DE60020943T2

DE60020943T2 - HYDANTOINASE-VARIANTEN MIT VERBESSERTEN EIGENSCHAFTEN UND IHRE ANWENDUNG ZUR PRODUKTION VON AMINOSäUREN

Info

Publication number: DE60020943T2
Application number: DE60020943T
Authority: DE
Inventors: H. Frances ARNOLD; Oliver May; Karlheinz Drauz; Andreas Bommarius
Original assignee: Degussa GmbH; California Institute of Technology CalTech
Current assignee: Evonik Operations GmbH; California Institute of Technology CalTech
Priority date: 1999-03-29
Filing date: 2000-03-28
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2020-03-29
Also published as: JP4641100B2; US6524837B1; DE60020943D1; ES2244430T3; EP1165763A1; EP1165763A4; AU4178800A; ATE298365T1; DK1165763T3; EP1586636A1; PT1165763E; WO2000058449A1; EP1165763B1; JP2003521235A

Description

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Hydantoinasen. Insbesondere bezieht die vorliegende Erfindung die Entdeckung einer Anzahl modifizierter Hydantoinasen, die bezogen auf bisher isolierte Hydantoinasen verbesserte enzymatische Eigenschaften aufweisen, und deren Verwendung in Ganzzellkatalysatoren zur Produktion von Aminosäuren ein.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Hydantoinhydrolysierende Enzyme, die hier als „Hydantoinasen" bezeichnet werden, umfassen eine vielfältige Klasse von Enzymen, die einen breiten Bereich an Spezifitäten und biologischen Funktionen aufweisen. Beispielsweise spielen einige Hydantoinasen eine wesentliche Rolle auf dem reduktiven Weg des Pyrimidinabbaus (Dihydropyrimidinasen, EC 3.5.2.2), wohingegen andere Reaktionen auf dem Purinabbauweg katalysieren (Allantoinasen, EC 3.5.2.5). Trotz ihrer funktionellen Vielfalt zeigen Hydantoinasen beträchtliche Sequenzähnlichkeiten und gehören einer Überfamilie von Amidohydrolasen an, die mit Ureasen verwandt sind, wie beschrieben von Holm, L. und Sander, C. (1997), An evolutionary treasure: Unification of a broad set of amidohydrolases related to ureases, Proteins 28: 72–82. Der Abgleich von Sequenzen aus den verschiedenen Hydantoinasen wurde verwendet, um bewahrte Reste zu identifizieren, die für die katalytische Funktion wichtig sind, wie beschrieben von May, O., Habenicht, A., Mattes, R., Syldatk, C. und Siemann, M. (1998) Molecular Evolution of Hydantoinases, Biol. Chem. 379: 743–747; und von Kim, G. J. und Kim, H. S. (1998) Identification of the structural similarity in the functionally related amidohydrolases acting on the cyclic amide ring, Biochem. J. 330: 295–302. Trotz dieses Wissens, das ermöglicht, äquivalente Aminosäurereste der verschiedenen Hydantoinasen zu identifizieren, ist das Wissen über die Funktion anderer Aminosäurereste begrenzt. Bisher wurde keine Röntgenstrahlstruktur von Hydantoinasen angegeben.
Eine wichtige Eigenschaft von Hydantoinasen ist ihre Enantioselektivität, die sie für die Produktion von optisch reinen D- oder L-Aminosäuren wertvoll macht. Ein detaillierter Hintergrund zu den Hydantoinasen ist in der veröffentlichten Dissertation von Oliver May mit dem Titel „The Hydantoinase from Arthrobacter aurescens DSM 3745 and its Relation to other Hydantoinases" (Institut für Bioverfahrenstechnik, Lehrstuhl Physiologische Mikrobiologie, Universität Stuttgart, 1998) bereitgestellt.
Angesichts der Bedeutung von Hydantoinasen für die Produktion optisch reiner Aminosäuren gab es konzentrierte Bemühungen, modifizierte Enzyme zu entwickeln, die verbesserte Eigenschaften hinsichtlich der Aminosäureproduktion aufweisen. Infolge dieser Bemühungen ist eine Anzahl von Mikroorganismen isoliert und identifiziert worden, die Hydantoinasen mit wünschenswerten enzymatischen Eigenschaften produzieren. Die US-Patentschrift Nr. 5,516,660 offenbart Mikroorganismen, die als DSM 7329 und DSM 7330 identifiziert sind, welche Hydantoinasen erzeugen, die in der Lage sind, aus D-, L- und/oder D,L-S-monosubstituierten Hydantoinen L-alpha-Aminosäuren zu produzieren. In der US-Patenschrift Nr. 5,714,355 ist ein Mutant des Mikroorganismus DSM 7330 offenbart, der eine um einen Faktor von bis zu 2,7 höhere enzymatische Aktivität als der Vorläuferorganismus aufweist. Der Mutant (DSM 9771) wurde mittels Kultivieren des Vorläuferorganismus DSM 7330 unter selektivem Druck unter Verwendung von L- Carbamoylmethionin (L-CAM) als die alleinige Stickstoffquelle erhalten (Wagner et al., J. Biotech., 1996, 46,6). Obwohl die Hydantoinasen, die von den oben erwähnten Mikroorganismen erzeugt werden, für mindestens einige der beabsichtigten Zwecke gut geeignet sind, besteht weiterhin ein Bedarf, neue Enzyme zu entwickeln, die eine noch wünschenswertere Hydantoinaseaktivität aufweisen. Insbesondere besteht ein Bedarf, die Enantioselektivität sowie auch die katalytische Aktivität zu verbessern.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß sind modifizierte Hydantoinasen bereitgestellt, die bezogen auf die Hydantoinase, die von dem Mikroorganismus DSM 9771 produziert wird, der in der US-Patentschrift Nr. 5,714,355 identifiziert ist, verbesserte enzymatische Eigenschaften (bessere Ganzzellkatalysatoren) aufweisen. Die DSM-9771-Hydantoinase weist eine Aminosäuresequenz auf, die numerierte Positionen im Bereich von abfolgend 1 bis 458 (SEQ. ID. NO. 2) aufweisen.
