DE69731113T2

DE69731113T2 - Thermostabilen phosphatasen

Info

Publication number: DE69731113T2
Application number: DE69731113T
Authority: DE
Inventors: J. Eric MATHUR; Edd Lee; Edward Bylina
Original assignee: Diversa Corp
Current assignee: BASF Enzymes LLC
Priority date: 1996-06-19
Filing date: 1997-06-19
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2017-06-20
Also published as: AU721570B2; EP0949930B1; JP2001510983A; WO1997048416A1; EP0949930A4; EP0949930A1; AU3641697A; CA2257863A1; ATE278416T1; DE69731113D1

Description

Diese Erfindung betrifft jüngst identifizierte Polynucleotide, durch solche Polynucleotide codierte Polypeptide, die Verwendung solcher Polynucleotide und Polypeptide sowie die Herstellung und Isolierung solcher Polynucleotide und Polypeptide. Genauer sind die erfindungsgemäßen Polynucleotide und Polypeptide als thermostabile alkalische Phosphatasen aus Thermococcus identifiziert worden.
Hintergrund der Erfindung
Phosphatasen sind eine Gruppe von Enzymen, die Phosphatgruppen aus Organophosphatesterverbindungen entfernen. Es gibt zahlreiche Phosphatasen, einschließlich alkalische Phosphatasen, Phosphodiesterasen und Phytasen.
Alkalische Phosphatasen sind weit verbreitete Enzyme und setzen sich aus einer Gruppe von Enzymen zusammen, die organische Phosphatesterbindungen bei einem alkalischen pH-Wert hydrolysieren.
Phosphodiesterasen sind in der Lage, Nucleinsäuren durch Hydrolyse der Phosphodiesterbrücken von DNA und RNA zu hydrolysieren. Die Klassifizierung von Phosphodiesterasen hängt davon ab, welche Seite der Phosphodiesterbrücke angegriffen wird. Die 3'-Enzyme hydrolysieren spezifisch die Esterbindung zwischen dem 3'-Kohlenstoffatom und der Phosphorgruppe, während die 5'-Enzyme die Esterbindung zwischen der Phosphorgruppe und dem 5'-Kohlenstoffatom der Phosphodiesterbrücke hydrolysieren. Das bekannteste Enzym der Klasse der 3'-Enzyme ist eine Phosphodiesterase aus dem Gift der Klapperschlange oder aus einer Kreuzotter („rustle's viper"), die alle 3'-Bindungen in entweder RNA oder DNA hydrolysiert, wodurch nahezu alle Nucleotideinheiten als Nucleotid-5'-phosphate freigesetzt werden. Dieses Enzym benötigt eine freie 3'-Hydroxylgruppe an dem terminalen Nucleotidrest und schreitet von diesem Ende der Polynucleotidkette schrittweise fort. Dieses Enzym und alle anderen Nucleasen, die nur an den Enden der Polynucleotidketten angreifen, werden als Exonucleasen bezeichnet. Die 5'-Enzyme werden durch eine Phosphodiesterase aus der Rindermilz repräsentiert, welche auch eine Exonuclease ist, die alle 5'-Bindungen von sowohl DNA als auch RNA hydrolysiert und somit nur Nucleosid-3'-phosphate freisetzt. Es beginnt seinen Angriff an dem Ende der Kette, das eine freie 3'-Hydroxylgruppe aufweist.
Phytasen sind Enzyme, die vor kurzem in den Handel gebracht worden sind. Das Phytaseenzym entfernt das Phosphat aus Phytinsäure (Inosithexaphosporsäure), einer Verbindung, die in Pflanzen wie Mais, Weizen und Reis vorkommt. Das Enzym findet kommerzielle Verwendung bei der Behandlung von Tierfutter, um das Inosit der Phytinsäure für die tierische Ernährung verfügbar zu machen. Aspergillus ficuum und Weizen sind Quellen für Phytasen (Business Communications Co., Inc., 25 Van Zant Street, Norwalk, CT 06855).
Phytase wird verwendet, um die Verwertung von natürlichem Phosphor in Tierfutter zu verbessern. Die Verwendung von Phytase als ein Futterzusatz ermöglicht, daß das Tier einen größeren Grad des natürlichen Mineralgehalts seines Getreidefutters metabolisiert, wodurch die Erfordernis für synthetische Phosphorzusätze verringert oder gänzlich beseitigt wird. Wichtiger als die verminderte Notwendigkeit für Phosphorzusätze ist die entsprechende Reduktion von Phosphor in Ausscheidungsprodukten von Schweinen und Hühnern. Viele Europäische Länder schränken die Düngermenge, die pro Morgen ausgebracht werden kann, wegen Besorgnissen im Hinblick auf eine Verunreinigung des Grundwassers durch Phosphor stark ein. Dies ist in Nordeuropa besonders wichtig und wird schließlich auch im Rest des Europäischen Kontinents und in den Vereinigten Staaten vorgeschrieben werden (Auszüge aus Business Trend Analysts, Inc., Januar 1994, Frost und Sullivan Report, 1995, und USDA-on-line-Information).
Die alkalische Phosphatase hydrolysiert Monophosphatester, wobei ein organisches Phosphat und die entsprechende Alkoholverbindung freigesetzt werden. Sie ist im Hinblick auf die Alkoholgruppe unspezifisch, und dieses Merkmal erklärt die vielen Anwendungen dieses Enzyms. Das Enzym weist ein pH-Optimum zwischen 9 und 10 auf, jedoch kann es auch bei einem neutralen pH-Wert wirksam sein (Studie der Enzymindustrie, durchgeführt durch Business Communications Company, Inc., 25 Van Zant Street, Norwalk, Connecticut 06855, 1995).
Thermostabile alkalische Phosphatasen werden nicht irreversibel inaktiviert, selbst wenn sie auf 60°C oder mehr für kurze Zeiträume erhitzt werden, wie zum Beispiel in der Praxis bei der Hydrolyse von Monophosphatestern.
Alkalische Phosphatasen können aus zahlreichen thermophilen Organismen wie Ammonifex degensii, Aquifex pyrophilus, Archaeoglobus lithotrophicus, Methanococcus igneus, Pyrolobus (ein Crenarchaeota-Bakterium), Pyrococcus und Termococcus, die vorwiegend Eubakterien und Euryarchaeota-Bakterien sind, erhalten werden. Viele dieser Organismen wachsen bei Temperaturen bis etwa 103°C und können unterhalb von 70°C nicht wachsen. Diese anaeroben Bakterien werden aus extremen Umgebungen isoliert. Zum Beispiel wurde Termococcus CL-2 aus einem Wurm isoliert, welcher auf der Sulfitstruktur eines "schwarzen Rauchers" vorkommt.
Das Interesse an alkalischen Phosphatasen aus thermophilen Mikroben hat in letzter Zeit wegen ihrer Bedeutung für kommerzielle Anwendungen zugenommen. Zwei Quellen für alkalische Phosphatasen dominieren und konkurrieren im Handel: (i) eine tierische aus der Darmschleimhaut von Rindern und Kälbern, und (ii) eine bakterielle aus E. coli. Aufgrund der hohen Wechselzahl der Phosphatase aus Kälberdarm wird sie oft als Marker für viele Enzymimmuntests ausgewählt. Die Nützlichkeit der alkalischen Kalbsphosphatase wird jedoch durch die ihr eigene geringe Thermostabilität eingeschränkt, die während der chemischen Darstellung des Enzyms – Antikörperkonjugate – noch weiter beeinträchtigt wird. Eine bakterielle alkalische Phosphatase stellt eine Alternative zu der alkalischen Kalbsphosphatase dar, da die bakterielle alkalische Phosphatase eine extreme Thermotoleranz bei Temperaturen um 95°C zeigt (Tomazic-Allen S. J., Recombinant Bacterial Phosphatase as an Immunodiagnostic Enzyme, Annals D. Biology Clinique, 49 (5) (1991), 287–90), jedoch weist das Enzym eine sehr niedrige Wechselzahl auf.
Es besteht ein Bedarf an neuen Phosphataseenzymen mit einer erhöhten Thermostabilität. Dies schließt einen Bedarf an thermostabilen alkalischen Phosphatasen ein, deren erhöhte Thermostabilität bei Enzymmarkierungsverfahren und bestimmten DNA-Rekombinationstechniken wie bei der Dephosphorylierung von Vektor-DNA vor der Insertion-DNA-Ligierung vorteilhaft ist. Rekombinante Phosphataseenzyme sorgen dafür, daß die Proteine in einer Form vorliegen, welche die effiziente Herstellung eines reinen Enzyms ermöglicht, das in einer Vielzahl von Anwendungen, wie hierin beschrieben, verwendet werden kann. Demgemäß ist eine Charakterisierung, Aminosäuresequenzierung, DNA-Sequenzierung und heterologe Expression von thermostabilen Phosphataseenzymen erforderlich. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Anforderungen durch die Bereitstellung von DNA- und Aminosäuresequenz-Informationen und eines Expressions- und Reinigungsprotokolls für thermostabile Phosphatasen, die aus mehreren Organismen stammen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt thermostabile Phosphatasen aus Thermococcus bereit. Gemäß einem Aspekt der vorliegende Erfindung werden neue Enzyme sowie aktive Fragmente, Analoge und Derivate davon bereitgestellt.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt, welche die erfindungsgemäßen Enzyme codieren, einschließlich mRNAs, cDNAs, genomische DNAs sowie aktive Analoge und Fragmente solcher Nucleinsäuren.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt, die reife Enzyme codieren, welche durch die DNA exprimiert werden, die in dem Plasmid-DNA-Vektor enthalten ist, welcher bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 97536 am 10. Mai 1996 hinterlegt wurde.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung solcher Polypeptide durch Rekombinationstechniken bereitgestellt, umfassend das Züchten von rekombinanten prokaryontischen und/oder eukaryontischen Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße Nucleinsäuresequenz enthalten, unter Bedingungen, welche die Expression der Enzyme begünstigen, und anschließend die Gewinnung der Enzyme.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verwendung von solchen Enzymen zur Hydrolyse von Monophosphatesterbindungen wie als ein Enzymmarker in Immuntests, zur Entfernung einer 5'-Phosphatgruppe vor einer Endgruppenmarkierung und zur Dephosphorylierung von Vektoren vor der Insertions-Ligierung bereitgestellt.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden auch Nucleinsäuresonden bereitgestellt, umfassend Nucleinsäuremoleküle mit einer ausreichenden Länge, um mit einer erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenz spezifisch zu hybridisieren.
Gemäß einem noch anderen Aspekt der vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zur Verwendung von solchen Enzymen oder Polynucleotiden, die solche Enzyme codieren, für in vitro-Zwecke in Verbindung mit wissenschaftlichen Untersuchungen bereitgestellt; zum Beispiel zur Erzeugung von Sonden zur Identifizierung von ähnlichen Sequenzen, die ähnliche Enzyme aus anderen Organismen codieren könnten, unter Verwendung von bestimmten Regionen, d. h. konservierten Sequenzregionen der Nucleotidsequenz.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind für Fachleute aus den Lehren hierin ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die folgenden Zeichnungen zeigen DNA-Sequenzen, die in der nachstehenden Beschreibung veranschaulicht werden.
1 ist eine Darstellung der erfindungsgemäßen vollständigen DNA-Sequenz und der entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenz von Ammonifex degensii KC4. Die Sequenzierung erfolgte unter Verwendung eines automatischen 378-DNA-Sequenzanalysengeräts für alle erfindungsgemäßen Sequenzen (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien).
2 ist eine Darstellung der vollständigen DNA-Sequenz und der entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenz von Methanococcus igneus Kol5.
3 ist eine Darstellung der vollständigen DNA-Sequenz und der entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenz von Thermococcus alcaliphilus AEDII12RA.
