JP2003521235A - 改善された特性を有するヒダントイナーゼ変異体及びそのアミノ酸の製造のための使用 - Google Patents

改善された特性を有するヒダントイナーゼ変異体及びそのアミノ酸の製造のための使用

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Abstract

(57)【要約】 アミノ酸配列番号２を有する従来に単離されたヒダントイナーゼの突然変異体であるヒダントイナーゼ酵素。これらの突然変異体は野生型のヒダントイナーゼ（配列番号２）の位置（９５，１５４，１８０，２５１及び／又は２５５）でのアミノ酸置換を含む。ペアレントのヒダントイナーゼのような突然変異ヒダントイナーゼを光学的に純粋なアミノ酸の製造において使用する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 １．発明の分野 本発明は一般にヒダントイナーゼに関する。殊に、本発明は従来単離されたヒ
ダントイナーゼに対して改善された酵素特性を示す幾つかの改変ヒダントイナー
ゼを見いだすこと並びにアミノ酸の製造のための全細胞触媒中でのそれらの使用
に関する。
【０００２】 ２．関連分野の記載 本発明において“ヒダントイナーゼ”と呼称されるヒダントイン加水分解酵素
は広範な特異性並びに生物学的機能を有する多様なクラスの酵素を含む。幾つか
のヒダントイナーゼは、例えばピリミジン分解の還元経路において必須の役割を
果たし（ジヒドロピリミジナーゼ、ＥＣ３．５．２．２）、一方、その他はプリ
ン分解経路での反応を触媒する（アラントイナーゼ、ＥＣ３．５．２．５）。そ
れらの機能的多様性にもかかわらず、ヒダントイナーゼは多大な配列類似性を示
し、Ｈｏｌｍ，Ｌ及びＳａｎｄｅｒ，Ｃ（１９９７）進化の産物（An evolution
ary treasure）：ウレアーゼに関連するアミドヒドロラーゼの広範な集合の統一
（Unification of a broad set of amidohydrolases related to ureases）、プ
ロテインズ（Proteins） ２８：７２−８２によって記載されるようなウレアー
ゼに関連するアミドヒドロラーゼのスーパーファミリーに属する。種々のヒダン
トイナーゼからの配列のアライメントを使用して、Ｍａｙ，Ｏ．，Ｈａｂｅｎｉ
ｃｈｔ，Ａ．，Ｍａｔｔｅｓ，Ｒ．，Ｓｙｌｄａｔｋ，Ｃ及びＳｉｅｍａｎｎ，
Ｍ（１９９８）ヒダントイナーゼの分子進化（Molecular Evolution of Hydanto
inases），Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９：７４３−７４７並びにＫｉｍ，Ｇ．Ｊ
及びＫｉｍ，Ｈ．Ｓ（１９９８）環式のアミド環に作用する機能的に関連するア
ミドヒドロラーゼにおける構造的類似性の同定（Identification of the struct
ural similarity in the functionally related amidohydrolase acting on the
cyclic amide ring）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３０：２９５−３０２によって
記載されるような触媒機能のために重要な保存された残基を同定した。種々のヒ
ダントイナーゼの相当アミノ酸残基を同定することができる知識にもかかわらず
、他のアミノ酸残基の機能についての知識は限られている。更に、ヒダントイナ
ーゼのＸ−線構造は報告されていない。
【０００３】 ヒダントイナーゼの重要な特性は、光学的に純粋なＤ−アミノ酸又はＬ−アミ
ノ酸の製造のために有用とされるそれらのエナンチオ選択性である。ヒダントイ
ナーゼの詳細な背景は、Ｏｌｉｖｅｒ Ｍａｙの公表された博士論文の表題“オ
ースロバクター アウレッセンスＤＳＭ３７４５からのヒダントイナーゼ並びに
他のヒダントイナーゼとの関連（The Hydantoinase from Arthrobacter auresce
ns DSM 3745 and its Relation to other Hydantoinases）”（Institut fuer B
ioverfahrenstechnik, Lehrstuhl Physiologische Mikrobiologie, Universitae
t Stuttgart- 1998）に提供されている。
【０００４】 光学的に純粋なアミノ酸の製造に対するヒダントイナーゼの重要性の観点にお
いて、アミノ酸酸性に関して改善された特性を有する改変酵素を開発する努力が
集中してなされている。この努力の結果として、ヒダントイナーゼを所望の酵素
特性を伴って製造する幾つかの微生物が単離かつ同定された。米国特許第５５１
６６６０号はＤＳＭ７３２９及びＤＳＭ７３３０として同定される微生物を開示
しており、これらはＤ−、Ｌ−及び／又はＤ，Ｌ−５−一置換されたヒダントイ
ンからからＬ−α−アミノ酸を製造できるヒダントイナーゼを製造する。米国特
許第５７１４３５５号においてはＤＳＭ７３３０微生物の突然変異体を開示して
おり、これは親生物よりも２．７倍までのより高い酵素活性を有する。該突然変
異体（ＤＳＭ９７７１）は親のＤＳＭ７３３０生物を選択圧下に唯一の窒素源と
してのＬ−カルバモイルメチオニン（Ｌ−ＣＡＭ）を使用して培養することによ
って得られた。前記の微生物によって産生されたヒダントイナーゼがその意図さ
れた少なくとも幾つかの目的のために非常に適しているけれども、依然としてな
おもより望ましいヒダントイナーゼ活性を示す新規の酵素を開発することが必要
とされ続けている。特にエナンチオ選択性並びに触媒活性を改善することが必要
である。
【０００５】 発明の概要 本発明によれば、改変されたヒダントイナーゼが提供され、これらは米国特許
第５７１４３５５号で同定される微生物ＤＳＭ９７７１によって産生されるヒダ
ントイナーゼに対して高められた酵素特性（より良好な全細胞触媒）を有する。
ＤＳＭ９７７１のヒダントイナーゼは１〜４５８の連続的な範囲の限定された位
置を含むアミノ酸配列（配列番号２）を有する。
【０００６】 ＤＳＭ９７７１酵素内の１つ以上の特定のアミノ酸位置でのアミノ酸の置換に
よって活性及びエナンチオ選択性に関して高められた特性を有する酵素が形成さ
れることが判明した。置換により本発明により改変ヒダントイナーゼ酵素が達成
される特定のアミノ酸位置番号は位置番号９５、１５４、１８０、２５１及び２
５５である。本発明の他の特徴として、種々の位置での特定のアミノ酸の置換は
特定の型の改変ヒダントイナーゼを提供することが明らかにされた。特定のアミ
ノ酸置換は、Ｉ９５Ｆ、Ｉ９５Ｌ、Ｖ１５４Ａ、Ｖ１８０Ａ、Ｑ２５１Ｒ及びＶ
２５５Ａを含む。これらの特定の置換の１つ以上は酵素活性を高め、かつ“野生
型”のＤＳＭ９７７１のヒダントイナーゼのエナンチオ選択性を変化させること
が判明した。これらの変化した酵素特性はＮ−カルバモイル−アミノ酸の逆のエ
ナンチオマーの蓄積を削減することによってかなり改善されたヒダントイナーゼ
法に貢献すると判明した。
【０００７】 前記のアミノ酸置換の１つ以上を有する６つの特定の改変ヒダントイナーゼを
開示している。これらの改変ヒダントイナーゼのためのアミノ酸配列は配列番号
４、６、８、１０、１２及び１４に示されている。これらの改変ヒダントイナー
ゼは、それぞれ１ＣＧ７、１１ＤＨ７、１ＢＦ７、１９ＡＧ１１、２２ＣＧ２及
びＱ２Ｈ４として明細書中に記載される。
【０００８】 更に活性及び／又はエナンチオ選択性に関して進化させたヒダントイナーゼは
、進化させたヒダントイナーゼを少なくとも１種のカルバモイラーゼの他に含む
全細胞触媒を使用するアミノ酸（すなわちＬ−メチオニン）の製造を劇的に改善