Es wurde entdeckt, daß die Substitution von Aminosäuren an einer oder mehreren spezifischen Aminosäurepositionen innerhalb des DSM-9771-Enzyms zur Bildung von Enzymen mit verbesserten Eigenschaften hinsichtlich der Aktivität und Enantioselektivität führte. Die spezifischen Aminosäurepositionsnummern, an denen Substitutionen erfolgen, um die erfindungsgemäßen modifizierten Hydantoinaseenzyme zu erhalten, sind die Positionen Nr. 95, 154, 180, 251 und 295. Als ein weiteres Merkmal der Erfindung sind spezifische Aminosäuresubstitutionen an den verschiedenen Positionen identifiziert, um spezifische Typen modifizierter Hydantoinasen bereitzustellen. Zu den spezifischen Aminosäuresubstitutionen gehören I95F, I95L, V154A, V180A, Q251R und V295A. Es wurde festgestellt, daß eine oder mehrere dieser spezifischen Substitutionen die enzymatische Aktivität verbessern und die Enantioselektivität der „Wildtyp"-DSM-9771-Hydantoinase ändern. Es wurde festgestellt, daß diese geänderten Enzymeigenschaften zu einem bedeutend verbesserten Hydantoinaseverfahren beitragen, indem sie die Akkumulation des falschen Enantiomers der N-Carbamoyl-Aminosäure verringern.
Sechs spezifische modifizierte Hydantoinasen sind offenbart, die eine oder mehrere der obigen Aminosäuresubstitutionen aufweisen. Die Aminosäuresequenzen dieser modifizierten Hydantoinasen sind in SEQ. ID. NO. 4, 6, 8, 10, 12 und 14 dargelegt. Diese modifizierten Hydantoinasen sind in der gesamten Beschreibung auch als 1CG7, 11DH7, 1BF7, 19AG11, 22CG2 bzw. Q2H4 ausgewiesen.
Es wurde ferner entdeckt, daß Hydantoinasen, die auf Aktivität und/oder Enantioselektivität entwickelt wurden, die Produktion von Aminosäuren (d.h. L-Methionin) drastisch verbessern können, indem ein Ganzzellkatalysator verwendet wird, der eine entwickelte Hydantoinase zusätzlich zu mindestens einer Carbamoylase umfaßt.
Die oben erörterten und viele andere Merkmale und begleitenden Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung besser verstanden werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die erfindungsgemäßen modifizierten Hydantoinasen wurden unter Verwendung von Zufallsmutagenese-Verfahren des Typs, der in den US-Patentschriften Nr. 5,316,935 und 5,906,930 beschrieben ist, produziert, identifiziert und isoliert. Zufallsmutagenese-Vorschriften, die auch als Verfahren der gerichteten Evolution bekannt sind, sind auch beschrieben in: Kuchner, O., Arnold, F. H. (1997) Directed Evolution of Enzyme Catalysts, TIBTECH 15: 523–530; Chen, K. and Arnold, F. (1991) Enzyme engineering for nonaqueous solvents-random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media, Bio/Technology 9: 1073–1077; Chen, K. and Arnold, F. (1993) Tuning the activity of an enzyme for unusual environments: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5618–5622; und You, L. and Arnold, F. H. (1996) Directed Evolution of Subtilisin E in Bacillus Subtilis to Enhance Total Activity in Aqueous Dimethylformamide, Protein Engineering, 9, 77–83.
Das Zufallsmutagenese-Verfahren, das verwendet wurde, um die modifizierten Hydantoinasen zu identifizieren und zu isolieren, folgte denselben grundlegenden Vorgehensweisen, wie sie oben ausgewiesen sind. Zuerst wurde in der Wildtyp-Nucleotidsequenz (SEQ. ID. NO. 1) eine große Anzahl von Zufallsmutationen erzeugt. Diese Bibliothek von Nucleotidsequenzen wurde dann verwendet, um eine große Anzahl von mutierten Enzymen zu exprimieren. Die Bibliothek mutierter Hydantoinasen wurde dann durchmustert, um diejenigen Mutanten mit verbesserter enzymatischer Aktivität und geänderter Enantioselektivität zu identifizieren.
Der Schritt des Durchmusterns der ersten Bibliothek exprimierter Aminosäuresequenzen, um wünschenswerte Varianten zu identifizieren, hätte unter Verwendung einer beliebigen Anzahl geeigneter Durchmusterungstechniken durchgeführt werden können, die wünschenswerte Enzymeigenschaften messen. Das Durchmusterungsverfahren, das tatsächlich verwendet wurde, war eine pH-Indikator-Prüfung, die unten ausführlicher beschrieben wird.
Erfindungsgemäß wurden als das Ergebnis der ersten Runde der Zufallsmutagenese der DSM-9711- Nucleotidsequenz (SEQ. ID. NO. 1) vier Enzyme mit verbesserten Hydantoinaseeigenschaften identifiziert. Die Mutanten-Enzyme der ersten Runde sind 1CG7, 11DH7, 1BF7 und 19AG11. Die Nucleotidsequenzen dieser Mutanten der ersten Runde sind unter den SEQ. ID. NO. 3, 5, 7 bzw. 9 angegeben. Die entsprechenden Aminosäuresequenzen sind unter den SEQ. ID. NO. 4, 6, 8 bzw. 10 angegeben.
Eine zweite Runde der Zufallsmutagenese wurde durchgeführt, in der die 11DH7-Nucleotidsequenz zufallsmutiert wurde, um eine zweite Bibliothek von Mutanten zu bilden. Ein einzelner Mutant (22CG2) wurde identifiziert, der eine modifizierte Hydantoinase exprimierte, die wünschenswerte enzymatische Eigenschaften aufwies. Das 22CG2-Enzym ist dasselbe wie das 11DH7-Enzym, mit der Ausnahme, daß der 22CG2-Mutant eine Aminosäuresubstitution an der Position 180 aufweist.
Der 22CG2-Mutant wurde der Sättigungsmutagenese unterworfen, um alle 20 verschiedenen Aminosäuren in die Aminosäureposition 95 einzuführen. 400 Klone wurden durchmustert, und ein Mutanten-Enzym mit verbesserter enzymatischer Aktivität und höherer (L)-Selektivität wurde als Q2H4 identifiziert. Der Q2H4-Mutant ist derselbe wir der 22CG2-Mutant, mit der Ausnahme, daß an der Position 95 Phenylalanin durch Isoleucin ersetzt ist.