4 ist eine Darstellung der vollständigen DNA-Sequenz und der entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenz von Thermococcus celer.
5 ist eine Darstellung der vollständigen DNA-Sequenz und der entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenz von Thermococcus GU5L5.
6 ist eine Darstellung der vollständigen DNA-Sequenz und der entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenz von OC9a.
7 ist eine Darstellung der vollständigen DNA-Sequenz und der entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenz von M11TL.
8 ist eine Darstellung der vollständigen DNA-Sequenz und der entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenz von Thermococcus CL-2.
9 ist eine Darstellung der vollständigen DNA-Sequenz und der entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenz von Aquifex VF-5.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Um die Erfindung verständlicher zu machen, wird nachstehend eine Reihe von Begriffen definiert.
Der Begriff "isoliert" bedeutet, daß der natürliche Zustand eines Moleküls "durch die Hand des Menschen" verändert wurde; d. h., falls es in der Natur vorkommt, ist es verändert oder aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt worden oder beides. Zum Beispiel ist ein in der Natur vorkommendes Polynucleotid oder ein Polypeptid, das natürlicherweise in einem lebenden Tier vorhanden ist, in seinem natürlichen Zustand nicht "isoliert", aber dasselbe Polynucleotid oder Polypeptid, getrennt von den gleichzeitig vorhandenen Materialien seines natürlichen Zustands, ist gemäß dem hierin verwendeten Begriff "isoliert". Zum Beispiel bedeutet der Begriff isoliert im Hinblick auf Polynucleotide, daß sie von der Nucleinsäure und der Zelle, worin sie natürlicherweise vorkommen, getrennt sind.
Als Teil oder nach einer Isolierung können solche Polynucleotide mit anderen Polynucleotiden wie DNAs zum Beispiel zur Mutagenese, zur Bildung von Fusionsproteinen und zur Vermehrung oder Expression in einem Wirt verknüpft werden. Die isolierten Polynucleotide, allein oder verknüpft mit anderen Polynucleotiden wie Vektoren, können in Wirtszellen, in eine Kultur oder in ganze Organismen eingeschleust werden. Eingeschleust in Wirtszellen, in eine Kultur oder in ganze Organismen wären solche Polynucleotide gemäß dem wie hierin verwendeten Begriff noch isoliert, da sie nicht in ihrer in der Natur vorkommenden Form oder Umgebung vorliegen. In ähnlicher Weise können die Polynucleotide und Polypeptide in einer Zusammensetzung wie einer Mediumformulierung (Lösungen zur Einschleusung von Polynucleotiden oder Polypeptiden, zum Beispiel in Zellen oder Zusammensetzungen oder Lösungen für chemische oder enzymatische Reaktionen, die keine natürlich vorkommende Zusammensetzungen sind) vorliegen und darin isolierte Polynucleotide oder Polypeptide gemäß der Bedeutung des Begriffs, wie er hierin verwendet wird, bleiben.
Der Begriff "Ligierung" verweist auf den Prozeß der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei oder mehreren Polynucleotiden, die überwiegend doppelsträngige DNAs sind. Techniken für die Ligierung sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt, und Protokolle für die Ligierung sind in Laborstandardhandbüchern und Nachschlagewerken wie zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) beschrieben.
Der Begriff "Oligonucleotid", so wie hierin verwendet, ist definiert als ein Molekül, das aus zwei oder mehreren Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden, vorzugsweise mehr als drei und üblicherweise mehr als zehn, besteht. Die genaue Größe eines Oligonucleotids hängt von vielen Faktoren einschließlich der endgültigen Funktion oder Verwendung des Oligonucleotids ab. Oligonucleotide können durch irgendein geeignetes Verfahren hergestellt werden, einschließlich zum Beispiel durch die Clonierung und Restriktion geeigneter Sequenzen und die direkte chemische Synthese durch ein Verfahren wie das Phosphotriesterverfahren von Narang et al., Meth. Enzymol. 68 (1979), 90–99; das Phosphodiesterverfahren von Brown et al., Meth. Enzymol. 68 (1979), 109–151; das Diethylphosphoramiditverfahren von Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22 (1981), 1859–1862; das Triesterverfahren von Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103 (1981), 3185–3191; oder automatisierte Syntheseverfahren; und das Festphasenverfahren von US-Patent Nr. 4,458,066.
Der Begriff "Plasmide" wird hierin allgemein durch den Kleinbuchstaben p, dem Großbuchstaben und/oder Zahlen vorausgehen und/oder folgen, in Übereinstimmung mit üblichen Namensgebungskonventionen, die den Fachleuten vertraut sind, gekennzeichnet.
Die hierin offenbarten Plasmide sind entweder im Handel erhältlich, uneingeschränkt öffentlich zugänglich oder können aus erhältlichen Plasmiden durch die routinemäßige Anwendung von hinreichend bekannten, veröffentlichten Verfahren konstruiert werden. Viele Plasmide und andere Clonierungs- und Expressionsvektoren, die im Einklang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind hinreichend bekannt und ohne weiteres für Fachleute zugänglich. Außerdem können Fachleute ohne weiteres eine beliebige Anzahl von anderen Plasmiden konstruierten, die zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet sind. Die Eigenschaften, die Konstruktion und die Verwendung solcher Plasmide sowie anderer Vektoren in der vorliegenden Erfindung ist für Fachleute aus der vorliegenden Offenbarung ohne weiteres ersichtlich.
Der Begriff "Polynucleotid(e)" verweist allgemein auf ein beliebiges Polyribonucleotid oder Polydesoxyribonucleotid, das eine unmodifizierte RNA oder DNA oder eine modifizierte RNA oder DNA sein kann. Folglich verweist der Begriff Poly nucleotide, so wie hierin verwendet, zum Beispiel u. a. auf eine einzel- oder doppelsträngige DNA; eine DNA, die ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen darstellt; eine einzel- oder doppelsträngige RNA; und eine RNA, die ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen ist; sowie Hybridmoleküle, umfassend eine DNA und eine RNA, die einzelsträngig oder typischer doppelsträngig oder ein Gemisch von einzel- und doppelsträngigen Regionen sein kann.
Zusätzlich verweist der Begriff Polynucleotid, so wie hierin verwendet, auf dreifachsträngige Regionen, umfassend RNA oder DNA oder sowohl RNA als auch DNA. Die Stränge in solchen Regionen können von demselben Molekül oder von verschiedenen Molekülen stammen. Die Regionen können den gesamten Bereich eines oder mehrerer der Moleküle einschließen, aber schließen typischerweise nur eine Region aus einigen der Moleküle ein. Eines der Moleküle einer Dreifachhelixregion ist oft ein Oligonucleotid.
So wie hierin verwendet, schließt der Begriff Polynucleotid DNAs oder RNAs ein, wie vorstehend beschrieben, die eine oder mehrere modifizierte Basen enthalten. Folglich sind DNAs oder RNAs mit Gerüsten, die hinsichtlich der Stabilität oder aus anderen Gründen modifiziert wurden, "Polynucleotide" gemäß dem hierin verwendeten Begriff. Außerdem sind DNAs oder RNAs, umfassend ungewöhnliche Basen wie Inosin oder modifizierte Basen wie Tritium markierte Basen, um nur zwei Beispiele zu nennen, Polynucleotide gemäß dem wie hierin verwendeten Begriff.
Es ist erkennbar, daß eine große Vielzahl von Modifikationen in DNA und RNA eingeführt worden sind, die vielen nützlichen Zwecken dienen können, welche den Fachleuten bekannt sind. Der Begriff Polynucleotid, so wie hierin verwendet, umfaßt solche chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierten Formen von Polynucleotiden sowie die chemischen Formen von DNA und RNA, die für Viren und Zellen, einschließlich u. a. einfache und komplexe Zellen, charakteristisch sind.
Der Begriff "Primer", so wie hierin verwendet, verweist auf ein Oligonucleotid, ob natürlich oder synthetisch, das in der Lage ist, als eine Initiationsstelle für die Synthese wirksam zu sein, wenn es unter Bedingungen gebracht wird, bei denen eine Primerverlängerung initiiert wird oder möglich ist. Die Synthese eines Primerverlängerungsprodukts, das zu einem Nucleinsäurestrang komplementär ist, wird in Gegenwart von Nucleosidtriphosphaten und einer Polymerase in einem geeigneten Puffer bei einer geeigneten Temperatur initiiert.
Der Begriff "Primer" kann auf mehr als einen Primer verweisen, besonders in dem Fall, wo einige Unklarheiten bezüglich der Information im Hinblick auf ein Ende oder beide Enden der zu synthetisierenden Zielregion bestehen. Zum Beispiel, falls eine Nucleinsäuresequenz aus einer Proteinsequenz abgeleitet ist, ist ein "Primer", der erzeugt wurde, um eine Nucleinsäure zu synthetisieren, welche die Proteinsequenz codiert, eigentlich eine Auswahl von Primer-Oligonucleotiden, die Sequenzen enthalten, welche alle möglichen Codonvariationen basierend auf der Degeneration des genetischen Codes widergeben. Einer oder mehrere der Primer in dieser Auswahl sind zu dem Ende der Zielsequenz homolog. Ebenso, falls eine "konservierte" Region einen wesentlichen Polymorphismusgrad in einer Population zeigt, können Gemische von Primern hergestellt werden, die benachbarte Sequenzen amplifizieren.
Der Begriff "Restriktionsendonucleasen" und "Restriktionsenzyme" verweist auf bakterielle Enzyme, die eine doppelsträngige DNA an oder nahe einer spezifischen Nucleotidsequenz schneiden.
Der Begriff "Gen" verweist auf das DNA-Fragment, das an der Herstellung einer Polypeptidkette beteiligt ist. Der Begriff schließt Regionen ein, die der codierenden Region vorausgehen und folgen (Leader- und Trailersequenzen), sowie dazwischenliegende Sequenzen (Introns) zwischen einzelnen codierenden Segmenten (Exons).
Eine codierende Sequenz ist mit einer anderen codierenden Sequenz "funktionell verbunden", wenn eine RNA-Polymerase die zwei codierenden Sequenzen in eine einzige mRNA transkribiert, die dann in ein einzelnes Polypeptid translatiert wird, das Aminosäuren aus beiden codierenden Sequenzen aufweist. Die codierenden Sequenzen müssen nicht aufeinanderfolgen, so lange wie die exprimierten Sequenzen letztendlich prozessiert werden, um das gewünschte Protein herzustellen.
"Rekombinante" Enzyme verweist auf Enzyme, die durch DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden; d. h. die durch Zellen hergestellt werden, welche mit einem exogenen DNA-Konstrukt transformiert sind, welches das gewünschte Enzym codiert. "Synthetische" Enzyme sind solche Enzyme, die durch eine chemische Synthese hergestellt werden.
Eine DNA "codierende Sequenz" oder eine ein bestimmtes Enzym "codierende Nucleotidsequenz" ist eine DNA-Sequenz, die in ein Enzym transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gebracht wird.
Der Begriff "thermostabile Phosphatase" verweist auf ein Enzym, das gegen Hitze stabil und hitzebeständig ist und die Entfernung von Phosphatgruppen aus Organophosphatesterverbindungen katalysiert. Die Bezugnahme auf "thermostabile Phosphatasen" schließt alkalische Phosphatasen, Phosphodiesterasen und Phytasen ein.