することができると判明した。
【０００９】 先に論じられた多くの他の本発明の特徴及び付随の利点は、添付の図面と共に
考慮するときに以下の詳細な記載を参照してより良く理解されるはずである。
【００１０】 図面の簡単な説明 図１はアルスロバクターｓｐ．ＤＳＭ９７７１からのヒダントイナーゼ遺伝子
（ｈｙｕＨ）の発現のために使用されるベクターの制限地図である。
【００１１】 図２は突然変異体Ｑ２Ｈ４、１１ＤＨ７及び１ＣＧ７によって生産されるＮ−
カルボモイル−メチオニンエナンチオマーの分離のＤＳＭ９７７１ヒダントイナ
ーゼとの比較による結果を示しているクロマトグラムである。
【００１２】 図３はＤＳＭ９７７１ヒダントイナーゼ（Ｗ）に対する本発明の突然変異酵素
によって提供される酵素活性及びエナンチオ選択性における相対的な改善を示し
ている図である。
【００１３】 図４は種々のアルスロバクター株及び本発明の突然変異体Ｑ２Ｈ４の酵素活性
を示す図である。
【００１４】 図５はＡ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＯＭ２０／ｐＯＭ２１）（野生型の
経路）並びにＢ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＯＭ２２／ｐＯＭ２１）（Ｑ２
Ｈ４からの進化されたヒダントイナーゼによる経路）の８ｍｇの細胞乾燥質量を
使用する０．１Ｍのトリス ｐＨ７．８中３７℃での１００ｍＭのＤ，Ｌ−ＭＴ
ＥＨの加水分解の時間経過を示す２種の図である。
【００１５】 図６は２５ｇ／ｌのＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＯＭ２０，ｐＯＭ２１）及
びＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＯＭ２１，ｐＯＭ２３）を使用する０．９％（
ｗ／ｖ）のＮａＣｌ、１ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ７．８中での１００ｍＭのＤ，
Ｌ−ＭＴＥＨの加水分解の１時間の反応時間後の比較を示す図である。
【００１６】 本発明の詳細な記載 本発明による改変されたヒダントイナーゼを、米国特許番号５３１６９３５号
及び同第５９０６９３０号に記載されるタイプのランダム突然変異誘発手順を使
用して製造し、同定し、かつ単離した。方向付け進化手順としても知られるラン
ダム突然変異誘発プロトコールは、Ｋｕｃｈｎｅｒ，Ｏ．，Ａｒｎｏｌｄ，Ｆ．
Ｈ（１９９７）酵素触媒の方向付け進化（Directed Evolution of Enzyme Catal
ysts），ＴＩＢＴＥＣＨ １５：５２３−５３０；Ｃｈｅｎ，Ｋ及びＡｒｎｏｌ
ｄ Ｆ．（１９９１）非水性溶剤のための酵素エンジニアリング−極性有機媒体
中でサブチリシンＥの活性を高めるためのランダム突然変異誘発（Enzyme engin
eering for nonaqueous solvents-random mutagenesis to enhance activity of
subtilisin E in polar organic media），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９
：１０７３−１０７７；Ｃｈｅｎ，Ｋ及びＡｒｎｏｌｄ，Ｆ（１９９３）通常環
境のための酵素活性の調節：ジメチルホルムアミドにおける触媒のためのサブチ
リシンＥの連続的ランダム突然変異誘発（Tuning the activity of an enzyme f
or unusual environments: sequential random mutagenesis of subtilisin E f
or catalysis in dimethylformamide）、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９０：５６１８−５６２２；並びにＹｏｕ，Ｌ及びＡｒｎｏｌｄ，
Ｆ．Ｈ（１９９６）水性ジメチルホルムアミドにおける全活性を高めるためのバ
シラス サブチリスでのサブチリシンＥの定方向進化（Directed Evolution of S
ubtilisin E in Bacillus Subtilis to Enhance Total Activity in Aqueous Di
methylformamide），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９７７−８３
にも記載されている。
【００１７】 ランダム突然変異誘発手順を使用して、改変ヒダントイナーゼを同定及び単離
することは前記に定義したような同様な基本的な手順に従った。まず、野生型の
ヌクレオチド配列（配列番号１）における多数のランダム突然変異を発生させた
。ヌクレオチド配列のライブラリーを次いで使用して多数の突然変異した酵素を
発現させる。次いで突然変異されたヒダントイナーゼのライブラリーをスクリー
ニングして、高められた酵素活性及び変化したエナンチオ選択性を有する突然変
異体を同定した。
【００１８】 所望の変異体を同定するために、発現されたアミノ酸配列の第１のライブラリ
ーをスクリーニングする工程は、所望の酵素活性を測定する任意の数の適当なス
クリーニング技術を使用して達成できた。事実上使用されたスクリーニング法は
ｐＨ−インジケータアッセイであり、これは以下により詳細に記載する。
【００１９】 本発明によれば、高められたヒダントイナーゼ特性を有する４種の酵素をＤＳ
Ｍ９７１１ヌクレオチド配列（配列番号１）のランダム突然変異誘発の第１工程
の結果として同定した。１回目の突然変異酵素は１ＣＧ７、１１ＤＨ７、１ＢＦ
７及び１９ＡＧ１１である。これらの第１工程の突然変異体のためのヌクレオチ
ド配列は配列番号３、５、７及び９にそれぞれ示されている。相応のアミノ酸配
列は配列番号４、６、８及び１０にそれぞれ示されている。
【００２０】 ２回目のランダム突然変異誘発は１１ＤＨ７ヌクレオチド配列をランダムに突
然変異誘発させて、突然変異体の第２のライブラリーを作成して実施した。単一
の突然変異体（２２ＣＧ２）が同定され、これは所望の酵素特性を示す改変ヒダ
ントイナーゼを発現した。２２ＣＧ２酵素は１１ＤＨ７酵素と同一であるが、但
し、２２ＣＧ２突然変異体は位置１８０にアミノ酸置換を有している。
【００２１】 ２２ＣＧ２突然変異体に飽和突然変異誘発を実施して、アミノ酸位置９５に全
ての異なる２０種のアミノ酸全てを導入した。４００個のクローンをスクリーニ
ングし、かつ高められた酵素活性及びより高い（Ｌ）−選択性を有する突然変異
酵素はＱ２Ｈ４として同定された。Ｑ２Ｈ４突然変異体は２２ＣＧ２突然変異体
と同一であるが、但し、位置９５でフェニルアラニンにイソロイシンが置換され
ている。
【００２２】 前記に定義された突然変異体の単離及び同定の結果として、改善されたヒダン
トイナーゼは、位置９５、１２４、１５４、１８０、２５１及び２５５でのアミ
ノ酸の置換によってＤＳＭ９７７１酵素を改変することによって得られると確立
された。これらの置換は１つ以上の位置でなされてもよい。第１表は有利なアミ
ノ酸置換を示している。
【００２３】
【表１】
【００２４】 第１表に示される置換の他に、得られるヒダントイナーゼが所望の酵素活性を
示すアミノ酸置換は可能である。例えば位置９５でのイソロイシンに対する他の
適当なアミノ酸置換はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴ
ｒｐを含む。位置１５４、１８０及び２５５に関しては、バリンに対する適当な
選択的アミノ酸置換はＡｌａ及びＧｌｙを含む。位置２５１でのグルタミンに対
