JPH067160A - 古細菌からの組換え熱安定性ｄｎａポリメラーゼ - Google Patents

古細菌からの組換え熱安定性ｄｎａポリメラーゼ

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JPH067160A
JPH067160A JP4355752A JP35575292A JPH067160A JP H067160 A JPH067160 A JP H067160A JP 4355752 A JP4355752 A JP 4355752A JP 35575292 A JP35575292 A JP 35575292A JP H067160 A JPH067160 A JP H067160A
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polymerase
litoralis
dna polymerase
probe
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Donald G Comb
ドナルド・ジー・コーム
Francine Perler
フランシーン・パーラー
Rebecca Kucera
レベツカ・クセラ
William E Jack
ウイリアム・イー・ジヤツク
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New England Biolabs Inc
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria

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Abstract

(57)【要約】 【構成】古細菌からの組換えＤＮＡポリメラーゼ類、並
びに、このようなポリメラーゼ類をコードする単離され
たＤＮＡを提供する。単離されたＤＮＡは、各々、Ｔ．
リトラリスＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡから
調製されるＤＮＡもしくは抗体プローブ、及び、Ｔ．リ
トラリスＤＮＡポリメラーゼの使用により取得する。 【効果】組換え古細菌熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを産
生する方法、及び、このようなＤＮＡポリメラーゼをコ
ードするＤＮＡ内に含まれるイントロンの同定、位置決
定、及び、除去による、このようなポリメラーゼ類の発
現の増幅化のための方法をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、古細菌からの組換えＤ
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ
をコードするＤＮＡ配列から調製されるＤＮＡプローブ
に対してハイブリッド形成する当該ＤＮＡポリメラーゼ
をコードする単離されたＤＮＡ、当該ＤＮＡの単離に利
用されるＤＮＡ及び抗体プローブに関し、同様に、当該
ＤＮＡを単離するための方法、及び、当該ＤＮＡポリメ
ラーゼの発現を増幅させる目的で、当該ＤＮＡ内に含ま
れる介在ヌクレオチド配列を同定し、位置を決定し、か
つ、除去するための方法に関する。
【０００２】関連特許出願に対する相互引用文献 本発明は、１９９１年４月１７日に提出された米国特許
出願、整理番号No. ：07/686,340の継続部分であり、こ
れは、１９９０年１２月１１日に提出された米国特許出
願、整理番号No. ：07/626,057の継続部分であり、これ
は、１９９０年４月２６日に提出された米国特許出願、
整理番号No. ：07/513,994の継続部分である。
【０００３】発明の背景 ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ修復及び複製に関連する
酵素類の一種である。大腸菌（E. coli ）のような中温
性微生物からのＤＮＡポリメラーゼ類の単離については
広範囲の研究が行われていきた。例えば、Bessman 、et
al.、J. Biol.Chem.（1957） 233:171−177 、及び、B
uttin and Kornberg J. Biol. Chem.（1966） 241:5419
−5427を参照せよ。
【０００４】大腸菌から単離されたＤＮＡポリメラーゼ
の例には、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌のＤ
ＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、及び、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼがある。これらの酵素は、例えば、ニック
トランスレーションによるＤＮＡのラベル化、ｃＤＮＡ
クローニングにおける第２鎖ｃＤＮＡ合成、及び、ＤＮ
Ａの配列決定を含む、組換えＤＮＡ技術における多様な
用途を有する。Maniatis、et al.、 Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual （1982）を参照せよ。
【０００５】最近、米国特許番号4,683,195 、 4,683,2
02、及び、4,800,159 が、核酸配列を増幅、検出、及び
／又は、クローニングするための方法における上記酵素
の用途を開示した。この方法は、共通して、ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）として引用されており、存在する
核酸配列の増幅に対する、ポリメラーゼ類、プライマー
類、及び、ヌクレオチド三リン酸類の用途を含む。
【０００６】先に論議した幾つかのＤＮＡポリメラーゼ
類は、合成がある一つの塩基対形成選択段階のみの結果
である場合よりも、かなり高い忠実性をＤＮＡ複製に付
与するプルーフリーディング機能を提供する、３′−
５′エキソヌクレアーゼ活性を所有する。Burtlag 、D.
and Kornberg 、A.、J. Biol. Chem.、（1972） 247:2
41 −248 。３′−５′プルーフリーディングエキソヌ
クレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ類は、非プ
ルーフリーディングエキソヌクレアーゼ所有ポリメラー
ゼと比較する場合、実質的に、より低い塩基取り込み過
誤率を有する。Chang 、L.M.S.、J. Biol. Chem.、（19
77）252: 1873 −1880。
【０００７】セルムス・アクアティクス（Thermus aqua
ticus ）のような好熱性生物からのＤＮＡポリメラーゼ
類の同定及び精製についても研究が行われてきた。Chie
n 、A.、et al. J. Bacteriol.、（1976） 127: 1550−
1557、は、Ｔ．アクアティクス（T. aquaticus）ＹＴ１
株からの８０℃の至適温度を有するＤＮＡポリメラーゼ
の同定及び精製を開示している。このChien 、et al.、
の精製法は４段階の過程を必要とする。これらの段階
は、未精製抽出物の調製、ＤＥＡＥ−セファデックスク
ロマトグラフィー、フォスフォセルロースクロマトグラ
フィー、及び、ＤＮＡセルロース上でのクロマトグラフ
ィー、を含む。Kaledin 、et al.、Biokhymiyay （198
0） 45: 644−651 、も又、Ｔ．アクアティクスＹＴ１
株の細胞類からのＤＮＡポリメラーゼの同定及び精製を
開示している。このKaledin 、et al.の精製法は６段階
の過程を必要とする。これらの段階は、未精製抽出物の
単離、硫酸アンモニウム沈殿、ＤＥＡＥ−セルロースク
ロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト上での分画
化、ＤＥＡＥ−セルロース上での分画化、及び、１本鎖
のＤＮＡ−セルロース上でのクロマトグラフィーを含
む。
【０００８】米国特許番号4,889,818 は、Ｔ．アクアテ
ィクスからの精製した熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、つ
まり、１本鎖ＤＮＡ−セルロース上でのクロマトグラフ
ィーの代わりにフォスフォセルロースクロマトグラフィ
ーを代用することを付け加えた、Kaledin の方法に実質
的に等しい方法により調製される、約86,000から90,000
ダルトンの分子量を有するＴａｑポリメラーゼを開示し
ている。更に、欧州特許出願0258017 は、先に論議した
ＰＣＲ法における用途に好ましい酵素としてのＴａｑポ
リメラーゼを開示している。
【０００９】研究により、Ｔａｑポリメラーゼが５′−
３′ポリメラーゼ依存的エキソヌクレアーゼ機能を有す
るにもかかわらず、このＴａｑＤＮＡポリメラーゼは
３′−５′プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ機