Die erfindungsgemäßen Phosphataseenzyme können nicht irreversibel denaturiert (inaktiviert) werden, wenn sie den erhöhten Temperaturen für den Zeitraum, der notwendig ist, um die Hydrolyse einer Phosphatgruppe aus einer Organophosphatesterverbindung zu bewirken, ausgesetzt werden. Irreversible Denaturierung verweist für die Zwecke hierin auf den bleibenden und vollständigen Verlust einer enzymatischen Aktivität. Die Phosphataseenzyme werden durch das Aussetzen gegen Temperaturen in einem Bereich von etwa 60°C bis etwa 113° oder mehr nicht irreversibel denaturiert. Die außerordentliche Thermostabilität der Phosphataseenzyme stellt weitere Vorteile im Vergleich zu bereits charakterisierten thermostabilen Enzymen bereit. Vor der vorliegenden Erfindung ist die wirksame Hydrolyse von Phosphatgruppen bei Temperaturen um 100°C nicht nachgewiesen worden. Für diesen Zweck ist keine thermostabile Phosphatase beschrieben worden.
Die Beschreibung veranschaulicht auch isolierte Nucleinsäuren (Polynucleotide), welche die reifen Enzyme mit den abgeleiteten Aminosäuresequenzen der 1–9 (SEQ ID Nrn.: 28–36) codieren.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Polynucleotide bereitgestellt, welche die erfindungsgemäßen Enzyme codieren. Das hinterlegte Material ist ein Gemisch von genomischen Clonen, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein erfindungsgemäßes Enzym codiert. Jeder genomische Clon, umfassend die jeweilige DNA-Sequenz, ist in einen pBluescript-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA) inseriert worden. Die Hinterlegung ist bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 10. Mai 1996 unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 97536 erfolgt.
Die Hinterlegung(en) erfolgte(n) gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren. Die Stämme werden unwiderruflich und frei von Einschränkungen oder Bedingungen bei der Erteilung eines Patents an die Öffentlichkeit herausgegeben. Diese Hinterlegungen werden lediglich der Einfachheit halber für die Fachleute bereitgestellt und stellen kein Eingeständnis dar, daß eine Hinterlegung gemäß 35 U. S. C §112 erforderlich ist. Die Sequenzen der Polynucleotide, die in den hinterlegten Materialien enthalten sind, sowie die Aminosäuresequenzen der dadurch codierten Polypeptide dienen im Falle eines Widerspruchs mit jeder Beschreibung der Sequenzen hierin zur Kontrolle. Eine Lizenz kann erforderlich sein, um die hinterlegten Materialien herzustellen, zu verwenden oder zu verkaufen, und es wird hiermit keine solche Lizenz erteilt.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide wurden ursprünglich aus genomischen Genbanken erhalten, die aus den folgenden Organismen abgeleitet sind: Thermococcus alcaliphilus AEDII12RA gehört zur Gattung Thermococcus.
AEDII12RA wächst optimal bei 85°C, pH 9,5, in einem salzreichen Medium (Meerwasser), das Polysulfide und Hefeextrakt als Substrate und N₂ in der Gasphase enthält.
Thermococcus celer ist ein Euryarchaeota-Bakterium. Es wächst optimal bei 85°C und pH 6,0 in einem salzreichen Meerwassermedium, das elementaren Schwefel, Hefeextrakt und Pepton als Substrate und N₂ in der Gasphase enthält.
Thermococcus GU5L5 ist ein Euryarchaeota-Bakterium, das aus dem Guaymas-Becken in Mexiko isoliert wurde. Es wächst optimal bei 85°C und pH 6,0 in einem salzreichen Meerwassermedium, das 1% elementaren Schwefel, 0,4% Hefeextrakt und 0,5% Pepton als Substrate und N₂ in der Gasphase enthält.
Thermococcus CL-2 ist ein Euryarchaeota-Bakterium, das aus dem North Cleft Segment im Juan de Fuca-Rücken isoliert wurde. Es wächst optimal bei 88°C in einem Salzmedium unter einer Argonatmosphäre.
Andere Polynucleotide, die nicht Teil dieser Erfindung sind, wurden ursprünglich aus genomischen Genbanken erhalten, die aus den folgenden Organismen abgeleitet sind:
Ammonifex degensii KC4 ist ein Eubakterium der Gattung Ammonifex. Es wurde in Java, Indonesien, isoliert. Es ist ein Gram-negatives, chemolithoautotrophes Bakterium. Es wächst optimal bei 70°C in einem salzarmen Kulturmedium bei pH 7 mit 0,2% Nitrat als Substrat und H₂/CO₂ in der Gasphase.
Methanococcus igneus Kol5 ist ein Euryarchaeota-Bakterium, das vom Kolbeinsey-Rücken im Norden von Island isoliert wurde. Es wächst optimal bei 85°C und pH 7,0 in einem salzreichen Meerwassermedium mit H₂/CO₂ in einer Gasphase. Aquifex pyrophilus KOL5A ist ein marines Bakterium, das vom Kolbeinsey-Rücken im Norden von Island isoliert wurde. Es ist ein Gram-negatives, stäbchenförmiges, strikt chemolithoautotrophes Knallgas-Bakterium und ein Denitrifizierer. Es wächst optimal bei 85°C in einem salzreichen Meerwassermedium bei pH 6,8 mit O₂ als Substrat und H₂/CO₂ + 0,5% O₂ in der Gasphase.
OC9a-27A3A ist ein Bakterium unbekannter Herkunft, das aus dem Yellowstone-Nationalpark erhalten und als eine Reinkultur aufrechterhalten wurde. Es wächst gut auf einem TK6-Medium und besitzt eine Cellulose abbauende Aktivität. Ferner codiert es eine alkalische Phosphatase mit einer Polypeptidübereinstimmung von mehr als 50% und einer Polypeptidübereinstimmung von mehr als 32% zu den jeweiligen Vorläufern der alkalischen Phosphatase aus Bombyx mori und Escherichia coli C, was einer signifikanten Homologie entspricht. Folglich wird erwartet, daß OC9a-27A3A ohne weiteres in Escherichia coli C anstelle des nativen alkalischen Phosphatasevorläufers davon cloniert und exprimiert werden kann.
M11TL ist eine neue Spezies von Desulfurococcus, die aus dem Diamond Pool im Yellowstone-Nationalpark isoliert wurde. M11TL wächst heterotrophisch durch die Fermentation verschiedener organischer Materialien (Schwefel ist nicht notwendig) und bildet traubenähnliche Aggregate. Der Organismus wächst optimal bei 85°C bis 88°C und pH 7,0 in einem salzarmen Medium, enthaltend Hefeextrakt, Pepton und Gelatine als Substrate, mit einer N₂/CO₂-Gasphase.
Aquifex VF-5 ist ein marines Bakterium, das von einem Strand in Vulcano, Italien, isoliert wurde. Es ist ein Gram-negatives, stäbchenförmiges, strikt chemolithoautotrophes Knallgas-Bakterium. Es wächst optimal bei 85–90°C in salzreichem Meerwassermedium bei einem pH-Wert von 6,8 mit O₂ als einem Substrat und H₂/CO₂ + 0,5% 0₂ in der Gasphase.
Entsprechend werden die Polynucleotide und die dadurch codierten Enzyme durch den Organismus identifiziert, aus dem sie isoliert wurden, und werden zuweilen nachstehend als "KC4" (1 und SEQ ID Nrn.: 19 und 28), "KO15 (Figur 2 und SEQ ID Nrn.: 20 und 29), "AEDII12RA" (3 und SEQ ID Nrn.: 21 und 30), "Celer" (4 und SEQ ID Nrn.: 22 und 31), "GU5L5 (5 und SEQ ID Nrn.: 23 und 32), "OC9a" (6 und SEQ ID Nrn.: 24 und 33), "M11TL (7 und SEQ ID Nrn.: 25 und 34), "CL-2" (8 und SEQ ID Nrn.: 26 und 35) und "VF-5" (9 und SEQ ID Nrn.: 27 und 36) bezeichnet.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide und Polypeptide zeigen eine Übereinstimmung auf der Nucleotid- und Proteinebene mit bekannten Genen und den dadurch codierten Proteinen, wie in Tabelle 1 gezeigt ist.
Tabelle 1
Alle in Tabelle 1 identifizierten Clone codieren Polypeptide, die eine Phosphataseaktivität besitzen.
Ein Mittel zur Isolierung der Nucleinsäuremoleküle, welche die erfindungsgemäßen Enzyme codieren, ist das Absuchen einer Genbank mit einer natürlichen oder synthetisch konstruierten Sonde mittels den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren (vgl. zum Beispiel: Current Protocols in Molecular Biology, al. (Hrsg.), Green Publishing Company Assoc. und John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992). Der Fachmann erkennt, daß die Polynucleotide der SEQ ID Nrn.: 1–18 oder Fragmente davon (umfassend mindestens 12 aufeinanderfolgende Nucleotide) besonders nützliche Sonden sind. Andere besonders nützliche Sonden für diesen Zweck sind hybridisierbare Fragmente der Sequenzen der SEQ ID Nrn.: 19–27 (d. h. die mindestens 12 aufeinanderfolgende Nucleotide umfassen).
Im Hinblick auf Nucleinsäuresequenzen, die mit den hierin offenbarten spezifischen Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, kann die Hybridisierung unter Bedingungen einer verringerten Stringenz oder mäßigen Stringenz oder auch unter stringenten Bedingungen ausgeführt werden. Als ein Beispiel für eine Oligonucleotid-Hybridisierung wird eine Polymermembran, enthaltend immobilisierte denaturierte Nucleinsäuren, zuerst für 30 Minuten bei 45°C in einer Lösung, bestehend aus 0,9 M NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, pH 7,0, 5,0 mM Na₂EDTA, 0,5% SDS, 10 × Denhardt-Lösung und 0,5 mg/ml Polyriboadenylsäure, vorhybridisiert. Etwa 2 × 10⁷ CpM (spezifische Aktivität = 4 – 9 × 10⁸ CpM/ug) einer ³²P-endmarkierten Oligonucleotidsonde werden dann zu der Lösung zugegeben. Nach einer Inkubation für 12–16 Stunden wird die Membran für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 1 × SET (150 mM NaCl, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,8, 1 mM Na₂EDTA), enthaltend 0,5% SDS, gewaschen, gefolgt durch einen Waschschritt für 30 Minuten in frischem 1 × SET (Tm weniger als 10°C) für die Oligonucleotidsonde. Die Membran wird dann zum Nachweis der Hybridisierungssignale einem Autoradiographiefilm ausgesetzt.
Stringente Bedingungen bedeuten, daß die Hybridisierung nur erfolgt, wenn mindestens 90% Übereinstimmung, vorzugsweise mindestens 95% Übereinstimmung und am meisten bevorzugt mindestens 97% Übereinstimmung zwischen den Sequenzen besteht. Ferner ist selbstverständlich, daß ein Abschnitt einer 100 bp-Sequenz, der eine Länge von 95 bp hat, eine Übereinstimmung von 95% mit der 100 bp-Sequenz, aus welcher dieser erhalten wurde, aufweist. Vgl. Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), welches hierin unter Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist. Es ist auch selbstverständlich, daß ein Fragment einer 100 bp-Sequenz, das eine Länge von 95 bp hat, eine Übereinstimmung von 95% mit der 100 bp-Sequenz, aus welcher dieses erhalten wurde, aufweist.
