６０頁左欄１６−２２行では、Ｐ６Ｃ脱水素酵素を精製するのにＰ６Ｃを合成したことが示唆されている。本発明者らもかようなＰ６Ｃを該アルデヒド脱水素酵素の精製に用いることを試みたが、該酵素活性の測定系でＰ６Ｃは必ずしも安定に使用することはできなかった。また、Ｚ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドの化学合成を試みたが、目的物を得ることはできなかった。

そこで、生物学的変換法によるＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドの調製を検討してみた。その結果、上述のF. lutescens ＩＦＯ３０８４から得られるＬＡＴおよびＰ６Ｃ脱水素酵素系はＺ−Ｌ−２−リジンをＺ−Ｌ−２−アジピン酸に変換しなかったにもかかわらず、意外にも、該ＬＡＴはＺ−Ｌ−２−リジン等のα−アミノ基保護Ｌ−リジンを対応するＬ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドへ変換しうることを見出した。本発明者らは、こうして取得できる、例えば、Ｚ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドを基質として該アルデヒド脱水素酵素活性を測定することにより、初めて、目的とする酵素をS. moderatus ＩＦＯ１３４３２から精製し、そしてその部分アミノ酸配列を決定することに成功した。そして、かようなアミノ酸配列に基づいて調製したプライマーを用いるＰＣＲにより目的とする該アルデヒド脱水素酵素をコードする遺伝子を取得することができた。

したがって、本発明によれば、基質として少なくともＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドをＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸に変換できる酵素活性を有するタンパク質（アルデヒド脱水素酵素）をコードする遺伝子が提供できる。

また本発明によれば、α−アミノ基の保護されたＬ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドを対応するＬ−２−アミノアジピン酸に変換できる酵素活性を有するタンパク質または該タンパク質をコードする遺伝子を単離するか、あるいは該遺伝子を担持する微生物をスクリーニングするための、下記一般式（Ｉ）で示されるＬ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド誘導体それ自体も提供される。

上式中、Ｒはアミノ基の保護基、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基等の炭素数１〜５の低級アルカノイル基；フェニルアセチル基、４−メトキシフェニルアセチル基等の炭素数８〜９の芳香族置換アセチル基；ベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基等の炭素数７〜８の芳香族アシル基；ベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基等の炭素数８〜９の芳香族置換アルキルオキシカルボニル基；ｔ−ブトキシカルボニル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等の炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基等を表す。

基質として少なくともＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドをＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸に変換できる酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、それを自律複製性または組込み複製性の組換えプラスミドとすることで、例えば、S. moderatus ＩＦＯ１３４３２を宿主として該組換えプラスミドで形質転換することにより、特に、α−アミノ基を保護したＬ−リジンからそれらに対応するα−アミノ基を保護したＬ−２−アミノアジピン酸への変換効率を有意に高めることができる。

（Ａ）Ｚ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドの調製
（１）本発明者らの一部によって提供された、F. lutescens ＩＦＯ３０８４由来のＬＡＴをコードする遺伝子（lat）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の情報（特許文献３参照。）を基に、大腸菌（Escherichia coli）における lat 発現プラスミドｐＲＨ１２４を作製できる。具体的には、lat Ｎ末のＤＮＡ配列から作製したプライマーＲ１（ＡＴＡＡＧＣＴＴＧＴＣＣＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＧＣ：配列番号：６参照。）と、lat の下流のＤＮＡ配列から作製したプライマーＲ２（ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＧＣＣＧＣＴＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＡＧ配列番号：７参照。）とを用い、F. lutescens ＩＦＯ３０８４株のゲノムＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして、ＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩサイトに連結したプラスミドをｐＲＨ１２４とした。ｐｒｏＣ３２変異株大腸菌（E. coli）ＲＫ４９０４（ＣＧＳＣ＃：６４０４）を E. coli Genetic Stock Center.（Yale University, USA）から取得し、ｐＲＨ１２４を導入した。