能を所有しないことが示されている。Lawyer、F.C.、et
al. J. Biol. Chem. 、（1989） 264: II、 p. 6427−
6437。Bernard 、A.、et al. Cell （1989） 59: 219。
その結果、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは塩基取り込み過
誤を生じさせる傾向にあり、特定の応用法におけるその
用途を望ましくないものにしている。例えば、遺伝子の
任意の１コピーがランダムな誤った取り込みのために過
誤を含むことができるため、増幅された遺伝子をクロー
ン化する試みは未解決である。複製周期のどこで過誤が
生じるかによって（例えば、初期複製周期において）、
増幅される完全なＤＮＡは、誤って取り込んだ塩基を含
み、従って、突然変異した遺伝子産物を生じる。更に、
研究により、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、１００℃に
おいては、数種の突然変異体ほどの熱安定性を有さない
ことが示された。
【００１０】従って、比較用のもしくは改善された熱安
定性、及び／又は、３′から５′へのエキソヌクレアー
ゼプルーフリーディング活性を有する他のＤＮＡポリメ
ラーゼ類が、科学団体にとって望まれるところのもので
ある。このような酵素の一つである（以下により詳細に
記載してある）、セルモコッカス・リトラリス（Thermo
coccus litoralis）、つまり、海底熱火道付近で１００
℃に近い温度で増殖する古細菌からのＤＮＡポリメラー
ゼを大腸菌内にクローン化した。しかしながら、この遺
伝子からのこの組換え酵素蛋白質の大量産生は２つのイ
ントロンの存在により複雑化されており、その一つは、
遺伝子工学技術により除去する必要があり、更に、もう
一方のものは、大腸菌内からスプライスされてくるエン
ドヌクレアーゼをコードする。
【００１１】先に記載したＤＮＡポリメラーゼ法を改善
するような、３′から５′方向へのプルーフリーディン
グ活性、及び／又は、比較用のもしくは改善された熱安
定性を有する古細菌からの、他の高度に熱安定性なＤＮ
Ａポリメラーゼ類を取得及び産生することが希望され
る。
【００１２】発明の要約 本発明に従って、古細菌からのＤＮＡポリメラーゼをコ
ードするＤＮＡを同定、単離、及び、クローニングする
ための方法及び産物が提供される。本発明は、又、古細
菌からの組換えＤＮＡポリメラーゼ類、並びに、当該ポ
リメラーゼ類をコードするＤＮＡ内に存在する介在ヌク
レオチド配列類もしくはイントロン類を同定、位置決
定、及び、除去することによる、当該組換えＤＮＡポリ
メラーゼ類の発現を改善するための方法に関する。
【００１３】より具体的には、本発明に従って、古細菌
からのＤＮＡポリメラーゼ類をコードするＤＮＡは、Ｄ
ＮＡ及びアミノ酸レベルの両方において、実質的な同一
性を有することが発見された。又、このような酵素類を
コードする古細菌からのＤＮＡは、やはりＤＮＡレベル
における実質的な相同性を共有する１つもしくは複数の
介在ヌクレオチド類もしくはイントロン類を有するよう
に思われることが発見された。
【００１４】従って、本発明に従い、セルモカッカス・
リトラリスのような古細菌からの１種類のＤＮＡポリメ
ラーゼをコードするＤＮＡ配列からＤＮＡプローブ類を
作製することができ、かつ、これを使用して、ピロコッ
カス（Pyrococcus）のような他の古細菌からのＤＮＡポ
リメラーゼ類をコードするＤＮＡを同定及び単離するこ
とができる。同様に、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラー
ゼと交差反応する抗体プローブ類を使用してもやはり、
このような他のポリメラーゼ類を発現するコーディング
配列をコードするＤＮＡを同定することができる。
【００１５】一度、標的ＤＮＡポリメラーゼをコードす
るＤＮＡが単離したら、それを使用して、標的ＤＮＡポ
リメラーゼの商業的な量を産生する目的で発現ベクター
類を作製することができる。これに関して、本発明は更
に、このＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列中
に存在する任意の介在ヌクレオチド配列類もしくはイン
トロン類を、同定、位置決定、及び、除去することによ
る、標的ＤＮＡポリメラーゼの発現レベルを増加させる
方法をも提供する。以下に記載するように、大腸菌内に
おいては特定のイントロン類はスプライシングされて
（切り出されて）くるものの、組換えＤＮＡポリメラー
ゼの発現を、大腸菌内における発現の以前のこのような
介在ヌクレオチド配列の除去により増幅させることがで
きる。
【００１６】発明の詳細な説明 本発明のある好ましい実施態様に従って、古細菌から組
換えＤＮＡポリメラーゼを産生する方法が提供される。
好ましい方法は、１）標的固体菌からゲノムライブラリ
ーを形成する、２）適切な宿主細胞を形質転換もしくは
トランスフェクションさせる、３）ｉ）形質転換もしく
はトランスフェクトさせた宿主細胞からのＤＮＡを、
Ｔ．リトラリスからのＤＮＡポリメラーゼをコードする
ＤＮＡに対してハイブリッド形成するＤＮＡプローブと
反応させるか、あるいは、ｉｉ）形質転換もしくはトラ
ンスフェクトさせた宿主細胞からの抽出物を、Ｔ．リト
ラリスＤＮＡポリメラーゼと交差反応する抗体プローブ
と反応させるか、のいずれか、４）ＤＮＡプローブに対
してハイブリッド形成するか、あるいは、Ｔ．リトラリ
ス特異的抗体と交差反応するかのいずれかである、段階
３の形質転換もしくはトランスフェクトさせた細胞を、
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ活性についてアッセイする
ことを含む。
【００１７】前述の方法は、古細菌からの組換えＤＮＡ
ポリメラーゼ類の産生、並びに、当該ポリメラーゼ類を
コードするＤＮＡの単離を考慮にいれている。
【００１８】他の好ましい実施態様に従い、古細菌から
の組換えＤＮＡポリメラーゼ類の発現を増幅させるため
の方法が提供される。先に記載したように、古細菌から
のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡは、標的組換
えＤＮＡポリメラーゼの発現を複雑にすることができる
１つもしくは複数のイントロンを所有することができ
る。発現系の作製以前のこれらのイントロン類の位置決
定及び除去により、イントロンがその宿主細胞内で標準
的にスプライシングされてくる場合でさえも、標的ＤＮ
Ａポリメラーゼの発現を増幅させることが発見された。
以下により詳しく論議しているように、イントロンは、
数々の方法において同定及び除去することができる。特
に、Ｔ．リトラリスのイントロンは、ピロコッカスのよ
うな他の属の古細菌と、ＤＮＡレベルにおいて実質的な
相同性を共有することも発見した。この事実の見識によ
り、以下により詳しく記載されている方法によるイント
ロンの同定、位置決定、及び、除去が容易になるはずで
ある。
【００１９】本発明の実際の特定の実施態様の実施に当
たり、ｉ）Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼをコード
するＤＮＡに対してハイブリッド形成するＤＮＡプロー
ブ、あるいは、ｉｉ）Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラー
ゼと交差反応する抗体、のいずれかを利用することが好
ましい。ＤＮＡプローブを、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリ
メラゼーをコードするＤＮＡ配列に基づいて作製するこ
とが好ましく（Fig.６を参照せよ）、一方、抗体プロー
ブは、精製したＴ．リトラリス酵素そのもの自体から作
成することが好ましい。本発明の方法に従い、当然のこ
とながら、他の源の古細菌からのＤＮＡポリメラーゼも
しくはそのＤＮＡを基にしてプローブ類を作製すること
ができる。しかしながら、このようなプローブ類を作製
するのに用いる好ましいＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡ
は、Ｔ．リトラリスからのものである。
【００２０】天然のＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼの産生 Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ．リトラリス
株ＮＳ−Ｃから取得可能である（ＤＳＭ No. 5473、こ
の試料は、アメリカン タイプ カルチャーコレクショ
ンに、ATCC受託番号No. 55233 として、１９９１年９月
１７日に寄託してもある）。Ｔ．リトラリスは、１９８
５年、イタリア、ナポリ付近の海底熱火道から単離され
た。この生物、Ｔ．リトラリスは、極度に好熱性である
イオウ代謝性の古細菌であり、５５℃と９８℃との間に
増殖範囲を有する。Neuner、etal.、Arch. Microbiol.