する適当な選択的アミノ酸置換はＡｒｇ、Ｌｙｓ及びＡｓｎを含む。これらのア
ミノ酸置換は飽和突然変異誘発に引き続いてのクローンのスクリーニングによっ
てなされてよい。これらの置換はＤＳＭ９７１１酵素の化学的操作によるか、又
は所望の場所に所望のアミノ酸置換を有するペプチドの慣用の合成によっても作
成することができる。前記のアミノ酸置換は種々の置換部位での有利な選択的置
換の例として意図されることに留意すべきである。得られたタンパク質の酵素活
性が破壊されていない他のアミノ酸の置換は可能である。位置９５、１５４、１
８０、２５１及び２５５での特定のアミノ酸置換の有用性は以下のように慣例の
ｐＨスクリーニングによって決定できる。
【００２５】 前記のアミノ酸置換は他のヒダントイナーゼにおいて相当位置でなされてよい
。“他のヒダントイナーゼ”は、任意の５′−一置換又は二置換されたヒダント
イン誘導体の加水分解を触媒して、誘導体化されたＮ−カルバモイル−アミノ酸
を得て、アルスロバクターｓｐ．ＤＳＭ９７７１からのヒダントイナーゼとＢＬ
ＡＳＴ（Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W.& Lipman, D.J.(
1990) "Basic local alignment search tool." J.Mol.Biol.215:403-410）のよ
うな配列アライメントアルゴリズムによって決定できる２０〜１００％のアミノ
酸配列の同一性を有してよい酵素とする。
【００２６】 アミノ酸位置は線形順序で番号付け（開始コドンから出発する）し、それらの
機能的かつ構造的関連によるものではない。従って種々のヒダントイナーゼの酵
素機能に同様に貢献するアミノ酸残基は場合により、同一の酵素の欠失又は挿入
の発生の故に同一のアミノ酸位置番号を有さない。従ってヒダントイナーゼの“
相当位置”は、進化実験において同定されるアミノ酸としての機能（活性又はエ
ナンチオ選択性）に同様に貢献するアミノ酸位置である。種々のヒダントイナー
ゼのアミノ酸同一性が高い、特に６０％より大であり、アミノ酸位置が配列のギ
ャップを伴わずに保存された領域に位置するのであれば、相当位置は、例えばＢ
ＬＡＳＴアルゴリズムを使用して配列のアライメントによって決定できる。アミ
ノ酸配列の同一性が低い、例えば６０％未満であり、アミノ酸位置が非保存領域
に位置するか、又はギャップの近くに保存されたアミノ酸の領域によって包囲さ
れずに位置するのであれば、構造アライメントのような他の方法を、ｘ−線構造
を利用できれば使用できる（Mizuguchi, K., Go, N., Seeking significance in
3-dimensional protein-structure comparisons. Cur. Opin. Struc. Biol. 5:
377-382(1995)）。ここでは主鎖原子を構造的に整合させ、かつ相当位置をその
構造のアミノ酸残基の相対位置に基づいて見いだすことができる。
【００２７】 例えば定方向進化によって同定する特定の機能に貢献するアミノ酸位置はしば
しば種々のアミノ酸残基によって占有されうるが、ランダム点突然変異誘発によ
って同定されたものではない。幾つかの置換は機能を破壊し、それらの幾つかは
機能を変化させず、その他は機能を改善することになる。部位飽和突然変異誘発
のような公知法を使用して、１つは、同様に機能に貢献するか、又はそれを存在
するアミノ酸を全ての可能なアミノ酸残基と置換させることによって改善するア
ミノ酸を容易に同定できる（Miyazaki, K., Arnold, F., Exploring nonnatural
evolutionary pathways by saturation mutagenesis:rapid improvement of pr
otein function. J. Mol. Evol. 49:1716-1720）。非天然アミノ酸でさえも、同
定された部位に停止コドン及びサプッレサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸と結合さ
せて使用して導入できる（Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T. A., Chamberlain
, A.R., Diala, E.S., Biosynthetic Site-Specific Incorporation Of A Non-N
atural Amino Acid Into A Polypeptide. JACS 111:8013-8014(1989)）。
【００２８】 本発明による６種の改変ヒダントイナーゼを第２表に記載する。また第２表も
、同定されたそれぞれの改変された酵素についてのＤＳＭ９７７１配列（配列番
号２）に関するアミノ酸置換を記載している。
【００２９】
【表２】
【００３０】 本発明の改変されたヒダントイナーゼを他のヒダントイナーゼと同様に使用し
て光学的に純粋なＤ−及びＬ−アミノ酸を製造してよい。例えば、ＤＬ−５−一
置換されたヒダントインから光学的に純粋なアミノ酸を製造する際のヒダントイ
ナーゼの使用の記載については、アミノ酸及び誘導体の生物触媒的製造（Biocat alytic Production of Amino Acids and Derivatives (Rozzel, J. D. and Wagn
er, F. eds.)(1992) Hanser Publisher, NY, at pages 75-176）を参照されたい
。またヒダントイナーゼの一般的使用は、有機合成における酵素触媒（Enzyme c
atalysis in organic synthesis (Dranz, K. and Waldmann, H. eds.) 1995, VC
H-Verlag, Weinheim, at pages 409-431）及びＷａｇｎｅｒ，Ｔ他（１９９６）
アルスロバクター種ＤＳＭ７３３０の新規の突然変異株の休止細胞によるｄ，ｌ
−５−（２−メチルチオエチル）ヒダントインからの１−メチオニンの製造（Pr
oduction of 1-methionine from d,l-5-(2-methylthioethyl)hydantoin by rest
ing cells of a new mutant strain of Arthrobacter species DSM 7330），Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４６：６３−６８に記載され
ている。
【００３１】 本発明において呼称されるアミノ酸は全ての天然又は非天然アミノ酸であり、
その際、これらのアミノ酸は１つの媒介Ｃ−原子（α−Ｃ−原子）を介してカル
ボン酸基に連結する第一級アミンであると判断される。このＣ−原子はたった１
つの他の残基を有する。有利な非天然アミノ酸はＤＥ１９９０３２６８．８号に
開示されている。有利な天然アミノ酸はＢｅｙｅｒ−Ｗａｌｔｅｒ，有機化学の
教科書（Lehrbuch der Organischen Chemie），第２２版，Ｓ．Ｈｉｒｚｅｌ出
版シュトゥットガルト，８２２〜８２７頁に挙げられるものである。前記に示さ
れるアミノ酸のうち、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン
、ｔ−ロイシン又はネオペンチルグリシンは改変されたヒダントイナーゼを使用
する方法において変換されない。
【００３２】 ヒダントインを酵素によって直接アミノ酸に変換するために、カルバモイラー
ゼと共に本発明のヒダントイナーゼを含む全細胞触媒を使用するのが有利である
。ヒダントインラセマーゼをヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼの他に使用
