DE69631787T2

DE69631787T2 - Verfahren zum screening enzymatischer aktivität

Info

Publication number: DE69631787T2
Application number: DE69631787T
Authority: DE
Inventors: M. Jay SHORT
Original assignee: Diversa Corp
Current assignee: BASF Enzymes LLC
Priority date: 1995-12-07
Filing date: 1996-12-06
Publication date: 2005-03-10
Anticipated expiration: 2016-12-07
Also published as: AU720334B2; EP0866853A4; CA2239686A1; EP0866853B1; IL124794A; ATE260987T1; WO1997020918A1; EP1130090A3; JP2000501606A; IL124794A0; JP2001078786A; AU1148997A; EP1130090A2; EP0866853A1; DE69631787D1

Description

Die vorliegende Anmeldung ist eine teilweise Fortsetzung der US-Anmeldung Serien-Nr. 08/692 002, angemeldet am 2. August 1996 (schwebend), die eine teilweise Fortsetzung der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/008 317 ist, die am 7. Dezember 1995 angemeldet wurde (schwebend); eine teilweise Fortsetzung der US-Anmeldung Serien-Nr. 08/ 651 568, angemeldet am 22. Mai 1996 (schwebend), die eine teilweise Fortsetzung der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/008 316 ist, die am 7. Dezember 1995 angemeldet wurde (schwebend); eine teilweise Fortsetzung der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/008 311, die am 7. Dezember 1995 angemeldet wurde (schwebend).
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung und Durchmusterung von Expressionsbanken auf eine Enzymaktivität und insbesondere die Gewinnung einer ausgewählten DNA aus der DNA eines Mikroorganismus und die Durchmusterung einer Expressionsbank auf eine Enzymaktivität, die aus der ausgewählten DNA produziert wird, die gezielte Mutagenese einer DNA und die Durchmusterung von Clonen, die die mutagenisierte DNA enthalten, auf ein resultierendes spezifisches Protein, insbesondere ein Enzym, eine Aktivität (Aktivitäten) von Interesse und thermostabile Enzyme, insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung thermostabile Enzyme, die bei hohen Temperaturen stabil sind und die bei niedrigeren Temperaturen eine verbesserte Aktivität aufweisen.
In US 5 352 778 wurde ein Verfahren zum Isolieren einer rekombinanten DNA-Polymerase aus Archaebakterien beschrieben. Dieses Verfahren umfasst den Schritt des Konstruierens einer DNA-Sonde mit einer Spezifität für eine bestimmte DNA-Polymerase aus einem bestimmten Archaebacterium und die Verwendung der Sonde zum Identifizieren und Isolieren einer DNA, die eine DNA-Polymerase aus einem anderen Archaebacterium codiert. Die isolierte DNA wird gemäß US 5 352 778 zum Konstruieren von Expressionsvektoren eingesetzt, so dass kommerzielle Mengen der Ziel-DNA-Polymerase hergestellt werden können.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst den Schritt des Bereitstellens einer ersten Bank mit DNA, die von mindestens einem Mikroorganismus erhalten wird, vor dem Schritt des Erzeugens einer DNA-Teilmenge durch Verwendung einer Nucleinsäuresonde, die für ein gemeinsames Enzym charakteristisch ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Industrie hat den Bedarf für neue Enzyme für eine Vielzahl von gewerblichen Anwendungen erkannt. Folglich wurden verschiedene Mikroorganismen durchgemustert, um zu testen, ob solche Mikroorganismen eine gewünschte Enzymaktivität besitzen. Wenn solche Mikroorganismen die gewünschte Enzymaktivität aufweisen, wird anschließend das Enzym aus ihnen gewonnen. Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Vorgehensweise zum Gewinnen von Enzymen für eine weitere Anwendung bereit, z.B. für eine Vielzahl von gewerblichen Anwendungen, für medizinische Anwendungen, zum Verpacken in Kits für die Verwendung als Reagenzien für die Forschung usw..
Somit werden gemäß der vorliegenden Erfindung rekombinante Enzyme aus Mikroorganismen erzeugt und durch verschiedene Enzymmerkmale klassifiziert. Insbesondere stellt ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren von Clonen, die eine spezifische Enzymaktivität aufweisen, bereit und wird in Anspruch 1 beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts wird eine DNA, die von mindestens einem Mikroorganismus erhalten wird, selektiert, indem aus der DNA eine DNA gewonnen wird, die spezifisch an eine Sonden-DNA-Sequenz bindet, z.B. durch Hybridisierung. Die von dem Mikroorganismus oder den Mikroorganismen erhaltene DNA kann eine genomische DNA oder eine DNA einer genomischen Genbank sein. Man könnte auch eine DNA verwenden, die z.B. für eine Vektorligierung hergestellt wurde. Die Sonde kann direkt oder indirekt an eine feste Phase gebunden sein, hierdurch kann sie von der DNA abgetrennt werden, die weder mit der Sonde hybridisiert noch auf andere Weise spezifisch daran gebunden ist. Das Verfahren kann auch die Freisetzung der DNA von der Sonde nach Gewinnung der hybridisierten oder auf andere Weise gebundenen DNA und die Amplifikation der auf diese Weise freigesetzten DNA umfassen.
Ein Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung eines Enzyms mit einer spezifischen Enzymaktivität bereit, das von einer heterogenen DNA-Population hergeleitet ist, wobei das Verfahren das Durchmustern einer Bank von Clonen auf die spezifische Enzymaktivität umfasst, enthaltend eine DNA aus der heterogenen DNA-Population, die für die Produktion der spezifischen Enzymaktivität einer gezielten Mutagenese ausgesetzt wurden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung eines Enzyms mit einer spezifischen Enzymaktivität bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Durchmustern einer Bank von Clonen auf die spezifische Enzymaktivität, enthaltend eine DNA aus einem Pool von DNA-Populationen, die einer gezielten Mutagenese ausgesetzt wurden, in einem Versuch, in der Bank von Clonen eine DNA zu erzeugen, die ein Enzym mit einem oder mehreren gewünschten Merkmalen codiert, welche die gleiche oder eine unterschiedliche spezifische Enzymaktivität sein können. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der DNA-Pool, der einer gezielten Mutagenese unterworfen wird, ein Pool von DNA, der so selektiert wurde, dass dieser Enzyme codiert, die mindestens ein Enzymmerkmal, insbesondere mindestens eine gemeinsame Enzymaktivität, besitzen.
Das Verfahren nach einem dieser Aspekte kann vor der gezielten Mutagenese weiterhin ein selektives Gewinnen einer DNA aus der heterogenen DNA-Population umfassen, wobei die DNA Sequenzen umfasst, die Enzyme codieren, welche mindestens ein gemeinsames Merkmal besitzen, welches die gleiche oder eine unterschiedliche spezifische Enzymaktivität sein kann. Vorzugsweise umfasst das Gewinnen der DNA-Präparation ein Inkontaktbringen der DNA-Population mit einem spezifischen Bindungspartner, z.B. einer an eine Festphase gebundenen Hybridisierungssonde, der für mindestens einen Teil der Sequenzen codiert. Das gemeinsame Merkmal kann z.B. eine Klasse einer Enzymaktivität, z.B. eine Hydrolase-Aktivität, sein. Die DNA wird aus Clonen gewonnen, enthaltend eine DNA aus der heterogenen DNA-Population, welche die Enzymaktivität-Klasse aufweisen. Vorzugsweise ist die gezielte Mutagenese eine ortsspezifische gezielte Mutagenese. Das Verfahren dieses Aspekts kann weiterhin einen Schritt zur Vordurchmusterung der Bank von Clonen auf eine Aktivität umfassen, welche die gleiche oder eine unterschiedliche spezifische Enzymaktivität sein kann, bevor sie einer gezielten Mutagenese ausgesetzt werden. Diese Aktivität kann das Ergebnis von z.B. der Expression eines Proteins von Interesse sein.
Die heterogene DNA-Population, aus der die DNA-Bank hergeleitet wird, ist ein komplexes Gemisch aus DNA, das z.B. aus einer Umweltprobe gewonnen wird. Solche Proben können mehrere oder einzelne nicht-kultivierbare, nicht-kultivierte oder kultivierte Organismen umfassen. Diese Umweltproben können z.B. aus dem Eis der Arktis oder Antarktis, aus Wasser- oder Permafrostmaterial, Stoffen vulkanischen Ursprungs, Stoffen aus Boden oder Pflanzen in tropischen Gebieten usw. stammen. Eine Vielzahl bekannter Techniken kann angewendet werden, um die Umweltprobe auf Organismen von Interesse anzureichern, umfassend differenzierende Züchtung, Sedimentationsgradient, Affinitätsmatrizes, Kappillar- Elektrophorese, optische Pinzetten und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung. Die Proben können auch Kulturen eines einzelnen Organismus darstellen.
Thermostabile Enzyme sind Enzyme, die bei mehr als 60°C funktionsfähig sind. Thermostabile Enzyme werden sowohl im industriellen Bereich als auch in der biomedizinischen Forschung in Tests eingesetzt, wobei bestimmte Schritte des Tests bei signifikant erhöhten Temperaturen durchgeführt werden. Thermostabile Enzyme können aus thermophilen Organismen gewonnen werden, die in heißen Quellen, Material vulkanischen Ursprungs, tropischen Gebieten usw. gefunden werden. Beispiele solcher Organismen umfassen z.B. prokaryotische Mikroorganismen, z.B. Eubakterien und Archaebakterien (Bronneomerier, K., und Staudenbauer, W. L., D. R. Woods (Hrsg.), „The Clostridia and Biotechnology", Butterworth Publishers, Stoneham, M. A., (1993), und andere Organismen.
Thermostabile Enzyme zeigen im Vergleich zu ihren mesophilen Gegenstücken eine größere Haltbarkeit und Widerstandsfähigkeit gegenüber organischen Lösungsmitteln.
Es gibt Anwendungen in der Industrie und in der Forschung für thermostabile Enzyme, die bei einer gewünschten Mindesttemperatur eine Enzymaktivität zeigen. Ein Beispiel hierfür betrifft molekulare Diagnostika, bei denen Reportermoleküle eine langfristige Lagerung bei Raumtemperatur oder bei einer höheren Temperatur überstehen oder in unüblichen Umgebungen funktionieren müssen, wobei die Tests, in denen sie eingesetzt werden, bei Raumtemperatur durchgeführt werden, bei der die Aktivität thermostabiler Enzyme im Allgemeinen sehr niedrig ist.
Somit stellt eine weitere Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung eines thermostabilen Enzyms bereit, das verbesserte Enzymaktivitäten bei niedrigeren Temperaturen besitzt, wobei das Enzym ein Mitglied aus der Gruppe ist, die aus einem Enzym oder einem das Enzym codierenden Polynucleotid besteht, umfassend:

(a) Unterwerfen mindestens eines Enzyms, das bei einer Temperatur von mindestens 60°C stabil ist, einer Mutagenese; und
(b) Durchmustern der in (a) produzierten Mutanten auf ein mutiertes Enzym oder ein Polynucleotid, das ein mutiertes Enzym codiert, wobei das mutierte Enzym bei einer Temperatur von mindestens 60°C stabil ist, eine Enzymaktivität bei einer Temperatur von weniger als 50°C aufweist und eine Aktivität besitzt, die größer als die des Enzyms von Schritt (a) ist.

Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann aus den hier vorliegenden Angaben ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A und 1B: 1A zeigt ein Foto eines Agarose-Gels, das Standards und die Proben a bis f enthält, die in Beispiel 2 beschrieben sind. Die Proben c bis f stellen eine DNA dar, die aus einer genomischen DNA-Bank unter Verwendung von zwei spezifischen DNA-Sonden gewonnen und unter Verwendung von Gen-spezifischen Primern amplifiziert wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben. 1B zeigt auch ein Foto eines Agarose-Gels, das Standards und die Proben a bis f enthält, die in Beispiel 2 beschrieben sind. Die Proben c bis f stellen eine DNA dar, die aus einer genomischen DNA-Bank unter Verwendung von zwei spezifischen DNA-Sonden gewonnen und unter Verwendung von Vektor-spezifischen Primern amplifiziert wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben.
2 zeigt ein Foto von vier Koloniehybridisierungs-Platten. Die Platten A und B zeigten positive Clone, d.h. Kolonien, die eine DNA enthielten, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde und die auch die Sondensequenz enthielt. Die Platten C und D waren Kontrollen und zeigten keine positiven Clone.
3 erläutert die Volllängen-DNA-Sequenz und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz der Beta-Glykosidase von Thermococcus 9N2.
Genaue Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
Die Begriffe „hergeleitet" oder „isoliert" bedeuten, dass Material aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wurde (z.B. der natürlichen Umgebung, sofern es in der Natur vorkommt). Z.B. ist ein in der Natur vorkommendes Polynucleotid oder Polypeptid, das in einem lebenden Tier vorkommt, nicht isoliert, während das gleiche Polynucleotid oder Polypeptid isoliert ist, wenn es von einigen oder allen der im natürlichen System gleichzeitig vorliegenden Stoffen abgetrennt wurde.
Der Begriff „fehleranfällige PCR" bezieht sich auf ein Verfahren zum Durchführen einer PCR unter Bedingungen, bei denen die Kopietreue der DNA-Polymerase gering ist, so dass eine hohe Rate von Punktmutationen entlang der gesamten Länge des PCR-Produkts entsteht. Leung, D. W., et al., Technique 1: 11-15 (1989); und Caldwell, R. C., und Joyce, G. F., PCR Methods Applic. 2: 28-33 (1992).
Der Begriff „Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese" bezieht sich auf ein Verfahren, das die Erzeugung von ortsspezifischen Mutationen in einem beliebigen clonierten DNA-Segment von Interesse möglich macht. Reidhaar-Olson, J. F., und Sauer, R. T., et al., Science 241: 53-57 (1988).
Der Begriff „Assembly-PCR" bezieht sich auf ein Verfahren, das den Zusammenbau eines PCR-Produkts aus einem Gemisch kleiner DNA-Fragmente umfasst. Eine größere Zahl verschiedener PCR-Reaktionen läuft gleichzeitig in dem gleichen Reaktionsgefäß ab, wobei die Produkte der einen Reaktion die Produkte einer anderen Reaktion primen.
Der Begriff „sexuelle PCR-Mutagenese" bezieht sich auf eine forcierte homologe Rekombination zwischen DNA-Molekülen mit einer unterschiedlichen, jedoch nah verwandten DNA-Sequenz in vitro, die ausgelöst wird durch eine zufällige Fragmentierung des DNA-Moleküls, basierend auf Sequenzhomologie, worauf eine Fixierung des Crossovers durch Primerverlängerung in einer PCR-Reaktion folgt. Stemmer, W. P., PNAS USA 91: 10747-10751 (1994).
Der Begriff „in vivo-Mutagenese" bezieht sich auf ein Verfahren zum Erzeugen von zufälligen Mutationen in einer beliebigen clonierten DNA von Interesse, umfassend die Vermehrung der DNA in einem E. coli-Stamm, der Mutationen in einem oder mehreren DNA-Reparatur-Stoffwechselwegen enthält. Diese „Mutator"-Stämme weisen eine höhere Rate für Zufallsmutationen auf als der Wildtyp-Elternstamm. Durch Vermehren der DNA in einem dieser Stämme werden schließlich innerhalb der DNA Zufallsmutationen erzeugt.
Der Begriff „Kassetten-Mutagenese" bezieht sich auf ein beliebiges Verfahren zum Ersetzen einer kleinen Region eines doppelsträngigen DNA-Moleküls durch eine synthetische Oligonucleotid-„Kassette", die sich von der nativen Sequenz unterscheidet. Das Oligonucleotid enthält häufig eine vollständig und/oder teilweise randomisierte native Sequenz.
Der Begriff „rekursive Ensemble-Mutagenese" bezieht sich auf einen Algorithmus für Protein-Engineering (Protein-Mutagenese), der entwickelt wurde, um verschiedene Populationen von phänotypisch verwandten Mutanten zu produzieren, deren Mitglieder sich in der Aminosäuresequenz unterscheiden. Bei diesem Verfahren wird ein Feedback-Mechanismus eingesetzt, mit dem die aufeinander folgenden Runden der kombinatorischen Kassetten-Mutagenese gesteuert werden. Arkin, A. P., und Youvan, D. C., PNAS USA 89: 7811-7815 (1992).
Der Begriff „exponentielle Ensemble-Mutagenese" bezieht sich auf ein Verfahren zum Erzeugen kombinatorischer Banken mit einem hohen Prozentsatz von einmaligen und funktionellen Mutanten, wobei kleine Gruppen von Resten parallel randomisiert werden, so dass an jeder veränderten Position Aminosäuren identifiziert werden können, die zu funktionellen Proteinen führen, Delegrave, S., und Youvan, D. C., Biotechnology Research 11: 1548-1552 (1993); sowie eine zufällige und ortsspezifische Mutagenese, Arnold, F. H., Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455 (1993). Alle vorstehend erwähnten Referenzen sind hierdurch in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen.
In einem anderen Aspekt, wie hinsichtlich eines der vorstehenden Aspekte beschrieben, stellt die Erfindung ein Verfahren zum Durchmustern von Clonen, die eine ausgewählte, aus einem Mikroorganismus hergeleitete DNA enthalten, auf eine Enzymaktivität bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
Durchmustern einer Bank auf eine spezifische Enzymaktivität, wobei die Bank eine Vielzahl von Clonen enthält, wobei die Clone durch Gewinnung einer ausgewählten DNA aus einer DNA eines Mikroorganismus hergestellt wurden, wobei die DNA durch Hybridisierung mit mindestens einer DNA-Sequenz ausgewählt wird, die die gesamte oder einen Teil einer DNA-Sequenz darstellt, die ein Enzym codiert, welches die spezifische Aktivität besitzt; und Transformieren eines Wirts mit der ausgewählten DNA, um Clone zu erzeugen, die auf die spezifische Enzymaktivität durchgemustert werden.
In einer Ausführungsform wird eine von einem Mikroorganismus hergeleitete DNA-Bank einem Selektionsverfahren unterworfen, wodurch hieraus eine DNA selektiert wird, die mit einer oder mehreren DNA-Sondensequenzen hybridisiert, wobei es sich um die gesamte oder einen Teil einer DNA-Sequenz handelt, die ein Enzym codiert, welches die spezifische Aktivität besitzt, durch:

(a) Umwandeln der doppelsträngigen DNA-Population in eine einzelsträngige DNA-Population;
(b) Inkontaktbringen der einzelsträngigen DNA-Population aus (a) mit einer DNA-Sonde, die an einen Liganden gebunden ist, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zulassen, so dass ein doppelsträngiger Komplex aus der Sonde und den hiermit hybridisierenden Mitgliedern der DNA-Population erzeugt wird;
(c) Inkontaktbringen des doppelsträngigen Komplexes aus (b) mit einem spezifischen Festphasen-Bindungspartner für den Liganden, so dass ein Festphasen-Komplex hergestellt wird;
(d) Abtrennen des Festphasen-Komplexes von der einzelsträngigen DNA-Population aus (b);
(e) Freisetzen der Mitglieder der Population, die sich mit der an der Festphase gebundenen Sonde verknüpft hatten, von der Sonde;
(f) Bilden einer doppelsträngigen DNA aus den Mitgliedern der Population aus (e);
(g) Einführen der doppelsträngigen DNA aus (f) in einen geeigneten Wirt, um eine Bank zu erzeugen, die eine Vielzahl von Clonen enthält, welche die ausgewählte DNA enthalten; und
(h) Durchmustern der Bank auf die spezifische Enzymaktivität.

In einer anderen Ausführungsform wird eine von einem Mikroorganismus hergeleitete DNA-Bank einem Selektionsverfahren unterworfen, um hieraus eine doppelsträngige DNA zu selektieren, die mit einer oder mehreren DNA- Sondensequenzen hybridisiert, die die gesamte oder einen Teil einer DNA-Sequenz darstellt, die ein Enzym codiert, welches die spezifische Aktivität besitzt, durch:

(a) Inkontaktbringen der doppelsträngigen DNA-Population mit einer an einen Liganden gebundenen DNA-Sonde unter Bedingungen, die eine Hybridisierung erlauben, so dass ein Komplex aus der Sonde und den hiermit hybridisierenden Mitgliedern der DNA-Population erzeugt wird;
(b) Inkontaktbringen des Komplexes aus (a) mit einem spezifischen Festphasen-Bindungspartner für den Liganden, so dass ein Festphasen-Komplex hergestellt wird;
(c) Abtrennen des Festphasen-Komplexes von der ungebundenen DNA-Population aus (b);
(d) Freisetzen der Mitglieder der Population, die sich mit der an der Festphase gebundenen Sonde verknüpft hatten, von der Sonde;
(e) Einführen der doppelsträngigen DNA aus (d) in einen geeigneten Wirt, um eine Bank zu erzeugen, die eine Vielzahl von Clonen enthält, welche die ausgewählte DNA enthalten; und
(f) Durchmustern der Bank auf die spezifische Enzymaktivität.

In einem anderen Aspekt umfasst das Verfahren eine Vorselektion, um eine DNA zu gewinnen, die Signal- oder Sekretionssequenzen enthält. Auf diese Weise ist es möglich, aus der DNA-Population durch Hybridisierung wie vorstehend beschrieben nur die DNA zu selektieren, die eine Signal- oder Sekretionsequenz enthält. In den folgenden Abschnitten werden das Protokoll für diese Ausführungsform der Erfindung, die Natur und die Funktion der Sekretionssignalsequenzen im Allgemeinen und eine spezifische beispielhafte Verwendung solcher Sequenzen in einem Test oder Selektionsverfahren beschrieben.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Aspekts umfasst ferner, nach (a), jedoch vor dem vorstehenden (a), die folgenden Schritte:

(i) Inkontaktbringen der doppelsträngigen DNA-Population aus (a) mit einer Ligand-gebunden Oligonucleotidsonde, die zu der Sekrektionssignalsequenz komplementär ist, die für eine bestimmte Klasse von Proteinen einmalig ist, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung erlauben, um einen doppelsträngigen Komplex zu erzeugen;
(ii) Inkontaktbringen des Komplexes aus (a i) mit einem spezifischen Festphase-Bindungspartner für den Liganden, so dass ein Festphasen-Komplex hergestellt wird;
(iii) Abtrennen des Festphasen-Komplexes von der ungebundenen DNA-Population;
(iv) Freisetzen der Mitglieder der Population, die sich mit der an der Festphase gebundenen Sonde verknüpft hatten; und
(v) Abtrennen der an der Festphase gebundenen Sonde von den Mitgliedern der Population, die sich hiermit verknüpft hatten.