（1990）。
【００２１】天然の蛋白質を回収するために、Ｔ．リト
ラリスを、Belkin、et al.、Arch Microbiol. （1985）
142: 181−186 、により記載されている技術のような任
意の適切な技術にを用いて増殖させることができ、その
開示は、引用文献として本明細所内に取り込んである。
簡潔には、１０mg/ml のイオウ及び０．０１Ｍのシステ
インを含む先に記載した培地中で、１５ml中のねじ蓋式
の試験管内で、９５℃で２日間、細胞を増殖させる。よ
り大量の細胞が必要な場合には、１リットルのねじ蓋式
容器を用い、かつ、滅菌後に、新しく作成した１０mlの
培養物で接種し、更に、９０−９５℃で、２日間増殖さ
せる。
【００２２】細胞増殖後、以下に示すような多段階法を
使用して、酵素の単離及び精製のための、ある好ましい
方法を行う：最初に、細胞を、もし凍結しているのであ
れば解凍させて、バッファーＡ（１０mMのＫＰＯ4 バッ
ファー、ＰＨ７．４；１．０mMのＥＤＴＡ、１．０mMの
β−メルカプトエタノール）のような適切なバッファー
中に懸濁し、超音波処理し、更に、遠心する。その後、
この上清を、アフィゲル ブルー カラム（バイオラド
社）のような、核酸に結合する蛋白質類について高い親
和性を有するカラムを通過させる。カラムの数倍の容積
の約７．０のｐＨの低塩バッファーでカラムを洗浄する
ことにより、Ｔ．リトラリスの上清溶液中に存在する核
酸、及び、カラムを通過する多くの蛋白質を除去する。
洗浄後、バッファーＡ中に含まれる０．１から２．０Ｍ
のＮａＣｌのような直線濃度勾配で酵素を溶出する。ピ
ークのＤＮＡポリメラーゼ活性を透析し、更に、フォス
フォセルロースカラムに供する。カラムを洗浄し、更
に、バッファーＡ中に含まれる０．１から１．０ＭのＮ
ａＣｌのような直線濃度勾配液で酵素を溶出する。ＤＮ
Ａポリメラーゼ活性を含む分画を一まとめにし、バッフ
ァーＡに対して透析し、更に、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）のモノ−Ｑカラム（陰イオン交換体）
に供する。酵素を再び、バッファーＡ中に含まれる０．
０５から１．０ＭのＮａＣｌのような直線濃度勾配液で
溶出する。熱安定性ポリメラーゼ活性を有する分画を一
まとめにし、透析し、更に、ＨＰＬＣ モノ−Ｓカラム
（陽イオン交換体）に供する。酵素を再び、バッファー
Ａ中に含まれる０．０５から１．０ＭのＮａＣｌのよう
な直線濃度勾配液で溶出する。この段階においては、酵
素は約５０％の純度である。この酵素を、５０mMのＮａ
Ｃｌを補足したバッファーＡに対して繰り返し透析する
ことによる混入低分子量蛋白質の沈殿化により更に精製
することができる。Ｔ．リトラリスから取得することが
できるＤＮＡポリメラーゼの見かけの分子量は、９７，
４００ダルトンの分子量が割り当てられているフォスフ
ォリラーゼＢのような既知の分子量の蛋白質標準物類と
比較した場合、約９０，０００から９５，０００ダルト
ンの間である。しかしながら、極端な好熱性生物からの
蛋白質として、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼは、
完全な変性の不首尾もしくは他の固有な性質のため常態
でない比較分子量に電気泳動されることがあることを念
頭に置くべきである。本発明の熱安定性酵素の正確な分
子量は、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のコ
ーディング配列から決定することができる。溶出産物の
分子量は、例えば、蛋白質分子量マーカー類を使用する
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）によるような任意の技術により決定することが
できる。
【００２３】ポリメラーゼ活性を、ＤＮＡアーゼ処理し
た、もしくは、活性化したＤＮＡ内へ、放射能でラベル
したデオキシヌクレオチド類の取り込みにより測定する
ことが好ましく、その後、連続的に、ＤＮＡ基質から取
り込まれなかったデオキシヌクレオチド類を分離する
と、ポリメラーゼ活性は、そのＤＮＡを含む酸可溶性分
画における放射能の量に比例する。Lehman、I.R.、et a
l.、J. Biol. Chem.（1958） 233: 163 、この開示は、
本明細書内に、引用文献として取り込んである。
【００２４】１００℃における本発明のＤＮＡポリメラ
ーゼの半減期は約６０分である。このＤＮＡポリメラー
ゼの熱安定性もしくは半減期は、ある１種類の放射能ラ
ベルしたデオキシヌクレオチドを除く全てのアッセイ成
分（バッファー、ＭｇＣｌ2、デオキシヌクレオチド
類、及び、活性化したＤＮＡ）の存在下において、興味
の対照である温度において酵素を予めインキュベートす
ることにより決定する。４−１８０分の範囲に渡る予め
決定した時間間隔において、小分画を除去し、先に記載
した方法を用いてポリメラーゼ活性についてアッセイす
る。
【００２５】そのＤＮＡポリメラーゼの１００℃におけ
る半減期は又、共通には、TritonＸ−１００（ローム＆
ハース社）としてしられている非イオン性洗剤オクトオ
キシノール、もしくは、蛋白質のウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）のような安定化剤類の存在下において測定す
ることもできる。非イオン性洗剤ポリオキシエチル化し
た（Tween ２０）ソルビタンモノラウリン酸（Tween ２
０、ＩＣＩ アメリカズ社）、及び、エトキシル化した
アルキルフェノール（ノニル）（イコノール ＮＰ−４
０、ＢＡＳＦ ワイアンドット社）を使用することもで
きる。安定化剤を使用して、反応混合物に対して添加す
る少量の酵素を、試験管の側面への吸着、あるいは、そ
の酵素活性を低減させるある種の方法における構造的立
体配座の変化から回避させる。安定化剤TritonＸ−１０
０もしくはＢＳＡの存在下における、Ｔ．リトラリスか
ら取得可能なＤＮＡポリメラーゼの１００℃における半
減期は、約９５分である。
【００２６】組換えＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼの調製 Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼを又、この酵素をコ
ードする遺伝子をＴ．リトラリスのゲノムＤＮＡからク
ローン化した時の組換えＤＮＡ技術により産生させるこ
ともできる。Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼについ
ての完全なコーディング配列を、約１４kbのBamHI 制限
断片上のバクテリオファージＮＥＢ＃６１９から誘導す
ることができる。このファージは、１９９０年４月２４
日にアメリカン タイプ カルチャー コレクション
（ＡＴＣＣ）に寄託し、受託番号ＡＴＣＣ４０７９５を
有する。
【００２７】Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼの組換
え型の産生は、以下に示す段階を含む：ポリメラーゼの
活性型をコードするＤＮＡを、天然型で、あるいは、他
の配列との融合物としてのいずれかにおいて単離する
が、後者の場合、他の配列は天然型のポリメラーゼから
開裂により除去されてよいし、あるいは、そうでなくと
もよく、かつ、ポリメラーゼ活性に影響を与えてもよ
く、あるいは、与えなくてもよい。次に、この遺伝子
を、原核生物もしくは真核生物宿主／ベクター系のいず
れかにおいて、発現のための適切な調節配列類に遺伝子
操作により結合させることができる。このベクターは、
適切な宿主内における形質転換及び保持に必要な全ての
機能をコードすることが好ましく、かつ、Ｔ．リトラリ
スポリメラーゼ発現についての選択的なマーカー類及び
／又は調節配列類をコードすることができる。活性な組
換え熱安定性ポリメラーゼを、連続的にもしくは発現の
誘導後のいずれかに、形質転換させた宿主生物類により
産生させることができる。活性な熱安定性ポリメラーゼ
を、宿主細胞内から、あるいは、その蛋白質が細胞膜を
通して分泌される場合には培養培地から、のいずれかで
回収することができる。
【００２８】先の段階の各々を数々の方法において実行
することができる一方、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラ
ーゼをコードするＤＮＡのクローニングについては、大
腸菌内のそれ自身の調節配列からのポリメラーゼの発現
の結果、ポリメラーゼ遺伝子の不安定性、ポリメラーゼ
遺伝子の高頻度の突然変異、遅い細胞増殖、及び、幾分
かの度合いの細胞死亡率を生じる。
【００２９】理論には縛られたくないものの、この不安
定性は、少なくとも、Fig.６のヌクレオチド１７７６か
ら３３８９までのものからＴ．リトラリスＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子を切り離す１６１４bpのイントロン、及
び、ヌクレオチド３５３４から４７０３までのものから
Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼを切り離す第２の１
１７０bpのイントロンのためであると考えられている。
以下に論議するように、介在配列がやはり他の古細菌か
らのＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ中に存在す
ると考えられている。数々の古細菌からのイントロン類
もやはり、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼをコード
するＤＮＡ中に存在するイントロン類に対する実質的な
相同性を共有するものと考えられており、これにより、
本発明のある側面に従い、それらの同定、位置決定、及
び、除去が容易になる。
【００３０】イントロンは、遺伝子のコーディング領域
を分断する介在性ＤＮＡの広がりである（蛋白質のコー
ディング領域はエキソンと呼ばれている）。イントロン
は、ナンセンス配列を含むことができるか、あるいは、
蛋白質をコードすることができる。機能を有する蛋白質
を作成する目的で、このイントロンは、成熟したｍＲＮ
Ａの蛋白質への翻訳以前に、前−ｍＲＮＡの外へスプラ
イスされる必要がある。イントロンは、本来は、真核生
物内に同定されたが、最近、特定の原核生物内において
記載されている（例えば、Krainer and Maniatis（Tran
scription andSplicing（1988） B.D. Hames and D.M.