してもよい。
【００３３】 ヒダントイナーゼを前記の方法においてその遊離形又は固定化形のいずれでも
使用できる。またカルバモイラーゼ及びヒダントインラセマーゼを固定化しても
よい。酵素の固定化の技術は当業者に公知である。有利な方法はＢｈａｖｅｎｄ
ｅｒ Ｐ．Ｓｈａｒｍａ，Ｌｏｒｒａｉｎｅ Ｆ．Ｂａｉｌｅｙ及びＲａｌｐｈ
Ａ．Ｍｅｓｓｉｎｇ，固定化された生物材料−技術及び使用（Immobilisierte B
iomaterialien - Techniken und Anwendungen），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９
９２，９４，８３６−８５２；Ｄｏｒｄｉｃｋ他，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ
．１９４，１１６，５００９−５０１０；Ｏｋａｈａｔａ他，Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９７，３８，１９７１−１９７４；Ａｄｌｅｒｃｒｅｕ
ｔｚ他，生体触媒（Biocatalysis）１９９２，６，２９１−３０５；Ｇｏｔｏ他
，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９９４，１０，２６３−２６８；Ｋａｍ
ｉｙａ他，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９９５，１１，２７０−２７５
；Ｏｋａｈａｔａ他，Ｔｉｂｔｅｃｈ，１９９７年２月，１５，５０−５４；Ｆ
ｉｓｈｍａｎ他，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９９８，２０，５３５−
５３８に挙げられている。
【００３４】 論ぜられた変換はバッチ式方法又は連続式方法で実施できる。有利には、酵素
−メンブレン−リアクターを反応容器として使用する（Wandrey et al.in Jahrb
uch 1998, Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI S. 151ff.:Wand
rey et al. in Applied Homogenous Catalysis with Organometallic Compounds
, Vol. 2, VCH 1996, S. 832 ff.; Kragl et al., Angew. Chem. 1996, 6, 684f
.）。
【００３５】 本発明の更なる態様はカルバモイラーゼ、場合によりラセマーゼ及びヒダント
イナーゼをコードする遺伝子を含有する全細胞触媒に向けられ、その際、ヒダン
トイナーゼは本発明の改変されたヒダントイナーゼによるものと考慮される。
【００３６】 有利には細菌は、高い繁殖速度及び容易な増殖条件が適用されるべきであるの
で細胞として使用される。この点で使用できる当業者に公知の細菌は幾つか存在
する。このことについては有利にはＥ．ｃｏｌｉが細胞及び発現系として使用で
きる（Yanisch-Perron et al., Gene(1985), 33, 103-109）。本発明の他の態様
は、本発明により全細胞触媒を使用するエナンチオマー的に高められたアミノ酸
の製造のための方法である。
【００３７】 この点に関しては、メチオニン、トレオニン、リジン又はｔ−ロイシンのよう
なアミノ酸を全細胞触媒を使用して製造することが更に有利である。
【００３８】 前記の実例で論ぜられる変換はバッチ式方法又は連続式方法で実施できる。有
利には、酵素−メンブレン−リアクターを反応容器として使用する（Wandrey et
al.in Jahrbuch 1998, Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI S.
151ff.:Wandrey et al. in Applied Homogenous Catalysis with Organometall
ic Compounds, Vol. 2, VCH 1996, S. 832 ff.; Kragl et al., Angew. Chem. 1
996, 6, 684f; DE19910691.6）。
【００３９】 本発明の他の態様は、本発明の全細胞触媒の製造のための方法に向けられる。
該方法は、有利には発現ベクターｐＯＭ１７、ｐＯＭ１８、ｐＯＭ２０、ｐＯＭ
２２及び／又はｐＯＭ２１を使用することによって実施する。更に配列番号１７
、配列番号１８、配列番号１５及び／又は配列番号１６のプライマーが全細胞触
媒の製造に関して使用される。
【００４０】 実施例は以下の通りである： 例１ 以下の例は、本発明による改変ヒダントイナーゼを同定及び単離するために使
用される手順に関して更なる詳細を提供する。
【００４１】 アルスロバクターｓｐ．ＤＳＭ９７７１からのヒダントイナーゼ（米国特許第
５７１４３５５号）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングし
た。ヌクレオチド配列を決定し、親密に関連するアルスロバクター株からの他の
ヒダントイナーゼと比較した。ヒダントイナーゼのためのヌクレオチド及びアミ
ノ酸配列を配列番号１及び２にそれぞれ示す。アルスロバクターｓｐ．ＤＳＭ９
７７１からクローニングされた酵素はアルスロバクター アウレッセンスＤＳＭ
３７４７及びＤＳＭ３７４５からの酵素と、それらのヌクレオチド配列に基づき
約９７．５％の同一性を共有している。これらの酵素はＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏ
ｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｓｔ
ｕｔｔｇａｒｔ（ドイツ）によって提供されたラムノース誘導性ベクター構築物
を使用してＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中で発現させた。制限地図を図１に示す。
【００４２】 該ヒダントイナーゼにエラー−プロンＰＣＲ（error-prone PCR）を使用する
ランダム突然変異誘発を実施した。約１００００個のクローンを以下のようにｐ
Ｈ−インジケータアッセイを使用してスクリーニングした： １． 種培養プレート：１００μｌ／ウェルのＬＢａｍｐを含有するプレートに
単集落／ウェルで接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした
。
【００４３】 ２． 主培養プレート：種培養プレートからの細胞を９６ピンのレプリケータを
使用して２００μｌのＬＢａｍｐ＋０．２％のラムノースを含有するプレート中
に移した。プレートを３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
【００４４】 ３． アッセイ：ピペッティングロボットを使用して、それぞれのウェルの培養
をピペッティング（上下を３回）によって混合し、かつ２つの新鮮なプレート中
に移した（それぞれ７５μｌ）。２つのプレートを１００μｌ／ウェルの新鮮に
製造された基質溶液（０．０５ｇ／ｌのクレゾールレッド中のそれぞれ８０ｍＭ
のＤ−ＭＴＥＨ及びＬ−ＭＴＥＨ ｐＨ８．６）で満たした。５８０ｎｍでの吸
光を、基質をプレートに添加した直後及び室温で３時間インキュベートした後に
測定した。活性を以下のように測定した： 活性＝(A580(0時間)-A580(3時間))/(A580(0時間)-0.８)) （記:0.8は細胞不含での吸光） スクリーニングの目的のために、Ｄ−及びＬ−エナンチオマーに関する活性の
比を、変化したエナンチオ選択性のためのインジケータとして得た。