Anschließend wird die DNA, die so selektiert und isoliert wurde, dass sie eine Signalsequenz enthält, dem vorstehend beschriebenen Selektionsverfahren unterworfen, um hieraus die DNA zu selektieren und isolieren, die an eine oder mehrere DNA-Sondensequenzen bindet, die von einer DNA hergeleitet wurde/wurden, welche ein Enzym (Enzyme) mit einer spezifischen Enzymaktivität codiert.
Die Stoffwechselwege, durch die Proteine sortiert und zu ihrem richtigen Ort in der Zelle transportiert werden, werden häufig als „Protein Targeting"-Stoffwechselwege bezeichnet. Eines der wichtigsten Elemente in allen diesen Zielsteuerungssystemen ist eine kurze Aminosäuresequenz am Aminoterminus eines neu synthetisierten Polypeptids, die Signalsequenz genannt wird. Diese Signalsequenz steuert ein Protein zu seinem passenden Ort in der Zelle und wird während des Transports entfernt, oder sie wird entfernt, wenn das Protein seinen endgültigen Bestimmungsort erreicht hat. Die meisten Iysosomalen, Membran- oder sekretierten Proteine weisen eine aminoterminale Signalsequenz auf, die sie für eine Ortsveränderung ins Lumen des endoplasmatischen Retikulums markiert. Mehr als 100 Signalsequenzen für Proteine dieser Gruppe wurden bestimmt. Die Sequenzen variieren in der Länge von 13 bis 36 Aminosäureresten.
Ein phoA-Expressionsvektor, der pMG genannt wird, kann wie TaphoA eingesetzt werden, um Gene zu identifizieren, die Membran-überspannende Sequenzen oder Signalpeptide codieren. Giladi et al., J. Bacteriol. 175 (13): 4129-4136, 1993. Dieses Clonierungssystem wurde modifiziert, um die Unterscheidung zwischen Fusionsproteinen aus der äußeren Membran und der periplasmatischen alkalischen Phosphatase (AP) und Innere-Membran-AP-Fusionsproteinen zu erleichtern, indem pMG-Rekombinanten in E. coli KS330 transformiert wurden, wobei es sich um den Stamm handelt, der in dem „blue halo"-Test verwendet wird, der erstmals von Strauch und Beckwith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1576-1580 (1988), beschrieben wurde. Die Vorgehensweise mit pMG/KS330r^–-Clonierung und Durchmusterung kann zum Identifizieren von Genen eingesetzt werden, die Proteine mit abspaltbaren Signalpeptiden codieren, und sie kann somit als ein erster Schritt bei der Identifizierung von Genen dienen, die Polypeptide von Interesse codieren.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung eines Enzyms mit einer spezifischen Enzymaktivität bereit, das aus einer heterogenen DNA-Population hergeleitet wurde, indem eine Bank von Clonen, enthaltend eine DNA aus der heterogenen DNA-Population, die für die Produktion der spezifischen Enzymaktivität einer gezielten Mutagenese unterworfen wurden, auf die spezifische Enzymaktivität durchgemustert wird. Das Verfahren kann weiterhin vor der gezielten Mutagenese eine selektive Gewinnung einer DNA aus der heterogenen DNA-Population umfassen, die DNA-Sequenzen umfasst, die ein gemeinsames Merkmal codieren, welches die gleiche oder eine unterschiedliche spezifische Enzymaktivität sein kann. Das gemeinsame Merkmal kann z.B. eine Klasse einer Enzymaktivität sein. Dies umfasst das Gewinnen einer DNA aus Clonen, die eine DNA aus der heterogenen DNA-Population enthalten, welche die Enzymaktivität-Klasse aufweist.
In dieser Ausführungsform wird die Gewinnung des DNA-Präparats vorzugsweise durchgeführt, indem die DNA-Population mit einem spezifischen Bindungspartner, z.B. einer an eine Festphase gebundenen Hybridisierungssonde, für mindestens einen Teil der codierenden Sequenzen, in Kontakt gebracht wird.
Das Verfahren dieser Ausführungsform kann weiterhin eine Vordurchmusterung der Bank von Clonen auf eine Aktivität umfassen, welche die gleiche oder eine unterschiedliche spezifische Enzymaktivität sein kann, bevor sie einer gezielten Mutagenese ausgesetzt werden. Die Vordurchmusterung der Clone kann z.B. auf die Expression eines Proteins von Interesse erfolgen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung eines Enzyms mit einer spezifischen Enzymaktivität bereit, wobei das Verfahren ein Durchmustern einer Bank von Clonen auf die spezifische Enzymaktivität umfasst, enthaltend eine DNA aus einem Pool, von DNA-Populationen, die einer gezielten Mutagenese ausgesetzt wurden, die eine ortsspezifische Mutagenese sein kann, in einem Versuch, in der Bank von Clonen eine DNA zu produzieren, die ein Enzym mit einem oder mehreren gewünschten Merkmalen codiert, welche die gleiche oder eine unterschiedliche spezifische Enzymaktivität sein können. Das Verfahren dieser Ausführungsform kann weiterhin vor der gezielten Mutagenese eine selektive Gewinnung einer DNA aus der heterogenen DNA-Population umfassen, wobei die DNA Sequenzen umfasst, die mindestens ein gemeinsames Enzymmerkmal codieren, welches die gleiche oder eine unterschiedliche spezifische Enzymaktivität sein kann.
In dieser Ausführungsform kann die Gewinnung der DNA-Präparation das Inkontaktbringen der DNA-Population mit einem spezifischen Bindungspartner für mindestens einen Teil der codierenden Sequenzen umfassen. Der spezifische Bindungspartner ist eine an eine Festphase gebundene Hybridisierungssonde. Die DNA wird aus Clonen gewonnen, enthaltend eine DNA aus der heterogenen DNA-Population, welche die Enzymaktivität-Klasse zeigen.
Der Anmelder hat herausgefunden, dass es möglich ist, thermostabile Enzyme bereitzustellen, die eine verbesserte Aktivität bei niedrigeren Temperaturen besitzen. Insbesondere hat der Anmelder herausgefunden, dass die Aktivität von thermophilen Enzymen bei niedrigeren Temperaturen verbessert werden kann, während die Temperaturstabilität solcher Enzyme erhalten bleibt. Weiterhin wurde herausgefunden, dass ein thermostabiles Enzym mit einer verbesserten Aktivität bei niedrigeren Temperaturen erhalten werden kann, indem ein thermostabiles Enzym oder ein Polynucleotid, das ein solches thermostabiles Enzym codiert, einer Mutagenese ausgesetzt wird, worauf eine Durchmusterung der resultierenden Mutanten folgt, um ein mutiertes Enzym oder ein mutiertes Polynucleotid, das ein mutiertes Enzym codiert, zu identifizieren, wobei das mutierte Enzym die Thermostabilität beibehält und eine Enzymaktivität bei niedrigeren Temperaturen besitzt, die mindestens zweimal (2x) größer ist als die eines entsprechenden nicht-mutierten Enzyms.
Die thermostabilen Enzyme und die mutierten thermostabilen Enzyme sind bei Temperaturen bis zu 60°C stabil, und vorzugsweise sind sie bei Temperaturen bis zu 70°C und am stärksten bevorzugt bei Temperaturen bis zu 95°C und höher stabil.
Eine erhöhte Aktivität von mutierten thermostabilen Enzymen bei niedrigeren Temperaturen soll Aktivitäten umfassen, die mindestens zweimal, vorzugsweise mindestens viermal und stärker bevorzugt mindestens zehnmal größer sind als die des entsprechenden Wildtyp-Enzyms.
Eine erhöhte Enzymaktivität bei niedrigeren Temperaturen bedeutet, dass die Enzymaktivität bei einer Temperatur unter 50°C, vorzugsweise unter 40°C und stärker bevorzugt unter 30°C erhöht ist. So ist beim Vergleich der Enzymaktivität bei einer niedrigeren Temperatur zwischen dem mutierten und dem nicht-mutierten Enzym die Enzymaktivität des mutierten Enzyms bei einer definierten niedrigeren Temperatur mindestens zweimal größer als die Enzymaktivität des entsprechenden nicht-mutierten Enzyms.
Somit umfassen niedrigere Temperaturen und niedrigere Temperaturbereiche Temperaturen, die mindestens 5°C unter der Temperatur liegen, bei der die thermostabilen Enzyme stabil sind, umfassend Temperaturen unter 55°C, 50°C, 45°C, 40°C, 35°C, 30°C, 25°C und 20°C, wobei unter 50°C bevorzugt ist, unter 40°C stärker bevorzugt ist und unter 30°C (oder etwa Raumtemperatur) am stärksten bevorzugt ist.
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird die niedrigere Temperatur oder der niedrigere Temperaturbereich, bei dem eine größere Enzymaktivität gewünscht wird, bestimmt, und ein thermostabiles Enzym (thermostabile Enzyme) oder ein Polynucleotid, das ein solches Enzym (solche Enzyme) codiert, wird (werden) einer Mutagenese unterworfen, und die resultierenden Mutanten werden durchgemustert, um mutierte Enzyme (oder Polynucleotide, die mutierte Enzyme codieren) zu bestimmen, welche die Thermostabilität beibehalten und eine mindeste gewünschte Zunahme der Enzymaktivität bei der gewünschten Temperatur oder dem gewünschten Temperaturbereich aufweisen.
Thermostabile Enzyme sind Enzyme, die bei Temperaturen über 60°C eine Aktivität besitzen, d.h. nicht abgebaut werden. Thermostabile Enzyme weisen auch eine längere Haltbarkeit und eine hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber organischen Lösungsmitteln auf.
Thermostabile Enzyme können aus thermophilen Organismen isoliert werden, z.B. solchen, die in erhöhten Temperaturen gefunden werden, z.B. in heißen Quellen, vulkanischen Gebieten und tropischen Gegenden. Beispiele von thermophilen Organismen sind prokaryotische Organismen, z.B. thermophile Bakterien wie Eubakterien und Archaebakterien.
Anschließend kann die DNA aus diesen thermostabilen Organismen durch verfügbare Techniken isoliert werden, die in der Literatur beschrieben sind. Für diesen Zweck ist das IsoQuick^® Nucleinsäure-Extraktionskit (MicroProbe Corporation) geeignet.
Andererseits können auch Enzyme, von denen nicht bekannt ist, dass sie thermostabile Eigenschaften besitzen, auf solche Eigenschaften getestet werden, indem die das Enzym codierende DNA in einen Expressionsvektor eingefügt und ein geeigneter Wirt wie nachstehend beschrieben transformiert wird, so dass das Enzym exprimiert und auf eine positive thermostabile Aktivität durchgemustert werden kann.
Die ein thermostabiles Enzym codierende isolierte DNA wird Mutagenesetechniken unterworfen, wobei der bevorzugte Typ von Mutagenesetechniken hier beschrieben wird.
Wie aus den vorstehend definierten Mutagenesetechniken ersichtlich ist, kann die DNA, die ein Enzym mit der gewünschten Aktivität codiert, alleine, d.h. als nackte DNA, einer Mutagenese unterworfen werden, oder die DNA kann einer Mutagenese unterworfen werden, nachdem sie in einen geeigneten Vektor wie hier beschrieben eingefügt wurde. Diese Techniken werden als in vitro-Mutagenese bezeichnet.
Andererseits kann auch eine in vivo-Mutagenese durchgeführt werden, bei der die DNA einer Mutagenese unterworfen wird, während sie innerhalb einer Zelle oder eines lebenden Organismus vorliegt. Ein bevorzugtes Beispiel dieser Technik nutzt den Stamm XL1 Red von E. coli (Stratagene, Inc.), bei dem seine DNA-Reparatur-Gene, Mutti, MutL und Muts, deletiert sind, so dass in kurzer Zeit zahlreiche verschiedene Mutationen auftreten. Bis zu 10 000 Mutationen können innerhalb einer Zeitspanne von 30 Stunden stattfinden, so dass aus einer mutierten DNA durch Verfahren nach dem Stand der Technik eine vollständige mutierte DNA-Bank hergestellt werden kann.
Nach einem geeigneten Zeitraum, in dem die Mutationen zugelassen werden, wird die mutierte DNA im Fall einer in vivo-Mutagenese aus der Wirtszelle ausgeschnitten und in einen anderen geeigneten Vektor eingefügt und zur Transformation eines Nicht-Mutator-Wirts, z.B. des Stamms XL1 Blue von E. coli, verwendet, danach wird eine mutierte DNA-Bank hergestellt. Im Fall einer in vitro-Mutagenese, sofern die mutierte DNA vorher in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt wurde, wird der Vektor anschließend direkt zur Transformation eines geeigneten Nicht-Mutator-Wirts verwendet, um eine mutierte DNA-Bank herzustellen, sofern die mutagenisierte DNA nicht in einem geeigneten Expressionsvektor vorliegt.
Eine Bank wird zur Durchmusterung vorbereitet, indem ein geeigneter Organismus transformiert wird. Wirte, insbesondere solche, die hier spezifisch als bevorzugt angegeben sind, werden transformiert, indem die Vektoren, die die mutierte DNA enthalten, durch Beimpfen unter Bedingungen, die für eine solche Transformation förderlich sind, künstlich eingeführt werden.
Sodann werden die resultierenden Banken von transformierten Clonen auf Clone durchgemustert, die in einem phänotypischen Test auf Enzymaktivität eine Aktivität für das Enzym von Interesse zeigen.
Nachdem z.B. eine Vielzahl von Clonen aus einer durch eine der vorstehend beschriebenen Techniken mutagenisierten DNA hergestellt wurde, werden solche Clone auf die spezifische Enzymaktivität von Interesse durchgemustert.
Z.B. werden die Clone, welche die mutierte DNA enthalten, nun Durchmusterungsverfahren unterworfen, um ihre Aktivität sowohl bei höheren Temperaturen als auch in dem gewünschten niedrigeren Temperaturbereich zu bestimmen, um Mutanten zu identifizieren, welche die gewünschte Zunahme der Aktivität im niedrigeren Temperaturbereich aufweisen, im Vergleich zu dem entsprechenden thermostabilen Wildtyp-Enzym, das nicht mutiert ist.
Positiv identifizierte Clone, d.h. diejenigen, die mutierte DNA-Sequenzen enthalten, welche thermostabile Enzyme exprimieren, die thermostabil sind und noch eine mindestens zweimal erhöhte Aktivität im Vergleich zu dem entsprechenden Wildtyp-Enzym bei Temperaturen innerhalb des niedrigeren Temperaturbereichs aufweisen, werden isoliert und sequenziert, um die DNA-Sequenz zu identifizieren. Z.B. kann die Phosphatase-Aktivität in den gewünschten niedrigeren Temperaturbereichen identifiziert werden, indem die Clone und somit das thermostabile Enzym diesen ausgesetzt und seine Fähigkeit getestet wird, ein geeignetes Substrat zu spalten.
In Beispiel 7 werden die Aktivität der Phosphatase und der β-Galactosidase gemessen, indem die Wildtyp-Enzyme mit den Enzymen verglichen werden, die einer Mutagenese ausgesetzt wurden. Wie aus den hier angegebenen Ergebnissen ersichtlich ist, werden durch die Mutagenese eines thermophilen Wildtyp-Phosphatase- und β-Galactosidase-Enzyms mutierte Enzyme erzeugt, die bei niedrigeren Temperaturen 3- bzw. 2,5-mal aktiver sind als die entsprechenden Wildtyp-Enzyme innerhalb des niedrigeren Temperaturbereichs der Raumtemperatur.
Im Fall des Protein-Engineering wird, nachdem ein thermophiles Enzym einer Mutagenese unterworfen wurde, das mutagenisierte Enzym auf die gewünschte Aktivität durchgemustert, nämlich auf eine erhöhte Aktivität bei niedrigeren Temperaturen, während die Aktivität bei höheren Temperaturen erhalten bleibt. Jedes der bekannten Verfahren der Protein-Mutagenese kann verwendet werden, wobei die vorstehend beschriebenen Mutagenesetechniken besonders bevorzugt sind.
Die von einem Mikroorganismus (Mikroorganismen) hergeleitete DNA wird vorzugsweise in einen geeigneten Vektor eingefügt (im Allgemeinen in einen Vektor, der geeignete regulatorische Sequenzen zur Durchführung der Expression enthält), bevor eine solche DNA einem Selektionsverfahren unterworfen wird, um daraus eine DNA zu selektieren und isolieren, die mit einer DNA hybridisiert, die von einer DNA hergeleitet wurde, die ein Enzym (Enzyme) mit der spezifischen Enzymaktivität codiert.
Die Mikroorganismen, aus denen die Banken hergestellt werden können, umfassen prokaryotische Mikroorganismen, z.B. Eubakterien und Archaebakterien, sowie niedere eukaryotische Mikroorganismen, wie Pilze, einige Algen und Protozoen. Die Mikroorganismen können kultivierte Mikroorganismen oder nicht-kultivierte Mikroorganismen sein, die aus Umweltproben gewonnen werden, wobei solche Mikroorganismen Extremophile sein können, z.B. Thermophile, Hyperthermophile, Psychrophile, Psychrotrophe usw..
Wie vorstehend angegeben kann die Bank aus Umweltproben hergestellt werden, in diesem Fall kann die DNA ohne Kultivieren eines Organismus gewonnen werden, oder die DNA kann aus einem kultivierten Organismus gewonnen werden.
Quellen, die sich für eine Mikroorganismus-DNA als Ausgangsmaterial für die Gewinnung einer Ziel-DNA eignen, sollen insbesondere Umweltproben umfassen, z.B. mikrobielle Proben, die aus dem Eis der Arktis oder Antarktis, aus Wasser- oder Permafrostproben, Stoffen vulkanischen Ursprungs, Stoffen aus Boden oder Pflanzen in tropischen Gebieten usw. stammen. Somit kann die DNA z.B. aus einem kultivierbaren oder einem nicht-kultivierbaren Mikroorganismus gewonnen und zur Herstellung einer geeigneten rekombinanten Expressionsbank für die anschließende Bestimmung der Enzymaktivität verwendet werden.
Bakterien und viele Eukaryoten wenden einen koordinierten Mechanismus zur Regulation solcher Gene an, deren Produkte an in Zusammenhang stehenden Prozessen beteiligt sind. Die Gene liegen in Strukturen, die als „Gen-Cluster" bezeichnet werden, auf einem einzelnen Chromosom zusammen vor und werden zusammen unter der Kontrolle einer einzelnen regulatorischen Sequenz transkribiert, die einen einzelnen Promotor umfasst, der die Transkription des gesamten Clusters in Gang setzt. Das Gen-Cluster, der Promotor und weitere Sequenzen, die bei der Regulation zusammenwirken, werden hierin als ein „Operon" bezeichnet und können bis zu 20 oder mehr Gene, üblicherweise zwei bis sechs Gene, umfassen. Ein Gen-Cluster ist also eine Gruppe von nebeneinander liegenden Genen, die üblicherweise im Bezug auf ihre Funktion entweder identisch sind oder in Zusammenhang stehen.
Einige Genfamilien bestehen aus identischen Mitgliedern. Das Clustern ist eine Voraussetzung zur Beibehaltung der Identität zwischen Genen, wobei jedoch geclusterte Gene nicht notwendigerweise identisch sind. Gen-Cluster reichen von Extremen, bei denen eine Verdopplung von benachbarten, in Zusammenhang stehenden Genen erzeugt wird, bis zu Fällen, bei denen Hunderte von identischen Genen in einer Tandemanordnung vorliegen. Manchmal lässt sich nicht feststellen, ob die Wiederholung eines bestimmten Gens eine besondere Bedeutung hat. Ein wichtiges Beispiel hierfür sind die exprimierten doppelten Insulingene in einigen Arten, wohingegen in anderen Säugerarten ein einzelnes Insulingen ausreichend ist.
Es ist wichtig, die Gen-Cluster noch weiter zu erforschen und zu klären, in welchem Ausmaß die volle Länge des Clusters für die Expression der daraus resultierenden Proteine erforderlich ist. Weiterhin unterliegen Gen-Cluster einer dauernden Neuorganisation, weshalb die Fähigkeit zur Herstellung heterogener Banken von Gen-Clustern aus z.B. bakteriellen oder anderen prokaryotischen Quellen dazu dienen kann, um Quellen für neue Proteine zu bestimmen, die insbesondere Enzyme umfassen, z.B. die Polyketid-Synthasen, die für die Synthese von Polyketiden verantwortlich sind, die ein großes Spektrum nützlicher Aktivitäten besitzen. Auch andere Typen von Proteinen sind gemeint, die das Produkt (die Produkte) von Gen-Clustern sind, umfassend z.B. Antibiotika, antivirale Mittel, Anti-Tumor-Mittel und regulatorische Proteine, wie Insulin.
Polyketide sind Moleküle, die eine extrem reiche Quelle von Bioaktivitäten bereitstellen, umfassend Antibiotika (z.B. Tetracycline und Erythromycin), Anti-Krebs-Mittel (Daunomycin), Immunsuppressiva (FK506 und Rapamycin) und tiermedizinische Produkte (Monesin). Zahlreiche Polyketide (hergestellt durch Polyketid-Synthasen) sind wertvolle Therapeutika. Polyketid-Synthasen sind multifunktionelle Enzyme, welche die Biosynthese einer gewaltigen Vielfalt von Kohlenstoffketten katalysieren, die sich in der Länge und in den Funktionalitäts- und Cyclisierungsmustern unterscheiden. Polyketid-Synthase-Gene fallen unter die Gen-Cluster, wobei mindestens ein Typ (der mit Typ I bezeichnet wird) der Polyketid-Synthasen große Gene und Enzyme aufweist, was die genetische Manipulation und die in vitro-Untersuchungen dieser Gene/Proteine erschwert.
Die Fähigkeit wäre attraktiv, gewünschte Komponenten aus einer Bank von Polyketiden und Post-Polyketid-Biosynthese-Genen zu selektieren und zu kombinieren, um neue Polyketide für Untersuchungen zu erzeugen. Das Verfahren (die Verfahren) der vorlegenden Erfindung macht (machen) die Clonierung neuer Polyketid-Synthasen möglich und erleichtern diese, da man Genbanken mit Clonen erzeugen kann, die große Einschübe enthalten (insbesondere wenn man auf dem f-Faktor basierenden Vektoren verwendet), wodurch die Clonierung von Gen-Clustern erleichtert wird.
Vorzugsweise wird die Gen-Cluster-DNA in einen Vektor ligiert, wobei ein Vektor insbesondere außerdem regulatorische Sequenzen für die Expression umfasst, welche die Produktion eines nachweisbaren Proteins oder einer mit dem Protein zusammenhängenden Aktivität aus den ligierten Gen-Clustern kontrollieren und regulieren können. Vektoren, die eine außergewöhnlich große Kapazität für die Einführung einer exogenen DNA aufweisen, eignen sich besonders zur Verwendung im Zusammenhang mit solchen Gen-Clustern und werden hier als ein Beispiel beschrieben, wobei sie den f-Faktor (oder Fertilitäts-Faktor) von E. coli enthalten. Dieser f-Faktor von E. coli ist ein Plasmid, welches während der Konjugation einen Transfer von sich selbst mit einer hohen Frequenz bewirkt, und ist deshalb ideal, um große DNA-Fragmente, wie z.B. Gen-Cluster, aus gemischten mikrobiellen Proben zu erhalten und stabil zu vermehren.
Danach kann die DNA durch verfügbare Techniken isoliert werden, die in der Literatur beschrieben sind. Das IsoQuick^® Nucleinsäure-Extraktionskit (MicroProbe Corporation) ist für diesen Zweck geeignet.
Die aus diesen Mikroorganismen isolierte oder hergeleitete DNA kann vorzugsweise in einen Vektor oder ein Plasmid eingefügt werden, bevor sie auf eine selektierte DNA mit Sonden getestet wird. Solche Vektoren oder Plasmide sind vorzugsweise solche, die regulatorische Sequenzen für die Expression enthalten, einschließlich Promotoren, Enhancer und dergleichen. Solche Polynucleotide können Teil eines Vektors und/oder einer Zusammensetzung sein, und sie können isoliert sein, wobei ein solcher Vektor oder eine solche Zusammensetzung nicht Teil seiner natürlichen Umgebung ist. Ein besonders bevorzugter Phage oder ein besonders bevorzugtes Plasmid sowie Verfahren zur Einführung und Verpackung in diese werden im hier dargestellten Protokoll ausführlich beschrieben.
Im Folgenden wird ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von Banken aus sowohl kultivierbaren als auch nicht-kultivierbaren Organismen beschrieben, wobei die Banken mit Sonden getestet werden können, um hieraus DNA-Sequenzen zu selektieren, die mit einer spezifischen Sonden-DNA hybridisieren.
Umweltprobe

Gewinnen von Biomasse;
Isolieren von DNA (verschiedene Verfahren);
Scheren der DNA (25-Gauge-Nadel);
Versehen der DNA mit glatten Enden (Nuclease der Mungobohne);
Methylieren der DNA (EcoRI-Methylase);
Ligieren an EcoRIl-Linker (GGAATTCC);
Spalten der Linker (EcoRI-Restriktionsendonuclease);
Größen-Fraktionieren (Saccharose-Gradient);
Ligieren an einen Lambda-Vektor (Lambda Zap II und gt11);
Verpackung (in vitro-Lambda-Verpackungsextrakt);
Plattieren auf einem E. coli-Wirt und Amplifizieren.