Als ein Ergebnis der Isolierung und Identifizierung der oben identifizierten Mutanten wurde festgestellt, daß durch Modifizieren des DSM-9771-Enzyms mittels Substituieren von Aminosäuren an den Positionen 95, 124, 154, 180, 251 und 295 verbesserte Hydantoinasen erhalten werden können. Die Substitutionen können an einer oder an mehreren der Positionen vorgenommen werden. Tabelle 1 gibt bevorzugte Aminosäuresubstitutionen an.
Tabelle 1
Andere Aminosäuresubstitutionen als diejenigen, die in Tabelle 1 angegeben sind, sind möglich, vorausgesetzt, daß die resultierende Hydantoinase wünschenswerte enzymatische Eigenschaften aufweist. Beispielsweise gehören zu anderen geeigneten Aminosäuresubstitutionen für Isoleucin an Position 95 Gly, Ala, Val, Leu, Phe, Tyr und Trp. Für die Positionen 154, 180 und 295 gehören zu geeigneten alternativen Aminosäuresubstitutionen für Valin Ala und Gly. Zu geeigneten alternativen Aminosäuresubstitutionen an Position 251 für Glutamin gehören Arg, Lys und Asn. Die Aminosäuresubstitutionen können durch Sättigungsmutagenese vorgenommen werden, gefolgt vom Durchmustern der Klone. Die Substitutionen können auch durch chemische Manipulation des DSM-9711-Enzyms oder durch herkömmliche Synthese von Peptiden, welche die gewünschten Aminosäuresubstitutionen an den gewünschten Orten aufweisen, vorgenommen werden. Es sei angemerkt, daß die oben aufgeführten Aminosäuresubstitutionen beispielhaft für bevorzugte alternative Substitutionen an den verschiedenen Substitutionsorten sein sollen. Substitutionen anderer Aminosäuren sind möglich, vorausgesetzt, daß die enzymatische Aktivität des resultierenden Proteins nicht vernichtet wird. Die Nützlichkeit einer besonderen Aminosäuresubstitution an den Positionen 95, 154, 180, 251 und 295 kann mittels routinemäßigem pH-Screening bestimmt werden, wie unten beschrieben.
Eine Aminosäureposition, die beispielsweise durch gerichtete Evolution identifiziert ist, daß sie zu einer spezifischen Funktion beiträgt, kann oftmals durch verschiedene Aminosäurereste besetzt werden, nicht nur von demjenigen, der durch Zufallspunktmutagenese identifiziert wurde. Einige Substitutionen werden die Funktion zerstören, einige von ihnen werden die Funktion nicht ändern, und noch andere werden die Funktion verbessern. Mit bekannten Verfahren, wie z.B. der ortspezifischen Sättigungsmutagenese, können Aminosäuren, die in derselben Weise zu einer Funktion beitragen oder diese sogar verbessern, durch Austauschen des festgestellten Aminosäurerestes gegen alle möglichen Aminosäurereste leicht identifiziert werden (Miyazaki, K., Arnold, F., Exploring nonnatural evolutionary pathways by saturation mutagenesis: rapid improvement of protein function. J. Mol. Evol. 49: 1716–1720). Sogar nicht natürlich vorkommende Aminosäuren können an dem identifizierten Ort unter Verwendung eines Stoppcodons und einer Suppressor-tRNA, verknüpft mit einer nicht natürlich vorkommenden Aminosäure, eingeführt werden (Bain, J. D., Glabe, C. G., Dix, T. A., Chamberlain, A. R., Diala, E. S., Biosynthetic Site-Specific Incorporation Of A Non-Natural Amino-Acid Into A Polypeptide. JACS 111: 8013–8014 (1989)).
Sechs erfindungsgemäße modifizierte Hydantoinasen sind in Tabelle 2 aufgeführt. In Tabelle 2 sind auch die Aminosäuresubstitutionen bezüglich der DSM-9771-Sequenz (SEQ. ID. NO. 2) für jedes modifizierte Enzym, das identifiziert ist, aufgeführt.
Tabelle 2
Die modifizierten Hydantoinasen der vorliegenden Erfindung können in derselben Weise verwendet werden wie andere Hydantoinasen, um optisch reine D- und L-Aminosäuren herzustellen. Siehe z.B. Biocatalytic Production of Amino Acids and Derivatives (Rozzell, J. D. and Wagner, F. eds.) (1992) Hanser Publisher, NY, auf den Seiten 75 bis 176 eine Beschreibung der Verwendung von Hydantoinasen zur Produktion von optisch reinen Aminosäuren aus DL-5-monosubstituierten Hydantoinen. Die allgemeine Verwendung von Hydantoinasen ist auch in Enzyme catalysis in organic synthesis (Dranz, K. and Waldmann, H. eds.) 1995, VCH-Verlag, Weinheim, auf den Seiten 409 bis 431; und Wagner, T. et al. (1996) Production of l-methionine from d,l-5-(2-methylthioethyl)hydantoin by resting cells of a new mutant strain of Arthrobacter species DSM 7330, Journal of Biotechnology 46: 63–68 beschrieben.
Die Aminosäuren, auf die sich in der vorliegenden Erfindung bezogen wird, sind alle natürlich oder nicht natürlich vorkommende Aminosäuren, wobei die Aminosäuren als ein primäres Amin angesehen werden, das über ein dazwischenliegendes C-Atom (α-C-Atom) mit einer Carbonsäuregruppe verbunden ist. Dieses C-Atom trägt nur einen weiteren Rest. Bevorzugte nicht natürlich vorkommende Aminosäuren sind in DE 1 990 3268.8 offenbart. Bevorzugte natürlich vorkommende Aminosäuren sind diejenigen, die in Beyer-Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 22. Auflage, S. Hirzel Verlag Stuttgart, S. 822–827 genannt sind. Unter denjenigen Aminosäuren, die oben aufgeführt sind, werden Alanin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Valin, tert.-Leucin oder Neopentylglycin nicht vorzugsweise in einem Verfahren unter Verwendung der modifizierten Hydantoinase transformiert.