【００４５】 スクリーニング試験での種々のエナンチオマーに関する活性の比はエナンチオ
選択性のたった１つの最大の暗示なので、同定された突然変異体は以下のように
ラセミ体基質を使用するキラルＨＰＬＣによって確認された。２ｍｌのオーバー
ナイト培養を０．１Ｍのトリス（ｐＨ８．５）中の２ｍｌの８０ｍＭのＤＬ−Ｍ
ＴＥＨに添加し、３７℃でインキュベートした。それぞれ１時間及び２時間後に
、反応混合物を１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。２０μの上清をＨＰＬ
Ｃカラム上に適用し、種々の分画が溶離した。
【００４６】 約２％のポピュレーションによって野生型のＤＳＭ９７７１と比較してかなり
高い（＞５０％）活性が示された。これらのクローンの相当数はポピュレーショ
ン中での発現レベルの共通の変動の故に擬陽性の場合があるので、むしろ再スク
リーニングされたクローンの約５０％がより高い活性の突然変異体であった。大
きい数は、ヒダントイナーゼが大きな進化ポテンシャルを有することを示してい
る。（その活性及びエナンチオ選択性を従って改善することが出来る）。これは
高いＫｍ値（約１５ｍＭ）、かなり低い比活性（約１２Ｕ／ｍｇ）及び低い発現
レベル（＜１０％の全タンパク質）がこの酵素の改善のための余地を残している
ので合理的に説明することができる。
【００４７】 第３表は試験された突然変異体の結果を示している。突然変異体１ＣＧ７は（
Ｄ−）選択性の劇的な増大を示す。野生型と比較して生成物のエナンチオマー過
剰は４倍に増大する。クローン１１ＤＨ７及び１９ＡＧ１１のエナンチオ選択性
を反対方向に変化させた。それというのも両者の突然変異体は絶対的に非選択性
だからである。活性突然変異体１ＢＦ７は野生型と同じエナンチオ選択性を有す
る。
【００４８】
【表３】
【００４９】 全ての突然変異体の配列決定をし、ヌクレオチド及びアミノ酸配列は第４表に
示されるように確立された。
【００５０】 第４表
【００５１】
【表４】
【００５２】 ランダム突然変異誘発の第２工程を親として第一世代の突然変異体１１ＤＨ７
を使用して実施した。
【００５３】 異なるエラー率（２０％及び５０％の不活性クローン）を有する２つの異なる
ライブラリーを製造し、各ライブラリーの１００００クローンを前記のｐＨ−イ
ンジケータ法を使用してスクリーニングした。スクリーニングされたクローンは
いずれもかなり高いＬ−選択性を示さないが、改善された活性及び高いＤ−選択
性を有する突然変異体が見られた。親とたった１つのアミノ酸だけが異なる１つ
の突然変異体（２２ＣＧ２）は親の１１ＤＨ７と比較して４倍も活性が高いこと
が判明した。
【００５４】 第一世代の突然変異体１１ＤＨ７及び１９ＡＧ１１の配列決定によって、単一
の突然変異（Ｉ９５Ｌ）が低減されたＤ−選択性に関連することが明らかにされ
た。全ての２０種の種々のアミノ酸を突然変異体２２ＣＧ２のアミノ酸位置９５
中に飽和突然変異誘発によって導入し、かつ約４００個のクローンをスクリーニ
ングすることによって、大きく改善されたＬ−選択性（ｅｅＬ＝２０％）及びそ
の親の２２ＣＧ２と比較して１．５倍に改善された活性を有する新規の突然変異
体（Ｑ２Ｈ４）が示された。エナンチオ選択性に関するＨＰＬＣ分析の結果を図
２に示す。２２ＣＧ２のためのヌクレオチド及びアミノ酸配列を配列番号１１及
び１２にそれぞれ示す。Ｑ２Ｈ４のためのヌクレオチド及びアミノ酸配列を配列
番号１３及び１４にそれぞれ示す。
【００５５】 前記の突然変異体によって提供される改善の他に全細胞触媒の活性を、１ｍＭ
のマンガンを増殖培地及び基質溶液に添加することによって１０倍に増大させる
ことができた。これらの条件下に、突然変異体２２ＣＧ２の活性を測定すると、
約３８０Ｕ／ｇＣＤＷであり、これはアルスロバクターｓｐ．ＤＳＭ９７７１に
関して記載される活性と比較して５０倍の活性増加である。突然変異体Ｑ２Ｈ４
と他の株との活性の比較を図４に示す。
【００５６】 親のＤＳＭ９７７１に関する種々の改変された酵素の酵素活性の一覧を図３に
示す。図３から明らかなように、本発明により同定された全ての改変された酵素
は改変されていないＤＳＭ９７７１のヒダントイナーゼよりも良好な活性及び／
又はエナンチオ選択性を有する。標準的な条件下にＨＰＬＣによって試験する場
合に、Ｑ２Ｈ４突然変異体はＤ，Ｌ−ＭＴＥＨの加水分解に関して逆のエナンチ
オ選択性を示した。Ｑ２Ｈ４はＮ−カルバモイル−Ｌ−メチオニンを約３０％の
変換率において２０％のエナンチオマー過剰（ｅｅ）で産出した。更にＱ２Ｈ４
突然変異体はその親の２２ＣＧ２より約１．５倍高い活性であった。
【００５７】 例２ 更なる例において、Ｌ−メチオニンを組み換え全細胞触媒を使用して製造した
。組み換え全細胞触媒を以下のようにＥ．ｃｏｌｉ中で、進化された又は野生型
のヒダントイナーゼとヒダントインラセミ体及びＬ−カルバモイラーゼとを同時
発現させることによって製造した。
【００５８】 株及び発現ベクター。Ｌ−カルバモイラーゼ及びヒダントイナーゼの発現ベク
ターｐＯＭ１７及びｐＯＭ１８を、アルスロバクターｓｐ．ＤＳＭ９７７１から
のそれぞれｈｙｕＣ及びｈｙｕＨ遺伝子を以下のプライマー：ｈｙｕＣ−増幅の
ため：５′−ＡＧＧＣＧＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＣＡＡ
−３′（配列番号１７）、５′−ＡＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＴＧＣ
ＣＴＴＣＡＴＴＡＣ−３′（配列番号１８）；ｈｙｕＨ−増幅のため：５′−Ａ
ＧＡＡＣＡＴＡＴＧＴＴＴＧＡＣＧＴＡＡＴＡＧＴＴＡＡＧＡＡ−３′（配列番
号１５）、５′−ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＴＣＧＡＣＧＣＣＴＣＧＴＡ
−３′（配列番号１６）を使用してＰＣＲ増幅することによって構築した。増幅
された断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じ酵素を使用してｒ
ｈａＢＡＤプロモーター（ラムノースプロモーター）の下流でベクターｐＪＯＥ
２７０２（Volff, J.-N., Eichenseer, C., Viell, P., Piendl, W. & Altenbuc
hner, J. (1996) Nucleotide sequence and role in DNA amplification of the
direct repeats composing the amplificable element AUDI og Streptomyces
lividans 66. Mol. Microbiol. 21, 1037-1047）中に挿入した。両者とも別個に
ラムノースプロモーターの制御下のＬ−カルバモイラーゼ及びヒダントイナーゼ
遺伝子を有する同時発現プラスミドｐＯＭ２０をプラスミドｐＯＭ１７及びｐＯ
Ｍ１８から誘導した。ｐＯＭ１７をＳａｌＩによって消化し、かつクレノウ断片
で処理して、平滑末端を形成させた。ｐＯＭ１８をＢａｍＨＩによって消化し、
またクレノウ断片で処理して、ブラントエンドを形成させた。引き続き両者の断
片をＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ｐＯＭ１７から得られるカルバモイラーゼ遺伝
子及びラムノースプロモーターを有する１５２１ｋｂの断片を消化されたｐＯＭ
１８の５６５０ｋｂの断片とライゲーションして、ｐＯＭ２０が得られた。Ｌ−
選択性のヒダントイナーゼの突然変異をｐＯＭ２０中に制限酵素ＲｓｒＩＩ及び
ＫａｓＩを使用して導入して、ｐＯＭ２２が得られた。ラセマーゼ発現ベクター
