DE10037115A1

DE10037115A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Allysinacetal

Info

Publication number: DE10037115A1
Application number: DE10037115A
Authority: DE
Inventors: Hans-Peter Krimmer; Oliver May; Ingo Klement; Karlheinz Drauz; Dietmar Reichert
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-07-28
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2002-02-07
Also published as: US6825014B2; TWI272309B; US20020132848A1; EP1305441A1; AR029840A1; AU2001269104A1; WO2002010424A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Verbindungen der Formel (I) DOLLAR F1 aus den entsprechenden Hydantoinen mittels eines enzymatischen Verfahrens. Vorzugsweise wird die L-Verbindung gebildet.

Description

Die vorliegende Erfindung ist auf die Herstellung von Ver bindungen der allgemeinen Formel (I)

gerichtet. Insbesondere werden diese Verbindungen mittels eines enzymatischen Verfahrens aus Hydantoinen der allge meinen Formel (II)

hergestellt.

Verbindungen der Formel (I) sind geeignete Zwischenprodukte zur Herstellung von in der US 5552397, WO 9738705 und in J. Med. Chem. 42, 305 (1999) beschriebenen Pharmazeutika.

In J. Med. Chem. 42, 305 (1999) ist eine Syntheseroute zur Herstellung eines Bausteins - ein α-Amino-ε- caprolactamderivat - der pharmazeutisch wirksamen Verbin dungen erwähnt. Dieses wird mit Hilfe teurer Reagenzien in einem für einen robusten technischen Prozeß eher nachteili gen Verfahren gewonnen.

Aus JP 99206397 ist die Herstellung von Verbindungen wie (I) aus Hydantoinen wie (II) mittels Athrobacter sp. be reits bekannt. Dort wird jedoch nicht die vorteilhafte Ra cemisierung beschrieben.

Die Umsetzung von Hydantoinen mittels Hydantoinasen und spezifischen Carbamoylasen ist aus der DE 195 29 211.1 bereits bekannt. Die spontane chemischen Racemisierung von Hydanto inen zur Herstellung von enantiomer angereicherten Ami nosäuren ist aus der DE-P 41 37 581.5-44 zu entnehmen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war deshalb die Angabe eines weiteren enzymatisch arbeitenden Verfahrens zur Her stellung der gewünschten Verbindungen. Insbesondere sollte dieses Verfahren einfacher in der Durchführung und damit für die Anwendung in einem großtechnischen Prozeß besser geeignet sein.

Diese und näher angeführte weitere, sich aus dem Stand der Technik jedoch in naheliegenderweise erschließende Aufgaben werden gelöst durch die Angabe eines Verfahrens mit den Merkmalen des vorliegenden Anspruchs 1. Vorteilhafte Ausge staltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in den von Anspruch 1 abhängigen Unteransprüchen unter Schutz ge stellt. Eine vorteilhafte Verwendung stellt Anspruch 6 un ter Schutz.

Dadurch, daß man in einem Verfahren zur Herstellung von Al lysinacetal der allgemeinen Formel (I)

von Hydantoinen der allgemeinen Formel (II)

worin in den Formeln (I) und (II) R bedeutet (C₁-C₈)-Alkyl, (C₂-C₄)-Alkylenyl, vorzugsweise Ethylenyl, (C₆-C₁₈)-Aryl, (C₇-C₁₉)-Aralkyl, (C₁-C₈)-Acyl, ausgeht, wobei letztere ei ner Umsetzung mit Hydantoinasen und D- oder L-spezifischen Carbamoylasen, sowie einer spontanen und/oder enzymkataly sierten in-situ Razemisierung unterworfen werden, und wobei die beteiligten Enzyme in freier, immobilisierter oder in Zellen eingeschlossener Form verwendet werden können, ge langt man in überraschender für einen großtechnischen Pro zeß jedoch vorteilhafterweise zu den gewünschten Verbindun gen wie (I).

Die erfindungsgemäße Reaktionssequenz wurde bis dato im Stand der Technik noch nicht auf die vorliegenden Verbin dungen angewandt. Mithin ist es als überraschend zu werten, daß die labile acetalische Schutzgruppe unter den Reakti onsbedingungen stabil ist und man in sehr hohen Ausbeute aus 100% des Hydantoins in 85% Gesamtausbeute das Allysina cetal generieren kann, welches eine optische Reinheit von <99%ee besitzt.

Wie gesagt kann das erfindungsgemäße Verfahren teilenzyma tisch oder vollständig enzymatisch durchgeführt werden. Ne ben der Anwendung der freien Enzyme in einem Reaktionsan satz ist allerdings ein Verfahren besonders bevorzugt, bei dem ein sogenannter Ganzzellkatalysator, welcher ein klo niertes Gen codierend für eine Hydantoinracemase, eine Hy dantoinase und eine L- oder D-spezifische Carbamoylase auf weist, eingesetzt wird. Derartige Organismen sind prinzipi ell aus der US 60/157427 oder US 09/407062 (Seq. 1/Hydantoinase, 2/Hydantoinracemase, 3/Carbamoylase) bekannt. Die Offenbarung dieser Schriften gilt hiermit als mitum faßt, insbesondere die Offenbarung der relevanten Aminosäu resequenzen in den Sequenzprotokollen. Dies gilt insbeson dere für die US 60/157427.

Ganz besonders vorteilhaft ist der Einsatz eines Ganzzell katalysators aufweisend eine L-spezifische Carbamoylase. Damit läßt sich die gewünschte optische Antipode des Ally sinacetal zur Herstellung der pharmazeutisch wirksamen Sub stanzen gewinnen.