So wie hierin verwendet, ist eine erste DNA (RNA)-Sequenz mindestens 70% und vorzugsweise mindestens 80% identisch mit einer anderen DNA (RNA)-Sequenz, falls mindestens 70% und vorzugsweise mindestens 80% bzw. 90% Übereinstimmung zwischen den Basen der ersten Sequenz und den Basen der anderen Sequenz besteht, wenn diese geeignet gegeneinander ausgerichtet werden, zum Beispiel durch BLASTN ausgerichtet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft Polynucleotide, die sich von dem Referenz-Polynucleotid insofern unterscheiden, als die Unterschiede stumm sind; zum Beispiel ist die Aminosäuresequenz, die durch die Polynucleotide codiert wird, die gleiche. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nucleotidaustäusche, die Aminosäuresubstitutionen, -additionen, -deletionen, -fusionen und -verkürzungen in dem Polypeptid, welches durch das Referenz-Polynucleotid codiert wird, zur Folge haben. Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung behalten diese Polypeptide die gleiche biologische Wirkung wie das Polypeptid, welches durch das Referenz-Polynucleotid codiert. wird, bei.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide wurden aus genomischen Genbanken von Thermococcus gewonnen. Die Genbanken wurden aus entweder einem Lambda ZAP II- oder einem pBluescript-Clonierungsvektor (Stratagene Cloning Systems) erzeugt. Mit diesen Genbanken wurden Massenexzisionen durchgeführt, um Genbanken in dem pBluescript-Phagemid zu erzeugen. Die Genbanken wurden erzeugt und die Exzisionen wurden durchgeführt, wie in den nachstehenden Protokollen/Verfahren beschrieben ist.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide können in Form einer RNA oder DNA vorliegen, wobei die DNA eine cDNA, genomische DNA und synthetische DNA einschließt. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, und kann, falls einzelsträngig, der codierende Strang oder der nicht-codierende (Antisense)-Strang sein. Die codierenden Sequenzen, welche die reifen Enzyme codieren, können mit den codierenden Sequenzen, die in den 1–9 (SEQ ID Nrn.: 21, 22, 23, 26) gezeigt werden, identisch sein oder können eine andere codierende Sequenz darstellen, wobei die codierende Sequenz als ein Ergebnis der Redundanz oder Degeneration des genetischen Codes dieselben reifen Enzyme codiert wie die DNA der 1–9 (SEQ ID Nrn.: 21, 22, 23, 26).
Das Polynucleotid, welches das reife Enzym der 1–9 (SEQ ID Nrn.: 30, 31, 32, 35) codiert, kann, aber ist nicht darauf begrenzt, einschließen: nur die codierende Sequenz für das reife Enzym; die codierende Sequenz für das reife Enzym und eine zusätzliche codierende Sequenz wie eine Leadersequenz oder eine Proproteinsequenz; die codierende Sequenz für das reife Enzym (und wahlweise zusätzliche codierende Sequenzen) und nicht-codierende Sequenzen wie Introns oder nicht-codierende Sequenzen, die sich 5'- und/oder 3' der codierenden Sequenz für das reife Enzym befinden.
Folglich umfaßt der Begriff "Polynucleotid, codierend ein Enzym (Protein)", ein Polynucleotid, das nur die codierende Sequenz für das Enzym einschließt, sowie ein Polynucleotid, das eine zusätzliche codierende und/oder nicht-codierende Sequenz einschließt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Varianten der vorstehend beschriebenen Polynucleotide, die Fragmente, Analoge und Derivate der Enzyme mit den abgeleiteten Aminosäuresequenzen der 1–9 (SEQ ID Nrn.: 30, 31, 32, 35) codieren. Die Variante des Polynucleotids kann eine in der Natur vorkommende allele Variante des Polynucleotids oder eine nicht in der Natur vorkommende Variante des Polynucleotids sein.
Die Beschreibung veranschaulicht Polynucleotide, welche die gleichen reifen Enzyme codieren, wie in den 1–9 (SEQ ID Nrn.: 19–27) gezeigt, sowie Varianten solcher Polynucleotide, wobei die Varianten ein Fragment, Derivat oder Analog der Enzyme der 1–9 (SEQ ID Nrn.: 19–27) codieren. Solche Nucleotidvarianten schließen Deletionsvarianten, Substitutionsvarianten und Additions- oder Insertionsvarianten ein.
Wie vorstehend angegeben, können die Polynucleotide eine codierende Sequenz aufweisen, die eine in der Natur vorkommende allele Variante der codierenden Sequenzen ist, die in den 1–9 (SEQ ID Nrn.: 19–27) gezeigt sind. Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, ist eine allele Variante eine andere Form einer Polynucleotidsequenz, die eine Substitution, Deletion oder Addition eines oder mehrerer Nucleotide aufweisen kann, welche die Funktion des codierten Enzyms nicht wesentlich verändert. Auch können durch gerichtete und andere Evolutionsstrategien sehr geringfügige Austäusche in die DNA-Sequenz eingeführt werden, die bedeutende Veränderungen der Funktion zur Folge haben können.
Fragmente des erfindungsgemäßen Gens vollständiger Länge können als Hybridisierungssonden für eine cDNA- oder eine genomische Genbank verwendet werden, um die DNA vollständiger Länge zu isolieren und um andere DNAs zu isolieren, die eine hohe Sequenzübereinstimmung mit dem Gen oder eine ähnliche biologische Aktivität aufweisen. Sonden dieses Typs weisen vorzugsweise mindestens 10, bevorzugt mindestens 15 und noch mehr bevorzugt mindestens 30 Basen auf und können zum Beispiel mindestens 50 oder mehr Basen enthalten. In der Tat können Sonden dieses Typs mit mindestens bis zu 150 Basen oder mehr vorzugsweise verwendet werden. Die Sonde kann auch verwendet werden, um einen DNA-Clon, der einem Transkript vollständiger Länge entspricht, und einen genomischen Clon oder Clone, die das vollständige Gen einschließlich regulatorischen Regionen und Promotorregionen, Exons und Introns enthalten, zu identifizieren. Ein Beispiel für eine Durchmusterung umfaßt die Isolierung der codierenden Region des Gens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz, um eine Oligonucleotidsonde zu synthetisieren. Markierte Oligonucleotide mit einer Sequenz, die komplementär ist zu oder identisch ist mit der Sequenz des Gens oder einem Teil der Gensequenzen der vorliegenden Erfindung, werden zum Durchmustern einer Genbank von genomischer DNA verwendet, um zu bestimmen, mit welchen Vertretern der Genbank die Sonde hybridisiert.
Es ist auch erkennbar, daß solche Sonden vorzugsweise mit einem analytisch nachweisbaren Reagens markiert sein können oder sind, um die Identifizierung der Sonde zu erleichtern. Nützliche Reagenzien schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Radioaktivität, Fluoreszenzfarbstoffe oder Enzyme, die fähig sind, die Bildung eines nachweisbaren Produkts zu katalysieren, ein. Die Sonden sind folglich nützlich, um komplementäre DNA-Kopien aus anderen Quellen zu isolieren oder um solche Quellen auf verwandte Sequenzen zu durchmustern.
Die Beschreibung veranschaulicht ferner Polynucleotide, die mit den vorstehend beschriebenen Sequenzen hybridisieren, falls mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 90% und mehr bevorzugt mindestens 95% Übereinstimmung zwischen den Sequenzen besteht. (Wie vorstehend angegeben, würde eine Übereinstimmung von 70% gemäß einer solchen Definition zum Beispiel ein 70 bp-Fragment einschließen, das aus einem 100 bp-Polynucleotid abgeleitet ist.) Die vorliegende Erfindung betrifft auch Polynucleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren. So wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "stringente Bedingungen", daß die Hybridisierung nur erfolgt, wenn mindestens 95% und vorzugsweise mindestens 97% Übereinstimmung zwischen den Sequenzen besteht. Die Polynucleotide, die mit den vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren, codieren Enzyme, die jeweils im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie das reife Enzym, das durch die DNA in den 1–9 (SEQ ID Nrn.: 19–27) codiert wird, beibehalten. Unter Bezugnahme auf die Übereinstimmung im Falle einer Hybridisierung verweist eine solche Übereinstimmung, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, auf die Komplementarität von zwei Polynucleotidsegmenten.
Alternativ kann das Polynucleotid mindestens 15 Basen, vorzugsweise mindestens 30 Basen und mehr bevorzugt mindestens 50 Basen aufweisen, die mit einem Teil eines erfindungsgemäßen Polynucleotids hybridisieren, wobei das Polynucleotid eine Übereinstimmung damit zeigt, wie vorstehend beschrieben, und die Aktivität beibehalten kann, aber nicht muss. Zum Beispiel können solche Polynucleotide als Sonden für die Polynucleotide der SEQ ID Nrn.: 19–27, zum Beispiel zur Gewinnung des Polynucleotids oder als eine diagnostische Sonde oder als ein PCR-Primer, verwendet werden.
Folglich veranschaulicht die Beschreibung Polynucleotide mit mindestens einer 70%igen Übereinstimmung, vorzugsweise mindestens einer 90%igen Übereinstimmung und mehr bevorzugt mindestens einer 95%igen Übereinstimmung mit einem Polynucleotid, das die Enzyme der SEQ ID Nrn.: 28–36 codiert, sowie Fragmente davon, wobei die Fragmente mindestens 15 Basen, vorzugsweise mindestens 30 Basen und mehr bevorzugt mindestens 50 Basen aufweisen, und die am meisten bevorzugten Fragmente bis zu mindestens 150 Basen oder mehr aufweisen, wobei die Fragmente mindestens 90% identisch, vorzugsweise mindestens 95% identisch und am meisten bevorzugt mindestens 97% identisch sind mit einem Teil eines erfindungsgemäßen Polynucleotids.
Die vorliegende Erfindung betrifft Enzyme, welche die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der 1–9 (SEQ ID Nrn.: 30, 31, 32, 35) aufweisen, sowie Fragmente, Analoge und Derivate eines solchen Enzyms.
Die Begriffe "Fragment", "Derivat" und "Analog" verweisen unter Bezugnahme auf die Enzyme in den 1–9 (SEQ ID Nrn.: 30, 31, 32, 35) auf Enzyme, die im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie solche Enzyme beibehalten. So schließt ein Analog ein Proprotein ein, das durch die Abspaltung des Proproteinanteils aktiviert werden kann, um ein aktives reifes Enzym herzustellen.
Die erfindungsgemäßen Enzyme können ein rekombinantes Enzym, ein natürliches Enzym oder ein synthetisches Enzym, vorzugsweise ein rekombinantes Enzym, darstellen.
Das Fragment, Derivat oder Analog der Enzyme in den 1–9 (SEQ ID Nr.: 28–36) kann (i) eines sein, worin einer oder mehrere der Aminosäurereste durch einen konservierten oder nicht-konservierten Aminosäurerest (bevorzugt einen konservierten Aminosäurerest) substituiert sind und ein solcher substituierter Aminosäurerest durch den genetischen Code codiert werden kann, aber nicht muß, oder (ii) eines, worin einer oder mehrere der Aminosäurereste eine Substituentengruppe einschließen, oder (iii) eines, worin das reife Enzym mit einer anderen Verbindung, z. B. einer Verbindung, um die Halbwertszeit des Enzyms zu erhöhen (zum Beispiel Polyethylenglykol), verknüpft ist, oder (iv) eines, worin die zusätzlichen Aminosäurereste mit dem reifen Enzym verknüpft sind, wie eine Leadersequenz oder eine sekretorische Sequenz oder eine Sequenz, die zur Reinigung des reifen Enzyms verwendet wird, oder eine Proproteinsequenz. Solche Fragmente, Derivate und Analoge sind für Fachleute aus den Lehren hierin ersichtlich.
Die erfindungsgemäßen Enzyme und Polynucleotide werden vorzugsweise in einer isolierten Form bereitgestellt und werden vorzugsweise bis zur Homogenität gereinigt.
Der Begriff "isoliert" bedeutet, daß das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung (z. B. der natürlichen Umgebung, falls es in der Natur vorkommt) entfernt ist. Zum Beispiel ist ein in der Natur vorkommendes Polynucleotid oder Enzym, das in einem lebenden Tier vorhanden ist, nicht isoliert, aber dasselbe Polynucleotid oder Enzym, getrennt von einigen oder allen der gleichzeitig vorhandenen Materialien in dem natürlichen System, ist isoliert. Solche Polynucleotide können Teil eines Vektors sein, und/oder solche Polynucleotide oder Enzyme können Teil einer Zusammensetzung sein und dennoch insofern isoliert sein, als eine solcher Vektor oder eine solche Zusammensetzung nicht Teil der natürlichen Umgebung davon ist.