ｐＯＭ２１をｐＡＣＹＣ１８４（Rose, R.E. The nucleotide sequence of pACY
C184. Nucleic Acids Res. 16, 355(1988)）から得て、これはクロラムフェニコ
ール選択マーカー及びアルスロバクターｓｐ．ＤＳＭ３７４７からのラセマーゼ
遺伝子ｈｙｕＲをラムノースプロモーターの制御下に有している。全てのプラス
ミドを慣例通りにＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中に形質転換させた（Yanisch-Perro
n, C., Viera, J. & Messing, J. (1984) Improved M13 phage cloning vectors
and host strains: nucleotide sequences of the M13 mp18 and pUC vectors,
Gene 33, 103-109）。ヒダントイン変換経路をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９におい
て、ｐＯＭ２０及びｐＯＭ２２をそれぞれＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＯＭ２
１）中に形質転換することによって導入した。細胞を、両者とも増殖培地及び発
現培地のための各抗生物質（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、５０μｇ／ｍｌ
のクロラムフェニコール）が供給され、かつ発現媒体のための２ｍｇ／ｍｌのラ
ムノースが添加されたＬＢ液体培地又はＬＢ−アガープレート中で増殖させた（
Luria. S. E., Adams, J. N. & TIng, R. C. (1960) Transduction of lactose-
utilizing ability among strains of Escherichia coli and Shigella dysente
riae and properties of phage particles. Virology 12, 348-390）。
【００５９】 エラー−プロンＰＣＲ。ヒダントイナーゼ遺伝子のランダム突然変異誘発を、
鋳型として０．２５ｎｇのプラスミドＤＮＡ、ベーリンガーＰＣＲバッファー（
１０ｍＭのトリス、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ８．３）
、２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄＴＴＰ、２００μＭのｄＧＴＰ、２０
０μＭのｄＣＴＰ、５０ピコモルの各プライマー及び２．５ＵのＴａｑポリメラ
ーゼ（ベーリンガー）を含有する１００μｌの反応混合物中で実施した。３０サ
イクル後に、１６６７増幅生成物をゲルからＱｉａｅｘＩＩゲル抽出キット（キ
アゲン、バレンシア、ＣＡ）を使用して抽出し、かつベクターｐＪＯＥ２７０２
中にＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用してサブクローニングした。アル
カリ性ホスファターゼ処理されたベクターのリライゲーション頻度は１％未満で
あった。
【００６０】 飽和突然変異誘発。アミノ酸位置９５についてのコドンの無作為化のために、
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭプロトコール（ストラタジーン、Ｌａ Ｊｏｌｌａ
，ＣＡ）を使用した。クローン２２ＣＧ２からの約１０ｎｇのプラスミドを２種
の相補的なオリゴヌクレオチド（５′−ＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＣＣＧＮＮＮＡＣ
ＣＴＴＣＣＣＧＣＣＣＡＣ−３′、５−ＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＧＧＴＮＮＮＣ
ＧＧＣＡＴＣＴＣＧＡＴＧ−３′）を使用してＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ
増幅後に、反応混合物を２０Ｕの制限酵素ＤｐｎＩで２時間処理した。１０μｌ
のＤｐｎＩで消化された反応混合物をコンピテント細胞中に形質転換させること
によって、２０００より多い突然変異体のライブラリーが得られ、この中の約４
００個をスクリーニングした。
【００６１】 ライブラリーの作成及びスクリーニング。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉの単集
落を３８４ウェルプレート（マスタープレート）中にロボットシステムＱｂｏｔ
（Genetix, Dorset, UK）を使用して移した。３７℃で２０時間増殖させた後に
、プレートを−８０℃で貯蔵した。引き続いてのスクリーニングのために、これ
らのプレートを解凍し、１ウェルあたり２００μｌのインジケータ媒体を含有す
る９６ウェルプレート中に複製した。Ｂｉｏｍｅｋ１０００ピペッティングワー
クステーション（Beckman, Fullerton, CA）を使用して、３０℃で２４時間イン
キュベートされたプレートを２つの９６ウェルプレートに分配した（一方は１０
０μｌの８０ｍＭのＬ−ＭＴＥＨを含有し、もう一方はｐＨ８．５に調整された
５０ｍｇ／ｌのクレゾールレッド溶液中の１００μｌの８０ｍＭのＤ−ＭＴＥＨ
を含有する）。５８０ｎｍでの初期吸光及び室温での３時間のインキュベーショ
ンの後の吸光をＴＨＥＲＭＯｍａｘプレートリーダー（Molecular Devices, Sun
nyvale, CA）を使用して測定した。活性を、初期吸光と３時間のインキュベーシ
ョン後の吸光の差を各ウェルの細胞密度で割ることによって計算した。飽和突然
変異誘発ライブラリーに関してはインキュベーション時間を１．５時間に減らし
た。Ｌ−及びＤ−エナンチオマーに対する活性の比をエナンチオ選択性のための
第一のインジケータとして得た。同定されたクローンを次いでラセミ基質を使用
して以下に記載の条件下に試験した。
【００６２】 活性及びエナンチオ選択性の特徴付け。スクリーニングにおいて陽性であると
判明した突然変異体のプラスミドの配列決定を行い、これをＥ．ｃｏｌｉ中に再
形質転換させた。再形質転換されたＥ．ｃｏｌｉの培養を１ｍＭのＭｎＣｌ２を
供給したインジケータ媒体中で１６〜１８時間（ＯＤ１０まで）増殖させた。８
０ｍＭのＤ，Ｌ−ＭＴＥＨ、０．１Ｍのトリス（ｐＨ８．５）、１ｍＭのＭｎＣ
ｌ２からなる２ｍｌの基質溶液（３７℃で予備インキュベートした）を２ｍｌの
細胞培養（ＯＤ６００〜７）に添加した。反応混合物を直ちに水浴中で３７℃で
インキュベートした。種々の時間（本文に規定されるような）後に、１ｍｌの試
料を採取し、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。２０μｌの上清をキラル
ＨＰＬＣによってデグッサ−ヒュルスＡＧ（Degussa-Huels AG）によって製造さ
れたカラムを使用して分析した。活性は生産されたＮ−カルバモイル−Ｄ，Ｌ−
メチオニンの量から計算し、Ｕ／ｍｇの細胞乾燥質量（ＣＤＷ）のＵ／ｍｌの細
胞培養として表され、その際、１Ｕは規定の反応条件下に１分間で１マイクロモ
ルのＮ−カルバモイル−Ｄ，Ｌ−メチオニンを生産する全細胞触媒の量である。
ヒダントイナーゼ及びその突然変異体のエナンチオ選択性を、種々の変換の程度
での生成物についてｅｅＤ（(D-L)/(D+L)）とｅｅＬ（(L-D)/(L+D)）のそれぞれ
の割合を計算することによって比較した。Ｃｈｅｎ他（Chen, C.S., Fujimono,
Y., Girdaukas, G, & Sih, C.J.(1982) Quantitative analysis of biochemical