Um Hydantoine direkt mittels Enzymen in die Aminosäuren zu transformieren, wird vorzugsweise ein Ganzzellkatalysator verwendet, der die Hydantoinase der Erfindung zusammen mit einer Carbamoylase umfaßt. Zusätzlich zu der Hydantoinase und der Carbamoylase kann auch eine Hydantoinracemase eingesetzt werden.
Die Hydantoinase kann in diesem Verfahren entweder in ihrer freien oder ihrer immobilisierten Form eingesetzt werden. Auch die Carbamoylase und die Hydantoinracemase können immobilisiert werden. Dem Fachmann sind Techniken zur Immobilisierung von Enzymen gut bekannt. Bevorzugte Verfahren sind dargestellt in Bhavender P. Sharma, Lorraine F. Bailey und Ralph A. Messing, Immobilisierte Biomaterialien – Techniken und Anwendungen, Angew. Chem. 1992, 94, 836–852; Dordick et al., J. Am. Chem. Soc. 194, 116, 5009–5010; Okahata et al., Tetrahedron Lett. 1997, 38, 1971–1974; Adlercreutz et al., Biocatalysis 1992, 6, 291–305; Goto et al., Biotechnol. Prog. 1994, 10, 263–268; Kamiya et al., Biotechnol. Prog. 1995, 11, 270–275; Okahata et al., Tibtech, February 1997, 15, 50–54; Fishman et al., Biotechnol. Lett. 1998, 20, 535–538).
Die erörterte Transformation kann in einem Chargenverfahren oder in kontinuierlicher Weise durchgeführt werden. Als Reaktionsbehälter wird vorteilhaft ein Enzym-Membran-Reaktor verwendet (Wandrey et al. in Jahrbuch 1998, Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI, S. 151ff.; Wandrey et al. in Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds, Vol. 2, VCH 1996, S. 832 ff.; Kragl et al., Angew. Chem. 1996, 6, 684f.).
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf einen Ganzzellkatalysator gerichtet, der eine Gencodierung für eine Carbamoylase, eine wahlfreie Racemase und eine Hydantoinase umfaßt, wobei man annimmt, daß es sich bei der Hydantoinase um die modifizierte Hydantoinase der Erfindung handelt.
In vorteilhafter Weise wird ein Bakterium als eine Zelle verwendet, aufgrund der hohen Reproduktionsgeschwindigkeiten und der einfachen Wachstumsbedingungen, die anzuwenden sind. Dem Fachmann sind mehrere Bakterien bekannt, die in diesem Zusammenhang verwendet werden können. Diesbezüglich können vorzugsweise E. coli als die Zelle und das Expressionssystem verwendet werden (Yanisch-Perron et al., Gene (1985), 33, 103–109).
Ein anderer Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Verfahren zur Produktion von enantiomerenangereicherten Aminosäuren, wobei ein erfindungsgemäßer Ganzzellkatalysator verwendet wird.
Diesbezüglich werden Aminosäuren wie Methionin, Threonin, Lysin oder tert.-Leucin ferner vorzugsweise mithilfe des Ganzzellkatalysators produziert.
Die in diesem Beispiel erörterte Transformation kann in einem Chargenverfahren oder in kontinuierlicher Weise durchgeführt werden. Vorteilhaft wird ein Enzym-Membran-Reaktor als Reaktionsbehälter verwendet (Wandrey et al. in Jahrbuch 1998, Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI S. 151ff.; Wandrey et al. in Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds, Vol. 2, VCH 1996, S. 832 ff; Kragl et al., Angew. Chem. 1996, 6, 684f.; DE 19 910 691.6 ).
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist auf ein Verfahren zur Produktion eines Ganzzellkatalysators der Erfindung gerichtet. Zusätzlich werden Primer der SEQ. ID. NO. 17, SEQ. ID. NO. 18, SEQ. ID. NO. 15 und/oder SEQ. ID. NO. 16 im Zusammenhang mit der Produktion des Ganzzellkatalysators verwendet.
Anwendungsbeispiele sind folgende:
Beispiel 1
Das folgende Beispiel stellt zusätzliche Einzelheiten hinsichtlich der Arbeitsweisen bereit, die verwendet wurden, um die erfindungsgemäßen modifizierten Hydantoinasen zu identifizieren und zu isolieren.
Die Hydantoinase von Arthrobacter sp. DSM 9771 (US-Patentschrift Nr. 5,714,355) wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geklont. Die Nucleotidsequenz wurde bestimmt und mit derjenigen anderer Hydantoinasen von nahe verwandten Arthrobacter-Stämmen verglichen. Die Nucleotid- und Aminosäuresequenz für die Hydantoinase sind in der SEQ. ID. NO. 1 bzw. 2 angegeben. Die geklonten Enzyme von Arthrobacter sp. DSM 9771 weisen, bezogen auf ihre Nucleotidsequenz, mit den Enzymen von Arthrobacter aurescens DSM 3747 und DSM 3745 eine 97,5%ige Identität auf (entspricht 7 Aminosäureänderungen). Die Enzyme wurden in E. coli JM109 unter Verwendung eines rhamnoseinduzierbaren Vektorkonstrukts, das vom Institute of Industrial Genetics, Universität Stuttgart (Deutschland) bereitgestellt wurde, exprimiert.
Die Hydantoinase wurde der Zufallsmutagenese unter Verwendung der Error-prone-PCR unterworfen. Etwa 10.000 Klone wurden unter Verwendung einer pH-Indikator-Untersuchung durchmustert, wie oben beschrieben:

1. Keimkulturplatten: Platten, die 100 μl/Vertiefung LBamp enthielten, wurden mit Einzelkolonien/Vertiefung geimpft und 24 Stunden lang bei 30°C, 250 U/min, inkubiert.
2. Hauptkulturplatten: Zellen von den Keimkulturplatten wurden mit einem Replikator mit 96 Nadeln auf Platten überführt, die 200 μl LBamp + 0,2% Rhamnose enthielten. Die Platten wurden 24 Stunden lang bei 30°C, 250 U/min inkubiert.