Die in der Beschreibung veranschaulichten Enzyme schließen die Enzyme der SEQ ID Nrn.: 28–36 (insbesondere das reife Enzym) ein, sowie Enzyme, die mindestens 70% Ähnlichkeit (vorzugsweise mindestens 70% Übereinstimmung) mit den Enzymen der SEQ ID Nrn.: 28–36 und mehr bevorzugt mindestens 90% Ähnlichkeit (mehr bevorzugt mindestens 90% Übereinstimmung) mit den Enzymen der SEQ ID Nrn.: 28–36 und noch mehr bevorzugt mindestens 95% Ähnlichkeit (noch mehr bevorzugt mindestens 95% Übereinstimmung) mit den Enzymen der SEQ ID Nrn.: 28–36 aufweisen, und schließen auch Teile solcher Enzyme ein, wobei ein solcher Teil des Enzyms im Allgemeinen mindestens 30 Aminosäuren und mehr bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren und am meisten bevorzugt mindestens bis zu 150 Aminosäuren enthält.
Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, wird die "Ähnlichkeit" zwischen zwei Enzymen durch den Vergleich der Aminosäuresequenz und der konservierten Aminosäuresubstituenten eines Enzyms mit der Sequenz eines zweiten Enzyms bestimmt. Die Definition einer Ähnlichkeit von 70% würde zum Beispiel ein Sequenzfragment von 70 Aminosäuren einer Sequenz aus 100 Aminosäuren oder eine Sequenz von 70 Aminosäuren, erhalten durch aufeinanderfolgende oder zufällige Deletion von 30 Aminosäuren der Sequenz von 100 Aminosäuren, einschließen.
Eine Variante, d. h. ein "Fragment"-, "Analog"- oder "Derivat"-Polypeptid, und ein Referenz-Polypeptid können sich bezüglich der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen, Fusionen und Verkürzungen unterscheiden, die in einer beliebigen Kombination vorliegen können.
Unter den bevorzugten Varianten sind solche, die sich von einer Referenz durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden. Solche Substitutionen schließen diejenigen ein, die eine bestimmte Aminosäure in einem Polypeptid durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften ersetzen. Typisch anerkannte konservative Substitutionen umfassen den Austausch einer der aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Ile durch eine andere; den Austausch der Hydroxylgruppen enthaltenden Reste Ser und Thr; den Austausch der sauren Reste Asp und Glu; die Substitution zwischen den Amidresten Asn und Gln; den Austausch der basischen Reste Lys und Arg; und den Austausch der aromatischen Reste Phe und Tyr.
Besonders bevorzugt werden Varianten, welche die gleiche biologische Funktion und Aktivität wie das Referenz-Polypeptid, von dem sie sich unterscheiden, beibehalten.
Fragmente oder Teile der erfindungsgemäßen Enzyme können zur Herstellung des entsprechenden Enzyms vollständiger Länge mittels Peptidsynthese verwendet werden; folglich können die Fragmente als Zwischenprodukte zur Herstellung der Enzyme vollständiger Länge verwendet werden. Fragmente oder Teile der erfindungsgemäßen Polynucleotide können verwendet werden, um erfindungsgemäße Polynucleotide vollständiger Länge zu synthetisieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die erfindungsgemäße Polynucleotide einschließen; Wirtszellen, die durch erfindungsgemäße Vektoren genetisch verändert sind; und die Herstellung von erfindungsgemäßen Enzymen durch Rekombinationstechniken.
Wirtszellen werden durch die erfindungsgemäßen Vektoren, die zum Beispiel Clonierungsvektoren wie ein Expressionsvektor sein können, genetisch verändert (transduziert oder transformiert oder transfiziert). Der Vektor kann zum Beispiel in Form eines Plasmids, eines Phagen, etc. vorliegen. Die veränderten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährmedien gezüchtet werden, die gegebenenfalls zur Aktivierung von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder zur Amplifikation der erfindungsgemäßen Gene modifiziert sind. Die Züchtungsbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und dergleichen entsprechen denen, die vorher für die für die Expression selektierte Wirtszelle verwendet wurden und sind für den Fachmann ersichtlich.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide können zur Herstellung von Enzymen durch Rekombinationstechniken verwendet werden. So kann das Polynucleotid zum Beispiel in einem beliebigen einer Vielzahl von Expressionsvektoren zur Expression eines Enzyms eingeschlossen sein. Solche Vektoren schließen chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen, z. B. Derivate von SV40, bakterielle Plasmide, Phagen-DNA, Baculovirus, Hefe-Plasmide, aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA abgeleitete Vektoren, virale DNA wie Vacciniavirus, Adenovirus, Gefügelpockenvirus und Pseudorabiesvirus, ein. Jedoch kann irgendein anderer Vektor verwendet werden, so lange wie er in dem Wirt replizieren kann und darin lebensfähig ist.
Die geeignete DNA-Sequenz kann durch eine Vielzahl von Verfahren in den Vektor inseriert werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz durch die auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren in eine oder mehrere geeignete Restriktionsendonucleasestellen inseriert. Solche und andere Verfahren sind für Fachleute ersichtlich.
Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor ist mit einer oder mehreren geeigneten Expressionskontrollsequenzen (Promotoren) funktionell verbunden, um die mRNA-Synthese zu steuern. Als repräsentative Beispiele solcher Promotoren können der LTR- oder SV40-Promotor, der E. coli-lac- oder -trp-Promotor, der Phage Lambda-P_L-Promotor und andere Promotoren, die bekanntermaßen die Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder deren Viren steuern, erwähnt werden.
Der Expressionsvektor enthält auch eine Ribosomenbindungsstelle zur Initiation der Translation und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann auch geeignete Sequenzen zur Verstärkung der Expression einschließen.
Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein oder mehrere selektierbare Markergene, um ein phänotypisches Merkmal zur Selektion von transformierten Wirtszellen wie eine Dihydrofolatreduktase- oder Neomycin-Resistenz für eine eukaryontische Zellkultur oder eine Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenz in E. coli bereitzustellen.
Der Vektor, welcher die geeignete DNA-Sequenz, wie vorstehend beschrieben, sowie einen geeigneten Promotor oder eine Kontrollsequenz enthält, kann verwendet werden, um einen geeigneten Wirt zu transformieren und auf diese Weise zu ermöglichen, daß der Wirt das Protein exprimiert.
Als repräsentative Beispiele für geeignete Wirte können Bakterienzellen wie E. coli, Streptomyces und Bacillus subtilis; Pilzellen wie Hefe; Insektenzellen wie Drosophila S2 und Spodoptera Sf9; tierische Zellen wie CHO-, COS- oder Bowes-Melanomzellen; Adenoviren; Pflanzenzellen; etc. erwähnt werden. Die Auswahl eines geeigneten Wirts ist für Fachleute aus den Lehren hierin ersichtlich.
Genauer schließt die vorliegende Erfindung auch rekombinante Konstrukte ein, die eine oder mehrere der Sequenzen, wie vorstehend ausführlich beschrieben, umfassen. Die Konstrukte umfassen einen Vektor wie ein Plasmid oder einen viralen Vektor, in den eine erfindungsgemäße Sequenz in einer Vorwärts- oder entgegengesetzten Orientierung inseriert worden ist. Gemäß einem bevorzugen Aspekt dieser Ausführungsform umfaßt das Konstrukt ferner regulatorische Sequenzen, einschließlich zum Beispiel einen Promotor, der mit der Sequenz funktionell verbunden ist. Eine große Zahl von geeigneten Vektoren und Promotoren ist den Fachleuten bekannt und im Handel erhältlich. Die folgenden Vektoren werden als Beispiele angegeben: bakterielle Vektoren: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBluescript II KS, ptrc99a, pKK223-3, pDR540 und pRIT2T (Pharmacia); eukaryontische Vektoren: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL und SV40 (Pharmacia). Jedoch können irgendwelche anderen Plasmide oder Vektoren verwendet werden, so lange wie sie in dem Wirt replizieren können und darin lebensfähig sind.
Promotorregionen können aus jedem gewünschten Gen unter Verwendung von CAT (Chloramphenicoltransferase)-Vektoren oder anderen Vektoren mit selektierbaren Markern ausgewählt werden. Zwei geeignete Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Besonders erwähnenswerte bakterielle Promotoren schließen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, Lambda P_R, P_L und trp ein. Eukaryontische Promotoren schließen den sehr frühen CMV-Promotor, den HSV-Thymidinkinase-Promotor, den frühen und späten SV40-Promotor, LTRs aus Retroviren und den Maus-Metallothionein-I-Promotor ein. Die Auswahl des geeigneten Vektors und Promotors ist dem Fachmann hinreichend bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, welche die vorstehend beschriebenen Konstrukte enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Zelle wie eine Säugerzelle oder eine niedere eukaryontische Zelle wie eine Hefezelle sein, oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle wie eine Bakterienzelle sein. Die Einschleusung des Konstrukts in die Wirtszelle kann durch Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion oder Elektroporation erreicht werden (Davis L., Dibner M., Battey I., Basic Methods in Molecular Biology (1986)).
Die Konstrukte in den Wirtszellen können in herkömmlicher Weise verwendet werden, um das Genprodukt herzustellen, das durch die rekombinante Sequenz codiert wird. In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Enzyme durch herkömmliche Peptidsynthesegeräte synthetisiert werden.
Reife Proteine können in Säugerzellen, Hefe, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle von geeigneten Promotoren exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme können auch verwendet werden, um solche Proteine unter Verwen dung von RNAs herzustellen, die von den erfindungsgemäßen DNA-Konstrukten stammen. Geeignete Clonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung in prokaryontischen und eukaryontischen Wirten sind bei Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), beschrieben, wobei die Offenbarung davon hierin unter Bezugnahme eingeschlossen ist.
Die Transkription der DNA, welche die erfindungsgemäßen Enzyme codiert, durch höhere Eukaryonten wird durch die Insertion einer Enhancersequenz in den Vektor verstärkt. Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente von üblicherweise etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor einwirken, um die Transkription davon zu erhöhen. Beispiele schließen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs von bp 100 bis bp 270, den Enhancer des frühen Cytomegalievirus-Promotors, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer ein.
Im Allgemeinen schließen rekombinante Expressionsvektoren Replikationsursprünge und selektierbare Marker ein, welche die Transformation der Wirtszelle ermöglichen, z. B. das Ampicillin-Resistenzgen von E. coli und das TRP1-Gen von S. cerevisiae, sowie einen Promotor, der von einem Gen stammt, das in hoher Rate exprimiert wird, um die Transkription einer stromabwärts angeordneten strukturellen Sequenz zu steuern. Solche Promotoren können aus Operons abgeleitet sein, die u. a. glycolytische Enzyme wie 3-Phosphoglyceratkinase (PGK), den α-Faktor, eine saure Phosphatase oder Hitzeschockproteine codieren. Die heterologe strukturelle Sequenz wird in einer geeigneten Phase mit Translationsinitiations- und -terminationssequenzen und vorzugsweise einer Leadersequenz, die fähig ist, die Sekretion eines translatierten Enzyms zu steuern, zusammengelagert. Wahlweise kann die heterologe Sequenz ein Fusionsenzym codieren, das ein N-terminales Identifizierungspeptid einschließt, das die gewünschten Eigenschaften, z. B. eine Stabilisierung oder eine vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts, überträgt.
Nützliche Expressionsvektoren zur Verwendung in Bakterien werden durch Insertion einer strukturellen DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, zusammen mit geeigneten Translationsinitiations- und -terminationssignalen im funktionellen Leseraster mit einem funktionellen Promotor konstruiert. Der Vektor umfaßt einen oder mehrere phänotypisch selektierbare Marker und einen Replikationsursprung, um die Aufrechterhaltung des Vektors sicherzustellen und um gegebenenfalls eine Amplifikation innerhalb des Wirts vorzusehen. Geeignete prokaryontische Wirte zur Transformation schließen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus ein, obwohl andere auch wahlweise verwendet werden können.