Glover 、eds. IRL Press、Oxford andWashington 、D.
C. pp.131 −206 ）を参照せよ）。イントロンを有する
遺伝子がｍＲＮＡに転写される場合、そのイントロンが
自己スプライシングを行い、成熟したｍＲＮＡを形成す
るか、あるいは、前−ｍＲＮＡからそのイントロンを除
去するのには細胞因子が必要であることができる。同著
者。細菌のイントロンは、しばしば、スプライシングに
遺伝子特異的な補助因子を必要とする。例えば、あるバ
シルスのイントロンは、大腸菌内ではスプライシングさ
れることができない。（同著者）。
【００３１】しかしながら、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリ
メラーゼをコードする遺伝子内に含まれる介在ＤＮＡ配
列が転写されかつ翻訳され、更に、そこから産生される
ペプチドはｍＲＮＡレベルではなく蛋白質レベルでスプ
ライシングされることを示唆するある種の証拠が存在す
る。従って、スプライシングが行われる場所如何によら
ず、大腸菌内におけるＴ．リトラリスＤＮＡポリメラー
ゼの発現の目的では、大腸菌系内におけるポリメラーゼ
の発現に先立ち、介在配列を削除することが好ましい。
当然のことながら、例えば、あるサーモコッカス系のよ
うな、イントロンをスプライシングするための適切な因
子を所有する系内においてＴ．リトラリスＤＮＡポリメ
ラーゼを含む組換えベクターを発現させることができ
る。
【００３２】又、Ｔ．リトラリスの熱安定性ポリメラー
ゼ発現が、クローニング及び発現の最中に、大腸菌内で
強固に調節されることも好ましい。本発明を実施するの
に有用なベクター類は、以下に示す調節要所の幾つかも
しくは全てを提供することにより、様々な度合いに調節
されたＴ．リトラリスポリメラーゼ発現を提供するはず
である：（１）ポリメラーゼの出発点に直接近接してい
るか、あるいは、融合蛋白質類としてのいずれかの、プ
ロモーター類もしくは転写開始部位、（２）遺伝子発現
のスイッチを入れたり切ったりするのに使用することが
できるオペレーター類、（３）翻訳の改善のためのリボ
ゾーム結合部位、及び、（４）安定性の改善のための転
写もしくは翻訳停止部位。Ｔ．リトラリスポリメラーゼ
のクローニング及び発現に使用される適切なベクターに
は、例えば、ファージ及びプラスミド類がある。ファー
ジの例には、λgtll（プロメガ社）、λ Dash （ストラ
ッタジーン社）、λ ZapII（ストラッタジーン社）があ
る。プラスミド類の例には、pBR322、pBluescript （ス
トラッタジーン社）、pSP73 （プロメガ社）、pGW7（Ａ
ＴＣＣ No. 40166 ）、pET3A （Rosenberg 、et al. G
ene 、（1987） 56:125−135 ）、及び、pETllC（Metho
ds in Enzymology （1990） 185: 60−89）がある。
【００３３】形質転換及び感染 形質転換、ファージの感染、及び、細胞培養について
は、標準的な観察記録が存在する。Maniatis、et al.、
Molecular Cloning: A Laboratory Manual（1982）。プ
ラスミドの形質転換について使用することができる多数
の大腸菌株には、JM101 （ＡＴＣＣ No. 31343 ）、 X
L1（ストラッタジーン社）、 RRI（ＡＴＣＣ No. 3134
3 ）、及び、BL21（DE3 ） plysS（Methods in Enzymol
ogy （1990）、上述）がある。この株の中でラムダーフ
ァージについて使用することができるのは、大腸菌株XL
1 、ER1578、及び、ER1458（Raleigh 、et al.、N.A. R
esearch （1988） 16: 1563 −1575）であり、更に、Y1
089 を、ラムダーgtllの溶原性について使用することが
できる。Y1089 において一時的な溶原物質を調製する場
合（Arasu 、et al.、Experimental Parasitology （19
87） 64: 281−289 ）、１種類の大量のファージによ
り、もしくは、溶菌性宿主と共に培養することのいずれ
かにより、培養物をラムダーgtllの組換えファージで感
染させる。この感染したY1089 細胞は、誘導物ＩＰＴＧ
の存在下において、３７℃で増殖させるのが好ましく、
その結果、溶菌欠損性の宿主／ファージ系内に、組換え
蛋白質を作製する。
【００３４】ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作製及び
熱安定性ポリメラーゼのスクリーニング 特別な遺伝子のスクリーニングの最も一般的な方法は、
（１）他の生物からの相同性を有する遺伝子に対してハ
イブリッド形成させることによるもの、（２）宿主の欠
損の相補性による活性の選択、（３）特異的抗体類との
反応性、あるいは、（４）酵素活性についてのスクリー
ニング、である。Ｔ．リトラリスについては抗体の検出
が好ましく、それは、その方法は本来、完全に活性な酵
素ではなく酵素の一部分の発現のみを必要とするためで
ある。大腸菌内でのＴ．リトラリスポリメラーゼ遺伝子
の不安定性が、他の方法による成功することをより困難
なものにしてしまっている。
【００３５】Ｔ．リトラリスのＤＮＡを、ランダムな断
片としてか、あるいは、制限酵素断片としてのいずれか
で、ゲノムライブラリーを作製するのに用いることがで
きる。後者の方法が好ましい。Eco RI部分を、Ｔ．リト
ラリスのゲノムＤＮＡから、Maniatis et al. 、Molecu
lar Cloning: A Laboratory Manual（1982）に記載して
あるような標準的なＤＮＡ制限技術、この開示は本明細
書内に引用文献として取り込んである、を使用して調製
することが好ましい。BamHI 、NruI、及び、Xbalのよう
な他の制限酵素を使用することもできる。
【００３６】複数の方法を、抗体を使用してプラスミド
類及びファージの両方をスクリーニングするのに利用す
ることができるものの（Young and Davis 、PNAS、（19
83）80: 1194 −1198）、本発明に従い、ファージ系が
より良く作用する傾向にあり、かつ、そのため、最初の
ライブラリに好ましいということを発見した。Ｔ．リト
ラリスの調節領域が大腸菌内において機能しているかど
うかが不確実であるため、ラムダーgtll及びラムダーZa
pII ｃのような全ての必要な発現調節領域を供給するフ
ァージベクターが好ましい。Ｔ．リトラリスＤＮＡの、
ラムダーgtllのEco RI部以内へのクローニングにより、
Ｔ．リトラリスポリメラーゼを、ベーター−ガラクトシ
ダーゼとの融合蛋白質として、あるいは、それ自身の内
因性プロモーター類から、のいずれかで、発現させるこ
とができる。
【００３７】一度形成すれば、この発現ライブラリー
を、マウスの坑−Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ抗
体で、Young and Davis 、PNAS（1983）、により記載さ
れているもののような、標準的な抗体／プラーク法を使
用してスクリーニングする。
【００３８】発現ライブラリーをスクリーニングするた
めに使用される、マウスの坑−Ｔ．リトラリスＤＮＡポ
リメラーゼ抗体は、Harlow and Cane 、Antibodies: A
Laboratory Manual （1988） CSH Press、において記載
されている技術、この開示は引用文献として本明細書内
に取り込んである、のような、標準的な技術を使用して
調製することができる。大半の血清が大腸菌の蛋白質と
反応するため、発現ライブラリーをスクリーニングする
場合、Ｔ．リトラリスポリメラーゼ抗血清を標準的な方
法により大腸菌の蛋白質に対して予め吸着させて、バッ
クグラウンドの反応性を低減させることが好ましい。坑
−Ｔ．リトラリスポリメラーゼ抗体と反応するファージ
を選択し、プラーク精製する。Young and Davis 、PNAS
（1983）、上述。
【００３９】その後、一部分もしくは完全な遺伝子をコ
ードする、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼＤＮＡ
を、例えば、pBR322、 pBluescript、 M13、もしくは、
pUC19においてサブクローン化することができる。希望
であらば、このＤＮＡ配列を、例えば、サンジャーのジ
デオキシ鎖−末端配列決定法（Sanger、F.、Nicklen 、
S. & Coulson、A.R. PNAS （1977） 74: 5463 −5467）
により決定することができる。
【００４０】Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼをコー
ドするＤＮＡの同定及びＴ．リトラリスＤＮＡポリメラ
ーゼの発現 Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ
配列が取得されたことを決定するためには数々の方法が
存在する。これらは、例えば、天然の蛋白質に対して組
換えＤＮＡにより産生された蛋白質の実際もしくは演繹
したアミノ−末端配列を比較すること、あるいは、その
組換えＤＮＡが、天然のＴ．リトラリスＤＮＡポリメラ
ーゼに特異的な抗体に結合する蛋白質を産生しているか