限定されるものでないが、こうして例えば、Ｚでα−アミノ基を保護したＬ−リジンからＺ−Ｌ−２−アミノアジピン６−アルデヒドへ変換しうる微生物E. coli ＲＫ４９０４／ｐＲＨ１２４株が得られる。
（２）こうして取得した E. coli ＲＫ４９０４／ｐＲＨ１２４株を、アンピシリンナトリウム５０μｇ／ｍｌを添加したＬ−ブロス（トリプトン１％、酵母エキス０.５％、ＮａＣｌ０.０５％、ｐＨ７.４）２５ｍｌを入れた２５０ｍｌ容のエルレンマイヤーフラスコ２本に植菌し、３２℃で一晩振とう培養した後、培養液５０ｍｌを集菌し、BugBuster（Novagen 社製）で菌体を破砕してその上清をＬＡＴ粗酵素液とした。

７.３５ｍｌの０.２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）に１２５ｍｇのＺ−Ｌ−リジン、２９５ｍｇのα−ケトグルタル酸、１.８ｍｇのピリドキサルリン酸を溶かして、０.１ＮＮａＯＨでｐＨ７.０に合わせた後、ＬＡＴ粗酵素液２ｍｌを加えて３２℃で一晩振とうした。反応終了後、反応液を０.１ＮＨＣｌでｐＨ２.０に合わせた後、１０ｍｌの酢酸エチルで生成したＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドを抽出した。減圧下に酢酸エチルを留去して４１ｍｇのＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドを得た。これを１ｍｌの０.０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）に溶かしてＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド溶液とした。ＨＰＬＣ分析条件は、カラムはＹＭＣ−ＰａｋＯＤＳ（４.６Ｉ.Ｄ.×７５ｍｍ）を用い、移動相はアセトニトリル／０.０１％ＴＦＡ水溶液（１５：８５）からアセトニトリル／０.０１％ＴＦＡ水溶液（５０：５０）への１０分間のリニアグラジエントを行った。流速は１.５ｍｌ／ｍｉｎ、検出はＵＶ２２０ｎｍで行った。この分析条件でＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸およびＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドの保持時間は、それぞれ６.２分および１０.１分であった。
（Ｂ）アルデヒド脱水素酵素の酵素活性の測定
８２μｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５.０）をエッペンドルフチューブに取り、そこに０.２ｍｇのＮＡＤＨと５μｌの実施例２で調製したＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド溶液を添加して反応液とした。酵素反応は酵素液１０μｌを添加して３０℃で１５時間反応を行った。Ｚ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドの酸化によって生じたＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸はＨＰＬＣを用いて定量分析した。ＨＰＬＣ分析条件は、カラムはＹＭＣ−ＰａｋＯＤＳ（４.６Ｉ.Ｄ.×７５ｍｍ）を用い、移動相はアセトニトリル／０.０１％ＴＦＡ水溶液（２５：７５）、を２分間流した後のアセトニトリル／０.０１％ＴＦＡ水溶液（５０：５０）への２分間のリニアグラジエントを行った。流速は１.５ｍｌ／ｍｉｎ、検出はＵＶ２２０ｎｍで行った。この分析条件でＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸の保持時間は３.１分であった。
（Ｃ） S. moderatus ＩＦＯ１３４３２株のアルデヒド脱水素酵素の精製
S. moderatus ＩＦＯ１３４３２株を生育させた寒天斜面培地から菌の断片を取り、Tryptic Soy Broth 培地（Difco 社製）を３０ｍｌ入れた２５０ｍｌ容のエルレンマイヤーフラスコ１０本に植菌し、２８℃で３日間ロータリシェーカ上で培養を行った。培養液（３００ｍｌ）から遠心分離によって菌体を集め、３００ｍｌの０.８％塩化ナトリウムを溶かした１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）（ＰＢＳ）で菌体を洗浄後、遠心分離によって菌体を集めて９０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、リゾチームを添加して２８℃で１時間ゆっくり振蘯した後、１ｍＭになるようにＥＤＴＡを添加してから氷冷下で超音波破砕機で細胞を破砕した。１４０００ｒｐｍで３０分間遠心して菌体破砕残渣を除いた後、上清８３ｍｌを５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.０）で平衡化したＤＥＡＥ−Toyopearl ６５０Ｍカラム（４Ｉ.Ｄ.×１２ｃｍ，１５０ｍｌ）に通してアルデヒド脱水素酵素をカラムに吸着させた。１５０ｍｌの５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.０）でカラムを洗浄後、１.２Ｌの５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.０）から１.２Ｌの０.５Ｍの塩化ナトリウムを添加した５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.０）へのリニアグラジエントで目的酵素の溶出を行った。溶出液は２０ｍｌづつ分画し、上記（Ｂ）に記載の方法で酵素活性を測定した。酵素活性が確認された画分を合わせて（３２０ｍｌ）氷冷下に撹拌しながら硫安を１Ｍになるように溶かした。この活性画分を１Ｍ硫安を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）で平衡化したPhenyl-Toyopearl ６５０Ｓカラム（４Ｉ.Ｄ.×１０ｃｍ，１２５ｍｌ）に通しアルデヒド脱水素酵素をカラムに吸着させた。目的酵素の溶出は１Ｌの０.７Ｍ硫安を添加した５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）、から１Ｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）へのリニアグラジエントで行った。溶出液は２０ｍｌづつ分画し酵素活性を測定した。酵素活性が確認された画分を合わせて（２１ｍｌ）ＵＦ膜で７ｍｌまで濃縮した後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）で２０ｍｌまでメスアップして塩濃度を下げてから MonoQ ＨＲ５／５カラム（Pharmacia社製）へ通して目的酵素を吸着させた。これ以降の酵素精製は酵素用ＨＰＬＣ装置ＡＫＴＡ（Pharmacia 社製）を用いて行った。流速は０.５ｍｌ／ｍｉｎで行い、目的酵素の溶出は０.１Ｍ Bis−Tris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.０）中での塩化ナトリウム濃度０％から４０％へのリニアグラジエントで行った。溶出液は０.５ｍｌづつ分画して酵素活性を測定した。酵素活性画分を集めて（３ｍｌ）等量の１.５Ｍ硫安を溶かした５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.８）と混合してから Resource １ｍｌＨＩＣ Phe カラム（Pharmacia 社製）に通して目的酵素をカラムに吸着させた後、溶出は、５０ｍＭリン酸緩衝液（６.８）中での硫安濃度１.５Ｍから０Ｍへのリニアグラジエントで行った。流速は１ｍｌ／ｍｉｎであった。溶出液は１.０ｍｌづつ分画して酵素活性を測定した。酵素活性画分（３ｍｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで見たところ、８８.７ｋＤａ、４４.１ｋＤａ、２４.１ｋＤａに３つのバンドが見られ、Native−ＰＡＧＥでは、９７.７ｋＤａに一つのバンドが見られたことから、アルデヒド脱水素酵素は２４.６ｋＤａの４つのサブユニットからなるホモテトラマーであると予想された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動ゲルをクマシー染色して８８.７ｋＤａのバンドを切り出し、ペプチドシークエンサーでＮ末のアミン酸配列を決定したところＭＲＤＦＧＹＱＲＡＨＤＶ（アミノ酸の一文字記号による。以下、同じ。）であった。