Die Clone, die eine Enzymaktivität von Interesse besitzen, werden durch Durchmustern identifiziert. Dieses Durchmustern kann entweder anhand einer Hybridisierung durchgeführt werden, wobei das Vorliegen einer DNA identifiziert wird, die das Enzym von Interesse codiert, oder es kann anhand des Nachweises der enzymatischen Aktivität von Interesse erfolgen.
Die Sonden-DNA, die zur selektiven Isolierung der Ziel-DNA von Interesse aus der aus mindestens einem Mikroorganismus hergeleiteten DNA verwendet wird, kann eine Volllängen-DNA-Sequenz der codierenden Region oder eine teilweise DNA-Sequenz der codierenden Region für ein Enzym bekannter Aktivität sein. Die ursprüngliche DNA-Bank kann vorzugsweise unter Verwendung von Gemischen von Sonden getestet werden, die mindestens einen Teil der DNA-Sequenzen umfassen, die Enzyme mit der spezifischen Enzymaktivität codieren. Diese Sonden oder Sondenbanken sind vorzugsweise einzelsträngig, und die mikrobielle DNA, die mit den Sonden getestet wird, wurde vorzugsweise in die einzelsträngige Form umgewandelt. Besonders geeignet sind diejenigen Sonden, die von einer DNA hergeleitet sind, welche Enzyme mit einer ähnlichen oder identischen Aktivität wie der spezifischen Enzymaktivität codiert, nach der durchgemustert werden soll.
Die Sonden-DNA sollte mindestens etwa zehn Basen und vorzugsweise mindestens 15 Basen umfassen. In einer Ausführungsform kann die gesamte codierende Region als Sonde eingesetzt werden. Die Bedingungen für die Hybridisierung, bei der eine Ziel-DNA durch die Verwendung mindestens einer DNA-Sonde selektiv isoliert wird, werden so gewählt, dass eine Hybridisierungs-Stringenz für eine Sequenzidentität von mindestens etwa 50 % bereitgestellt wird, insbesondere eine Stringenz, die eine Sequenzidentität von mindestens etwa 70 %, vorzugsweise 75 %, bereitstellt.
Hybridisierungstechniken zum Sonden-Testen einer mikrobiellen DNA-Bank zum Isolieren einer Ziel-DNA von möglichem Interesse sind dem Fachmann bekannt, wobei alle in der Literatur beschriebenen Verfahren für die Verwendung hier geeignet sind, insbesondere diejenigen, bei denen ein Festphase verwendet wird, die direkt oder indirekt an die Sonden-DNA gebunden ist, um die Abtrennung von der restlichen, von den Mikroorganismen stammenden DNA zu ermöglichen. Bevorzugt sind Hybridisierungen in Lösungsphase, worauf die Bindung der Sonde an eine Festphase folgt.
Vorzugsweise ist die Sonden-DNA mit dem einen Partner eines spezifischen Bindungspaars (d.h. einem Liganden) „markiert", und der andere Partner des Paars ist an eine Feststoff-Matrix gebunden, so dass eine einfache Trennung des Ziels von seiner ursprünglichen Umgebung möglich ist. Der Ligand und der spezifische Bindungspartner können aus den folgenden Stoffen, in beiden Richtungen, ausgewählt werden: (1) einem Antigen oder Hapten und einem Antikörper oder einem spezifischen bindenden Fragment davon; (2) Biotin oder Iminobiotin und Avidin oder Streptavidin; (3) einem Zucker und einem dafür spezifischen Lektin; (4) einem Enzym und einem Inhibitor hierfür; (5) einem Apoenzym und einem Cofaktor; (6) komplementären homopolymeren Oligonucleotiden; und (7) einem Hormon und einem Rezeptor hierfür. Die Festphase ist vorzugsweise ausgewählt aus: (1) einer Glas- oder Polymeroberfläche; (2) einer gepackten Säule mit Polymerkügelchen, und (3) magnetischen oder paramagnetischen Partikeln.
Die wie vorstehend hergestellte Clon-Bank kann direkt auf die Enzymaktivität durchgemustert werden, ohne dass eine Kultur-Expansion, Amplifikation oder andere zusätzliche Verfahren erforderlich sind. Jedoch ist es in einer bestimmten Ausführungsform wünschenswert, die aus den einzelnen Clonen gewonnene DNA zu amplifizieren, z.B. durch PCR.
Weiterhin ist es fakultativ, jedoch wünschenswert, eine Amplifikation der Ziel-DNA durchzuführen, die isoliert wurde. In dieser Ausführungsform wird die Ziel-DNA nach der Isolierung von der Sonden-DNA abgetrennt. Danach wird sie amplifiziert, bevor sie zur Transformation von Wirten eingesetzt wird. Die doppelsträngige DNA, die so selektiert wurde, dass sie mindestens einen Teil der vorher bestimmten DNA-Sequenz enthält, kann einzelsträngig gemacht werden, einer Amplifikation unterworfen und erneut aneliert werden, so dass amplifizierte Vertreter der selektierten doppelsträngigen DNA bereitgestellt werden. Dem Fachmann sind zahlreiche Amplifikationsverfahren bekannt.
Anschließend wird die selektierte DNA zum Herstellen einer Bank für die Durchmusterung verwendet, indem ein geeigneter Organismus transformiert wird. Die Wirte, insbesondere die hier als bevorzugt angegebenen Wirte, werden transformiert, indem die Vektoren, welche die Ziel-DNA enthalten, durch Beimpfen unter Bedingungen, die für eine solche Transformation förderlich sind, künstlich eingeführt werden. Die Transformation kann mit einer doppelsträngigen zirkulären oder linearen DNA durchgeführt werden, oder sie kann in bestimmten Fällen auch mit einer einzelsträngigen zirkulären oder linearen DNA erfolgen.
Danach werden die resultierenden Banken transformierter Clone auf Clone durchgemustert, die in einem phänotypischen Test auf Enzymaktivität eine Aktivität des Enzyms von Interesse zeigen.
Nachdem aus einer selektiv aus einem Organismus isolierten DNA eine Vielzahl von Clonen hergestellt wurde, werden solche Clone auf eine spezifische Enzymaktivität durchgemustert, wobei die Clone identifiziert werden, welche die spezifischen Enzymmerkmale aufweisen.
Das Durchmustern auf eine Enzymaktivität kann auf einzelnen Expressionsclonen oder anfangs auch auf einem Gemisch von Expressionsclonen durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob das Gemisch eine oder mehrere spezifische Enzymaktivitäten aufweist oder nicht. Wenn das Gemisch eine spezifische Enzymaktivität aufweist, können die einzelnen Clone erneut auf eine solche Enzymaktivität oder auf eine spezifischere Aktivität durchgemustert werden. Wenn z.B. ein Clon-Gemisch eine Hydrolase-Aktivität besitzt, können anschließend die einzelnen Clone gewonnen und durchgemustert werden, um zu bestimmen, welcher der Clone eine Hydrolase-Aktivität aufweist.
Als repräsentative Beispiele von Expressionsvektoren, die eingesetzt werden können, können die Folgenden erwähnt werden: Viruspartikel, Baculovirus, Phage, Plasmide, Phagemide, Cosmide, Phosmide, bakterielle künstliche Chromosomen, virale DNA (z.B. Vaccinia, Adenovirus, Geflügelpocken-Virus, Pseudorabies und Derivate von SV40), auf P1 basierende künstliche Chromosomen, Hefeplasmide, künstliche Hefechromosomen und beliebige andere Vektoren, die für spezifische Wirte von Interesse spezifisch sind (z.B. Bacillus, Aspergillus, Hefe usw.). So kann die DNA für die Expression eines Polypeptids z.B. in einen beliebigen von einer Vielzahl von Expressionsvektoren eingefügt werden. Solche Vektoren umfassen chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen. Eine große Zahl von geeigneten Vektoren ist dem Fachmann bekannt, und diese sind im Handel verfügbar. Die folgenden Vektoren werden als Beispiel genannt; bakterielle: pQE70, pQE60, pQE-9 (Quiagen), psiX174, pBluescript SK, pBluescript KS (Strategene); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); eukaryotische: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Jedoch kann auch jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor verwendet werden, so lange sie in dem Wirt repliziert werden können und lebensfähig sind.
Ein besonders bevorzugter Vektortyp zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung enthält einen f-Faktor-Replikationsursprung. Der f-Faktor (oder Fertilitätsfaktor) in E. coli ist ein Plasmid, das während der Konjugation einen Transfer mit hoher Frequenz von sich selbst und einen Transfer mit einer niedrigeren Frequenz des bakteriellen Chromosoms selbst bewirkt. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform besteht in der Verwendung von Clonierungsvektoren, die als „Fosmide" oder bakterielles künstliches Chromosom- („bacterial artificial chromosome-", BAC-) Vektoren bezeichnet werden. Diese stammen vom f-Faktor von E. coli, der in der Lage ist, große DNA-Fragmente stabil zu integrieren. Wenn in diese Vektoren eine DNA aus einer gemischten nicht-gezüchteten Umweltprobe eingebaut wird, können auf diese Weise große genomische Fragmente in Form einer stabilen „Umwelt-DNA-Bank" bereitgestellt werden.
Die von einem Mikroorganismus (Mikroorganismen) hergeleitete DNA kann durch eine Vielzahl von Verfahren in den Vektor eingefügt werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz in eine geeignete Restriktionsendonuclease-Stelle(n) durch Verfahren eingefügt, die dem Fachmann bekannt sind. Solche Verfahren und andere liegen im Umfang des Wissens eines Fachmanns.
Die DNA-Sequenz im Expressionsvektor ist mit einer geeigneten Expressionskonstrollsequenz(en) (Promotor) funktionell verbunden, so dass die mRNA-Synthese gesteuert wird. Insbesondere umfassen die genannten bakteriellen Promotoren Iacl, IacZ, T3, T7, gpt, Lambda-P_R, P_L und trp. Eukaryotische Promotoren umfassen den unmittelbaren frühen CMV, HSV-Thymidinkinase, den frühen und späten SV40, LTRs von Retroviren und Metallothionein-I der Maus. Der Fachmann ist in der Lage den geeigneten Vektor und Promotor auswählen. Der Expressionsvektor enthält außerdem eine Ribosomenbindungsstelle für die Initiation der Translation und einen Transkirptionsterminator. Außerdem kann der Vektor geeignete Sequenzen zum Amplifizieren der Expression umfassen. Promotorregionen können aus jedem beliebigen gewünschten Gen selektiert werden, wobei CAT- (Chloramphenicol-Transferase-) Vektoren oder anderen Vektoren mit selektierbaren Markern verwendet werden.
Außerdem enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein oder mehrere Gene für selektierbare Marker, so dass ein phänotypisches Merkmal für die Selektion transformierter Wirtszellen bereitgestellt wird, z.B. die Dihydrofolat-Reduktase oder die Neomycin-Resistenz für eine eukaryotische Zellkultur, oder eine Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenz in E. coli.
Im Allgemeinen umfassen rekombinante Expressionsvektoren Replikationsursprünge und selektierbare Marker, die eine Transformation der Wirtszellen ermöglichen, z.B. das Ampicillin-Resistenz-Gen von E. coli und das TRP1-Gen von S. cerevisiae, und einen Promotor, der von einem stark-exprimierten Gen stammt, so dass die Transkription einer stromabwärts liegenden Struktursequenz gesteuert wird. Solche Promotoren können von Operons hergeleitet sein, die glykolytische Enzyme, z.B. 3-Phosphoglycerat-Kinase (PGK), α-Faktor, saure Phosphatase, oder Hitzeschockproteine oder andere codieren. Die heterologe Struktursequenz wird in geeigneter Phase mit Translations-Initiations- und Terminationssequenzen und vorzugsweise mit einer Leader-Sequenz zusammengebaut, die in der Lage ist, die Sekretion des translatierten Proteins in den periplasmatischen Raum oder das extrazelluläre Medium zu steuern.
Die wie vorstehend beschrieben selektierte und isolierte DNA wird in einen geeigneten Wirt eingeführt, wodurch eine Bank hergestellt wird, die sodann auf die gewünschte Enzymaktivität durchgemustert wird. Die selektierte DNA liegt vorzugsweise bereits in einem Vektor vor, der geeignete Kontrollsequenzen umfasst, so dass die selektierte DNA, die ein Enzym codiert, für den Nachweis der gewünschten Aktivität exprimiert werden kann. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryotische Zelle, z.B. eine Säugerzelle, oder eine niedrigere eukaryotische Zelle; z.B. eine Hefezelle sein, oder die Wirtszelle kann eine prokaryotische Zelle sein, z.B. eine Bakterienzelle. Die Einführung des Konstrukts in die Wirtszelle kann durch eine Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion oder Elektroporation erfolgen (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Als repräsentative Beispiele geeigneter Wirte können die Folgenden erwähnt werden: Bakterienzellen, z.B. E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Pilzzellen, z.B. Hefe; Insektenzellen, z.B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9; tierische Zellen, z.B. CHO-, COS- oder Bowes-Melanom; Adenoviren; Pflanzenzellen usw.. Die Auswahl eines geeigneten Wirts kann anhand der hier gemachten Angaben durch den Fachmann erfolgen.
Besonders wird auf verschiedene Säugerzell-Kultursysteme Bezug genommen, die zum Exprimieren von rekombinanten Proteinen eingesetzt werden können, Beispiele von Säuger-Expressionssystemen umfassen die COS-7-Linien der Fibroblasten aus Affennieren, die von Guzman, Cell 23: 175 (1981), beschrieben wurden, und andere Zelllinien, die in der Lage sind, einen kompatiblen Vektor zu exprimieren, z.B. die Zelllinien C127, 3T3, CHO, HeLa und BHK. Säuger-Expressionsvektoren umfassen einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer sowie außerdem beliebige erforderliche Ribosomenbindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Spleiß-Donor- und Akzeptorstellen, transkriptionale Terminationssequenzen und 5'-flankierende nichttranskribierte Sequenzen. DNA-Sequenzen, hergeleitet von den SV40-Spleiß- und Polyadenylierungsstellen, können verwendet werden, um die erforderlichen nichttranskribierten genetischen Elemente bereitzustellen.
Wirtszellen werden mit den Vektoren genetisch verändert (transduziert, transformiert oder transfiziert). Die veränderten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährmedien kultiviert werden, die jeweils nach Bedarf modifiziert werden, so dass Promotoren aktiviert, Transformanten selektiert oder Gene amplifiziert werden. Die Kulturbedingungen, z.B. Temperatur, pH-Wert und dergleichen, entsprechen den Bedingungen, die früher schon bei den für die Expression ausgewählten Wirtszellen eingesetzt wurden, und sind dem Fachmann bekannt.
Die Bank kann durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, auf eine spezifische Enzymaktivität durchgemustert werden. Z.B. kann die Enzymaktivität auf eine oder mehrere der folgenden sechs IUB-Klassen durchgemustert werden: Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen. Anschließend können die rekombinanten Enzyme, für die bestimmt wurde, dass sie für eine oder mehrere der IUB-Klassen positiv sind, auf eine noch spezifischere Enzymaktivität erneut durchgemustert werden.
Andererseits kann die Bank auf eine stärker spezialisierte Enzymaktivität durchgemustert werden. Z.B. kann die Bank, statt dass sie allgemein auf eine Hydrolase-Aktivität durchgemustert wird, auf eine stärker spezialisierte Aktivität durchgemustert werden, d.h. auf den Typ von Bindung, auf den die Hydrolase wirkt. So kann die Bank z.B. durchgemustert werden, um diejenigen Hydrolasen zu bestimmen, die auf eine oder mehrere spezifische chemische Funktionalitäten wirken, z.B. (a) Amid (Peptidbindungen), d.h. Proteasen; (b) Esterbindungen, d.h. Esterasen und Lipasen; (c) Acetale, d.h. Glykosidasen, usw..
Anschließend können die Clone, bei denen das Vorliegen der spezifischen Enzymaktivität nachgewiesen wurde, sequenziert werden, um die DNA-Sequenz zu identifizieren, welche ein Enzym mit der spezifischen Aktivität codiert. Somit ist es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, wie folgt zu isolieren und zu identifizieren: (i) eine DNA, die ein Enzym mit einer spezifischen Enzymaktivität codiert, (ii) Enzyme, die eine solche Aktivität besitzen (umfassend die Aminosäuresequenz davon), und (iii) Herstellen von rekombinanten Enzymen, die eine solche Aktivität aufweisen.
Andererseits werden die Clone, bei denen gefunden wurde, dass sie die enzymatische Aktivität besitzen, auf welche die Durchmusterung erfolgt war, sequenziert und anschließend einer gezielten Mutagenese unterworfen, um neue Enzyme mit gewünschten Aktivitäten zu entwickeln oder um modifizierte Enzyme mit besonders erwünschten Eigenschaften zu entwickeln, die im Wildtyp-Enzym fehlen oder weniger stark ausgeprägt sind, z.B. eine Stabilität gegenüber Hitze oder organischen Lösungsmitteln. Beliebige der bekannten Techniken zur gezielten Mutagenese können für die Erfindung verwendet werden. Z.B. umfassen besonders bevorzugte Mutagenesetechniken zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung die nachstehend beschriebenen Verfahren.
Die vorliegende Erfindung kann z.B. eingesetzt werden, um neue Enzyme zu identifizieren oder zu produzieren, die z.B. die folgenden Aktivitäten besitzen, die für die folgenden Anwendungen geeignet sind:

1. Lipase/Esterase
a. Enantioselektive Hydrolyse von Estern (Lipiden)/Thioestern
1) Trennung racemischer Gemische
2) Synthese optisch aktiver Säuren oder Alkohole aus Meso-Diestern
b. Selektive Synthesen
1) Regiospezifische Hydrolyse von Kohlenhydratestern
2) Selektive Hydrolyse von cyclischen sekundären Alkoholen
c. Synthese von optisch aktiven Estern, Lactonen, Säuren, Alkoholen
1) Trans-Veresterung von aktivierten/nicht-aktivierten Estern
2) Inter-Veresterung
3) Optisch aktive Lactone aus Hydroxyestern
4) Regio- und enantioselektive Ringöffnung von Anhydriden
d. Detergentien
e. Fett/Öl-Umwandlung
f. Reifung von Käse
2. Protease
a. Ester/Amidsynthese
b. Peptidsynthese
c. Trennung racemischer Gemische von Aminosäureestern
d. Synthese von nicht-natürlichen Aminosäuren
e. Detergentien/Proteinhydrolyse
3. Glykosidase/Glykosyltransferase
a. Zucker/Polymer-Synthese
b. Spaltung glykosidischer Bindungen zur Herstellung von Mono-, Di- und
Oligosacchariden
c. Synthese komplexer Oligosaccharide
d. Glykosidsynthese unter Verwendung von UDP-Galactosyltransferase
e. Transglykosylierung von Disacchariden, Glykosylfluoriden, Arylgalactosiden
f. Glykosyltransfer in der Oligosaccharidsynthese
g. Diastereoselektive Spaltung von β-Glucosylsulfoxiden
h. Asymmetrische Glykosylierungen
i. Bearbeitung von Lebensmitteln
j. Bearbeitung von Papier
4. Phosphatase/Kinase
a. Synthese/Hydrolyse von Phosphatestern
1) Regio-, enantioselektive Phosphorylierung
2) Einführung von Phosphatestern
3) Synthese von Phospholipid-Vorläufern
4. Kontrollierte Polynucleotidsynthese
b. Aktivieren eines biologischen Moleküls
c. Selektive Bildung einer Phosphatbindung ohne Schutzgruppen
5. Mono/Dioxygenase
a. Direkte Oxyfunktionalisierung von nicht-aktivierten organischen Substraten
b. Hydroxylierung von Alkanen, Aromaten, Steroiden
c. Epoxidation von Alkenen
d. Enantioselektive Sulphoxidation
e. Regio- und stereoselektive Bayer-Villinger-Oxidationen
6. Haloperoxidase
a. Oxidative Addition eines Halogenid-Ions an nucleophile Stellen
b. Anfügen von hypohalogenige Säuren an olefinische Bindungen
c. Ringspaltung von Cyclopropanen
d. Aktivierte aromatische Substrate, umgewandelt zu ortho- und para-Derivaten
e. 1,3-Diketone, umgewandelt zu 2-Halogen-Derivaten
f. Heteroatom-Oxidation von Schwefel- und Stickstoff-enthaltenden Substraten
g. Oxidation von Enolacetaten, Alkynen und aktivierten aromatischen Ringen
7. Lignin-Peroxidase/Diarylpropan-Peroxidase
a. Oxidative Spaltung von C-C-Bindungen
b. Oxidation von Benzylalkoholen zu Aldehyden
c. Hydroxylierung von Benzylkohlenstoffen
d. Phenol-Dimerisierung
e. Hydroxylierung von Doppelbindungen zur Herstellung von Diolen
f. Spaltung von Ligninaldehyden
8. Epoxid-Hydrolase
a. Synthese von enantiomer-reinen bioaktiven Verbindungen
b. Regio- und enantioselektive Hydrolyse von Epoxiden
c. Aromatische und olefinische Epoxidation durch Monooxigenasen zur
Herstellung von Epoxiden
d. Trennung racemischer Epoxide
e. Hydrolyse von Steroid-Epoxiden
9. Nitril-Hydratase/Nitrilase
a. Hydrolyse von aliphatischen Nitrilen zu Carboxamiden
b. Hydrolyse von aromatischen heterocyclischen ungesättigten aliphatischen
Nitrilen zu den entsprechenden Säuren
c. Hydrolyse von Acrylnitril
d. Herstellung von Aromaten und Carboxamiden, Carbonsäuren (Nicotinamid,
Picolinamid, Isonicotinamid)
e. Regioselektive Hydrolyse von Acryldinitril
f. α-Aminosäuren aus α-Hydroxynitrilen
10. Transaminase
a. Überführen von Aminogruppen in Oxo-Säuren
11. Amidase/Acylase
a. Hydrolyse von Amiden, Amidinen und anderen C-N-Bindungen
b. Trennung und Synthese nicht-natürlicher Aminosäuren
Die folgenden Beispiele sollen zur Erläuterung der Erfindung dienen.

Beispiel 1 (Referenzbeispiel)
Herstellung einer Säuger-DNA-Bank
Im Folgenden werden Verfahren beschrieben, die zum Herstellen einer Genbank aus einer Probe der äußeren Oberfläche eines Walknochens verwendet wurden, der während einer Tauchexpedition in 1240 Meter Tiefe im Santa Catalina Bassin gefunden wurde.
Isolieren der DNA
IsoQuick-Verfahren nach den Anweisungen des Herstellers
Scheren der DNA

1. Kräftiges Aufziehen und Ausspritzen der DNA durch eine 25G-Doppelstempel-Nadel und 1-cc-Spritzen, etwa 500-mal.
2. Testen einer kleinen Menge (0,5 μg) auf einem 0,8 % Agarose-Gel, um sicherzustellen, dass der größte Teil der DNA im gewünschten Größenbereich vorliegt (etwa 3 bis 6 kb).

Versehen der DNA mit platten Enden („Blunt DNA")

1. Zufügen von:

H₂O bis zu einem Endvolumen von 405

45 μl 10X Mungobohnen-Puffer

2,0 μl Mungobohnen-Nuclease (150 U/μl);
2. Inkubieren bei 37°C, 15 Minuten;
3. einmal Extrahieren mit Phenol/Chloroform;
4. einmal Extrahieren mit Chloroform;
5. Zufügen von 1 ml eiskaltem Ethanol zur Fällung;
6. Stellen auf Eis, 10 Minuten;
7. Abzentrifugieren in einer Mikrozentrifuge mit hoher Geschwindigkeit, 30 Minuten;
8. Waschen mit 1 ml 70 % Ethanol;
9. Abzentrifugieren in einer Mikrozentrifuge mit hoher Geschwindigkeit, 10 Minuten, und Trocknen.

Methylieren der DNA

1. Vorsichtiges Resuspendieren der DNA in 26 μl TE;
2. Zufügen von:

4 μl 10X EcoRI-Methylase-Puffer

0,5 μl SAM (32 mM)

5,0 μl EcoRI-Methylase (40 U/μl) ;
3. Inkubieren bei 37°C, eine Stunde.

Sicherstellen der platten Enden

1. Zufügen zu dem Methylierungs-Reaktionsgemisch:

5,0 μl 100 mM MgCl₂

8,0 μl dNTP-Gemisch (2,5 mM von jeweils dGTP, dATP, dTTP, dCTP)

4,0 μl Klenow (5 U/μl) ;
2. Inkubieren bei 12°C, 30 Minuten;
3. Zufügen von 450 μl 1X STE;
4. einmal Extrahieren mit Phenol/Chloroform;
5. einmal Extrahieren mit Chloroform;
6. Zufügen von 1 ml eiskaltem Ethanol zur Fällung und Überführen auf Eis für 10 Minuten;
7. Abzentrifugieren in einer Mikrozentrifuge mit hoher Geschwindigkeit, 30 Minuten;
8. Waschen mit 1 ml 70 % Ethanol;
9. Abzentrifugieren in einer Mikrozentrifuge mit hoher Geschwindigkeit, 10 Minuten, und Trocknen.

Linker-Ligierung

1. Vorsichtiges Resuspendieren der DNA in 7 μl Tris-EDTA (TE) ;
2. Zufügen von:

14 μl Phosphorylierten EcoRIl-Linkern (200 ng/μl)

3,0 μl 10X Ligierungspuffer

3,0 μl 10 mM rATP

3,0 μl T4-DNA-Ligase (4 WU/μl) ;
3. Inkubieren bei 4°C, über Nacht.

Zurückschneiden mit EcoRI

1. Hitzeabtötungs-Ligierungsreaktion bei 68°C, 10 Minuten;
2. Zufügen von:

237,9 μl H₂O

30 μl 10X EcoRI-Puffer

2,1 μl EcoRI-Restriktionsenzym (100 U/μl) ;
3. Inkubieren bei 37°C, 1,5 Stunden;
4. Zufügen von 1,5 μl 0,5 M EDTA;
5. Stellen auf Eis.

Größenfraktionierung auf einem Saccharose-Gradienten (2,2 ml)

1. Erhitzen der Probe auf 65°C, 10 Minuten;
2. Vorsichtiges Auftragen auf 2,2 ml eines Saccharose-Gradienten;
3. Abzentrifugieren in einer Mini-Ultrazentrifuge, 45 K, 20°C, 4 Stunden (keine Bremse);
4. Gewinnen der Fraktionen, indem man den Boden des Gradientenröhrchens mit einer 20G-Nadel punktiert und die Saccharose durch die Nadel abfließen lässt. Sammeln der ersten 20 Tropfen in einem Falcon-Röhrchen 2059, anschließend gewinnen von zehn 1-Tropfen-Fraktionen (markiert mit 1 bis 10). Jeder Tropfen hat etwa ein Volumen von 60 μl;
5. Laufenlassen von 5 μl jeder Fraktion auf einem 0,8 % Agarose-Gel, um die Größe zu testen;
6. Vereinigen der Fraktionen 1 bis 4 (etwa 10 – 1,5 kb), und in einem getrennten Röhrchen vereinigen der Fraktionen 5 bis 7 (etwa 5 – 0,5 kb);
7. Zufügen von 1 ml eiskaltem Ethanol zur Fällung und Stellen auf Eis für 10 Minuten;
8. Abzentrifugieren in einer Mikrozentrifuge mit hoher Geschwindigkeit, 30 Minuten;
9. Waschen mit 1 ml 70 % Ethanol;
10. Abzentrifugieren in einer Mikrozentrifuge mit hoher Geschwindigkeit, 10 Minuten, und Trocknen;
11. Resuspendieren in jeweils 10 μl TE-Puffer.

Test-Ligierung an Lambda-Arme

1. Platten-Tests, um eine geeignete Konzentration zu bekommen. Tüpfeln von 0,5 μl der Probe auf Agarose, enthaltend Ethidiumbromid, zusammen mit Standards (DNA-Proben bekannter Konzentration). Betrachten unter UV-Licht und Abschätzen der Konzentration im Vergleich zu den Standards. Fraktion 1 bis 4 = > 1,0 μg/μl. Fraktion 5 bis 7 = 500 ng/μl;
2. Herstellen der folgenden Ligierungs-Reaktionsgemische (5 μl Reaktionsgemische) und Inkubieren bei 4°C über Nacht:

Test-Verpackung und Plattieren

1. Verpackung der Ligierungsreaktionsgemische nach den Anweisungen des Herstellers. Verpackung von 2,5 μl pro Verpackungsextrakt (2 Extrakte pro Ligierung);
2. Beenden der Verpackungsreaktionen mit 500 μl SM-Puffer und Vereinigen der Verpackung, die aus derselben Ligierung stammt;
3. Titrieren von jeweils 1,0 μl auf einem geeigneten Wirt (OD₆₀₀ = 1,0)
[XL1 Blue MRF für ZAP, und Y1088 für gt11];
Zufügen von 200 μl Wirt (in mM MgSO₄) in Falcon 2059-Röhrchen;
Beimpfen mit 1 μl verpacktem Phagen;
Inkubieren bei 37°C, 15 Minuten;
Zufügen von etwa 3 ml 48°C warmem Deck-Agar [50 ml Stammlösung,
enthaltend 150 μl IPTG (0,5 M) und 300 μl X-GAL (350 mg/ml)];
Plattieren auf 100-mm-Platten und Inkubieren bei 37°C über Nacht;
4. Ergebnisse hinsichtlich Wirksamkeit:

gt11: 1,7 × 10⁴ Rekombinante mit 95 % Hintergrund

ZAP II: 4,2 × 10⁴ Rekombinante mit 66 % Hintergrund

Verunreinigungen in der DNA-Probe können zur Hemmung der Enzymreaktionen geführt haben, obwohl der Saccharose-Gradient und organische Extraktionen diese möglicherweise entfernt haben. Da die DNA-Probe kostbar war, wurde ein Versuch unternommen, die Enden für die Clonierung zu „fixieren":
Erneutes Versehen der DNA mit glatten Enden („Re-Blunt DNA")

1. Vereinigen aller restlichen DNA, die nicht mit den Lambda-Armen ligiert wurde (Fraktionen 1 bis 7) und Zufügen von H₂O bis zu einem Endvolumen von 12 μl. Danach zugeben von:

143 μl	H₂O
20 μl	10X Puffer 2 (aus dem cDNA-Synthese-Kit von
	Stratagene)
23 μl	Blunting dNTP (aus dem cDNA-Synthese-Kit von
	Stratagene)
2,0 μl	Pfu (aus dem cDNA-Synthese-Kit von Stratagene)

2. Inkubieren bei 72°C, 30 Minuten;
3. einmal Extrahieren mit Phenol/Chloroform;
4. einmal Extrahieren mit Chloroform;
5. Zufügen von 20 μl 3 M NaOAc und 400 μl eiskaltem Ethanol zur Fällung;
6. Halten bei –20°C über Nacht;
7. Abzentrifugieren in einer Mikrozentrifuge mit hoher Geschwindigkeit, 30 Minuten;
8. Waschen mit 1 ml 70 % Ethanol;
9. Abzentrifugieren in einer Mikrozentrifuge mit hoher Geschwindigkeit, 10 Minuten, und Trocknen. (KEIN Methylieren der DNA, da sie bereits in der ersten Runde der Prozessierung methyliert wurde.)