どうかを決定することを含む。更に、Wang、et al.、FA
SEB Journal （1989） 3: 20、は、ＤＮＡポリメラーゼ
配列の特定の領域が、多くの種間において高度に保存さ
れていることを示唆している。結果としては、クローン
化した遺伝子産物の予想されるアミノ酸配列を、ヒトの
ＤＮＡポリメラーゼ及び大腸菌ファージＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼのような既知のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸
配列と比較することによって、散在するこれらの相同性
配列を同定すれば、この組換えＤＮＡが実際にＤＮＡポ
リメラーゼをコードしていることの強い証拠が得られ
る。一度同定しさえすれば、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリ
メラーゼをコードするＤＮＡ配列を、例えば、pET3A 、
pBluescript 、あるいは、pUC19 のような大腸菌に由来
するプラスミド、pUB110、pTP5、及び、pC194 のような
バシルス・スブチリス（Bacillussubtilis ）に由来す
るプラスミド類、pSH19 、及び、pSH15 のようなイース
ツに由来するプラスミド類、ラムダーファージのような
バクテリオファージ、アグロバクテリウム・ツメファキ
エンス（Agrobacterium tumefaciens ）のような細菌、
レトロウイルスのような動物性ウイルス類、及び、バク
ロバイラスのような昆虫ウイルス類、のような適切な発
現ベクター内へクローン化することができる。
【００４１】先に記載したように、本発明に従い、Ｔ．
リトラリスＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡは、
以下に示す２つのイントロンを含むことが発見された：
ｉ）Fig.６において、ヌクレオチド１７７６から３３８
９へ広がる、１６１４bpのイントロンもしくは介在配
列、及び、ｉｉ）Fig.６において、ヌクレオチド３５３
４から４７０３に広がる、１１７０bpのもの。この１１
７０ｂｐのイントロンはエンドヌクレアーゼをコードし
ており、かつ、大腸菌内で自己スプライシングすること
が発見されている。大腸菌のような宿主細胞内における
過剰発現に先立ち、１６１４及び１１７０ｂｐのイント
ロンの両方をコードするＤＮＡ配列を除去することが好
ましい。たとえ、この１１７０ｂｐのイントロンが大腸
菌内でスプライシングされるとしても、このイントロン
を含まない発現ベクターは、結果として、希望するポリ
メラーゼの産生を増大することが発見されている。
【００４２】一般的に、一度イントロンを同定し、更
に、ヌクレオチド配列における位置決定を行ったら、Ｄ
ＮＡ配列を除去するため、つまり、イントロンをインビ
トロにおいてスプライシングさせるために使用すること
ができる、当業者にしられている数々の方法が存在す
る。ある方法は、スプライシングの接合点もしくは除去
されるべき領域付近に存在するコーディング領域におけ
る非反復の制限酵素部位を同定することを必要とする。
二重らせんオリゴマーを合成して、２つの制限断片の間
の間隙を橋渡しさせる。アミノ末端制限断片、橋渡しし
ているオリゴ及びカルボキシ末端制限断片からなる三点
結合連鎖反応により、イントロンを除去した完全な遺伝
子が生産される。
【００４３】他の方法は先に記載した方法の改良法であ
る。過半数のイントロンを、イントロン内に含まれる非
反復部位と共に、コーディング配列の境界に近くで制限
酵素で切断することにより除去する。過半数のイントロ
ンが除去された直線のプラスミドを互いに結合させる。
１本鎖のファージを、pBluescript ベクターの組換え体
から、f1ヘルパーファージIRI との重感染により作製す
る。希望する最終配列を有する１本鎖のオリゴマーを合
成し、更に、部分的にイントロンを除去したファージＤ
ＮＡに対してアニールする。残りのイントロンをこのよ
うにループ状にして追い出す。大腸菌株ＣＪ２３６内で
もともとのファージを産生させることにより、突然変異
誘発のKunkel法、Methods in Enzymology 154:367 （19
87）を使用して、完全にイントロンが除去された作製物
類を選択することができる。
【００４４】イントロンを除去するのに用いることがで
きる更に他の方法は、ＤＮＡ増幅を使用する。例えば、
Maniatis、et al.、Molecular Cloning:A Lboratory Ma
nual、（1989） Vol. 2 、2nd edition 、この開示は引
用文献として本明細所内に取り込んである、を参照せ
よ。簡潔に言うと、プライマーを作製して、遺伝子のア
ミノ及びカルボキシル半部分を増幅させ、その後、つな
ぎ合わせる。
【００４５】先に論議した方法を使用してイントロンを
インビトロにおいて除去する場合、天然のスプライス結
合点は未知であってよい。従って、当業者は、活性酵素
の産生を結果として生じる数々の人工的スプライス結合
点が存在し得ることが予測できる。
【００４６】一度イントロンを除去すれば、Ｔ．リトラ
リスの過剰発現を、例えば、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリ
メラーゼをその内因性調節成分類から分離し、更にその
後、Ｔ７発現ベクターのような非常に強固に調節される
プロモーターに対してこのポリメラーゼ遺伝子を遺伝子
操作を利用してつなぎ合わせることにより実行すること
ができる。本明細書内に引用文献として取り込んであ
る、Rosenberg 、et al.、Gene（1987） 56:125 −135
、を参照せよ。強力なプロモーターの挿入は、Ｔ．リ
トラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の両端付近の都合の
良い制限標的、及び、プロモーター付近のベクターにお
ける和合性の制限標的を同定するか、あるいは、部位特
異的突然変異誘発（Kunkel（1984）、上述）を使用して
制限標的を作製し、更に、強力なプロモーターの転写及
び翻訳調節下におけるもののような向きで、ベクター内
にこのＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を転移
させることにより行うことができる。
【００４７】Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼをやは
り、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の上流に
位置する強力な結合部位を利用することにより過剰発現
させて、その遺伝子の発現を増大させることもできる。
本明細書中に引用文献として取り込んである、Shine an
d Dalgarno、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1974） 71:
1342 −1346を参照せよ。
【００４８】この組換えベクターを、形質転換及びファ
ージ感染のための標準的な技術を使用して、適切な宿主
内へ導入する。例えば、Cohen 、S.N.、PNAS（1972） 6
9: 2110 、この開示は引用文献として取り込んである、
により記載されているように、塩化カルシウム法が大腸
菌のために使用されている。バシルスの形質転換は、Ch
ang 、S.、et al.、Molecular and General Gnetics
（1979） 168: 111 、この開示は引用文献として取り込
んである、に従って行う。イーストの形質転換は、Pare
nt、et al.、 Yeast（1985） 1: 83−138 、この開示は
引用文献として取り込んである、に従って行う。特定の
植物性細胞類は、Shaw、C.H.、et al 、Gene（1983） 2
3: 315、この開示は引用文献として取り込んである、に
記載されている方法に従って、アグロバクテリウム・ツ
メファキエンス（Agrobacterium tumefaciens ）で形質
転換させることができる。動物性細胞類の形質転換は、
例えば、Virology（1973） 52: 456、この開示は引用文
献として取り込んである、に記載されている方法に従っ
て行う。昆虫細胞類の形質転換は、例えば、Biotechnol
ogy （1988） 6: 47、この開示は本明細書中に引用文献
として取り込んである、において記載されている方法に
従って行う。
【００４９】形質転換体を、使用する宿主細胞によっ
て、このような細胞に適する標準的な技術を使用して培
養する。例えば、大腸菌の培養については、細胞を、LB
培地（Maniatis、 上述）中で、３０℃から４２℃で、中
間log もしくは定常相にまで増殖させる。
【００５０】このＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ
を、形質転換した細胞類の培養物から、例えば、培養し
た細胞類もしくは培養溶液からのいずれかからの抽出に
より単離及び精製することができる。
【００５１】Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼを培養
した細胞から抽出する場合、この細胞を、培養後、例え
ば遠心のような当業者に知られている方法により回収す