こうして得られた配列情報を基に、当該技術分野で周知のＰＣＲ法（例えば、Hyun，C.G．et al.，J．Microbiol．Biotechnol．８（１９９８）２９５−２９９に記載の方法）、遺伝子組換え法（例えば、“Molecular Cloning”Sambrook andRussell（third edition）に記載の方法）によれば、基質として少なくともＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドをＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸に変換できる酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む単離されたＤＮＡを取得することができる。かようなＤＮＡの具体的なものとしては、限定されるものでないが、例えば、後述する実施例１に従って取得できる遺伝子ｒｉｋＢを含んでなるものが挙げられ、また、遺伝子暗号の縮重を考慮すると、ｒｉｋＢがコードするタンパク質のアミノ酸配列を示す配列番号：４に記載のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡが挙げられる。

かようなＤＮＡの具体的なものとしては、４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする遺伝子であって、配列番号：１で表されるポリヌクレオチドの塩基１６２５〜塩基２６１７の連続する塩基配列を含んでなるＤＮＡを挙げることができる。かようなＤＮＡのさらに具体的なものとしては、配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする遺伝子であって、配列番号：１で表されるポリヌクレオチドの塩基１６２５〜塩基２７１１の連続する塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。かようなＤＮＡのより一層具体的なものとしては、配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする遺伝子であって、配列番号：１で表されるポリヌクレオチドの塩基１０８３〜塩基２７１１の連続する塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。かようなＤＮＡのなおさら具体的なものとしては、配列番号４：のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする遺伝子であって、配列番号：１で表されるポリヌクレオチドからなるＤＮＡを挙げることができる。