Im Prinzip kann der Ganzzellkatalysator jedwedes geeignete Expressionsystem sein, welches dem Fachmann für diesen Zweck in Frage kommt. Besonders bevorzugt ist allerdings ein rekombinantes Bakterium, vorzugsweise E. coli, für die Aufgabe heranzuziehen. Vorteilhafte E. coli-Stämme sind: JM109, NM522, JM105, RR1, DH5α, TOP 10^- oder HB101.

Zur Ausführung der Erfindung geht man im allgemeinen so vor, daß man das Substrat (II) in einem geeigneten Lösungs mittel, vorzugsweise Wasser, bei einem für die Hydantoinase und Carbamoylase optimalen pH-Wert bei ca. 5,5-8,5, vor zugsweise 6,5-8, und einer für die Enzymaktivität optimalen Temperatur von ca. 20°C-40°C, vorzugsweise 25°C-35°C, mit den Enzymen kontaktiert. Vorteilhaft kann die Zugabe von die Enzymaktivitäten positiv beeinflussenden Metallsalzen, wie CoCl₂ oder MgCl₂, MnCl₂ etc. sein.

Während der Spaltung der Hydantoine in die optisch angerei cherten Aminosäuren racemisieren die Hydantoine spontan. Um diese Reaktion jedoch zu beschleunigen kann das verbliebene Hydantoin in situ enzymatisch racemisiert werden und steht damit der erneuten Spaltung in die Aminosäure zur Verfü gung. Vorzugsweise wird deshalb aus Zeitgründen eine enzy matische Racemisierung angestrebt, die gleichzeitig mit der Umsetzung des Hydantoins zur Aminosäure verläuft. So kann in einem Arbeitsschritt das gesamte Hydantoin in die Ami nosäure umgesetzt werden. Dies kann wie gesagt mit separat zur Verfügung stehenden Enzymen, welche frei oder immobili siert vorliegen können oder mit einem in einem Mikroorga nismus eingeschlossenen Enzymen erfolgen (US 60/157427). Das erfindungsgemäße Verfahren kann in sequentiellen Reak tionsansätzen oder kontinuierlich in einem sogenannten En zym-Membran-Reaktor durchgeführt werden (Wandrey et al. in Jahrbuch 1998, Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI S. 151ff.; Kragl et al. Angew. Chem. 1996, 6, 684f.).

In einer weiteren Ausgestaltung bezieht sich die Erfindung auf eine Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Ace tale in einer Synthese zur Herstellung von bioaktiven Wirk stoffen, insbesondere von Pharamzeutika.

Als (C₁-C₈)-Alkyl sind anzusehen Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pen tyl, Hexyl, Heptyl oder Octyl samt aller ihrer Bindungsiso meren.

Als (C₁-C₈)-Alkylenyl sind gemeint Alkylbrücken mit 2 bis 8 C-Atomen, wobei in 1 und n-Stellung jeweils die Substituen ten sitzen, wie z. B. Ethylenyl, Propylenyl etc.

Unter einem (C₆-C₁₈)-Arylrest wird ein aromatischer Rest mit 6 bis 18 C-Atomen verstanden. Insbesondere zählen hierzu Verbindungen wie Phenyl-, Naphthyl-, Anthryl-, Phenan thryl-, Biphenylreste.

Ein (C₇-C₁₉)-Aralkylrest ist ein über einen (C₁-C₈)- Alkylrest an das Molekül gebundener (C₆-C₁₈)-Arylrest.

Ein (C₁-C₈)-Acylrest bezeichnet einen (C₁-C₈)-Alkylrest, welcher über eine C=O-Funktion an das Molekül gebunden ist.

Die gezeigten Strukturen der Verbindungen beziehen sich auf beide optische Isomere.

SEQUENZPROTOKOLL

Beispiel

30 g (Naßgewicht) E. coli-Zellen JM109 (pOM22, pOM21) (US 60/157427) wurden zusammen mit 100 mM DL-Allysinhydantoin und 1 mM CoCl₂ bei pH 7.8 in 1 l Wasser vermischt. Die Reak tionsmischung wurde anschließend bei 37°C für 4 h belassen. Die Zellen wurden dann abzentrifugiert (45 min, 8000 rpm, 4°C, Beckman Coulter JA-10 rotor) und der Überstand mittels HPLC analysiert. Man erhielt nach 4 h eine Ausbeute an L- Allysinacetal von <85% mit einer optischen Reinheit von <99%ee.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Allysinacetal der allge meinen Formel (I)
ausgehend von Hydantoinen der allgemeinen Formel (II)
worin in den Formeln (I) und (II) R bedeutet (C₁-C₈)- Alkyl, (C₂-C₄)-Alkylen, (C₆-C₁₆)-Aryl, (C₇-C₁₉)-Aralkyl, (C₁-C₈)-Acyl,
durch Umsetzung mit Hydantoinasen und D- oder L- spezifischen Carbamoylasen, sowie einer spontanen und/oder enzymkatalysierten in-situ Racemisierung, wo bei die beteiligten Enzyme in freier, immobilisierter oder in Zellen eingeschlossener Form verwendet werden können.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Ganzzellkatalysator, welcher ein kloniertes Gen codierend für eine Hydantoinracemase, eine Hydan toinase und eine L- oder D-spezifische Carbamoylase aufweist, einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Ganzzellkatalysator eine L-spezifische Carbamoyla se aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und/oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Ganzzellkatalysator ein rekombinantes Bakterium, vorzugsweise E. coli, ist.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Enzym-Membran-Reaktor arbeitet.

6. Verwendung der nach einem der vorhergehenden Ansprüche hergestellten Acetale in einer Synthese zur Herstel lung von bioaktiven Wirkstoffen, insbesondere von Phar mazeutika.