る。その後、回収した細胞を適切なバッファー溶液に懸
濁し、超音波処理、リゾチーム、及び／又は、凍結融解
により破壊する。Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼを
含む未精製抽出物は、遠心、及び／又は、濾過により取
得する。
【００５２】Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼが培養
溶液中に、つまり、単独であるいはマルトース結合性蛋
白質のような分泌性蛋白質との融合蛋白質として分泌さ
れる場合には、上清を当業者に知られている方法により
細胞から分離する。
【００５３】培養上清もしくは細胞抽出物中に含まれる
Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼの分離及び精製は、
先に記載した方法、あるいは、既知の分離及び精製法の
適切な組み合わせにより行うことができる。これらの方
法には、例えば、塩析法及び溶媒沈殿法のような溶解度
を利用する方法、透析法、限界濾過法、ゲル濾過法、及
び、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法のよう
な分子量の違いを利用する方法、イオン交換カラムクロ
マトグラフィーのような電子荷電における違いを利用す
る方法、親和性クロマトグラフィーのような特異的親和
性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーの
ような疎水度における違いを利用する方法、及び、等電
点電気泳動法のような等電点における違いを利用する方
法がある。
【００５４】この組換え酵素の単離及び精製に好ましい
ある方法は、域下に示すような多段階過程を使用して行
う。
【００５５】最初に、細胞を、凍結してあれば解凍し
て、バッファーＡ（１００mMのＮａＣｌ、２５mMのトリ
ス ｐＨ７．５、０．１mMのＥＤＴＡ、１０％のグリセ
ロール、０．０５％のTritonＸ−１００）のような適切
なバッファー中に懸濁させ、溶菌及び遠心する。清澄化
した未精製抽出物を、その後約３０分間、７５℃に加熱
する。変成した蛋白質類を遠心により除去する。この上
清を、その後、アフィゲル ブルー カラム（バイオラ
ド社）のような、核酸に結合する蛋白質類について高い
親和性を有するカラムを通す。上清溶液中に存在する核
酸及び多くの蛋白質類がカラムを通過し、そのため、こ
れらを、ｐＨが約７．０である低塩バッファーをカラム
容積の数倍容量を用いてカラムを洗浄することにより除
去する。洗浄後、０．１M から１．５M のＮａＣｌバッ
ファーＡのような直線濃度勾配液で酵素を溶出する。活
性分画を一まとめにし、透析し、更に、フォスフォセル
ロースカラムに供する。このカラムを洗浄し、ＤＮＡポ
リメラーゼ活性を、バッファーＢ（１００M のＮａＣ
ｌ、１５mMのＫＰＯ4 、０．１mMのＥＤＴＡ、１０％の
グリセロール、０．０５％のTritonＸ−１００、ｐＨ
６．８）中に含まれる０．１から１．０M のＮａＣｌの
直線濃度勾配液で溶出する。複数の分画を回収し、更
に、各分画にＢＳＡを添加する。ＤＮＡポリメラーゼ活
性を有する分画を一まとめにする。取得されるＴ．リト
ラリスＤＮＡポリメラーゼを、先に論議した標準的な産
物精製技術を使用して更に精製することができる。
【００５６】Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼの安定化及び用途 長期保存のために、本発明の熱安定性酵素を以下に示す
バッファー中で保存する：−２０℃における、０．０５
M のＮａＣｌ、０．０１M のＫＰＯ4 （ｐＨ７．４）、
０．１mMのＥＤＴＡ、及び、５０％のグリセロール。
【００５７】本発明のＴ．リトラリスＤＮＡポリメラー
ゼを、このような酵素が必要であるかあるいは希望され
るような任意の目的に使用することができる。例えば、
ｃＤＮＡのクローニングにおける第２鎖のｃＤＮＡ合成
を含む組換えＤＮＡ技術、及び、ＤＮＡ配列決定であ
る。Maniatis、et al.、上述。
【００５８】本発明のＴ．リトラリスＤＮＡポリメラー
ゼを化学的もしくは遺伝子的に修飾して３′−５′エキ
ソヌクレアーゼ機能を不活性化させることができ、か
つ、例えば、ＤＮＡ配列決定のように、そのような、修
飾した酵素が希望される任意の目的に使用することがで
きる。
【００５９】例えば、遺伝子的に修飾したＴ．リトラリ
スＤＮＡポリメラーゼを、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子をランダムに突然変異誘発させ、その後、
ポリメラーゼ活性を消失せずにエキソヌクレアーゼ活性
を消失したこれらの突然変異体をスクリーニングするこ
とにより単離することができる。それに代わる方法とし
ては、遺伝子的に修飾したＴ．リトラリスＤＮＡポリメ
ラーゼを、Kunkel、T.A.、 PNAS （1985） 82: 488−49
2 、この開示は本明細書中に引用文献として取り込んで
ある、において記載されている部位特異的突然変異誘発
を使用することにより単離することが好ましい。
【００６０】更に、本発明のＴ．リトラリスＤＮＡポリ
メラーゼを、やはり、例えば、米国特許番号4,683,195
、 4,683,202、及び、4,800,159 において開示されて
いる方法により、ＤＮＡを増幅させるのに使用すること
もできる。
【００６１】ゲノムＤＮＡライブラリーの作製及びＴ．
リトラリス以外の古細菌からの熱安定性ポリメラーゼの
スクリーニング 本発明に従い、Ｔ．リトラリスのＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子から調製したＤＮＡプローブ、及び／又は、マウス
の坑−Ｔ．リトラリス坑血清との交差反応性を利用す
る、標的古細菌ゲノムＤＮＡライブラリーのクロスハイ
ブリッド形成は、メサノコッカス（Methanococcus ）、
メサノバクテル（Methanobacter ）、メサノミクロビウ
ム（Methanomicrobium）、ハロバクテル（Halobacte
r）、セルモプラズマ（Thermoplasma）、セルモコッカ
ス（Thermococcus）、ピロコッカス（Pyrococcus）、及
び、その類のものの（例えば、Woese 、C.、Mrobiologi
cal Reviews 、pp. 221 −270 、June 1987 、この開示
は本明細書中に引用文献として取り込んである、を参照
せよ）ような他の古細菌からのＤＮＡポリメラーゼ遺伝
子の同定及び単離を考慮に入れている。
【００６２】一般的に、他の古細菌からのＤＮＡは、先
に記載した方法を使用して単離することができる。Ｔ．
リトラリスと同様、一度単離したこの古細菌のＤＮＡ
も、ランダムな断片としてか、あるいは、制限酵素断片
としてのいずれかで、ゲノムライブラリーを作製するの
に使用することができる。後者の方法が好ましい。この
方法は、一般的に、多様な制限酵素類で標的ゲノムＤＮ
Ａを切断し、かつ、例えば、Ｔ．リトラリスＤＮＡプロ
ーブを用いて、そのように形成される断片を探索するこ
とを含む。その後、ライブラリーを、単一のハイブリッ
ド形成を産生し、かつ、標的のＤＮＡポリメラーゼの分
子量を少なくともコードするのに充分な、約４Ｋｂもし
くはそれを上回る大きさである、１種類もしくは複数の
酵素から形成する。
【００６３】複数の方法を、抗体類もしくはＤＮＡプロ
ーブ類を使用するプラスミド類及びファージの両方をス
クリーニングするのに使用することができるものの（Yo
ungand Davis 、PNAS（1983） 80: 1194 −1198; Mania
tis et al. 、上述）、本発明に従い、ファージ系が良
く作用する傾向にあり、かつ、そのため、最初のライブ
ラリーに好ましいことを発見した。
【００６４】コロニーもしくはプラークハイブリッド形
成法（Maniatis、et al.、上述）を使用して、あるい
は、抗体プラークＤＮＡ法を使用して、ゲノムライブラ
リーをスクリーニングすることができる。コロニーもし
くはプラークハイブリッド形成法においては、ＤＮＡプ
ローブを、例えば、Ｔ．リトラリスのような関連する生
物からのポリメラーゼ遺伝子をラベル化することにより
形成することができる。このゲノムライブラリーを、以
下に記載されているような各場合において実験的に決定
することができる希望する緊縮度による条件化におい
て、ラベル化されたプローブとハイブリッド形成させ
る。
【００６５】具体的には、各古細菌は、標的ＤＮＡの検
出度を最大限にする目的で、それ特有の一連のハイブリ
ッド形成条件を必要とするものの、数々の基本的方法に
従うことができる。至適ハイブリッド形成条件及びプロ
ーブは、例えば、多様な温度において試験的なサザンブ
ロッティングを行うことにより、各標的古細菌について
決定することができる。ハイブリッド形成は、典型的に
は、４×SET 、０．１M のリン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０、０．１％のＮａピロリン酸、０．１％のＳＤＳ、１
×デンハルズ溶液（Maniatis、上述）中で行う。プロー
ブの選択も、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
のサイズ及び領域に関連して変えることができる（Fig.