Adaptor-Ligierunq

1. Vorsichtiges Resuspendieren der DNA in 8 μl EcoRI-Adaptoren (aus dem cDNA-Synthese-Kit von Stratagene);
2. Zufügen von:

1,0 μl 10X Ligierungspuffer

1,0 μl 10 mM rATP

1,0 μl T4-DNA-Ligase (4 WU/μl)
3. Inkubieren bei 4°C, zwei Tage. (KEIN Zurückschneiden, da dieses Mal Adaptoren verwendet wurden. Statt dessen ist eine Phosphorylierung erforderlich.)

Phosphorylieren der Adaptoren

1. Hitzeabtötungs-Ligierungsreaktion bei 70°C, 30 Minuten;
2. Zufügen:

1,0 μl 10X Ligierungspufter

2,0 μl 10 mM rATP

6,0 μl H₂O

1,0 μl PNK (aus dem cDNA-Synthese-Kit von Stratagene);
3. Inkubieren bei 37°C, 30 Minuten;
4. Zufügen von 31 μl H₂O und 5 μl 10X STE;
5. Größenfraktionierung auf einer Sephacryl S-500 Spin-Säule (Pool der Fraktionen 1 bis 3);
6. einmal Extrahieren mit Phenol/Chloroform;
7. einmal Extrahieren mit Chloroform;
8. Zufügen von eiskaltem Ethanol zur Fällung;
9. Stellen auf Eis, 10 Minuten;
10. Abzentrifugieren in einer Mikrozentrifuge mit hoher Geschwindigkeit, 30 Minuten;
11. Waschen mit 1 ml 70 % Ethanol;
12. Abzentrifugieren in einer Mikrozentrifuge mit hoher Geschwindigkeit, 10 Minuten, und Trocknen;
13. Resuspendieren in 10,5 μl TE-Puffer. Kein Plattieren des Tests. Statt dessen direktes Ligieren mit Armen wie vorstehend mit der Ausnahme, dass 2,5 μl DNA und kein Wasser verwendet werden.

Verpackung und Titer wie vorstehend
Ergebnisse hinsichtlich Wirksamkeit:

gt 11: 2,5 × 10⁶ Rekombinante mit 2,5 % Hintergrund

ZAP II: 9,6 × 10⁵ Rekombinante mit 0 % Hintergrund
Amplifikation von Banken (5,0 × 10⁵ Rekombinanten aus jeder Bank)

1. Zufügen von 3,0 ml Wirtszellen (OD₆₀₀ = 1,0) in zwei konische 50-ml-Röhrchen;
2. Beimpfen mit 2,5 × 10⁵ pfu pro konischem Röhrchen;
3. Inkubieren bei 37°C, 20 Minuten;
4. Zufügen von Deck-Agar zu jedem Röhrchen bis zu einem Endvolumen von 45 ml;
5. Plattieren des Röhrchens auf fünf 150-mm-Platten;
6. Inkubieren bei 37°C, 6 bis 8 Stunden oder so lange, bis die Plaques ungefähr eine Größe von Stecknadelköpfen erreicht haben;
7. Überschichten mit 8 bis 10 ml SM-Puffer und Halten bei 4°C über Nacht (wenn möglich mit vorsichtigem Schwenken).

Ernten der Phagen

1. Gewinnen einer Phagensuspension, indem der SM-Puffer von jeder Platte in ein konisches 50-ml-Röhrchen abgegossen wird;
2. Zufügen von 3 ml Chloroform, kräftiges Schütteln und Inkubieren bei Raumtemperatur, 15 Minuten;
3. Zentrifugieren bei 2K RpM, 10 Minuten, zum Entfernen der Zelltrümmer;
4. Gießen des Überstands in einen sterilen Kolben, Zufügen von 500 μl Chloroform;
5. Aufbewahren bei 4°C.

Titrieren der amplifizierten Bank

1. Herstellen serieller Verdünnungen: 10^–5= 1 μl amplifizierter Phage in 1 ml SM-Puffer 10^–6 = 1 μl der 10³-Verdünnung in 1 ml SM-Puffer
2. Zufügen von 200 μl Wirt (in 10 mM MgSO₄) zu zwei Röhrchen;
3. Beimpfen des einen mit 10 μl der Verdünnung 10^–6 (10^–5);
4. Beimpfen des anderen mit 1 μl der Verdünnung 10^–6 (10^–6);
5. Inkubieren bei 37°C, 15 Minuten;
6. Zufügen von etwa 3 ml 48°C warmem Deckagar; [50 ml Stammlösung, enthaltend 150 μl IPTG (0,5 M) und 375 μl X-GAL (350 mg/ml)];
7. Plattieren auf 100-mm-Platten und Inkubieren bei 37°C über Nacht;
8. Ergebnisse:

gt11: 1,7 × 10¹¹/ml

ZAP II: 2,0 × 10¹⁰/ml

Beispiel 2
Konstruktion einer stabilen DNA-Bank mit großen Inserten von genomischer Kleinstplankton-DNA
Gewinnung der Zellen und Herstellung der DNA
Agarosepfropfen, die konzentrierte Kleinstplankton-Zellen enthielten, wurden aus Proben hergestellt, die auf einer Ozean-Kreuzfahrt von Newport, Oregon, nach Honolulu, Hawaii, gewonnen wurden. Hierzu wurde Meerwasser (30 Liter) in Niskin-Flaschen gesammelt, durch 10 μm Nitrex durchgemustert und durch eine Hohlfaser-Filtration (Amicon DC10) durch Polysulfon-Filter mit einem Molekulargewichts-Ausschluss von 30 000 eingeengt. Die konzentrierten Mikroplankton-Zellen wurden auf einem 0,22-μm-47-mm-Durapore-Filter gewonnen und in 1 ml 2X STE-Puffer (1 M NaCl, 0,1 M EDTA, 10 mM Tris, pH 8,0) auf eine endgültige Dichte von etwa 1 × 10¹⁰ Zellen pro ml resuspendiert. Die Zellsuspension wurde gemischt mit einem Volumen einer 1 % geschmolzenen Seaplaque LMP Agarose (FMC), abgekühlt auf 40°C, und unmittelbar danach in einer 1-ml-Spritze aufgezogen. Die Spritze wurde mit Parafilm verschlossen und zehn Minuten auf Eis gelegt. Der Zellen-enthaltende Agarosepfropfen wurde in 10 ml Lyse-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, 50 mM NaCl, 0,1 M EDTA, 1 % Sarkosyl, 0,2 % Natriumdesoxycholat, 1 mg/ml Lysozym) extrudiert und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Danach wurde der Agarosepfropfen in 40 ml ESP-Puffer (1 % Sarkosyl, 1 mg/ml Proteinase K, in 0,5 M EDTA) überführt und 16 Stunden bei 55°C inkubiert. Die Lösung wurde dekantiert, durch frischen ESP-Puffer ersetzt und sodann eine weitere Stunde bei 55°C inkubiert. Anschließend wurden die Agarosepfropfen in 50 mM EDTA gebracht und für die Dauer der Ozean-Kreuzfahrt an Bord bei 4°C aufbewahrt.
Ein Scheibchen eines Agarosepfropfens (72 μl), der aus einer vor der Küste von Oregon gewonnen Probe hergestellt worden war, wurde über Nacht bei 4°C gegen 1 ml Puffer A (100 mM NaCl, 10 mM Bis-Tris-Propan-HCI, 100 μg/ml acetyliertes BSA, pH 7,5, bei 25°C) in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen dialysiert. Die Lösung wurde durch 250 μl frischen Puffer A ersetzt, der 10 mM MgCl₂ und 1 mM DTT enthielt, und auf einer Schwenkplattform eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die Lösung gegen 250 μl des gleichen Puffers ausgetauscht, der 4 U Sau3A1 (NEB) enthielt, in einem Wasserbad auf 37°C äquilibriert und danach auf einer Schwenkplattform in einem 37°C-Inkubator 45 Minuten inkubiert. Der Pfropfen wurde in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 30 Minuten bei 68°C inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren und die Agarose zu schmelzen. Die Agarose wurde gespalten und die DNA dephosphoryliert, indem Gelase bzw. HK-Phosphatase (Epicentre) gemäß den Anweisungen des Herstellers eingesetzt wurden. Protein wurde durch eine vorsichtige Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt und die DNA durch Ethanol gefällt, sedimentiert und danach mit 70 % Ethanol gewaschen. Diese teilweise gespaltene DNA wurde für die Ligierung mit dem Vektor pFOS1 in sterilem H₂O auf eine Konzentration von 2,5 ng/μl resuspendiert.
Die Ergebnisse der PCR-Amplifikation mehrerer Agarosepfropfen (Daten nicht dargestellt) zeigten das Vorliegen signifikanter Mengen von Archaea-DNA. Quantitative Hybridisierungsexperimente unter Verwendung einer rRNA, die aus einer Probe extrahiert wurde, welche in 200 m Tiefe vor der Küste von Oregon gewonnen worden war, machten deutlich, dass die Plankton-Archaea in diesem Material etwa 4,7 % der gesamten Kleinstplankton-Biomasse ausmachten (diese Probe entspricht dem „PACI"-200 m in der Tabelle 1 von DeLong et al., „High abundance of Archaea in antarctic marine picoplankton", Nature 371: 695-698, 1994). Die Ergebnisse der mit Agarosepfropfen-Lysaten durchgeführten, auf Archaea ausgerichteten rDNA basierenden PCR-Amplifikation bestätigten, dass in dieser Probe relativ großen Mengen einer Archaea-DNA vorlagen. Die aus dieser Kleinstplankton-Probe hergestellten Agarosepfropfen wurden für die anschließende Zubereitung einer Fosmid-Bank ausgewählt. Jeweils 1 ml Agarosepfropfen von dieser Stelle enthielt etwa 7,5 × 10⁵ Zellen, somit lagen etwa 5,4 × 10⁵ Zellen in dem 72-μl-Scheibchen vor, das zur Herstellung der teilweise gespaltenen DNA verwendet wurde.
Vektorarme wurden aus pFOS1 wie beschrieben hergestellt (Kim et al., „Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector", Nucl. Acids Res. 20: 1083-1085, 1992). Kurz gesagt wurde das Plasmid mit Astll vollständig gespalten, mit HK-Phosphatase dephosphoryliert und danach mit BamHl gespalten, um zwei Arme zu erzeugen, von denen jeder eine cos-Stelle in der richtigen Orientierung für die Clonierung und Verpackung der ligierten DNA zwischen 35 und 45 kbp enthielt. Die teilweise gespaltene Kleinstplankton-DNA wurde über Nacht mit den PFOS1-Armen in einem Ligierungs-Reaktionsgemisch von 15 μl ligiert, das jeweils 25 ng des Vektors und des Inserts sowie 1 U T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) enthielt. Die ligierte DNA in 4 μl dieses Reaktionsgemisches wurde in vitro verpackt, wobei das Gigapack XL Verpackungssystem (Stratagene) verwendet wurde, die Fosmid-Partikel wurden auf den E. coli-Stamm DH10B (BRL) transfiziert und die Zellen auf LB_cm15-Platten ausgestrichen. Die resultierenden Fosmid-Clone wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen überführt, die LB_cm15, angereichert mit 7 % Glycerin, enthielten. Die rekombinanten Fosmide, die jeweils ca. 40 kb eines Kleinstplankton-DNA-Inserts enthielten, ergaben eine Bank von 3,552 Fosmid-Clonen, die etwa 1,4 × 10⁸ Basenpaare der clonierten DNA enthielten. Alle untersuchten Clone enthielten Inserts im Bereich von 38 bis 42 kbp. Diese Bank wurde eingefroren bei –80°C für die spätere Analyse aufbewahrt.
Beispiel 3
Selektion durch Hybridisierung und Herstellung einer Expressionsbank
Unter Verwendung einer wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten Plasmidbank erfolgten eine Selektion durch Hybridisierung und eine Herstellung der Expressionsbank gemäß dem in diesem Beispiel beschriebenen Protokoll. Die Bank kann eine DNA aus isolierten Mikroorganismen, angereicherten Kulturen oder Umweltproben enthalten.
Einzelsträngige DNA wird durch eines der zwei folgenden Verfahren hergestellt: 1) Die Plasmidbank kann gezüchtet und die doppelsträngige Plasmid-DNA isoliert werden. Die doppelsträngige DNA wird unter Verwendung des F1-Gen-11-Proteins und der Exonuclease III einzelsträngig gemacht. Das Gen-11-Protein bricht die doppelsträngigen Plasmide am F1-Ursprung, und die ExoIII spaltet den gebrochenen Strang ab, so dass ein einzelsträngiger Kreis zurückbleibt. Dieses Verfahren wird von Life Technologies in ihrem GeneTrapper^TM Kit eingesetzt. 2) Das zweite Verfahren umfasst die Verwendung eines Helferphagen, um einen der Stränge der doppelsträngigen Plasmide zu „retten". Die Plasmidbank wird in einer kleinen Übernacht-Kultur gezüchtet. Ein kleines Aliquot dieser Kultur wird mit dem Helferphagen VCS-M13 gemischt und erneut über Nacht gezüchtet. Am nächsten Morgen werden die Phagemide (Viruspartikel, die einzelsträngige DNA enthalten) aus dem Medium gewonnen und für das folgende Protokoll verwendet.
Protokoll