3. Untersuchung: Unter Verwendung eines Pipettierroboters wurde die Kultur jeder Vertiefung mittels Auf- und Abpipettierens (3×) gemischt und auf zwei frische Platten überführt (jeweils 75 μl). Die beiden Platten sind mit 100 μl/Vertiefung frisch produzierter Substratlösung (80 mM D-MTEH bzw. L-MTEH in 0,05 g/l Kresolrot pH 8,6) gefüllt. Die Extinktion bei 580 nm wird sofort nachdem das Substrat der Platte zugegeben wurde und nach 3 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur gemessen. Die Aktivität wurde wie folgt berechnet: Aktivität = (A580(0h) – A580(3h))/((A580(0h) – 0,8))(Anm.: 0,8 ist die Absorption ohne Zellen)

Für Durchmusterungszwecke wird das Verhältnis der Aktivitäten für die D- und L-Enantiomere als ein Indikator für geänderte Enantioselektivität genommen.
Da das Verhältnis der Aktivitäten für verschiedene Enantiomere in den Durchmusterungsprüfungen nur ein erster Anhaltspunkt für die Enantioselektivität ist, wurden die identifizierten Mutanten mittels Chiral-HPLC unter Verwendung des racemischen Substrats wie folgt bestätigt: 2 ml Übernachtkulturen wurden zu 2 ml 80 mM DL-MTEH in 0,1 M Tris pH 8,5 gegeben und bei 37°C inkubiert. Nach 1 h bzw. nach 2 h wurde das Reaktionsgemisch 2 Minuten lang zentrifugiert, 14.000 U/min. 20 μl des Überstandes wurden auf die HPLC-Säule gegeben und die verschiedenen Fraktionen eluierten.
Etwa 2% der Population zeigten eine beträchtlich größere (> 50%) Aktivität im Vergleich zu dem Wildtyp DSM 9771. Obwohl eine beträchtliche Zahl dieser Klone, bedingt durch eine gewöhnliche Variation des Expressionsgrades, in einer Population falsch positiv sein könnte, waren etwa 50% erneut gemusterter Klone tatsächlich Mutanten mit größerer Aktivität. Die große Zahl weist darauf hin, daß Hydantoinase ein großes Evolutionspotential aufweist (seine Aktivität und Enantioselektivität können daher verbessert werden). Dies läßt sich begründen, da ein großer Km-Wert (etwa 15 mM), eine ziemlich geringe spezifische Aktivität (etwa 12 U/mg) und ein niedriger Expressionsgrad (< 10% vom Gesamtprotein) Raum für Verbesserungen dieses Enzyms lassen.
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der geprüften Mutanten. Mutant 1CG7 zeigt einen drastischen Anstieg an (D)-Selektivität. Im Vergleich zu dem Wildtyp ist der enantiomere Überschuß des Produktes um das 4-fache erhöht. Die Enantioselektivität von Klon 11DH7 und 19AG11 wurde in die entgegengesetzte Richtung geändert, da beide Mutanten völlig unselektiv sind. Der Aktivitätsmutant 1BF7 weist die gleiche Enantioselektivität wie der Wildtyp auf.
TABELLE 3
Alle Mutanten wurden sequenziert und die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen festgestellt, wie in Tabelle 4 angegeben.
TABELLE 4
Eine zweite Runde der Zufallsmutagenese wurde unter Verwendung des Mutanten 11DH7 der ersten Generation als Vorläufer durchgeführt.
Zwei verschiedene Bibliotheken mit verschiedenen Fehlerquoten (20% und 50% inaktive Klone) wurden produziert und 10.000 Klone jeder Bibliothek unter Verwendung des oben beschriebenen pH-Indikatorverfahrens gemustert. Keiner der gemusterten Klone zeigte signifikant höhere L-Selektivität, jedoch wurden Mutanten mit verbesserter Aktivität und höherer D-Selektivität festgestellt. Es wurde festgestellt, daß ein Mutant (22CG2), der sich von seinem Vorläufer durch nur eine Aminosäure unterschied (V180A), im Vergleich zum Vorläufer 11DH7 4mal aktiver war.
Das Sequenzieren der Mutanten der ersten Generation 11DH7 und 19AG11 enthüllte, daß eine einzige Mutation (I95L) für ihre verringerte D-Selektivität verantwortlich ist. Das Einführen aller 20 verschiedenen Aminosäuren in die Aminosäureposition 95 von Mutant 22CG2 durch Sättigungsmutagenese und das Durchmustern von etwa 400 Klonen enthüllte einen neuen Mutanten (Q2H4) mit im Vergleich zu seinem Vorläufer 22CG2 signifikant verbesserter L-Selektivität (ee_L = 20%) und 1,5-fach verbesserter Aktivität. Die Nucleotid- und die Aminosäuresequenz für 22CG2 sind in SEQ. ID. NO. 11 bzw. 12 angegeben. Die Nukleotid- und die Aminosäuresequenz für Q2H4 sind in SEQ. ID. NO. 13 bzw. 14 angegeben.
Außer den Verbesserungen, die durch die Mutanten bereitgestellt sind, die oben beschrieben sind, konnte durch Zugabe von 1 mM Mangan zu dem Wachstumsmedium und zu der Substratlösung die Aktivität des Ganzzellkatalysators um einen Faktor 10 erhöht werden. Unter diesen Bedingungen wurde die Aktivität von Mutant 22CG2 zu etwa 380 U/gCDW bestimmt, was im Vergleich zur Aktivität, die für Arthrobacter sp. DMS 9771 angegeben ist, eine 50-fache Vergrößerung der Aktivität ist.
Alle idenfizierten erfindungsgemäßen modifizierten Enzyme weisen eine Aktivität und/oder Enantioselektivität auf, die besser als diejenigen der unmodifizierten DSM-9771-Hydantoinase ist. Der Mutant Q2H4 zeigte, wenn unter Standardbedingungen mittels HPLC geprüft, umgekehrte Enantioselektivität für die Hydrolyse von D,L-MTEH. Q2H4 erzeugte N-Carbamoyl-L-methionin mit einem enantiomeren Überschuß (ee) von 20% bei etwa 30%iger Umwandlung. Außerdem war der Mutant Q2H4 etwa 1,5mal aktiver als sein Vörgänger 22CG2.