また本発明に従えば、配列番号：４のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ、基質として少なくともＬ−２−ベンジルオキシカルボニルアミノアジピン酸６−セミアルデヒドをＬ−２−ベンジルオキシカルボニルアミノアジピン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含んでなるポリヌクレオチド（ＤＮＡ）も提供される。かような遺伝子は、S．moderatus ＩＦＯ１３４３２株の一塩基多型によるか、自然または上記の手段により人工的に空然変異が誘発されているが、それらの遺伝子産物は、Ｚ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドをＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸に変換する酵素（アルデヒド脱水素酵素）活性を有するものであることを前提とするものである。

上記のごときアミノ酸が欠失、置換もしくは付加される例としては、配列番号：４のアミノ酸配列において構造的に類似する特徴を有するアミノ酸残基間、例えば、疎水性アミノ酸残基Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの相互間、ＳｅｒとＴｈｒとの間、酸性アミノ酸残基ＡｓｐとＧｌｕとの間、ＡｓｎとＧｌｎとの間、芳香族アミノ酸残基ＰｈｅとＴｙｒとの間、塩基性アミノ酸残基ＬｙｓとＡｒｇとの間で、数個、５〜１０個、１〜５個もしくは１〜２個のアミノ酸残基がいずれかの組み合わせで置換、欠失または付加されているものが挙げられる。

また、これらの変異体は、配列番号：４に対応するアミノ酸配列において、その全長にわたり、配列番号：４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し、好ましくは少なくとも９０％の同一性を有し、より好ましくは少なくとも９５％〜９７％の同一性を有し、特に好ましくは９９％の同一性を有するものである。かようなアミノ酸配列の同一性パーセンテージは、基準配列（本発明では配列番号：４）を照会配列と比較する市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。同一性を決定するために以下のプログラム（National Center for Biotechnology Information により提供される）：ＢＬＡＳＴ、ｇａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いることができ、これらはデフォールトパラメーターで使用することができる。

本発明の遺伝子を含むＤＮＡは、また、配列番号：１に表されているポリヌクレオチドの塩基１６２５〜塩基２６１７の連続するＤＮＡにストリンジェントな条件下（限定されるものでないが、例えば、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、次いで５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６５℃での０.２×ＳＳＣ、０.１％ＤＳＤ中での１回もしくはそれ以上の洗浄）でハイブリダイズし、しかも、上記のアルデヒド脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡであることができる。

かような遺伝子またはＤＮＡは、限定されるものでないが、市販されているベクターを用いることにより組換えプラスミドを構築することができ、こうして構築された組換えプラスミドは、各種宿主細胞、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、等を形質転換することに使用できる。かような形質転換体では、α−アミノ基の保護されたＬ−リジンから対応するＬ−２−アミノアジピン酸に変換される生合成系または異化過程における、対応するＬ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドからＬ−２−アミノアジピン酸への変換過程が増強される。

なお、特許文献３では、F. lutescens ＩＦＯ３０８４由来のＰ６Ｃ脱水素酵素をコードする遺伝子が単離されているが、該遺伝子産物は、Ｚ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドを対応するＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸に変換できなかった。具体的には、１ｍＭＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドと１０ｍＭＮＡＤ^＋を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）１ｍｌに F. lutescens ＩＦＯ３０８４株由来のＰ６Ｃ脱水素酵素液（６.８μｇ／ｍｌ）を５０μｌ添加して３２℃で１０時間反応を行った。反応液に等量のメタノールを加えて酵素反応を止めてから反応液をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析条件は、カラムはＹＭＣ−ＰａｋＯＤＳ（４.６×７５ｍｍ）を用い、移動相はアセトニトリル／０.０１％ＴＦＡ水溶液（２５：７５）、を２分間流した後のアセトニトリル／０.０１％ＴＦＡ水溶液（５０：５０）への２分間のリニアグラジエントを行った。流速は１.５ｍｌ／ｍｉｎ、検出はＵＶ２２０ｎｍで行った。その結果、反応液中にＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸は検出させず、F. lutescens ＩＦＯ３０８４株由来のＰ６Ｃ脱水素酵素は、上記条件下では、Ｚ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドをＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸へ酸化しなかった。

さらに参照までに本発明に従って取得できる、基質として少なくともＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドをＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸へ変換できる酵素をコードする遺伝子と公知のＰ６Ｃ脱水素酵素をコードする遺伝子との塩基配列の相同性はほとんどなかった。下記に詳述するようにして取得したS. moderatus のＲｉｋＢと F. lutescensのＰ６Ｃ脱水素酵素、および文献にある S. clavuligerus のＰ６Ｃ脱水素酵素とのアラインメントを図２に示す。