1. Sechs Proben von 4 μg der geretteten einzelsträngigen DNA aus der Bank Nr. 17 wurden in 3X SSC-Puffer zubereitet. Die endgültigen Reaktionsvolumina betrugen 30 μl.
2. Zu diesen Lösungen wurde einer der folgenden Stoffe zugegeben:
a) keiner;
b) 100 ng einer biotinylierten Sonde aus einer nicht in Zusammenhang stehenden Sequenz;
c, d) 100 ng einer biotinylierten Sonde aus dem DNA-Polymerase-Gen des Organismus Nr. 13;
e, f) 100 ng einer biotinylierten Sonde aus dem DNA-Polymerase-Gen des Organismus Nr. 17. Die biotinylierten Sonden wurden durch eine PCR-Amplifikation von Fragmenten mit einer Länge von etwa 1300 bp hergestellt, die einen Teil des DNA-Polymerase-Gens dieser Organismen codierten. Die Amplifikationsprodukte wurden hergestellt, indem im Amplifikationsgemisch biotinyliertes dUTP eingesetzt wurde. Dieses modifizierte Nucleotid wird während der Synthese in die gesamte DNA eingebaut. Die nicht eingebauten Nucleotide wurden unter Verwendung des QIAGEN PCR Clean up Kits entfernt.
3. Diese Gemische wurden durch Erhitzen auf 95°C, zwei Minuten, denaturiert.
4. Die Hybridisierung wurde bei den Proben a, b, d und f 90 Minuten bei 70°C durchgeführt. Die Proben c und e wurden bei 60°C hybridisiert.
5. Zu jeder Probe wurden 50 μl von gewaschenen und blockierten MPG-Kügelchen zugegeben und damit gemischt. Diese Gemische wurden insgesamt 30 Minuten lang alle fünf Minuten bewegt. Die MPG-Kügelchen werden mit 1 mg/ml in einem ein Konservierungsmittel umfassenden Puffer geliefert, so dass sechs Sätze von 100 μl zweimal in 3X SSC gewaschen und in 60 μl 3X SSC, enthaltend 100 μg beschallte Lachssperma-DNA, resuspendiert wurden.
6. Die DNA/Kügelchen-Gemische wurden zweimal bei Raumtemperatur in 0,1X SSC/0,1 % SDS, zweimal bei 42°C in 0,1 X SSC/0,1 % SDS, jeweils zehn Minuten, und ein weiteres Mal bei Raumtemperatur mit 3X SSC gewaschen.
7. Die gebundene DNA wurde eluiert, indem die Kügelchen in 50 μl TE 15 Minuten auf 70°C erhitzt wurden.
8. Verdünnungen der eluierten DNAs wurden hergestellt und eine PCR-Amplifikation entweder mit Gen-spezifischen Primern oder mit Vektor-spezifischen Primern durchgeführt. Die Verdünnungen der Bank-DNA wurden als Standards verwendet.
9. Die innerhalb der DNA enthaltenen DNA-Inserte wurden durch PCR amplifiziert, indem Vektor-spezifische Primer verwendet wurden. Diese Inserte wurden unter Verwendung des TA-Clonierungssystems (Invitrogen) cloniert.
10. Doppelte Ausführungen von 92 weißen Kolonien und vier blauen Kolonien aus den Proben d und f wurden über Nacht gezüchtet, sodann wurden Abklatschpräparate der Kolonien („colony lifts") für das Southern-Blotting hergestellt.
11. Das Digoxigenin-System von Boehringer Mannheim wurde eingesetzt, um die Kolonien unter Verwendung der Sonde des Organismus Nr. 17 zu testen.

Ergebnisse
PCR-Quantifizierung
1A und 1B: 1A zeigt ein Foto des Autoradiogramms, das aus den Agarose-Gel-Elektrophoresesäulen der Southern-Hybridisierung einer DNA aus den Probenlösungen a bis f in Beispiel 2 erhalten wurde, wenn diese mit Genspezifischen Primern hybridisiert wurde. 1B zeigt ein Foto des Autoradiogramms, das aus den Agarose-Gel-Elektrophoresesäulen der Southern-Hybridisierung einer DNA aus den Probenlösungen a bis f in Beispiel 2 erhalten wurde, wenn diese mit Vektor-spezifischen Primern hybridisiert wurde.
Die Gen-spezifischen DNA-Amplifikationen der Proben a und b machen deutlich, dass die unspezifische Bindung an die Kügelchen minimal ist. Die Menge der DNA, die unter den anderen Bedingungen gebunden wurde, ergibt eine Anreicherung im folgenden Ausmaß.
Koloniehybridisierung
2 zeigt ein Foto von vier Koloniehybridisierungs-Platten, wobei die von den Platten A und B erhalten wurden und positive Clone aufweisen, d.h. Kolonien, welche die in der Sonde enthaltene Sequenzen besitzen und die eine DNA aus einer Bank enthalten, die gemäß der Erfindung hergestellt wurde. Die Platten C und D waren Kontrollen und zeigten keine positiven Clone.
Sieben von 92 Kolonien aus der erfindungsgemäß hergestellten („panned") Probe waren für Sequenzen positiv, die in der Sonde enthalten waren. In der „unpanned" Probe (Kontrolle) wurden keine positiven Clone gefunden.
Beispiel 4
Test auf Enzymaktivität
Das Folgende stellt ein repräsentatives Beispiel eines Verfahrens zur Durchmusterung einer Expressionsbank, die gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde, auf eine Hydrolase-Aktivität dar.
Sodann werden Platten der Bank, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, verwendet, um eine einzelne Platte mehrfach zu beimpfen, die in jeder Vertiefung 200 μl LB Amp/Meth, Glycerin enthält. Dieser Schritt wird unter Verwendung des „High Density Replicating Tool" (HDRT) des Beckman Biomek durchgeführt, wobei zwischen dem Beimpfen jeweils ein Zyklus aus 1 % Bleichmittel, Wasser, Isopropanol und Luft-Trocken-Sterilisation erfolgt. Die einzelne Platte wird zwei Stunden bei 37°C gezüchtet und danach zum Beimpfen von zwei weißen Mikrotiter-Tochterplatten mit 96 Vertiefungen von Dynatech verwendet, die in jeder Vertiefung 250 μl LB Amp/Meth, Glycerin enthalten. Die ursprüngliche einzelne Platte wird 18 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend bei –80°C aufbewahrt. Die zwei konzentrierten Tochterplatten werden auch 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Danach werden die konzentrierten Tochterplatten 45 Minuten bei 70°C erhitzt, um die Zellen abzutöten und die Enzyme des Wirts E. coli zu inaktivieren. Eine Stammlösung von 5 mg/ml Morphoharnstoff-Phenylalanyl-7-amino-4-trifluormethylcoumarin (MuPheAFC, das „Substrat") in DMSO wird mit 50 mM Hepes-Puffer, pH 7,5, enthaltend 0,6 mg/ml des Detergens Dodecylmaltosid, auf 600 μM verdünnt.
MuPheAFC
50 μl der 600 μM MuPheAFC-Lösung werden zu jeder Vertiefung der weißen kondensierten Platten zugegeben, mit einem 100-μl-Misch-Zyklus unter Verwendung des Biomek, wodurch eine Endkonzentration des Substrats von etwa 100 μM erhalten wird. Die Fluoreszenzwerte (Anregung = 400 nm, Emission = 505 nm) werden auf einem Fluorometer zum Ablesen von Platten unmittelbar nach Zugabe des Substrats (t = 0) aufgezeichnet. Die Platte wird 100 Minuten bei 70°C inkubiert, anschließend lässt man sie weitere 15 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen. Die Fluoreszenzwerte werden erneut aufgezeichnet (t = 100). Um zu bestimmen, ob ein aktiver Clon vorliegt, werden die Werte bei t = 0 von den Werten bei t = 100 subtrahiert.
Die Daten geben an, ob einer der Clone in einer bestimmten Vertiefung das Substrat hydrolysiert. Um den einzelnen Clon zu bestimmen, der die Aktivität aufweist, werden die ursprünglichen Platten der Bank aufgetaut und die einzelnen Clone verwendet, um jeweils eine neue, LB Amp/Meth, Glycerin enthaltende Platte einzeln zu beimpfen. Wie vorstehend wird die Platte bei 37°C inkubiert, um die Zellen zu züchten, danach auf 70°C erhitzt, um die Enzyme des Wirts zu inaktivieren, und 50 μl des 600 μMl MuPheAFC unter Verwendung des Biomek zugegeben.
Nach Zugabe des Substrats werden die Fluoreszenzwerte bei t = 0 aufgezeichnet, die Platte wird bei 70°C inkubiert, und die Werte bei t = 100 werden wie vorstehend aufgezeichnet. Diese Daten zeigen, in welcher Platte der aktive Clon enthalten ist.
Der Enantioselektivitäts-Wert E für das Substrat wird gemäß der nachstehenden Gleichung bestimmt:
wobei ee_p = der enantiomere Überschuss (ee) des hydrolysierten Produkts, und c = die prozentuale Umwandlung der Reaktion. Vgl. Wong und Whitesides, „Enzymes in Synthetic Organic Chemistry", 1994, Elsevier, Tarrytown, New York, S. 9-12.
Der enantiomere Überschuss wird entweder durch eine chirale Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie (HPLC) oder durch eine chirale Kapillar-Elektrophorese (CE) bestimmt. Die Tests werden wie folgt durchgeführt: 200 μl des geeigneten Puffers werden zu jeder Vertiefung einer weißen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zugegeben, worauf 50 μl einer teilweise oder vollständig gereinigten Enzymlösung folgen; 50 μl des Substrats werden zugegeben und die Zunahme der Fluoreszenz gegen die Zeit so lange aufgezeichnet, bis 50 % des Substrats verbraucht sind oder die Reaktion endet, was auch immer zuerst stattfindet.
Beispiel 5
Mutagenese von Clonen mit positiver Enzymaktivität
Die Mutagenese wurde an zwei verschiedenen Enzymen (alkalischer Phosphatase und β-Glykosidase) durchgeführt, indem die zwei hier beschriebenen unterschiedlichen Strategien verwendet wurden, um neue Enzyme zu erzeugen, die einen höheren Aktivitätsgrad aufweisen als die Wildtyp-Enzyme.
Alkalische Phosphatase
Der Stamm XL1 Red (Stratagene) wurde mit dem genomischen Clon 27a3a (im Plasmid pBluescript), welcher das Gen der alkalischen Phosphatase aus dem Organismus OC9a codiert, nach den Anweisungen des Herstellers transformiert.
Eine 5-ml-Kultur von LB + 0,1 mg/ml Ampicillin wurde mit 200 μl des Transformationsgemisches beimpft. Die Kultur wurde 30 Stunden bei 37°C wachsen gelassen. Danach erfolgte an der Kultur ein Miniprep, hierauf folgte die Durchmusterung, indem eine Transformation von 2 μl der resultierenden DNA in XL-1-Blue-Zellen (Stratagene) gemäß den Anweisungen des Herstellers und das nachstehend beschriebene Verfahren (hinter: Transformieren der XL1 Blue-Zellen) durchgeführt wurden. Die mutierte OC9a-Phosphatase brauchte im Durchmusterungstest 10 Minuten, um eine Farbe zu entwickeln, wohingegen das Wildtyp-Enzym im Durchmusterungstest 30 Minuten brauchte, um eine Farbe zu entwickeln.
Standard-Durchmusterungstest auf alkalische Phosphatase
Transformieren des Stamms XL1 Red → Beimpfen von 5 ml der LB/amp-Kultur mit 200 μl Transformationsgemisch und Inkubieren 30 Stunden bei 37°C → Miniprep der DNA → Transformieren der XL1 Blue-Zellen → Plattieren auf LB/amp-Platten → Abklatschen von Kolonien mit Duralon UV- (Stratagene) oder HATF(Millipore) Membranen → Lysieren in Chloroform-Dämpfen, 30 Sekunden → Hitze-Abtöten, 30 Minuten bei 85°C → Entwickeln des Filters bei Raumtemperatur in BCIP-Puffer → Beobachten, wie sich das Filter entwickelt, und Identifizieren und Herausgreifen der sich am schnellsten entwickelnden Kolonien („Positive") → Erneutes Ausstreichen der „Positiven" auf einer BCIP-Platte.
BCIP-Puffer

20 mM CAPS, pH 9,0
1 mM MgCl₂
0,01 mM ZnCl₂
0,1 mg/ml BCIP

Beta-Glykosidase
Dieses Protokoll wurde zum Mutagenisieren der Beta-Glykosidase von Thermococcus 9N2 verwendet.
PCR-Reaktion

2 μl dNTPs (10 mM Stammlösungen)
10 μl 10x PCR-Puffer
0,5 μl Vektor-DNA 31G1A, 100 ng
20 μl 3'-Primer (100 pMol)
20 μl 5'-Primer (100 pMol)
16 μl MnCl · 4 H₂O (1,25 mM Stammlösung)
24,5 μl H₂O
1 μl Taq-Polymerase (5,0 Einheiten)
100 μl Gesamt

Reaktionszyklus

95°C, 15 Sekunden
58°C, 30 Sekunden
72°C, 90 Sekunden
25 Zyklen (10 Minuten Verlängerung bei 72°C – 4°C Inkubation) Laufenlassen von 5 μl auf einem 1 % Agarose-Gel, um die Reaktion zu testen;
Reinigen auf einer Qiaquick-Säule (Qiagen);
Resuspendieren in 50 μl H₂O.

Restriktionsspaltung

25 μl gereinigtes PCR-Produkt
10 μl NEB-Puffer Nr. 2
3 μl Kpnl (10 U/μl)
3 μl EcoRI (20 U/μl)
59 μl H₂O
Spalten zwei Stunden bei 37°C;
Reinigen auf einer Qiaquick-Säule (Qiagen);
Eluieren mit 35 μl H₂O.

Ligierung

10 μl gespaltenes PCR-Produkt
5 μl Vektor (gespalten mit EcoRIl/Kpnl und Phosphatase-behandelt mit der alkalischen Phosphatase von Shrimps)
4 μl 5x Ligierungspuffer
1 μl T4-DNA-Ligase (BRL)
Ligieren über Nacht;
Transformieren in M15pREP4-Zellen unter Verwendung einer Elektroporation;
Plattieren von 100 oder 200 μl auf LB-amp-meth-kan-Platten, Züchten über Nacht bei 37°C.

Test auf Beta-Gykosidase
Durchführen des Glykosidase-Tests zur Durchmusterung auf Mutanten wie folgt. Im Filtertest wird der Puffer Z (vgl. das nachstehende Rezept) verwendet, der 1 mg/ml des Substrats 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-o-glucopyranosid (XGLU) (Diagnostics Chemicals Limited oder Sigma) enthält.
Z-Puffer: (beschrieben in Miller, J. H., (1992), „A Short Course in Bacterial Genetics", S. 445) pro Liter:

Na₂HPO₄ · 7 H₂O 16,1 g

NaH₂PO₄ · H₂O 5,5 g

KCl 0,75 g

MgSO₄ · 7 H₂O 0,246 g β-Mercaptoethanol 2,7 ml

Einstellen des pH-Wertes auf 7,0

(1) Abklatschen der Kolonien unter Verwendung von Millipore HATF-Membranfiltern;
(2) Lysieren der Kolonien mit Chloroform-Dampf in 150-mm-Petrischalen aus Glas;
(3) Überführen der Filter auf 100-mm-Petrischalen aus Glas, die ein Stück Whatman-3MM-Filterpapier enthalten, gesättigt mit Z-Puffer, enthaltend 1 mg/ml XGLU. Nach Überführen des Filters, das lysierte Kolonien enthält, in die Glas-Petrischale wird die Schale bei Raumtemperatur gehalten.
(4) „Positive" wurden als blaue Punkte auf den Filtermembranen festgestellt („Positive" sind Punkte, die früh erscheinen). Die folgende Filter-Rettungstechnik wird eingesetzt, um das Plasmid aus der lysierten positiven Kolonie wiederzugewinnen. Anhand einer Pasteur-Pipette (oder eines Kapillarröhrchens aus Glas) werden die blauen Punkte auf der Filtermembran ausgestochen. Die kleinen Filterscheibchen werden in ein Epp-Röhrchen gegeben, das 20 μl Wasser enthält. Das Epp-Röhrchen wird fünf Minuten bei 75°C inkubiert, hierauf folgt eine Vortex-Behandlung, um die Plasmid-DNA aus dem Filter zu eluieren. Diese DNA wird in elektrokompetente E. coli-Zellen transformiert. Der Test mit dem Abklatschen auf ein Filter wird an den Transformationsplatten wiederholt, um „Positive" zu identifizieren. Die Transformationsplatten werden nach dem Filter-Abklatschen in den 37°C-Inkubator zurückgestellt, so dass sich die Kolonien regenerieren können. 3 ml LB-amp-Flüssigkeit werden mit neu-gereinigten Positiven beimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Aus diesen Kulturen wird die Plasmid-DNA isoliert, und anschließend wird das Plasmid-Insert sequenziert.