Beispiel 2
In einem weiteren Beispiel wurde L-Methionin mit einem rekombinanten Ganzzellkatalysator produziert. Rekombinante Ganzzellkatalysatoren wurden durch Co-Exprimieren der entwickelten oder der Wildtyp-Hydantoinase mit einer Hydantoinracemase und einer L-Carbamoylase in E. coli wie folgt hergestellt:
Stämme und Expressionsvektoren: Die L-Carbamoylase- und Hydantoinase-Expressionsvektoren pOM17 und pOM18 wurden mittels PCR-Amplifizierung des hyuC- bzw. hyuH-Gens von Arthrobacter sp. DSM 9771 unter Verwendung des folgenden Primers konstruiert: zur hyuC-Amplifizierung: 5'-AGGCGACATATGACCCTGCAGAAAGCGCAA-3' (SEQ. ID. NO. 17), 5'-ATGGGATCCCCGGTCAAGTGCCTTCATTAC-3' (SEQ. ID. NO. 18); zur hyuH-Amplifizierung: 5'-AGAACATATGTTTGACGTAATAGTTAAGAA-3' (SEQ. ID. NO. 15), 5'-AAAAGGATCCTCACTTCGACGCCTCGTA-3' (SEQ. ID. NO. 16). Die amplifizierten Fragmente wurden mit den Restriktionsenzymen Ndel und BamHI gespalten und unter Verwendung derselben Restriktionsenzyme dem rha-BAD-Promotor nachgeordnet (Rhamnose-Promotor) in den Vektor pJOE2702 eingeführt (Volff, J.-N., Eichenseer, C., Viell, P., Piendl, W. & Altenbuchner, J. (1996) Nucleotide sequence and role in DNA amplification of the direct repeats composing the amplificable element AUDI of Streptomyces lividans 66. Mol. Microbiol. 21, 1037–1047). Das Co-Expressionsplasmid pOM20, umfassend das L-Carbamoylase- und das Hydantoinase-Gen, beide separat unter Steuerung eines Rhamnose-Promotors, wurde vom Plasmid pOM17 und pOM18 abgeleitet. pOM17 wurde von SaII verdaut und zur Bildung stumpfer Enden mit dem Klenow-Fragment behandelt. pOM18 wurde mittels BamHI verdaut und ebenfalls zur Bildung stumpfer Enden mit dem Klenow-Fragment behandelt. Beide Fragmente wurden anschließend mit HindII verdaut. Das 1521-kb-Fragment, umfassend das Carbamoylase-Gen und den Rhamnose-Promotor, abgeleitet von pOM17, wurden mit dem 5650-kb-Fragment des verdauten pOM18 verbunden, um pOM20 zu erhalten. Mutationen der L-selektiven Hydantoinase wurden in pOM20 unter Verwendung der Restriktionsenzyme RsrII und KasI eingeführt, was pOM22 ergab. Der Racemase-Expressionsvektor pOM21 wurde von pACYC184 abgeleitet (Rose, R. E. The nucleotide sequence of pACYC184. Nucleic Acids Res. 16, 355 (1988)) und trägt einen Chloramphenicol-Selektionsmarker und das Racemase-Gen hyuR von Arthrobacter sp. DSM 3747 unter Steuerung des Rhamnose-Promotors. Alle Plasmide wurden routinemäßig in E. coli JM109 transformiert (Yanisch-Perron, C., Viera, J. & Messing, J. (1984) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13 mp18 and pUC vectors, Gene 33, 103–109). Der Hydantoin-Umwandlungsweg wurde in E. coli JM109 durch Transformation von pOM20 bzw. pOM22 in E. coli JM109 (pOM21) installiert. Die Zellen wurden entweder in LB-Flüssigmedium oder auf LB-Agar-Platten gezüchtet (Luria, S. E., Adams, J. N. & Ting, R. C. (1960) Transduction of lactose utilizing ability among strains of Escherichia coli and Shigella dysenteriae and properties of phage particles. Virology 12, 348–390), beide ergänzt mit den jeweiligen Antibiotika für das Wachstums- und Expressionsmedium (100 μg/ml Ampicillin, 50 μg/ml Chloramphenicol) und Zugabe von 2 mg/ml Rhamnose für das Expressionsmedium.
Error-prone-PCR: Die Zufallsmutagenese des Hydantoinase-Gens wurde in einem 100-μl-Reaktionsgemisch durchgeführt, das 0,25 ng Plasmid-DNA als Vorlage, Boehringer-PCR-Puffer (10 mM Tris, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, pH 8,3), 200 μM dATP, 200 μM dTTP, 200 μM dGTP, 200 μM dCTP, 50 pmol jedes Primers und 2,5 U Taq-Polymerase (Boehringer) enthielt. Nach 30 Zyklen wurde das 1667-Amplifizierungsprodukt unter Verwendung des QiaexII-Gel-Extraktionskits (Qiagen, Valencia, CA) aus Gel extrahiert und in Vektor pJOE2702 unter Verwendung der EcoRI- und HindIII-Restriktionsorte subkloniert. Die Religationshäufigkeit von mit alkalischer Phosphatase behandeltem Vektor betrug weniger als 1%.
Sättigungsmutagenese: Zur Randomisierung des Codons für die Aminosäureposition 95 wurde die Vorschrift QuickChange^TM (Stratagene, La Jolla, CA) verwendet. Etwa 10 ng Plasmid von Klon 22CG2 wurden mittels PCR unter Verwendung zweier komplementärer Oligonucleotide 5'-CATCGAGATGCCGNNNACCTTCCCGCCCAC-3', 5-GTGGGCGGGAAGGTNNNCGGCATCTCGATG-3') amplifiziert. Nach der PCR-Amplifizierung wurde das Reaktionsgemisch 2 Stunden lang mit 20 U des Restriktionsenzyms Dpnl behandelt. Die Transformation von 10 μl Dpnl-verdauter Reaktionsmischung in kompetente Zellen ergab eine Bibliothek von mehr als 2.000 Mutanten, von denen etwa 400 durchmustert wurden.