図２から明らかなようにＲｉｋＢとＰ６Ｃ脱水素酵素との相同性は全くない。また、ＲｉｋＢと相同性を示すタンパク質をＢＬＡＳＴサーチにより検索すると、多くの putative oxidoreductase に高い相同性を示すが、これらのタンパク質はすべて機能が推測されているだけで、実際にいかなる機能を有するかは実証されていない。

S. moderatus のアルデヒド脱水素酵素を精製し、そのＮ末端のアミノ酸配列がＭＲＤＦＧＹＱＲＡＨＤＶであると分かった。この情報から、この酵素をコードする遺伝子のクローニングを行った。

S. moderatus ＩＦＯ１３４３２株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩで切断し、ＳａｌＩカセット（ＴａＫａＲａ製）と連結した。これをテンプレートとしてプライマーＺＰＤ１とプライマーＣ１を用いてＰＣＲを行った（９８℃２０ｓ，５５℃２０ｓ，６８℃２ｍｉｎ、２５ｃｙｃｌｅ）。さらにプライマーＺＰＤ２とプライマーＣ２を用いて２ｎｄＰＣＲを行った（９８℃２０ｓ，５５℃２０ｓ，６８℃２ｍｉｎ、２５ｃｙｃｌｅ）。この結果、約５００ｂｐのＰＣＲ断片が得られた。これをシークエンスした結果、このＰＣＲ断片にはアルデヒド脱水素酵素のＮ末端とその上流領域がコードされているものと考えられた。

さらにこのＰＣＲ断片の周辺領域を取得するためにInverse ＰＣＲを行った S. moderatus ＩＦＯ１３４３２株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩで切断し、自己連結反応を行った。これをテンプレートとしてプライマーＺＰＤ３とプライマーＺＰＤ４とを用いてＰＣＲを行った（９８℃２０ｓ，６０℃２０ｓ，６８℃４ｍｉｎ、３０ｃｙｃｌｅ）。さらにプライマーＺＰＤ５とプライマーＺＰＤ６を用いて２ｎｄＰＣＲを行った（９８℃２０ｓ，６８℃４ｍｉｎ、３０ｃｙｃｌｅ）。この結果、約４ｋｂｐのＰＣＲ断片が得られ、これをシークエンスした。

ここで用いたプライマーの配列（５'から３'）を以下に示す。なお、ここでＳはＣあるいはＧを、ＢはＣあるいはＧあるいはＴを表す。

プライマーＺＰＤ１（配列：ＴＣＧＴＧＳＧＣＳＣＧＣＴＧＧＴＡ−配列番号：８参照。）
プライマーＣ１（配列：ＧＴＡＣＡＴＡＴＴＧＴＣＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡ−配列番号：９参照。）
プライマーＺＰＤ２（配列：ＧＣＳＣＧＣＴＧＧＴＡＢＣＣＧＡＡＧＴＣ−配列番号：１０参照。）
プライマーＣ２（配列：ＣＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−配列番号：１１参照。）
プライマーＺＰＤ３（配列：ＴＡＴＣＧＡＴＣＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＴＣＧＣＧＡＡ−配列番号１２参照。）
プライマーＺＰＤ４（配列：ＧＣＡＧＣＣＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＧＧＴＣＡＧＡ−配列番号：１３参照。）
プライマーＺＰＤ５（配列：ＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＣＧＣＡＴＧＡ−配列番号：１４参照。）
プライマーＺＰＤ６（配列：ＧＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＣＧＧＴＧＧＴ−配列番号：１５参照。）
この結果精製したアルデヒド脱水素酵素をコードする遺伝子を含む２９７７ｂｐが明らかになった（図１参照）。この酵素をコードする遺伝子領域には、オペロンをなすｒｉｋＡＢＣと名づけた３つの構造遺伝子と、その上流に逆向きにｒｉｋＲと名づけた転写調節遺伝子と考えられるオープン・リーディングフレームが存在していた。ｒｉｋＢの遺伝子産物のＮ末端アミノ酸配列が、精製したアルデヒド脱水素酵素のＮ末端配列と同じであることから（図１，下線部）、アルデヒド脱水素酵素はｒｉｋＢ（対応するアミノ酸配列を配列番号：４に示す。）にコードされていることが明らかになった。

