JP4251446B2 - アルデヒド脱水素酵素をコードする遺伝子 - Google Patents
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Description
(1) 本発明者らの一部によって提供された、F. lutescens IFO 3084由来のLATをコードする遺伝子(lat)のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の情報(特許文献3参照。)を基に、大腸菌(Escherichia coli)における lat 発現プラスミドpRH124を作製できる。具体的には、lat N末のDNA配列から作製したプライマーR1(ATAAGCTTGTCCCTTCTTGCCCCGCTCGC:配列番号:6参照。)と、lat の下流のDNA配列から作製したプライマーR2(GCGGATCCTGTTGCCGCTGGTGCCGGGCAG配列番号:7参照。)とを用い、F. lutescens IFO 3084株のゲノムDNAをテンプレートDNAとして、PCRを行った。このPCR産物をpUC19のHindIII−BamHIサイトに連結したプラスミドをpRH124とした。proC32変異株大腸菌(E. coli)RK4904(CGSC#:6404)を E. coli Genetic Stock Center.(Yale University, USA)から取得し、pRH124を導入した。
(2) こうして取得した E. coli RK4904/pRH124株を、アンピシリンナトリウム50μg/mlを添加したL−ブロス(トリプトン1%、酵母エキス0.5%、NaCl0.05%、pH7.4)25mlを入れた250ml容のエルレンマイヤーフラスコ2本に植菌し、32℃で一晩振とう培養した後、培養液50mlを集菌し、BugBuster(Novagen 社製)で菌体を破砕してその上清をLAT粗酵素液とした。
(B) アルデヒド脱水素酵素の酵素活性の測定
82μlの50mM酢酸緩衝液(pH5.0)をエッペンドルフチューブに取り、そこに0.2mgのNADHと5μlの実施例2で調製したZ−L−2−アミノアジピン酸6−セミアルデヒド溶液を添加して反応液とした。酵素反応は酵素液10μlを添加して30℃で15時間反応を行った。Z−L−2−アミノアジピン酸6−セミアルデヒドの酸化によって生じたZ−L−2−アミノアジピン酸はHPLCを用いて定量分析した。HPLC分析条件は、カラムはYMC−PakODS(4.6 I.D.×75mm)を用い、移動相はアセトニトリル/0.01%TFA水溶液(25:75)、を2分間流した後のアセトニトリル/0.01%TFA水溶液(50:50)への2分間のリニアグラジエントを行った。流速は1.5ml/min、検出はUV220nmで行った。この分析条件でZ−L−2−アミノアジピン酸の保持時間は3.1分であった。
(C) S. moderatus IFO 13432株のアルデヒド脱水素酵素の精製
S. moderatus IFO 13432株を生育させた寒天斜面培地から菌の断片を取り、Tryptic Soy Broth 培地(Difco 社製)を30ml入れた250ml容のエルレンマイヤーフラスコ10本に植菌し、28℃で3日間ロータリシェーカ上で培養を行った。培養液(300ml)から遠心分離によって菌体を集め、300mlの0.8%塩化ナトリウムを溶かした10mMリン酸緩衝液(pH6.8)(PBS)で菌体を洗浄後、遠心分離によって菌体を集めて90mlのPBSに懸濁し、リゾチームを添加して28℃で1時間ゆっくり振蘯した後、1mMになるようにEDTAを添加してから氷冷下で超音波破砕機で細胞を破砕した。14000rpmで30分間遠心して菌体破砕残渣を除いた後、上清83mlを50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.0)で平衡化したDEAE−Toyopearl 650Mカラム(4 I.D.×12cm,150ml)に通してアルデヒド脱水素酵素をカラムに吸着させた。150mlの50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.0)でカラムを洗浄後、1.2Lの50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.0)から1.2Lの0.5Mの塩化ナトリウムを添加した50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.0)へのリニアグラジエントで目的酵素の溶出を行った。溶出液は20mlづつ分画し、上記(B)に記載の方法で酵素活性を測定した。酵素活性が確認された画分を合わせて(320ml)氷冷下に撹拌しながら硫安を1Mになるように溶かした。この活性画分を1M硫安を含む50mMリン酸緩衝液(pH6.8)で平衡化したPhenyl-Toyopearl 650Sカラム(4 I.D.×10cm,125ml)に通しアルデヒド脱水素酵素をカラムに吸着させた。目的酵素の溶出は1Lの0.7M硫安を添加した50mMリン酸緩衝液(pH6.8)、から1Lの50mMリン酸緩衝液(pH6.8)へのリニアグラジエントで行った。溶出液は20mlづつ分画し酵素活性を測定した。酵素活性が確認された画分を合わせて(21ml)UF膜で7mlまで濃縮した後、50mMリン酸緩衝液(pH6.8)で20mlまでメスアップして塩濃度を下げてから MonoQ HR5/5カラム(Pharmacia社製)へ通して目的酵素を吸着させた。これ以降の酵素精製は酵素用HPLC装置AKTA(Pharmacia 社製)を用いて行った。流速は0.5ml/minで行い、目的酵素の溶出は0.1M Bis−Tris−HCl緩衝液(pH7.0)中での塩化ナトリウム濃度0%から40%へのリニアグラジエントで行った。溶出液は0.5mlづつ分画して酵素活性を測定した。