kinetic resolution of enantiomer. J.Am.Chem. Soc.104, 7294-7299）によっ
て記載されるようなｅｅ値及び変換の程度からＥ（エナンチオマー比）を慣用に
測定することは、基質の迅速なラセミ化の故に不可能である。
【００６３】 Ｄ，Ｌ−ＭＴＥＨのＬ−ｍｅｔへの変換。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＯＭ
２０及びｐＯＭ２１）及びＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＯＭ２２及びｐＯＭ２
１）の８ｍｇの細胞乾燥質量を、１ｍＭのＭｎＣｌ２を供給した０．１Ｍのトリ
ス（ｐＨ７．８）中の４ｍｌの１００ｍＭのＤ，Ｌ−ＭＴＥＨに添加した。反応
混合物を３７℃でインキュベートした。これらの試料を指示される時間の後に分
析し、かつＶｏｅｌｋｅｌ，Ｄ．＆Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．Ｒｅａｔｉｏｎ（１９９
５）５−一置換されたヒダントインのエナンチオマー的に純粋なＬ−アミノ酸へ
の変換に関するメカニズム（mechanism for the conversion of 5-monosubstitu
ted hydantoins to enantiomerically pure L-amino acids）．Ａｎｎ．ＮＹ Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．７５０，１−９に記載されるようにＭＴＥＨ、Ｄ，Ｌ−Ｃ ｍ
ｅｔ及びＤ，Ｌ−ｍｅｔに関してＨＰＬＣによって分析した。これらの化合物の
光学純度を前記のようにキラルＨＰＬＣによって分析した。
【００６４】 図５に示されるように、Ｄ，Ｌ−ＭＴＥＨのＬ−ｍｅｔへの変換は進化された
ヒダントイナーゼによって触媒についてかなり改善された。３時間後に、約６０
ｍＭのＬ−ｍｅｔが１００ｍＭのＤ，Ｌ−ＭＴＥＨから生産され、一方で全細胞
触媒は野生型経路でわずか１０ｍＭのアミノ酸を生産した。Ｄ−Ｃ ｍｅｔ中間
体の濃度は４分の１に低減し、Ｌ−アミノ酸の製造に関する生産性は反応の最初
の１時間の間に８倍に増大した。
【００６５】 例３ 以下の例はＬ−メチオニンの製造が、改善された活性を有しかつエナンチオ選
択的でない（４２％の変換率において０％のエナンチオマー過剰 第３表参照）
突然変異体２２ＣＧ２の進化されたヒダントイナーゼによってかなり改善される
ことを示している。突然変異体２２ＣＧ２からの進化されたヒダントイナーゼの
突然変異体をｐＯＭ２０中に従来から記載されているように制限酵素ＲｓｒＩＩ
及びＫａｓＩを使用して導入して、ｐＯＭ２３が得られた。この同時発現ベクタ
ーをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＯＭ２１）中に形質転換させた。得られた全
細胞触媒 Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＯＭ２１／ｐＯＭ２３）及びＥ．ｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０９（ｐＯＭ２１／ｐＯＭ２０）をＤ，Ｌ−ＭＴＥＨをメチオニン
に変換するために使用した。１２５ｍｇのそれぞれの細胞の細胞乾燥質量を５ｍ
ｌの基質溶液（０．９％のＮａＣｌ中の１００ｍＭのＤ，Ｌ−ＭＴＥＨ、１ｍＭ
のＭｎＣｌ２ ｐＨ７．８）に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。図
６は両者の触媒についての、Ｄ，Ｌ−ＭＴＥＨからメチオニン（Ｍｅｔ）及びＮ
−カルバモイル−メチオニン（Ｃ−Ｍｅｔ）の製造を示している。クローン２２
ＣＧ２からの改善されたヒダントイナーゼを有する全細胞触媒は１時間以内に約
６５ｍＭのメチオニンを産生し、一方で野生型のヒダントイナーゼを有する全細
胞触媒は同じ反応時間の間にわずか８ｍＭだけしか産生しない。このことは大き
なエナンチオ選択性を有さないが、改善された活性を有する進化されたヒダント
イナーゼはメチオニンの製造に重大な改善をもたらすことを証明している。
【００６６】 このように本発明の例示した実施態様を記載したので、当業者によれば、その
範囲内の開示が例示されているだけであり、種々の他の選択肢、適合及び変更を
本発明の範囲内で行ってよいことが留意されるはずである。従って本発明は本願
に説明されるような特定の実施態様に制限されるものではなく、請求の範囲によ
ってのみ制限される。
【００６７】
【外１】
【００６８】
【外２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はアルスロバクターｓｐ．ＤＳＭ９７７１からのヒダントイナーゼ遺伝子
（ｈｙｕＨ）の発現のために使用されるベクターの制限地図である。
【図２】 図２は突然変異体Ｑ２Ｈ４、１１ＤＨ７及び１ＣＧ７によって生産されるＮ−
カルボモイル−メチオニンエナンチオマーの分離のＤＳＭ９７７１ヒダントイナ
ーゼとの比較による結果を示しているクロマトグラムである。
【図３】 図３はＤＳＭ９７７１ヒダントイナーゼ（Ｗ）に対する本発明の突然変異酵素
によって提供される酵素活性及びエナンチオ選択性における相対的な改善を示し
ている図である。
【図４】 図４は種々のアルスロバクター株及び本発明の突然変異体Ｑ２Ｈ４の酵素活性
を示すグラフである。
【図５】 図５はＡ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＯＭ２０／ｐＯＭ２１）（野生型の
経路）並びにＢ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＯＭ２２／ｐＯＭ２１）（Ｑ２
Ｈ４からの進化されたヒダントイナーゼによる経路）の８ｍｇの細胞乾燥質量を
使用する０．１Ｍのトリス ｐＨ７．８中３７℃での１００ｍＭのＤ，Ｌ−ＭＴ
ＥＨの加水分解の時間経過を示す２つのグラフである。
【図６】 図６は２５ｇ／ｌのＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＯＭ２０，ｐＯＭ２１）及
びＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＯＭ２１，ｐＯＭ２３）を使用する０．９％（
ｗ／ｖ）のＮａＣｌ、１ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ７．８中での１００ｍＭのＤ，
Ｌ−ＭＴＥＨの加水分解の１時間の反応時間後の比較を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｐ 13/06 Ａ Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｂ 13/06 Ｃ Ｚ 13/08 Ｄ 13/12 Ａ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:19 13/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 13/04 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ０９／４９７，５８５ (32)優先日 平成12年２月３日(2000．2．3) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 フランシズ エイチ アーノルド アメリカ合衆国 カリフォルニア パサデ ナ サウス グランド アヴェニュー 629 (72)発明者 オリヴァー メイ ドイツ連邦共和国 フランクフルト アム レーベンボルン 17アー (72)発明者 カールハインツ ドラウツ ドイツ連邦共和国 フライゲリヒト ツア マリーエンルーエ 13 (72)発明者 アンドレアス ボマリウス アメリカ合衆国 ジョージア アトランタ ヴァーノン スプリングズ コート 1105 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA11 BA71 CA01 DA07 GA11 GA19 HA01 4B050 CC04 GG10 LL02 LL05 4B064 AE03 AE04 AE05 AE06 AE07 AE16 CA02 CA19 CA35 CB06 CC24 CD12 DA01 DA10 4B065 AA26X AB01 AC14 BA02 BB12 BB13 BC21 BD44 CA17 CA31 CA41 CA44