Beispiel 7
Gezielte Mutagenese von Clonen mit positiver Enzymaktivität
Die gezielte Mutagenese wurde an zwei verschiedenen Enzymen durchgeführt (alkalischer Phosphatase und β-Galactosidase), wobei die zwei hier beschriebenen unterschiedlichen Strategien verwendet wurden, um neue Enzyme zu erzeugen, die bei niedrigeren Temperaturen einen höheren Aktivitätsgrad zeigen als die Wildtyp-Enzyme.
Alkalische Phosphatase
Der Stamm XL1 Red (Stratagene) wurde mit einer DNA, die eine alkalische Phosphatase aus dem Organismus OC9a codiert (im Plasmid Bluescript), gemäß den Vorschriften des Herstellers transformiert. Eine 5-ml-Kultur von LB + 0,1 mg/ml Ampicillin wurde mit 200 μl des Transformationsgemisches beimpft. Die Kultur wurde 30 Stunden bei 37°C wachsen gelassen. Danach erfolgte an der Kultur ein Miniprep, anschließend wurde die Durchmusterung durch eine Transformation von 2 μl der resultierenden DNA in XL1 Blue-Zellen (Stratagene) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Standard-Durchmusterungstest auf alkalische Phosphatase
→ Plattieren auf LB/amp-Platten → Abklatschen von Kolonien mit Duralon UV- (Stratagene) oder HATF- (Millipore) Membranen → Lysieren in Chloroform-Dämpfen, 30 Sekunden → Hitze-Abtöten, 30 Minuten bei 85°C → Entwickeln des Filters bei Raumtemperatur in BCIP-Puffer → Beobachten, wie sich das Filter entwickelt, und Identifizieren und Herausgreifen der sich am schnellsten entwickelnden Kolonien („Positive") → Erneutes Ausstreichen der „Positiven" auf einer BCIP-Platte.
BCIP-Puffer

20 mM CAPS, pH 9,0
1 mM MgCl₂
0,01 mM ZnCl₂
0,1 mg/ml BCIP

Die mutierte Phosphatase OC9a brauchte im Durchmusterungstest 10 Minuten, um eine Farbe zu entwickeln, wohingegen das Wildtyp-Enzym im Durchmusterungstest 30 Minuten brauchte, um eine Farbe zu entwickeln. Beta-Glykosidase Dieses Protokoll wurde zum Mutagenisieren der DNA verwendet, die die Beta-Glykosidase von Thermococcus 9N2 codiert. Diese DNA-Sequenz ist in 1 beschrieben.
PCR

2 μl dNTPs (10 mM Stammlösungen)
10 μl 10x PCR-Puffer
0,5 μl pBluescript Vektor, enthaltend die β-Glykosidase-DNA (100 ng)
20 μl 3'-Primer (100 pMol)
20 μl 5'-Primer (100 pMol)
16 μl MnCl · 4H₂O (1,25 mM Stammlösung)
24,5 μl H₂O
1 μl Taq-Polymerase (5,0 Einheiten)
100 μl Gesamt

Reaktionszyklus

Restriktionsspaltung

Ligierung

10 μl gespaltenes PCR-Produkt
5 μl pBluescript Vektor (gespalten mit EcoRI/Kpnl und Phosphatasebehandelt mit der alkalischen Phosphatase von Shrimps)
4 μl 5x Ligierungspuffer
1 μl T4-DNA-Ligase (BRL)
Ligieren über Nacht;
Transformieren in M15pREP4-Zellen unter Verwendung einer Elektroporation;
Plattieren von 100 oder 200 μl auf LB-amp-meth-kan-Platten, Züchten über Nacht bei 37°C.

Test auf Beta-Gykosidase
Durchführen des Glykosidase-Tests zur Durchmusterung auf Mutanten wie folgt. Im Filtertest wird der Puffer Z (vgl. das nachstehende Rezept) verwendet, der 1 mg/ml des Substrats 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-o-glucopyranosid (XGLU) (Diagnostics Chemicals Limited oder Sigma) enthält.
Z-Puffer: (beschrieben in Miller, J. H., (1992), „A Short Course in Bacterial Genetics", S. 445) pro Liter:

Na₂HPO4 · 7 H₂O 16,1 g

NaH₂PO₄ · H₂O 5,5 g

KCl 0,75 g

MgSO₄ · 7 H₂O 0,246 g

β-Mercaptoethanol 2,7 ml

Einstellen des pH-Wertes auf 7,0

(1) Abklatschen der Kolonien unter Verwendung von Millipore HATF-Membranfiltern;
(2) Lysieren der Kolonien mit Chloroform-Dampf in 150-mm-Petrischalen aus Glas;
(3) Überführen der Filter auf 100-mm-Petrischalen aus Glas, die ein Stück Whatman-3MM-Filterpapier enthalten, gesättigt mit Z-Puffer, enthaltend 1 mg/ml XGLU. Nach Überführen des Filters, das lysierte Kolonien enthält, in die Glas-Petrischale wird die Schale bei Raumtemperatur gehalten.
(4) „Positive" wurden als blaue Punkte auf den Filtermembranen festgestellt („Positive" sind Punkte, die früh erscheinen). Die folgende Filter-Rettungstechnik wird eingesetzt, um das Plasmid aus der lysierten positiven Kolonie wiederzugewinnen. Anhand einer Pasteur-Pipette (oder eines Kapillarröhrchens aus Glas) werden die blauen Punkte auf der Filtermembran ausgestochen. Die kleinen Filterscheibchen werden in ein Epp-Röhrchen gegeben, das 20 μl Wasser enthält. Das Epp-Röhrchen wird fünf Minuten bei 75°C inkubiert, hierauf folgt eine Vortex-Behandlung, um die Plasmid-DNA aus dem Filter zu eluieren. Diese DNA wird in elektrokompetente E. coli-Zellen transformiert. Der Test mit dem Abklatschen auf ein Filter wird an den Transformationsplatten wiederholt, um „Positive" zu identifizieren. Die Transformationsplatten werden nach dem Filter-Abklatschen in den 37°C-Inkubator zurückgestellt, so dass sich die Kolonien regenerieren können. 3 ml LB-amp-Flüssigkeit werden mit den neu-gereinigten Positiven beimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Aus diesen Kulturen wird die Plasmid-DNA isoliert, und anschließend wird das Plasmid-Insert sequenziert.

Die einer Mutagenese unterworfene β-Glykosidase wirkte auf XGLU 2,5-mal stärker als die Wildtyp-β-Glykosidase.

Claims

Verfahren zur Gewinnung einer Enzymaktivität von Interesse, wobei das Verfahren die Schritte einschließt: (a) Bereitstellen einer ersten Bibliothek mit DNA, die von mindestens einem Mikroorganismus erhalten wird; (b) Binden mindestens eines Teils der codierenden Sequenzen der ersten Bibliothek an eine für die Enzymaktivität von Interesse spezifische Nucleinsäuresonde, um eine DNA-Teilmenge zu bilden; (c) Bereitstellen einer zweiten Bibliothek, die eine Expressionsbibliothek ist, wobei DNA von der in Schritt (b) erhaltenen DNA-Teilmenge verwendet wird; und (d) Durchmustern der zweiten Bibliothek auf enzymatische Aktivität.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin den Schritt des Einführens mindestens einer Mutation in die in der ersten Bibliothek enthaltenen DNA vor dem Bindungsschritt einschließt.
Verfahren nach Anspruch 2, das weiterhin den Schritt des Bestimmens der spezifischen Aktivität mindestens eines Mitglieds der zweiten Bibliothek einschließt.
Verfahren nach Anspruch 3, das weiterhin den Schritt des Vergleichens der Aktivität eines DNA-Expressionsprodukts von der zweiten Bibliothek mit der von einer nicht mutagenisierten Form der in der ersten Bibliothek vorhandenen DNA codierten Aktivität einschließt, wobei der Unterschied der Aktivitäten eine Wirkung der Einführung mindestens einer Mutation anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 2, das weiterhin den Schritt des Gewinnens einer DNA von einem Clon einschließt, der für mindestens ein gemeinsames Merkmal positiv ist, das die gleiche oder eine unterschiedliche Enzymaktivität als die von Interesse sein kann, vor dem Schritt des Einführens mindestens einer Mutation.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Gewinnen der in dem Clon enthaltenen DNA, der für mindestens ein gemeinsames Merkmal positiv ist, die Schritte des Inkontaktbringens des Clons mit einer komplementären Nucleinsäure oder einem Fragment davon, wodurch die Hybridisierung der Clon-DNA mit der komplementären Nucleinsäure ermöglicht wird, und das Isolieren der hybridisierten Clon-DNA einschließt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die komplementäre Nucleinsäure oder das Fragment davon eine an eine Festphase gebundene Hybridisierungssonde einschließt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Mutation durch ein Verfahren eingeführt wird, das ausgewählt ist aus von fehleranfälliger PCR, oligonucleotidgesteuerter Mutagenese, Assembly-PCR, sexueller PCR-Mutagenese, In-vivo-Mutagenese, Kassetten-Mutagenese, rekursiver Ensemble-Mutagenese, exponentieller Ensemble-Mutagenese und ortspezifischer Mutagenese.
Verfahren nach Anspruch 2, einschließlich des Schrittes des Durchmusterns der in der ersten Bibliothek enthaltenen DNA auf eine Aktivität, die die gleiche oder eine unterschiedliche Enzymaktivität als die von Interesse ist, bevor die DNA einer Mutagenese unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA ein Pool von DNA-Populationen ist, die eine Vielzahl von gewünschten Eigenschaften enthalten, und wobei die DNA von einer gemischten Population von Mikroorganismen erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren vor dem Durchmusterungsschritt weiterhin die Schritte einschließt: (i) Bereitstellen einer ersten DNA-Bibliothek mit genomischer DNA, die von einer gemischten Population aus Mikroorganismen erhalten wird; (ii) Umwandeln der DNA aus Schritt i) in Einzelstränge; (iii) Inkontaktbringen der einzelsträngigen DNA-Population aus ii) mit einer DNA-Sonde; (iv) Freisetzen der Mitglieder der genomischen Population, die an die Sonde gebunden war, von der Sonde; (v) Bilden doppelsträngiger DNA aus den Mitgliedern der genomischen Population aus (iv); und (vi) Einführen der doppelsträngigen DNA aus (v) in eine geeignete Wirtszelle, um eine Expressionsbibliothek herzustellen, die eine Vielzahl an Clonen enthält, die die gewählte DNA enthalten.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die genomische DNA oder das Fragment davon ein oder mehrere Operonen oder Teile davon enthalten.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Operonen oder Teile davon einen kompletten oder teilweisen Stoffwechselweg codieren.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Operonen oder Teile davon, die einen kompletten oder teilweisen Stoffwechselweg codieren, Polyketidsynthasen codieren.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die DNA-Sonde an einen Liganden gebunden ist und mindestens einen Teil der Sequenz der codierenden Region der DNA für ein Enzym mit bekannter Aktivität einschließt, und wobei ein Bindungspartner für den Liganden an eine Festphase gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Ligand ausgewählt ist aus Antigenen, Haptenen, Biotin, Iminobiotin, Zuckern, Enzymen, Apoenzymen, homopolymeren Oligonucleotiden und Hormonen.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Bindungspartner für den Liganden ausgewählt ist aus Antikörpern oder spezifischen Bindefragmenten davon, Avidin, Streptavidin, Lektinen, Enzyminhibitoren, Apoenzymen, Cofaktoren, homopolymeren Oligonucleotiden und Hormonrezeptoren.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Festphase ausgewählt ist aus Glasoberflächen, Polymeroberflächen, gepackten Säulen von Polymerkügelchen, magnetischen Partikeln und paramagnetischen Partikeln.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren vor dem Durchmusterungsschritt weiterhin die Schritte einschließt: (i) Gewinnung einer einzelsträngigen genomischen DNA-Population von der in der ersten Bibliothek enthaltenen DNA; (ii) Inkontaktbringen der einzelsträngigen DNA-Population aus (i) mit einer an einen Liganden gebundenen Oligonucleotidsonde, die zu einer Sekretionssignalsequenz komplementär ist, die bei einer gegebenen Klasse von Proteinen einzigartig ist, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung erlauben, um einen doppelsträngigen Komplex zu bilden; (iii) Inkontaktbringen des doppelsträngigen Komplexes aus (ii) mit einem für eine Festphase spezifischen Bindungspartner für den Liganden, um einen Festphasenkomplex herzustellen; (iv) Trennen des Festphasenkomplexes von der einzelsträngigen DNA-Population aus (i); (v) Freisetzen der Mitglieder der genomischen Population, die an die Sonde gebunden hatten, die an die Festphase gebunden war; (vi) Trennen der an die Festphase gebundenen Sonde von den Mitgliedern der genomischen Population, die daran gebunden hatten; (vii) Bilden einer doppelsträngigen DNA aus den Mitgliedern der genomischen Population aus (v); und (viii) Einführen der doppelsträngigen DNA aus (vii) in eine geeignete Wirtszelle, um eine Expressionsbibliothek zu erzeugen, die eine Vielzahl an Clonen enthält, die die gewählte DNA enthalten.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die genomische DNA oder das Fragment davon ein oder mehrere Operone oder Teile davon enthält.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die erste Bibliothek von der in einer gemischten Population von Mikroorganismen enthaltenen DNA erhalten wird.
Verfahren zur Gewinnung einer Enzymaktivität von Interesse nach Anspruch 1, wobei in Schritt (a) von Anspruch 1 die DNA der ersten Bibliothek aus einem Gemisch aus Mikroorganismen erhalten wird, wobei in Schritt (b) von Anspruch 1 ein Gemisch aus DNA-Sonden, die mindestens einen Teil einer DNA-Sequenz einschließen, die mindestens ein mit der Enzymaktivität in Verbindung stehendes Protein codiert, an die DNA der ersten Bibliothek gebunden ist, und wobei nach Ausführung der Schritte (c) und (d) von Anspruch 1 ein Clon identifiziert wird, der für die Enzymaktivität positiv ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Enzymaktivität die Aktivität eines Enzyms ist, das ausgewählt ist aus Oxidoreductasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die DNA der ersten Bibliothek eine genomische DNA ist, die von ein oder mehreren Arten von ungezüchteten Mikroorganismen erhalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die genomische DNA von ungezüchteten Mikroorganismen abstammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die genomische DNA von gezüchteten Mikroorganismen abstammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 26, wobei die Mikroorganismen von einer Umweltprobe isoliert werden.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die von einer Umweltprobe isolierten Mikroorganismen Extremophile sind.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Extremophile ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Thermophilen, Hyperthermophilen, Psychrophilen und Psychrotrophen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29, wobei das Enzym, das die Enzymaktivität von Interesse hat, ein thermostabiles Enzym ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 30, wobei die DNA aus einer heterogenen DNA-Population stammt.