Herstellung der Bibliothek und Durchmusterung: Einzelkolonien von transformierten E. coli wurden unter Verwendung des Robotersystems Qbot (Genetix, Dorset, UK) auf Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen (Hauptplatte) überführt. Nach 20stündigem Wachstum bei 37°C wurden die Platten bei –80°C aufbewahrt. Für das anschließende Durchmustern wurden die Platten aufgetaut und in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen repliziert, die pro Vertiefung 200 μl Induktormedium enthielten. Eine Biomek-1000-Pipettierstation (Beckman, Fullerton, CA) wurde verwendet, um die Platten, die 24 Stunden bei 30°C inkubiert wurden, auf zwei frische Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen aufzuteilen, wobei eine 100 μl 80 mM L-MTEH enthielt und die andere 100 μl 80 mM D-MTEH in 50 mg/l Kresolrotlösung, eingestellt auf pH 8,5, enthielt. Die anfängliche Extinktion bei 580 nm und diejenige nach 3 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurden unter Verwendung eines Plattenlesegeräts THERMOmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) gemessen. Die Aktivität wurde aus der Differenz zwischen der anfänglichen und der Extinktion nach 3 Stunden Inkubation, geteilt durch die Zelldichte jeder Vertiefung, berechnet. Für die Sättigungsmutagenesebibliothek wurde die Inkubationszeit auf 1,5 Stunden verringert. Das Verhältnis der Aktivität gegenüber dem L- und dem D-Enantiomer wurde als ein erster Indikator für die Enantioselektivität genommen. Die identifizierten Klone wurden dann unter Verwendung des racemischen Substrats unter Bedingungen, die unten beschrieben sind, geprüft.
Kennzeichnung der Aktivität und der Enantioselektivität: Plasmid eines Mutanten, der sich bei der Durchmusterung als positiv herausgestellt hatte, wurde sequenziert und in E. coli retransformiert. Eine Kultur von retransformierten E. coli wurde während 16 bis 18 Stunden (bis OD10) in Induktionsmedium, ergänzt mit 1 mM MnCl₂, gezüchtet. 2 ml Substratlösung, bestehend aus 80 mM D,L-MTEH, 0,1 M Tris pH 8,5, 1 mM MnCl₂ (vorinkubiert bei 37°C), wurden zu 2 ml Zellkultur (OD600~7) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unverzüglich bei 37°C in einem Wasserbad inkubiert. Nach verschiedenen Zeiträumen (wie im Text spezifiziert) wurden 1-ml-Proben genommen und 5 Minuten lang bei 14.000 U/min zentrifugiert. 20 μl des Überstandes wurden mittels Chiral-HPLC unter Verwendung einer Säule, hergestellt von der Degussa-Huels AG, analysiert. Die Aktivität wurde aus der Menge an produziertem N-Carbamoyl-D,L-methionin berechnet und als U/ml Zellkultur von U/mg Zelltrockengewicht (CDW) ausgedrückt, wobei 1 U die Menge Ganzzellkatalysator ist, um 1 μmol N-Carbamoyl-D,L-methionin in einer Minute unter den angegebenen Reaktionsbedingungen zu produzieren. Die Enantioselektivität der Hydantoinase und ihrer Mutanten wurde verglichen, indem der Prozentsatz von ee_D ((D – L)/(D + L)) bzw. ee_L ((L – D)/(L + D)) für das Produkt bei verschiedenen Umwandlungsgraden berechnet wurden. Eine herkömmliche Bestimmung von E (Enantionmerenverhältnis) aus ee-Werten und dem Umwandlungsgrad, wie beschrieben von Chen et al. (Chen, C. S., Fujimoto, Y., Girdaukas, G. & Sih, C. J., (1982) Quantitative analysis of biochemical kinetic resolutions of enantiomers. J. Am. Chem. Soc. 104, 7294–7299) ist wegen der schnellen Racemisierung des Substrats nicht möglich.
Umwandlung von D,L-MTEH in L-Met.: 8 mg Zelltrockenmasse von E. coli JM109 (pOM20 und pOM21) und E. coli JM109 (pOM22 und pOM21) wurden zu 4 ml 100 mM D,L-MTEH in 0,1 M Tris pH 7,8, ergänzt mit 1 mM MnCl₂, gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 37°C inkubiert. Proben wurden nach den angegebenen Zeiträumen mittels HPLC auf MTEH, D,L-C-Met und D,L-Met analysiert, wie beschrieben in Völkel, D. & Wagner, F., (1995), Reaction mechanism for the conversion of 5-monosubstituted hydantoins to enantiomerically pure L- amino acids. Ann. NY Acad. Sci. 750, 1–9. Die optische Reinheit der Verbindungen wurde mittels Chiral-HPLC analysiert, wie oben beschrieben.
Die Umwandlung von D,L-MTEH in L-Met ist bei dem Katalysator mit der entwickelten Hydantoinase bedeutend verbessert. Nach drei Stunden waren aus 100 mM D,L-MTEH etwa 60 mM L-Met produziert, während der Ganzzellkatalysator auf dem Wildtypweg nur 10 mM der Aminosäure produzierte. Die Konzentration der Zwischenverbindung D-C-Met war um einen Faktor von 4 verringert, und die Produktivität für die Produktion von L-Aminosäure war während der ersten Stunde der Reaktion 8-fach vergrößert.
Beispiel 3
Das folgende Beispiel zeigt, daß die Produktion von L-Methionin mit einer entwickelten Hydantoinase von Mutant 22CG2, die verbesserte Aktivität aufweist und nicht enantioselektiv ist (0% enantiomerer Überschuß bei 42%iger Umwandlung, siehe Tabelle 3), bedeutend verbessert ist. Mutationen der entwickelten Hydantoinase von Mutant 22CG2 wurden, wie vorher beschrieben, unter Verwendung der Restriktionsenzyme RsrII und KasI in pOM20 eingeführt, was pOM23 ergab. Dieser Co-Expressionsvektor wurde in E. coli JM109 (pOM21) transformiert. Die resultierenden Ganzzellkatalysatoren E. coli JM109 (pOM21/pOM23) und E. coli JM109 (pOM21/pOM20) wurden zur Umwandlung von D,L-MTEH in Methionin verwendet. 125 mg Zelltrockenmasse der jeweiligen Zellen wurden zu 5 ml Substratlösung (100 mM D,L-MTEH in 0,9% NaCl, 1 mM MnCl₂, pH 7,8) gegeben und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. 6 zeigt die Produktion von Methionin (Met) und N-Carbamoyl-methionin (C-Met) aus D,L-MTEH für beide Katalysatoren. Der Ganzzellkatalysator mit der verbesserten Hydantoinase vom Klon 22CG2 produzierte etwa 65 mM Methionin innerhalb einer Stunde, wohingegen der Ganzzellkatalysator mit der Wildtyp-Hydantoinase während derselben Reaktionsdauer nur 8 mM erzeugte. Dies zeigt, daß eine entwickelte Hydantoinase ohne bedeutende Enantioselektivität, jedoch mit verbesserter Aktivität, zu einer bedeutenden Verbesserung für die Produktion von Methionin führt.