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号２の非改変ヒダントイナーゼに対して改善された酵
    素特性を有し、その際、改変ヒダントイナーゼはアミノ酸位置番号９５、１５４
    、１８０、２５１及び２５５からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置
    及び他のヒダントイナーゼの相当位置におけるアミノ酸置換によって改変された
    非改変ヒダントイナーゼからなる改変されたヒダントイナーゼ。
  2. 【請求項２】 １つ以上のアミノ酸置換をＩ９５Ｆ、Ｉ９５Ｌ、Ｖ１５４Ａ
    、Ｖ１８０Ａ、Ｑ２５１Ｒ及びＱ２５５Ａからなる群から選択する、請求項１記
    載の改変ヒダントイナーゼ。
  3. 【請求項３】 非改変ヒダントイナーゼをアミノ酸置換Ｉ９５Ｆ、Ｖ１８０
    Ａ及びＱ２５１Ｒによって改変する、請求項１記載の改変ヒダントイナーゼ。
  4. 【請求項４】 非改変ヒダントイナーゼをアミノ酸置換Ｖ１８０Ａ及びＱ２
    ５１Ｒによって改変する、請求項１記載の改変ヒダントイナーゼ。
  5. 【請求項５】 非改変ヒダントイナーゼをアミノ酸置換Ｉ９５Ｌ及びＱ２５
    １Ｒによって改変する、請求項１記載の改変ヒダントイナーゼ。
  6. 【請求項６】 非改変ヒダントイナーゼをアミノ酸置換Ｖ１５４Ａによって
    改変する、請求項１記載の改変ヒダントイナーゼ。
  7. 【請求項７】 非改変ヒダントイナーゼをアミノ酸置換Ｑ２５５Ａによって
    改変する、請求項１記載の改変ヒダントイナーゼ。
  8. 【請求項８】 非改変ヒダントイナーゼをアミノ酸置換Ｉ９５Ｌによって改
    変する、請求項１記載の改変ヒダントイナーゼ。
  9. 【請求項９】 配列番号２の非改変ヒダントイナーゼに対して改善された酵
    素特性を有する改変ヒダントイナーゼをコードする領域を有し、その際、該改変
    ヒダントイナーゼがアミノ酸位置番号９５、１５４、１８０、２５１及び２５５
    からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置及び他のヒダントイナーゼの
    相当位置においてアミノ酸置換によって改変された非改変ヒダントイナーゼから
    なる核酸セグメント。
  10. 【請求項１０】 １つ以上のアミノ酸置換をＩ９５Ｆ、Ｉ９５Ｌ、Ｖ１５４
    Ａ、Ｖ１８０Ａ、Ｑ２５１Ｒ及びＱ２５５Ａからなる群から選択する、請求項９
    記載の核酸セグメント。
  11. 【請求項１１】 請求項９記載の核酸セグメントを有する発現ベクター。
  12. 【請求項１２】 請求項１０記載の核酸セグメントを有する発現ベクター。
  13. 【請求項１３】 請求項９記載の核酸セグメントを有する宿主細胞。
  14. 【請求項１４】 請求項１０記載の核酸セグメントを有する宿主細胞。
  15. 【請求項１５】 請求項９記載の改変ヒダントイナーゼをコードする核酸セ
    グメントを適当な宿主細胞中で発現させて、改変ヒダントイナーゼを製造し、か
    つ前記の発現工程によって製造された改変ヒダントイナーゼを回収する工程を含
    む、改変ヒダントイナーゼを製造するための方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１０記載の改変ヒダントイナーゼをコードする核酸
    セグメントを適当な宿主細胞中で発現させて、改変ヒダントイナーゼを製造し、
    かつ前記の発現工程によって製造された改変ヒダントイナーゼを回収する工程を
    含む、改変ヒダントイナーゼを製造するための方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１記載の改変ヒダントイナーゼを使用するアミノ酸
    の製造方法。
  18. 【請求項１８】 請求項２記載の改変ヒダントイナーゼを使用する、請求項
    １７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 ヒダントイナーゼと共にカルバモイラーゼ及びヒダントイ
    ンラセマーゼを使用する、請求項１７記載の方法。
  20. 【請求項２０】 固定化されたヒダントイナーゼを使用する、請求項１７記
    載の方法。
  21. 【請求項２１】 アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン
    又はｔ−ロイシン又はネオペンチルグリシンを製造する、請求項１７記載の方法
    。
  22. 【請求項２２】 方法を酵素−メンブレン−リアクター中で実施する、請求
    項１７記載の方法。
  23. 【請求項２３】 ヒダントイナーゼをコードする遺伝子を有し、その際、ヒ
    ダントイナーゼが請求項１記載のものである全細胞触媒。
  24. 【請求項２４】 更にカルバモイラーゼをコードする遺伝子を有する、請求
    項２３記載の全細胞触媒。
  25. 【請求項２５】 更にラセマーゼをコードする遺伝子を有する、請求項２４
    記載の全細胞触媒。
  26. 【請求項２６】 細菌を全細胞として使用する、請求項２３記載の全細胞触
    媒。
  27. 【請求項２７】 エシェリキア コリを全細胞として使用する、請求項２３
    記載の全細胞触媒。
  28. 【請求項２８】 請求項２３記載の全細胞触媒を使用するアミノ酸の製造方
    法。
  29. 【請求項２９】 メチオニン、バリン、トレオニン、リジン又はｔ−ロイシ
    ンを製造する、請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 方法を酵素−メンブレン−リアクター中で実施する、請求
    項２８記載の方法。
  31. 【請求項３１】 発現ベクターｐＯＭ１７、ｐＯＭ１８、ｐＯＭ２０、ｐＯ
    Ｍ２２及び／又はｐＯＭ２１を使用する、請求項２８記載の全細胞触媒の製造方
    法。
  32. 【請求項３２】 配列番号１７、配列番号１８、配列番号１５及び／又は配
    列番号１６のプライマーを全細胞触媒の製造のために使用する、請求項３１記載
    の方法。
  33. 【請求項３３】 請求項１記載の改変ヒダントイナーゼを含有する全細胞を
    使用し、その際、該ヒダントイナーゼの作用によって製造されるＮ−カルバモイ
    ル−Ｄ−アミノ酸又はＮ−カルバモイル−Ｌ−アミノ酸を更に化学的又は酵素的
    に加水分解してアミノ酸を製造し、かつヒダントインのラセミ化を化学的又は酵
    素的に達成する、α−アミノ酸の製造方法。
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