酵素活性画分を集めて(3ml)等量の1.5M硫安を溶かした50mMリン酸緩衝液(pH6.8)と混合してから Resource 1ml HIC Phe カラム(Pharmacia 社製)に通して目的酵素をカラムに吸着させた後、溶出は、50mMリン酸緩衝液(6.8)中での硫安濃度1.5Mから0Mへのリニアグラジエントで行った。流速は1ml/minであった。溶出液は1.0mlづつ分画して酵素活性を測定した。酵素活性画分(3ml)をSDS−PAGEで見たところ、88.7kDa、44.1kDa、24.1kDaに3つのバンドが見られ、Native−PAGEでは、97.7kDaに一つのバンドが見られたことから、アルデヒド脱水素酵素は24.6kDaの4つのサブユニットからなるホモテトラマーであると予想された。SDS−PAGEの泳動ゲルをクマシー染色して88.7kDaのバンドを切り出し、ペプチドシークエンサーでN末のアミン酸配列を決定したところMRDFGYQRAHDV(アミノ酸の一文字記号による。以下、同じ。)であった。
プライマーC1(配列:GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA−配列番号:9参照。)
プライマーZPD2(配列:GCSCGCTGGTABCCGAAGTC−配列番号:10参照。)
プライマーC2(配列:CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA−配列番号:11参照。)
プライマーZPD3(配列:TATCGATCGTGCAGGCTGTCGCGAA−配列番号12参照。)
プライマーZPD4(配列:GCAGCCCTTCTTGGTGCCGGTCAGA−配列番号:13参照。)
プライマーZPD5(配列:CGCCGAGGAAGGTGCCACCGCATGA−配列番号:14参照。)
プライマーZPD6(配列:GCGTCGAGCAGGGTGGTGCGGTGGT−配列番号:15参照。)
この結果精製したアルデヒド脱水素酵素をコードする遺伝子を含む2977bpが明らかになった(図1参照)。この酵素をコードする遺伝子領域には、オペロンをなすrikABCと名づけた3つの構造遺伝子と、その上流に逆向きに rikRと名づけた転写調節遺伝子と考えられるオープン・リーディングフレームが存在していた。rikBの遺伝子産物のN末端アミノ酸配列が、精製したアルデヒド脱水素酵素のN末端配列と同じであることから(図1,下線部)、アルデヒド脱水素酵素はrikB(対応するアミノ酸配列を配列番号:4に示す。)にコードされていることが明らかになった。
プライマーZPD8(配列:GAGCTGCAGTCGCTGTCGTCGTGGTGGTCA−配列番号:17参照。)
Claims (9)
- 以下の(a)または(b)のタンパク質をコードする遺伝子:
(a) 配列番号:4のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、または
(b) (a)のタンパク質における配列番号:4のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ、基質として少なくともL−2−ベンジルオキシカルボニルアミノアジピン酸6−セミアルデヒドをL−2−ベンジルオキシカルボニルアミノアジピン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質。 - 配列番号:4のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする遺伝子が、配列番号:1で表されるポリヌクレオチドの塩基1625〜塩基2617の連続する塩基配列を含んでなる単離されたDNAである請求項1に記載の遺伝子。
- 配列番号:4のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする遺伝子が、配列番号:1で表されるポリヌクレオチドの塩基1625〜塩基2711の連続する塩基配列からなる単離されたDNAである請求項1に記載の遺伝子。
- 配列番号:4のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする遺伝子が、配列番号:1で表されるポリヌクレオチドの塩基1083〜塩基2711の連続する塩基配列からなる単離されたDNAである請求項1に記載の遺伝子。
- 配列番号4:のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする遺伝子が、配列番号:1で表されるポリヌクレオチドからなる単離されたDNAである請求項1に記載の遺伝子。
- 配列番号4:のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列が、配列番号:1で表されるポリヌクレオチドの塩基1625〜塩基2617の連続する塩基配列と少なくとも80%の相同性を有する塩基配列である請求項1〜5のいずれかに記載の遺伝子。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の遺伝子を担持する自律複製性または組込み複製性の組換えプラスミド。
- 請求項7に記載の組換えプラスミドで形質転換した形質転換体。
- (a) 配列番号:4のアミノ酸配列を含んでなるか、あるいは
(b) 配列番号:4のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ少なくとも基質としてのL−2−ベンジルオキシカルボニルアミノアジピン酸6−セミアルデヒドをL−2−ベンジルオキシカルボニルアミノアジピン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質。
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