６）。至適プローブは、大きいもしくは小さいＤＮＡ断
片、あるいは、オリゴマー類さえ用いて、先に記載した
ように、試験的なサザンブロッティングを行うことによ
り、標的古細菌について決定することができる。例え
ば、Ｔ．リトラリスの介在配列の一つの中に完全に含ま
れるプローブを選択して、標的古細菌のＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子内における介在配列をスクリーニングするこ
とができるか、そうでなければ、このようなプローブ
は、成熟したポリメラーゼコーディング領域に限定され
ることがある。
【００６６】一般的には、このＤＮＡプローブは、Fig.
６の完全な配列であるか、あるいは、その一部分であ
る。このＤＮＡプローブは、少なくとも２０ヌクレオチ
ド分の長さであるべきであり、少なくとも約５０ヌクレ
オチド分の長さであることが好ましく、少なくとも約１
５０ヌクレオチド分の長さであることが最も好ましい。
使用することができる３種類のこのようなＤＮＡプロー
ブは、１．３kb断片（Fig.６のヌクレオチド１から１２
７４）、１．６kb断片（Fig.６のヌクレオチド１２６９
から２８５６）、及び、１．９kb断片（Fig.６のヌクレ
オチド２８５１から４７７１）である。
【００６７】Ｔ．リトラリス同様、標的古細菌のＤＮＡ
ポリメラーゼをコードするＤＮＡを、やはり、抗体／プ
ラーク法を使用して取得することもできる。抗体／プラ
ーク法を使用してゲノム発現ライブラリーをスクリーニ
ングする場合、この標的古細菌の調節領域が果たして大
腸菌内で機能するかどうかが未確定であるため、λgtll
及びλZapII のような、全ての必要な発現調節領域を供
給するファージベクター類が抗体スクリーニングには好
ましい。古細菌ＤＮＡをλgtllのEcoR I部位のような適
切な部位内へクローン化することにより、λgtll及びλ
ZapII 内におけるベーター−ガラクトシダーゼとの融合
蛋白質として、あるいは、それ自身の内因性プロモータ
ーからのいずれかで、古細菌のＤＮＡポリメラーゼを発
現させることができる。
【００６８】一度形成すれば、標的古細菌からの坑−古
細菌ＤＮＡポリメラーゼ抗血清で、あるいは、密接に関
連している生物のＤＮＡポリメラーゼに対する抗体によ
り（つまり、Ｔ．リトラリス、他の極度な好熱性生物）
Young and David 、PNAS（1983）、上述、により記載さ
れているもののような標準的な抗体／プラーク法を使用
してこの発現ライブラリーをスクリーニングすることが
できる。
【００６９】いずれかの方法を使用して、一部分のもし
くは完全な遺伝子をコードする古細菌ＤＮＡポリメラー
ゼのＤＮＡを一度同定すれば、その後、例えば、pBR32
2、pBluescript 、 M13、もしくは、pUC19 内でサブク
ローン化することができる。希望であれば、例えば、サ
ンジャーのジデオキシ鎖末端決定法（Sange 、F.、Nick
len 、S. & Coulson、A.R. PNAS （1977）74: 5463−54
67）により決定することができる。
【００７０】ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの同定 一度ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーを作製し、かつ、古
細菌のＤＮＡをコードする標的ＤＮＡをＤＮＡプローブ
もしくは抗体交差反応性の使用によりＴ．リトラリスか
ら同定すれば、Ｔ．リトラリスについてのＤＮＡポリメ
ラーゼ配列が、Ｔ．リトラリスについて先に記載したよ
うに取得されたことを確証することができる。結果とし
て生じるクローンを、サンジャーのジデオキシ配列決定
法のような標準的な方法により配列決定することができ
る。
【００７１】介在配列の同定、位置決定及び除去、及
び、ＤＮＡポリメラーゼの過剰発現 本発明の他の側面に従い、他の古細菌からのＤＮＡポリ
メラーゼをコードするＤＮＡもやはり、１つもしくは複
数の介在ヌクレオチド配列もしくはイントロンを含むこ
とを発見した。更に、そのようなイントロンは、Ｔ．リ
トラリス中に発見されたイントロンと、実質的な相同性
を共有するばかでなく、それらは同一の位置に存在する
ことを発見した。より具体的には、本発明に従って、イ
ントロンは、Ｔ．リトラリス及びピロコッカス（Pyroco
ccus）種の両方のＤＮＡポリメラーゼの遺伝子中におけ
るPol α保存領域モチーフ内に同定されている。理論に
縛られたくはないのであるが、他の古細菌もやはり、そ
れらのＤＮＡポリメラーゼについて、コーディング領域
内に１つもしくは複数の介在配列を所有すると考えられ
ている。これらのイントロンを、２つの方法において同
定することができる。そのイントロンが、Ｔ．リトラリ
ス及び／又はピロコッカス ｓｐ．のＤＮＡポリメラー
ゼ遺伝子内に位置するイントロンに関連する場合には、
Ｔ．リトラリスもしくはピロコッカス ｓｐ．のＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子のイントロン配列に由来するＤＮＡ
プローブに対する低緊縮度ハイブリッド形成によりそれ
らを同定することができる。２番目には、先に記載した
ように、一度、古細菌のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を同
定及び単離してあれば、そのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
をＤＮＡレベルで配列決定することができ、更に、その
配列を、（１）非類似性断片を同定するために、他のＤ
ＮＡポリメラーゼと、あるいは、（２）１つもしくは複
数の領域Ｉ−ＶＩが存在していないことを探索するため
に、保存されているモチーフと、比較し、次には、存在
していない領域における分断位置の同定を行う。
【００７２】一度同定すれば、例えば、先に記載した技
術、及び、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子内
における２つのイントロンを除去するための実施例にお
ける技術により、そのイントロンをインビトロにおいて
除去することができる。
【００７３】以下に示す実施例は、現在実行することが
好ましいという理由のため、本発明の実施態様を説明す
るために与える。この実施例は説明的なものであり、か
つ、本発明は、添付した特許請求の範囲に示すものを除
き、制限として考慮されるべきものではないことを理解
していただきたい。
【００７４】実施例１セルモコッカス・リトラリスからの熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼの精製 Ｔ．リトラリス株ＮＳ−Ｃ（ＤＭＳ No. 5473）を、１
００リットルの発酵機内において、１０g/ｌの基本的な
イオウを含む、Belkin、et al.、上述、により記載され
ている培地中で、約８０℃の最高耐久可能温度で２日間
増殖した。この細胞を室温に冷却し、デカンテーション
することにより未使用のイオウから分離し、更に、遠心
により回収し、更に、−７０℃に保存した。細胞の回収