Als repräsentatives, aber nichtbegrenzendes Beispiel können nützliche Expressionsvektoren zur Verwendung in Bakterien einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung, abgeleitet aus im Handel erhältlichen Plasmiden, umfassend genetische Elemente des gut bekannten Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017), umfassen. Solche kommerziellen Vektoren schließen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein. Diese pBR322-"Gerüst"-Abschnitte werden mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden strukturellen Sequenz kombiniert.
Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstamms und der Züchtung des Wirtsstamms bis zu einer geeigneten Zelldichte wird der ausgewählte Promotor durch ein geeignetes Mittel induziert (z. B. Temperaturverschiebung oder chemische Induktion), und die Zellen werden für einen weiteren Zeitraum gezüchtet.
Die Zellen werden typischerweise durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder chemische Mittel aufgebrochen, und der erhaltene Rohextrakt wird zur weiteren Reinigung zurückbehalten.
Mikrobenzellen, die bei der Expression von Proteinen verwendet werden, können durch irgendein geeignetes Mittel aufgebrochen werden, einschließlich Einfrier-Auftau-Wechsel, Ultraschall-Behandlung, mechanisches Aufbrechen oder Verwendung von Zelllysemitteln, wobei solche Verfahren den Fachleuten hinreichend bekannt sind.
Verschiedene Säugerzellkultursysteme können auch verwendet werden, um ein rekombinantes Protein zu exprimieren. Beispiele für Säugerexpressionssysteme schließen die COS-7-Linien von Affen-Nierenfibroblasten, beschrieben von Gluzman, Cell 23 (1981), 175; und andere Zelllinien, die fähig sind, einen kompatiblen Vektor zu exprimieren, zum Beispiel die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zelllinien, ein. Säugerexpressionsvektoren umfassen einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und einen Enhancer sowie auch gegebenenfalls Ribosomenbindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Spleiß-Donator- und -Akzeptor-Stellen, Transkriptionsterminationssequenzen und umgebende nichttranskribierte 5'-Sequenzen. DNA-Sequenzen, die aus den SV40-Spleiß- und -Polyadenylierungsstellen abgeleitet sind, können verwendet werden, um die erforderlichen nichttranskribierten genetischen Elemente bereitzustellen.
Das Enzym kann mittels Verfahren einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Lectin-Chromatographie aus rekombinanten Zellkulturen gewonnen und gereinigt werden. Gegebenenfalls können Proteinumfaltungsschritte verwendet werden, um die Konfiguration des reifen Proteins abzuschließen. Schließlich kann eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) für die letzten Reinigungsschritte verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Enzyme können ein natürlich gereinigtes Produkt oder ein Produkt von chemischen Syntheseverfahren sein oder mittels Rekombinationstechniken durch einen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt (zum Beispiel durch Bakterien-, Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen in Kultur) hergestellt werden. Abhängig von dem Wirt, der in einem rekombinanten Herstellungsverfahren verwendet wird, können die erfindungsgemäßen Enzyme glycosyliert oder nicht-glycosyliert sein. Die erfindungsgemäßen Enzyme können, aber müssen nicht, einen Methionin-Aminosäurerest am Anfang einschließen.
Phosphatasen stellen eine Gruppe von Schlüsselenzymen bei der Entfernung von Phosphatgruppen aus Organophosphatesterverbindungen dar. Es gibt zahlreiche Phosphatasen, einschließlich alkalische Phosphatasen, Phosphodiesterasen und Phytasen.
Die allgemeinen Anwendungen und Definitionen solcher Verbindungen werden vorstehend in dem Kapitel Hintergrund der Erfindung besprochen.
Die vorliegende Erfindung stellt neue Phosphataseenzyme mit einer erhöhten Thermostabilität bereit. Solche Phosphatasen sind bei Enzymmarkierungsverfahren und bei bestimmten DNA-Rekombinationstechniken wie bei der Dephosphorylierung einer Vektor-DNA vor der Insertion einer DNA-Ligierung vorteilhaft. Die rekombinanten Phosphataseenzyme stellen die Proteine in einer Form bereit, welche die wirksame Herstellung eines reines Enzyms ermöglicht, das in einer Vielzahl von Anwendungen, wie hierin beschrieben, verwendet werden kann.
Die Beschreibung veranschaulicht auch Antikörper, die gegen die Enzyme hervorgerufen werden, die einer erfindungsgemäßen Sequenz entsprechen, und die durch direkte Injektion der Enzyme in ein Tier oder durch Verabreichung der Enzyme an ein Tier, vorzugsweise keinen Menschen, erhalten werden können. Der auf diese Weise erhaltene Antikörper bindet dann die Enzyme selbst. Auf diese Weise kann auch eine Sequenz, die nur ein Fragment der Enzyme codiert, verwendet werden, um Antikörper hervorzurufen, welche die ganzen nativen Enzyme binden. Solche Antikörper können dann verwendet werden, um das Enzym aus Zellen, die das Enzym exprimieren, zu isolieren.
Zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern kann irgendeine Technik angewendet werden, die Antikörper bereitstellt, welche durch kontinuierliche Zelllinienkulturen hergestellt werden. Beispiele schließen die Hybridomtechnik (Kohler und Milstein, Nature 256 (1975), 495–497), die Triomtechnik, die Hybridomtechnik unter Verwendung von menschlichen B-Zellen (Kozbor et al., Immunology Today 4 (1983), 72) und die EBV-Hybridomtechnik, um menschliche monoclonale Antikörper herzustellen (Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96, 1985), ein.
Techniken, welche für die Herstellung von aus einzelnen Ketten bestehenden Antikörpern beschrieben wurden (US-Patent 4,946,778), können angepaßt werden, um aus einzelnen Ketten bestehende Antikörper gegen erfindungsgemäße immunogene Enzymprodukte herzustellen. Auch können transgene Mäuse verwendet werden, um humanisierte Antikörper gegen erfindungsgemäße immunogene Enzymprodukte zu exprimieren.
Die Beschreibung veranschaulicht auch Antikörper, die gegen ein erfindungsgemäßes Enzym hervorgerufen werden und die bei der Durchmusterung von ähnlichen Enzymen aus anderen Organismen und Proben verwendet werden können. Solche Durchmusterungstechniken sind auf dem Fachgebiet bekannt; ein solcher Durchmusterungstest ist zum Beispiel bei Sambrook und Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage), Bd. 2, Abschnitt 8.49, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben; jedoch sollte selbstverständlich sein, daß die vorliegende Erfindung nicht auf solche Beispiele begrenzt ist. Alle Anteile oder Mengen sind, sofern nicht anders angegeben, auf das Gewicht bezogen.
Um das Verständnis der folgenden Beispiele zu erleichtern, werden bestimmte häufig vorkommende Verfahren und/oder Begriffe beschrieben.
"Plasmide" sind durch den Kleinbuchstaben "p" gekennzeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Zahlen vorausgehen und/oder folgen. Die Ausgangsplasmide hierin sind entweder im Handel erhältlich, uneingeschränkt öffentlich zugänglich oder können aus erhältlichen Plasmiden im Einklang mit veröffentlichten Verfahren konstruiert werden. Außerdem sind Plasmide, die den beschriebenen entsprechen, auf dem Fachgebiet bekannt und für den Fachmann ersichtlich.
"Spaltung" von DNA verweist auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur auf bestimmte Sequenzen in der DNA einwirkt. Die verschiedenen Restriktionsenzyme, die hierin verwendet werden, sind im Handel erhältlich, und die Reaktionsbedingungen, Co-Faktoren und anderen Erfordernisse entsprechen denjenigen, die dem Fachmann bekannt sind. Für Analysenzwecke werden typischerweise 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment zusammen mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Zum Zwecke der Isolierung von DNA-Fragmenten aus einer Plasmidkonstruktion werden typischerweise 5 bis 50 μg DNA mit 20 bis 250 Einheiten Enzym in einem größeren Volumen gespalten. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme sind durch den Hersteller genau angegeben. Üblicherweise werden Inkubationszeiträume von etwa 1 Stunde bei 37°C verwendet, aber diese können im Einklang mit den Anweisungen des Lieferanten variieren. Nach der Spaltung wird der Reaktionsansatz direkt einer Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel unterzogen, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
Die Größenauftrennung der gespaltenen Fragmente erfolgt unter Verwendung eines 8%igen Polyacrylamidgels, wie bei Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980), 4057, beschrieben ist.
"Oligonucleotide" verweist auf entweder ein einzelsträngiges Polydesoxynucleotid oder zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die chemisch synthetisiert werden können. Solche synthetischen Oligonucleotide haben keine 5'-Phos phatgruppe und gehen daher keine Verbindung mit einem anderen Oligonucleotid ein, ohne daß eine Phosphatgruppe mit einem ATP in Gegenwart einer Kinase angehängt wird. Ein synthetisches Oligonucleotid geht mit einem Fragment, das nicht dephosphoryliert worden ist, eine Verbindung ein.
"Ligierung" verweist auf den Prozeß der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (Maniatis T. et al., Id., S. 146). Sofern nicht anders angegeben, kann die Ligierung unter Verwendung von bekannten Puffern und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 μg einer etwa äquimolaren Menge der zu ligierenden DNA-Fragmente ausgeführt werden.
Sofern nicht anders angegeben, wurde die Transformation durchgeführt, wie bei Sambrook und Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben ist.
Ein Mittel zur Isolierung der Nucleinsäuremoleküle, welche die erfindungsgemäßen Enzyme codieren, ist das Absuchen einer Genbank mit einer natürlichen oder synthetisch konstruierten Sonde mittels der auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren (vgl. zum Beispiel: Current Protocols in Molecular Biology, al. (Hrsg.), Green Publishing Company Assoc. und John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992). Für den Fachmann ist ersichtlich, daß die Polynucleotide der SEQ ID Nrn.: 1–16 oder Fragmente davon (umfassend mindestens 10 oder 12 aufeinanderfolgende Nucleotide) besonders nützliche Sonden sind. Andere besonders nützliche Sonden für diesen Zweck sind Fragmente, die mit den Sequenzen der SEQ ID Nrn.: 19–27 hybridisieren können (d. h. die mindestens 10 oder 12 aufeinanderfolgende Nucleotide umfassen).
Es ist auch erkennbar, daß solche Sonden mit einem analytisch nachweisbaren Reagens markiert sein können und vorzugsweise markiert sind, um die Identifizierung der Sonde zu erleichtern. Nützliche Reagenzien schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf, Radioaktivität, Fluoreszenzfarbstoffe oder Enzyme, die in der Lage sind, die Bildung eines nachweisbaren Produkts zu katalysieren. Die Sonden sind folglich nützlich, um komplementäre DNA-Kopien aus anderen Quellen zu isolieren oder um solche Quellen auf verwandte Sequenzen abzusuchen.
Im Hinblick auf Nucleinsäuresequenzen, die mit hierin offenbarten spezifischen Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, kann die Hybridisierung unter Bedin gungen einer verminderten Stringenz oder einer mäßigen Stringenz oder auch unter stringenten Bedingungen ausgeführt werden. Als Beispiel für eine Oligonucleotid-Hybridisierung wird eine Polymermembran, die immobilisierte denaturierte Nucleinsäuren enthält, zuerst für 30 Minuten bei 45°C in einer Lösung, bestehend aus 0,9 M NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, pH 7,0, 5,0 mM Na₂EDTA, 0,5% SDS, 10 × Denhardt-Lösung und 0,5 mg/ml Polyriboadenylsäure, vorhybridisiert. Etwa 2 × 10⁷ CpM (spezifische Aktivität = 4 – 9 × 10⁸ CpM/ug) einer ³²P-endmarkierten Oligonucleotidsonde werden dann zu der Lösung zugegeben. Nach einer Inkubation von 12–16 Stunden wird die Membran für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 1 × SET (150 mM NaCl, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,8, 1 mM Na₂EDTA), enthaltend 0,5% SDS, gewaschen, gefolgt durch einen 30-minütigen Waschschritt in frischem 1 × SET bei Tm –10°C für die Oligonucleotidsonde. Die Membran wird dann zum Nachweis der Hybridisierungssignale einem Autoradiographiefilm ausgesetzt.