Nachdem somit beispielhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben wurden, sollte der Fachmann beachten, daß die enthaltenen Offenbarungen nur beispielhaft sind und daß innerhalb des Umfangs der vorliegenden Ansprüche verschiedene andere Alternativen, Adaptationen und Modifikationen geschaffen werden können.
LITERATURVERZEICHNIS

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Modifizierte Hydantoinase mit geänderter Enantioselektivität und/oder verbesserter enzymatischer Aktivität, bezogen auf unmodifizierte Hydantoinase der SEQ. ID. NO: 2, wobei die unmodifizierte Hydantoinase durch eine Aminosäuresubstitution an einer oder mehreren Aminosäurepositionen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäurepositionsnummern 95, 154, 180, 251 und 295, modifiziert wurde.
Modifizierte Hydantoinase nach Anspruch 1, wobei die eine oder mehreren Aminosäuresubstitutionen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus I95F, V154A, V180A und V295A.
Modifizierte Hydantoinase nach Anspruch 1, wobei die unmodifizierte Hydantoinase durch die Aminosäuresubstitutionen I95F, V180A und Q251R modifiziert wird.
Modifizierte Hydantoinase nach Anspruch 1, wobei die unmodifizierte Hydantoinase durch die Aminosäuresubstitutionen I95L und Q251R modifiziert wird.
Modifizierte Hydantoinase nach Anspruch 1, wobei die unmodifizierte Hydantoinase durch die Aminosäuresubstitution V154A modifiziert wird.
Modifizierte Hydantoinase nach Anspruch 1, wobei die unmodifizierte Hydantoinase durch die Aminosäuresubstitution V295A modifiziert wird.
Nukleinsäureabschnitt, umfassend einen Bereich, der eine modifizierte Hydantoinase mit geänderter Enantioselektivität und/oder verbesserter enzymatischer Aktivität, bezogen auf unmodifizierte Hydantoinase der SEQ. ID. NO: 2, wobei die unmodifizierte Hydantoinase durch eine Aminosäuresubstitution an einer oder mehreren Aminosäurepositionen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäurepositionsnummern 95, 154, 180, 251 und 295, modifiziert wurde, codiert.
Nukleinsäureabschnitt nach Anspruch 7, wobei die eine oder mehreren Aminosäuresubstitutionen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus I95F, V154A, V180A und V295A.
Expressionsvektor, enthaltend einen Nukleinsäureabschnitt nach Anspruch 7.
Expressionsvektor, enthaltend einen Nukleinsäureabschnitt nach Anspruch 8.
Wirtszelle, umfassend einen Nukleinsäureabschnitt nach Anspruch 7.
Wirtszelle, umfassend einen Nukleinsäureabschnitt nach Anspruch 8.
Verfahren zur Produktion einer modifizierten Hydantoinase, bei dem man: zur Produktion von modifizierter Hydantoinase einen die modifizierte Hydantoinase codierenden Nukleinsäureabschnitt nach Anspruch 7 in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert und die durch den Expressionsschritt produzierte modifizierte Hydantoinase gewinnt.
Verfahren zur Produktion einer modifizierten Hydantoinase, bei dem man: zur Produktion von modifizierter Hydantoinase einen die modifizierte Hydantoinase codierenden Nukleinsäureabschnitt nach Anspruch 8 in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert und die durch den Expressionsschritt produzierte modifizierte Hydantoinase gewinnt.
Verfahren zur Produktion von Aminosäuren unter Verwendung einer modifizierten Hydantoinase nach Anspruch 1.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß eine modifizierte Hydantoinase nach Anspruch 2 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß zusammen mit der Hydantoinase eine Carbamoylase sowie eine Hydantoinracemase eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß freie oder immobilisierte Hydantoinase eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß Alanin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Valin oder tert.-Leucin oder Neopentylglycin produziert wird.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in einem Enzym-Membran-Reaktor durchgeführt wird.
Ganzzellkatalysator, umfassend ein für eine Hydantoinase codierendes Gen, wobei man annimmt, daß es sich bei der Hydantoinase um eine Hydantoinase nach Anspruch 1 handelt.
Ganzzellkatalysator nach Anspruch 21, der weiterhin ein für eine Carbamoylase codierendes Gen umfaßt.
Ganzzellkatalysator nach Anspruch 22, der weiterhin ein für eine Racemase codierendes Gen umfaßt.
Ganzzellkatalysator nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß als ganze Zelle ein Bakterium eingesetzt wird.
Ganzzellkatalysator nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß als ganze Zelle Escherichia coli eingesetzt wird.
Verfahren zur Produktion von Aminosäuren unter Verwendung von Ganzzellkatalysatoren nach Anspruch 21.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß Methionin, Valin, Threonin, Lysin oder tert.-Leucin produziert wird.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in einem Enzym-Membran-Reaktor durchgeführt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Ganzzellkatalysators nach Anspruch 21, wobei Primer der SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 18, SEQ. ID. NO: 15 und/oder SEQ. ID. NO: 16 eingesetzt werden.
Verfahren zur Produktion von alpha-Aminosäuren unter Verwendung eines eine verbesserte Hydantoinase nach Anspruch 1 enthaltenden Ganzzellkatalysators, wobei die durch die Wirkung der Hydantoinase produzierte N-Carbamoyl-D-aminosäure oder N-Carbamoyl-L-Aminosäure weiter chemisch oder enzymatisch unter Erhalt der Aminosäure hydrolysiert wird und wobei die Racemisierung des Hydantoins entweder chemisch oder enzymatisch erreicht wird.