E. coli のｒｉｋＢ発現プラスミドｐＴＲＣｒｉｋＢを次のように作製した。ｒｉｋＢ遺伝子産物のＮ末端アミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列から作製したプライマーＺＰＤ７と、ｒｉｋＢの下流のＤＮＡ配列から作製したプライマーＺＰＤ８とを用い、S. moderatus ＩＦＯ１３４３２株のゲノムＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして、ＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をｐＴｒｃＨｉｓＡ（Invitrogen 社製）のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩサイトに連結したプラスミドをｐＴＲＣｒｉｋＢとした。ｐＴＲＣｒｉｋＢはＮ末端にヒスチジンタグが付加したＲｉｋＢ蛋白質を発現できるプラスミドである。

ｐＴＲＣｒｉｋＢを E. coli ＢＬＲ（ＤＥ３）株（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に導入し、この株をアンピシリンナトリウム（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬ−培地５０ｍｌに植菌し、３２℃で６時間培養後、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに１７時間培養した。菌体を集菌し、４ｍｌの BugBuster（Novagen 社製）で懸濁した。１４,０００×ｇで２０分間遠心した上清をＲｉｋＢ粗精製液とした。このＲｉｋＢ粗精製液を用いて上記（Ｂ）に記載の方法によりの酵素活性の確認を行ったところ、ＨＰＬＣ分析によりＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドがＺ−Ｌ−アミノアジピン酸に変換されていることが確認できた。このことはｒｉｋＢ遺伝子の遺伝子産物ＲｉｋＢが、Ｚ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドからＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸への変換活性を有することを示している。

ここで用いたプライマーの配列（５'から３'）を以下に示す。

プライマーＺＰＤ７（配列：ＡＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＧＧＴＴＡＣＣＡＧＣＧＡＧ−配列番号：１６参照。）
プライマーＺＰＤ８（配列：ＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＣＧＣＴＧＴＣＧＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡ−配列番号：１７参照。）

以上のとおり、本発明によれば、医薬製造用の中間体等として使用できるα−アミノ基の保護されたＬ−２−アミノアジピン酸を効果的に製造できる変異微生物を提供でき、またそのような微生物をスクリーニングするのに用いることのできる基質も提供される。したがって、本発明は、特に発酵を用いる製造業で利用可能である。

S. moderatus 由来のＺ−Ｌ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒドを対応するＬ−２−アミノアジピン酸に変換することのできる酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および関連の周辺遺伝子を含むヌクレオチド配列。 S. moderatus のアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列と、F. lutescens および S. clavuligerusのＰ６Ｃ脱水素酵素のアライメント。

Claims

以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、または
（ｂ）（ａ）のタンパク質における配列番号：４のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ、基質として少なくともＬ−２−ベンジルオキシカルボニルアミノアジピン酸６−セミアルデヒドをＬ−２−ベンジルオキシカルボニルアミノアジピン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質。
配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする遺伝子が、配列番号：１で表されるポリヌクレオチドの塩基１６２５〜塩基２６１７の連続する塩基配列を含んでなる単離されたＤＮＡである請求項１に記載の遺伝子。
配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする遺伝子が、配列番号：１で表されるポリヌクレオチドの塩基１６２５〜塩基２７１１の連続する塩基配列からなる単離されたＤＮＡである請求項１に記載の遺伝子。
配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする遺伝子が、配列番号：１で表されるポリヌクレオチドの塩基１０８３〜塩基２７１１の連続する塩基配列からなる単離されたＤＮＡである請求項１に記載の遺伝子。
配列番号４：のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする遺伝子が、配列番号：１で表されるポリヌクレオチドからなる単離されたＤＮＡである請求項１に記載の遺伝子。
配列番号４：のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列が、配列番号：１で表されるポリヌクレオチドの塩基１６２５〜塩基２６１７の連続する塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列である請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子。
請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子を担持する自律複製性または組込み複製性の組換えプラスミド。
請求項７に記載の組換えプラスミドで形質転換した形質転換体。
（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるか、あるいは
（ｂ）配列番号：４のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ少なくとも基質としてのＬ−２−ベンジルオキシカルボニルアミノアジピン酸６−セミアルデヒドをＬ−２−ベンジルオキシカルボニルアミノアジピン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質。