Stringente Bedingungen bedeuten, daß die Hybridisierung nur erfolgt, wenn mindestens 90% Übereinstimmung, vorzugsweise 95% Übereinstimmung und am meisten bevorzugt mindestens 97% Übereinstimmung zwischen den Sequenzen besteht. Vgl. Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. Auflage, 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory), welches hierdurch unter Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist.
"Übereinstimmung", so wie der Begriff hierin verwendet wird, verweist auf eine Polynucleotidsequenz, die einen Prozentsatz der gleichen Basen wie ein Referenz-Polynucleotid (SEQ ID Nrn.: 1–16) aufweist. Zum Beispiel weist ein Polynucleotid, das mindestens 90% identisch ist mit einem Referenz-Polynucleotid, Polynucleotidbasen auf, die bei 90% identisch sind mit den Basen, die das Referenz-Polynucleotid ausmachen, und es kann andere Basen bei 10% der Basen, welche die Polynucleotidsequenz umfassen, aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft Polynucleotide, die sich von dem Referenz-Polynucleotid insofern unterscheiden, als die Unterschiede stumme Austäusche sind; zum Beispiel ist die Aminosäuresequenz, die durch beide Polynucleotide codiert wird, die gleiche. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nucleotidaustäusche, die Aminosäuresubstitutionen, -additionen, -deletionen, -fusionen und -verkürzungen in dem Polypeptid, das durch das Referenz-Polynucleotid codiert wird, zur Folge haben. Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung behalten diese Poly peptide die gleiche biologische Wirkung wie das Polypeptid, das durch das Referenz-Polynucleotid codiert wird, bei.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide wurden aus genomischen Genbanken der in Tabelle 1 aufgeführten Organismen gewonnen. Die Genbanken wurden in dem Lambda ZAP II-Clonierungsvektor (Stratagene Cloning Systems) erzeugt. Mit diesen Genbanken wurden Massenexzisionen durchgeführt, um Genbanken in dem pBluescript-Phagemid zu erzeugen. Die Genbanken wurden erzeugt und die Exzisionen wurden durchgeführt, wie in den nachstehenden Protokollen/Verfahren beschrieben ist.
Die mittels Exzision erzeugten Genbanken wurden in den E. coli-Stamm BW14893 F'kan1A eingeschleust. Expressions-Clone wurden dann mittels eines Hochtemperatur-Filtertests unter Verwendung von Phosphatasepuffer, enthaltend 1 mg/ml BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat), identifiziert. Expressions-Clone, die BCIPasen codieren, wurden aus den folgenden Organismen identifiziert und noch einmal gereinigt: Ammonifex degensii KC4, Methanococcus igneus Kol5, Thermococcus alcaliphilus AEDII12RA, Thermococcus celer, Thermococcus GU5L5, OC9a, M11TL, Thermococcus CL-2 und Aquifex VF-5.
Expressions-Clone wurden unter Verwendung eines Hochtemperatur-Filtertests mit entweder einem saure Phosphatase-Puffer oder einem alkalische Phosphatase-Puffer, enthaltend BCIP, identifiziert. Metcalf et al., Evidence For Two Phosphonate Degradative Pathways in Enterobacter Aerogenes, J. Bacteriol. 174 (1992), 2501–2510.
Die BCIPase-Aktivität wurde wie folgt getestet: Eine Exzisions-Genbank wurde in den E. coli-Stamm BW14893 F'kan, einen pho^–pnh^–lac^–-Stamm, eingeschleust. Nach der Vermehrung auf 100 mm-LB-Platten, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, 80 μg/ml Methicillin und 1 mM IPTG, wurden Kolonieabdrücke unter Verwendung von Millipore HATF-Membranfilter abgenommen. Die auf die Filter übertragenen Kolonien wurden mit Chloroformdampf in 150 mm-Glaspetrischalen lysiert. Die Filter wurden in 100 mm-Glaspetrischalen, enthaltend ein Stück Whatman 3MM-Filterpapier, gesättigt mit entweder dem saure Phosphatase-Puffer (vgl. nachstehende Rezeptur) oder dem alkalische Phosphatase-Puffer (vgl. nachstehende Rezeptur), enthaltend kein BCIP, übertragen. Die Schale wurde bei 80–85°C für 30–45 Minuten in den Ofen gestellt, um endogene E. coli-Phosphatasen durch Hitze zu inaktivieren.
Der die lysierten Kolonien tragende Filter wurde dann auf eine 100 mm-Glaspetrischale, enthaltend 3MM-Papier, gesättigt mit entweder dem saure Phosphatase-Puffer oder dem alkalische Phosphatase-Puffer, enthaltend 1 mg/ml BCIP, übertragen. Die Schale wurde bei 80–85°C in den Ofen gestellt.
Der alkalische Phosphatase-Puffer (erwähnt bei Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), S. 1874) schließt 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂ und 100 mM Tris-HCl (pH 9,5) ein. Clone, die eine Phosphataseaktivität exprimieren (wenn der alkalische Phosphatase-Puffer verwendet wurde), wurden aus Genbanken erhalten, die von den vorstehend identifizierten Organismen stammten.
Der saure Phosphatase-Puffer schließt 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂ und 100 mM Tris-HCl (pH 6,8) ein. Clone, die eine Phosphataseaktivität exprimieren (wenn der saure Phosphatase-Puffer verwendet wurde), wurden aus der Genbank erhalten, die von M11TL stammte.
'Positive Clone' wurden als blaue Flecken auf den Filtermembranen beobachtet. Die folgende Filterrettungstechnik wurde angewendet, um das Plasmid aus der lysierten positiven Kolonie wieder zu gewinnen.
Filterrettungstechnik: Eine Pasteurpipette (oder eine Glaskapillare) wurde verwendet, um die blauen Flecken auf der Filtermembran auszustechen. Die kleine Filterscheibe wurde in ein Eppendorf-Röhrchen, enthaltend 20 μl deionisiertes Wasser, eingebracht. Das Eppendorf-Röhrchen wurde bei 75°C für 5 Minuten inkubiert und anschließend mit Hilfe eines Vortexgeräts gemischt, um die Plasmid-DNA von dem Filter zu eluieren. Eine Plasmid-DNA, die DNA-Insertionen aus Thermococcus alcaliphilus AEDII12RA enthält, wurde verwendet, um elektrokompetente E. coli DH10B-Zellen zu transformieren. Elektrokompetente BW14893 F'kan1A- E. coli-Zellen wurden zur Transformation von Plasmid-DNA, enthaltend Insertionen aus Ammonifex degensii KC4, Methanococcus igneus Kol und Thermococcus GU5L5 verwendet. Der Filter-Abdrucktest wurde auf Transformationsplatten wiederholt, um 'positive Kolonien' zu identifizieren. Die Transformationsplatten wurden wieder in den 37°C warmen Brutschrank gelegt, um die Kolonien zu regenerieren. 3 ml LBamp-Flüssigkeit wurden mit den noch einmal gereinigten positiven Kolonien beimpft und bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Plasmid-DNA wurde aus diesen Kulturen isoliert, und die Plasmidinsertionen wurden sequenziert.
In einigen Fällen, in denen die Platten, welche für die ersten Kolonieabdrücke verwendet wurden, nicht-konfluente Kolonien enthielten, konnte eine spezifische Kolonie, die einem blauen Fleck auf dem Filter entspricht, auf einer regenerierten Platte anstelle der Filterrettungstechnik identifiziert werden und noch einmal direkt gereinigt werden. Dieses nochmalige "Reinigungs"-Protokoll wurde für Plasmid-DNAs verwendet, die Insertionen aus den folgenden Organismen enthielten: Ammonifex degensii KC4, Thermococcus celer, M11TL und Aquifex VF-5.
Die Filterrettungstechnik wurde für DNA aus den folgenden Organismen angewendet: Ammonifex degensii KC4, Methanococcus igneus Kol5, Thermococcus alcaliphilus AEDII12RA, Thermococcus CL-2 und OC9a.
Phosphatasen stellen eine Gruppe von Schlüsselenzymen dar, die Phosphatgruppen aus Organophosphatesterverbindungen entfernen. Die wichtigsten Phosphatasen für kommerzielle Zwecke sind alkalische Phosphatasen, Phosphodiesterasen und Phytasen.
Alkalische Phosphatasen weisen mehrere kommerzielle Anwendungen auf, einschließlich deren Verwendung bei analytischen Anwendungen als ein Enzymmarker in ELISA-Immuntests und Enzym gebundenen Gensonden und deren Verwendung bei wissenschaftlichen Anwendungen zur Entfernung von 5'-Phosphatgruppen in Polynucleotiden vor der Endmarkierung und zur Dephosphorylierung von Vektoren vor der Insertionsligierung (vgl. auch Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons) (1995), Kapitel 3, Abschnitt 10).
Die alkalische Phosphatase hydrolysiert Monophosphatester, wobei ein anorganisches Phosphat und die verwandte Alkoholverbindung freigesetzt werden. Sie ist im Hinblick auf die Alkoholgruppe unspezifisch, ein Merkmal, das viele Anwendungen dieses Enzyms erklärt. Das Enzym weist ein pH-Optimum zwischen 9 und 10 auf, jedoch kann es auch bei einem neutralen pH-Wert wirksam sein. (Aus einer Studie der Enzymindustrie, durchgeführt durch Business Communications Co., Inc., 25 Van Zant Street, Norwalk, CT 06855, 1995).
Zwei Quellen für alkalische Phosphatasen dominieren und konkurrieren im Handel: eine tierische aus der Darmschleimhaut von Rindern und Kälbern, und eine bakterielle aus E. coli. Aufgrund der hohen Wechselzahl der Phosphatase aus Kälberdarm wird sie oft als Marker für viele Enzymimmuntests ausgewählt. Die Nützlichkeit der alkalischen Kalbsphosphatase wird durch die ihr eigene geringe Thermo stabilität eingeschränkt, die während der chemischen Herstellung des Enzyms – Antikörperkonjugate – noch weiter beeinträchtigt wird. Eine bakterielle alkalische Phosphatase könnte eine attraktive Alternative zu der alkalischen Kalbsphosphatase darstellen, da die bakterielle alkalische Phosphatase eine extreme Thermotoleranz bei Temperaturen um 95°C zeigt. (Tomazic-Allen S. J., Recombinant Bacterial Alkaline Phosphatase as an Immunodiagnostic Enzyme, Annales de Biologie Clinique, 49 (5) (1991), 287–90.)
Die Beschreibung veranschaulicht auch Antikörper, die gegen die Enzyme hervorgerufen werden, die einer erfindungsgemäßen Sequenz entsprechen, und die durch direkte Injektion der Enzyme in ein Tier oder durch Verabreichung der Enzyme an ein Tier, vorzugsweise keinen Menschen, erhalten werden können. Der auf diese Weise erhaltene Antikörper bindet dann die Enzyme selbst. Auf diese Weise kann auch eine Sequenz, die nur ein Fragment der Enzyme codiert, verwendet werden, um Antikörper hervorzurufen, welche die ganzen nativen Enzyme binden. Solche Antikörper können dann verwendet werden, um das Enzym aus Zellen, die das Enzym exprimieren, zu isolieren.
Zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern kann irgendeine Technik angewendet werden, die Antikörper bereitstellt, die durch kontinuierliche Zelllinienkulturen hergestellt werden. Beispiele schließen die Hybridomtechnik (Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 495–497), die Triomtechnik, die Hybridomtechnik unter Verwendung von menschlichen B-Zellen (Kozbor et al., Immunology Today 4 (1983), 72) und die EBV-Hybridomtechnik, um menschliche monoclonale Antikörper herzustellen (Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96, 1985), ein.
Techniken, die für die Herstellung von aus einzelnen Ketten bestehenden Antikörpern beschrieben wurden (US-Patent 4,946,778), können angepaßt werden, um aus einzelnen Ketten bestehende Antikörper gegen erfindungsgemäße immunogene Enzymprodukte herzustellen. Auch können transgene Mäuse verwendet werden, um humanisierte Antikörper gegen erfindungsgemäße immunogene Enzymprodukte zu exprimieren.
Die Beschreibung veranschaulicht Antikörper, die als eine Sonde zum Absuchen einer Genbank verwendet werden können, um die vorstehend beschriebenen Aktivitäten oder kreuzreaktiven Aktivitäten in Genbanken, die aus den vorstehend beschriebenen Organismen oder anderen Organismen erzeugt wurden, zu identifizieren.
Die folgenden Beispiele decken auch Ausführungsformen ab, die nicht Teil der Erfindung sind.
Beispiel 1
Bakterielle Expression und Reinigung von alkalischen Phosphataseenzymen
DNA-Sequenzen, codierend die in der Beschreibung veranschaulichten Enzyme, SEQ ID Nrn.: 1 bis 16, wurden zuerst aus einem pBluescript-Vektor, enthaltend die DNA-Sequenzen, mit Hilfe der PCR-Technik unter Verwendung der hierin angegebenen Primer amplifiziert. Die amplifizierten Sequenzen wurden dann in den jeweiligen unter den Primersequenzen aufgeführten pQE-Vektor inseriert, und das Enzym wurde gemäß den hierin angegebenen Protokollen exprimiert. Die zur Subclonierung verwendeten 5'- und 3'-Oligonucleotidprimersequenzen und die Vektoren für die jeweiligen Gene sind wie folgt:
Die angegebenen Restriktionsenzymstellen entsprechen den Restriktionsenzymstellen in dem bakteriellen Expressionsvektor, der für das jeweilige Gen angegeben ist (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). Der pQE-Vektor codiert eine Antibiotikaresistenz (Amp^r), einen bakteriellen Replikationsursprung (ori), eine IPTG regulierbare Promotor-Operator (P/O)-Sequenz, eine Ribosomenbindungsstelle (RBS), einen 6-His-Marker und Restriktionsenzymstellen.
Der pQE-Vektor wurde mit den angegebenen Restriktionsenzymen gespalten. Die amplifizierten Sequenzen wurden in den jeweiligen pQE-Vektor ligiert und im Leseraster mit der Sequenz, welche die RBS codiert, inseriert. Das native Stoppcodon wurde so eingebaut, daß die Gene nicht mit dem His-Marker des Vektors verbunden waren. Das Ligierungsgemisch wurde dann verwendet, um den E. coli-Stamm M15/pREP4 (Qiagen, Inc.) mittels Elektroporation zu transformieren. M15/pREP4 enthält mehrere Kopien des Plasmids pREP4, das den lacI-Repressor exprimiert und auch eine Kanamycin-Resistenz (Kan^r) überträgt. Transformanten wurden durch ihre Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, und Ampicillin/Kanamycin-resistente Kolonien wurden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde isoliert und durch eine Restriktionsanalyse bestätigt. Clone, welche die gewünschten Konstrukte enthalten, wurden über Nacht (O/N) in einer Flüssigkeitskultur in LB-Medium, supplementiert mit sowohl Amp (100 μg/ml) als auch Kan (25 μg/ml), gezüchtet. Die O/N-Kultur wurde verwendet, um eine große Kultur in einem Verhältnis von 1 : 100 bis 1 : 250 zu beimpfen. Die Zellen wurden bis zu einem optischen Dichtewert bei 600 (OD₆₀₀) zwischen 0,4 und 0,6 gezüchtet. IPTG ("Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid") wurde dann zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. IPTG induziert durch Inaktivierung des lacI-Repressors, wodurch die P/O-Sequenz freigemacht wird, was eine Erhöhung der Genexpression zur Folge hat. Die Zellen wurden weitere 3 bis 4 Stunden gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet.
Die vorstehend angegebenen Primersequenzen können auch verwendet werden, um das Zielgen aus dem hinterlegten Material durch die vorstehend beschriebenen Hybridisierungstechniken zu isolieren.
Beispiel 2
Isolierung eines ausgewählten Clons aus den hinterlegten genomischen Clonen
Ein Clon wird durch Durchmusterung des hinterlegten Materials unter Verwendung der in Beispiel 1 angegebenen Oligonucleotidprimer für das bestimmte Gen, das isoliert werden soll, direkt isoliert. Die spezifischen Oligonucleotide werden unter Verwendung eines Applied Biosystems DNA-Synthesegeräts synthetisiert.
Die zwei Oligonucleotidprimer, die dem Gen von Interesse entsprechen, werden verwendet, um das Gen aus dem hinterlegten Material zu amplifizieren. Eine Polymerasekettenreaktion wird in 25 μl-Reaktionsgemisch mit 0,1 μg der DNA des Gens von Interesse ausgeführt. Das Reaktionsgemisch besteht aus 1,5–5 mM MgCl₂, 0,01% (Gew./Vol.) Gelatine, jeweils 20 μM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 25 pMol jedes Primers und 1,25 Einheiten Taq-Polymerase. 30 PCR-Zyklen (Denaturierung bei 94°C für 1 min; Anlagerung bei 55°C für 1 min; Verlängerung bei 72°C für 1 min) werden mit der Perkin-Eimer Cetus 9600-Thermocycler-Vorrichtung ausgeführt. Das amplifizierte Produkt wird durch eine Agarose-Gelelektrophorese analysiert, und die DNA-Bande mit dem erwarteten Molekulargewicht wird ausgeschnitten und gereinigt. Durch die Subclonierung und Sequenzierung des DNA-Produkts wird bestätigt, daß es sich bei dem PCR-Produkt um das Gen von Interesse handelt. Die Nucleotidsequenz der Enden der erneut gereinigten Gene wird sequenziert, um Sequenzen vollständiger Länge zu identifizieren. Eine vollständige Sequenzierung der Gene vollständiger Länge wird dann durch einen Exonuclease III-Verdau oder ein Primer-Walking durchgeführt.
Zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind im Hinblick auf die vorstehenden Lehren möglich und daher im Schutzumfang der beigefügten Patentansprüche eingeschlossen, wobei die Erfindung in einer anderen Art und Weise, als hierin speziell beschrieben, ausgeführt werden kann.
Sequenzprotokoll

Claims

Polynucleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nucleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert wie in SEQ ID Nr.: 30, SEQ ID Nr.: 31, SEQ ID Nr.: 32, SEQ ID Nr.: 35 oder SEQ ID Nr.: 46 gezeigt; (b) einer Nucleinsäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 21, SEQ ID Nr.: 22; SEQ ID Nr.: 23, SEQ ID Nr.: 26, SEQ ID Nr.: 38 oder SEQ ID Nr.: 45 gezeigt; (c) der Nucleinsäuresequenz von (a) oder (b), wobei T auch U sein kann; (d) einer Nucleinsäuresequenz, die mindestens 15, 30 oder 50 aufeinanderfolgende Basen einer Sequenz wie in SEQ ID Nr.: 21, SEQ ID Nr.: 22, SEQ ID Nr.: 23, SEQ ID Nr.: 26, SEQ ID Nr.: 38 oder SEQ ID Nr.: 45 gezeigt, lang ist; (e) einer Nucleinsäuresonde, die mindestens 15, 30 oder 50 aufeinanderfolgende Basen lang ist, welche spezifisch an die Nucleineinsäuresequenz von (a) bis (d) hybridisiert; (f) einer Nucleinsäuresequenz, die ein Enzym mit alkalischer Phosphatase-Aktivität codiert, das mindestens 70%, 90%, 95% oder 97% Sequenzidentität zu SEQ ID Nr.: 21, SEQ ID Nr.: 22, SEQ ID Nr.: 23, SEQ ID Nr.: 26, SEQ ID Nr.: 38 oder SEQ ID Nr.: 45 aufweist; und (g) einer Nucleinsäuresequenz, die zu der Nucleinsäuresequenz von (a) bis (f) komplementär ist; gegebenenfalls einschließlich zusätzlicher codierender und/oder nicht-codierender Sequenz.
Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid DNA ist.
Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid RNA ist.
Polynucleotid umfassend ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polynucleotid, das ein Enzym mit alkalischer Phosphatase-Aktivität codiert und mindestens 70% Identität zu einem Polynucleotid aufweist, das ein Enzym codiert, welches von der in ATCC-Hinterlegungsnummer Nr. 97536 enthaltenen DNA codiert wird, wobei das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Thermococcus AEDII12RA, Thermococcus celer, Thermococcus CL-2 and Thermococcus GU5L5; (b) einem Polynucleotid, das komplementär zu dem Polynucleotid von (a) ist; (c) einem Polynucleotid, das mindestens 15 Basen des Polynucleotids von (a) und (b) umfasst.
Vektor, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Wirtszelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 5.
Verfahren zur Herstellung eines Polynucleotids umfassend: Exprimieren eines Polypeptids, das von der DNA codiert wird, von der Wirtszelle nach Anspruch 6 und Isolieren des Polypeptids.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Zelle umfassend: Transformieren oder Transfizieren der Zelle mit dem Vektor nach Anspruch 5, so dass die Zelle das Polypeptid exprimiert, das von der DNA codiert wird, die in dem Vektor enthalten ist.
Enzym, von dem zumindest ein Teil von einem Polynucleotid codiert wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 30, SEQ ID Nr.: 31, SEQ ID Nr.: 32, SEQ ID Nr.: 35 oder SEQ ID Nr.: 46 gezeigt; (b) einer Aminosäuresequenz, die von dem Polynucleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 4 codiert wird; (c) einer Aminosäuresequenz, die mindestens 30 aufeinanderfolgende Aminosäuren einer Sequenz wie in SEQ ID Nr.: 30, SEQ ID Nr.: 31, SEQ ID Nr.: 32, SEQ ID Nr.: 35 oder SEQ ID Nr.: 46 gezeigt, lang ist oder einem Polypeptid, das von dem Polynucleotid von Anspruch 1 codiert wird; (d) einer Aminosäuresequenz mit alkalischer Phosphatase-Aktivität, die mindestens 70%, 90%, 95% oder 97% Sequenzidentität zu SEQ ID Nr.: 30, SEQ ID Nr.: 31, SEQ ID Nr.: 32, SEQ ID Nr.: 35 oder SEQ ID Nr.: 46 aufweist oder einem Polypeptid, das von dem Polynucleotid von Anspruch 1 codiert wird.
Verfahren zum Hydrolysieren von Phosphatbindungen umfassend: Zugeben einer wirksamen Menge eines Enzyms, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Enzym mit der Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe von Aminosäuresequenzen wie in SEQ ID Nr.: 30, 31, 32, 35 oder 46 gezeigt, einem Enzym nach Anspruch 9 oder einem Enzym, das von dem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird.
Thermostabile alkalische Phosphatase mit der Sequenz wie in Anspruch 9 gezeigt oder codiert von dem Polynucleotid nach Anspruch 1(a), (b), (c) oder (f).
Antikörper, erzeugt gegen das Enzym nach Anspruch 9 oder erzeugt gegen ein Fragment des Enzyms, der ganze native Enzyme bindet.