率は、リットル当たり０．８ｇであった。
【００７５】先に記載したように取得した細胞の１８３
g を、０．１M のＮａＣｌを含む５５０mlのバッファー
Ａ（１０mMのＫＰＯ4 バッファー、ｐＨ７．４；１．０
mMのＥＤＴＡ、１．０mMのベーター−メルカプトエタノ
ール）中に懸濁し、更に、４℃において５分間超音波処
理した。この溶菌液を、４℃において３０分間、１５，
０００g で遠心した。この上清溶液を、４７０mlのアフ
ィゲル ブルー カラム（バイオラド社）を通した。そ
の後、カラムを、０．１M のＮａＣｌを含む１０００ml
のバッファーＡで洗浄した。このカラムを、バッファー
Ａ中に含まれる０．１から２．０M のＮａＣｌの２００
０mlの直線濃度勾配液で溶出した。ＤＮＡポリメラーゼ
は、約１．3MのＮａＣｌにおいて単一のピークとして溶
出され、カラムに供した活性の８０％を示した。ＤＮＡ
ポリメラーゼのピーク活性を、４リットルのバッファー
Ａに対して透析し、その後、０．１M のＮａＣｌを含む
バッファーＡで平衡化した８０mlのフォスフォセルロー
スに供した。このカラムを０．１M のＮａＣｌを含むバ
ッファーＡで洗浄し、バッファーＡ中の０．１から１．
０M のＮａＣｌの１０００mlの直線濃度勾配で溶出し
た。活性は、０．６MのＮａＣｌにおける単一のピーク
として溶出され、カラムに供した活性の７４％を示し
た。一まとめにした活性（１５０ml）を、９００mlのバ
ッファーＡに対して透析し、更に、４２mlのＤＮＡ−セ
ルロースカラムに供した。このカラムを、０．１M のＮ
ａＣｌを含むバッファーＡの８４mlで洗浄し、酵素活性
は、０．１から１．０M のＮａＣｌのバッファーＡの直
線濃度勾配液で溶出した。ＤＮＡポリメラーゼ活性は、
０．３M のＮａＣｌにおける単一のピークとして溶出さ
れ、カラムに供した活性の８０％を示した。この活性を
一まとめにした（９３ml）。一まとめにした分画を、
０．０５M のＮａＣｌを含む２リットルのバッファーＡ
に対して透析し、その後、１．０mlのＨＰＬＣ モノ−
Ｑカラム（ファルマシア社）に供した。ＤＮＡポリメラ
ーゼ活性は、バッファーＡ中の０．０５M から１．０M
のＮａＣｌの１００mlの直線濃度勾配液で溶出した。Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性は、０．１M のＮａＣｌにおける
単一のピークとして溶出され、カラムに供した活性の１
６％を示した。一まとめにした分画（３．０ml）を、バ
ッファーＡで６mlに希釈し、更に、１．０mlのＨＰＬＣ
モノ−Ｓカラム（ファルマシア社）に供し、０．０５
から１．０M のＮａＣｌのバッファーＡでの１００mlの
直線濃度勾配液で溶出した。活性は、０．１９M のＮａ
Ｃｌにおける単一のピークとして溶出され、カラムに供
した活性の７５％を示した。
【００７６】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び、その後の、クーマシーブル
ー（Neuhoff 、et al.、Eectrophoresis（1988） 9: 25
5 −262 ）より、より感度の高いコロイド染色（ＩＳＳ
プロブルー）を使用する蛋白質の染色により、ＤＮＡ
ポリメラーゼ調製物が約５０％の純度であることを決定
し：それによると、２本の主要なバンドが存在し、その
一つは９０，０００から９５，０００ダルトンであり、
二重線が、１８，０００ダルトンに存在した。Fig.１
Ａ。非常に小さいバンドが、約８０，０００から８５，
０００ダルトンに明白に見られた。このレベルでの精製
において、ポリメラーゼは、ポリメラーゼ蛋白質のmg当
たり、３０，０００単位と５０，０００単位のポリメラ
ーゼ活性の間の特異的活性を有した。別に行ったＳＤＳ
‐ポリアクリルアミドゲルにおいて、精製したＴ．リト
ラリスポリメラーゼを含むゲルラインを１８本の薄片に
切り出すことにより、９０，０００から９５，０００ダ
ルトンにおける染色したバンドの同定の検証が得られ
た。カラムにのせた蛋白質を、０．１％のＳＤＳ及び１
００μg/mlのＢＳＡを含むバッファー中でそのゲル薄片
を擂り潰すことにより、ゲルから溶出させた。この溶出
した蛋白質を、グアニジンＨＣｌに対して露出させるこ
とにより変成させ、その後、Hager and Burgess 、Anal
ytical Biochemistry （1980） 109:76 −86により記載
されているように、変成剤の希釈により復元させた。ポ
リメラーゼ活性は、放射能でラベルした32Ｐ−ｄＣＴＰ
の、酸可溶性ＤＮＡ内への取り込みにより測定し（先に
記載したように）、更に、エキソヌクレアーゼ活性につ
いてアッセイした（実施例５において記載するように、
3Ｈ−ラベルしたＤＮＡの、酸可溶性型への放出により
測定される）。Fig.１Ｂにおいて示すように、９０，０
００から９５，０００ダルトンのバンドのみが、有意な
ポリメラーゼ活性もしくはエキソヌクレアーゼ活性のい
ずれかを示した。
【００７７】このＤＮＡポリメラーゼ調製物を、０．０
５M のＮａＣｌを含むバッファーＡに対して透析した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定したように、１８，０００
ダルトンの蛋白質の大部分が溶液外に沈殿化した。Ｔ．
リトラリスＤＮＡポリメラーゼの回収率は、定量的蛋白
質分析により０．５mgであると決定され、かつ、これ
は、出発未精製抽出物中に存在する総活性の６．５％を
示した。
【００７８】精製したＴ．リトラリスポリメラーゼを電
気泳動し、更に、クーマシーブルー、もしくは、蛋白質
を検出するための予め記載してあるコロイド染色（ＩＳ
Ｓプロブルー）のいずれかで染色した。一つの濃く染色
される蛋白質バンドが、約９０，０００から９５，００
０ダルトンに見られ；以下に示すマーカー蛋白質の移動
に対する同一ゲル上での比較により、この分子量決定を
行った：ミオシン、２００，０００ダルトン；フォスフ
ォリラーゼＢ、９７，４００ダルトン；ＢＳＡ、６８，
０００ダルトン；オバルブミン、４３，０００ダルト
ン；カルボニックアンヒドラーゼ、２９，０００ダルト
ン；ｂ−ラクトグロブリン、１８，４００ダルトン；リ
ゾチーム、１４，３００ダルトン。
【００７９】実施例２Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニン
グ Ａ．マウスの坑−Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ抗
血清の産生マウスの免疫化 ０．４mgのポリメラーゼ蛋白質を含む３mlの溶液（実施
例１の方法により取得された）を、４℃において約０．
３mlに濃縮し、更に、２匹のマウスを接種するのに使用
した。精製したＴ．リトラリスポリメラーゼ調製物は、
クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ上におい
て、約８５−９５、７５−８５、及び、１０−２５kDal
の二重線の４本のバンドからなっていた。実施例１にお
いて示したように、Ｔ．リトラリスポリメラーゼは、約
９０−９５kDalである。両方のＴ．リトラリスポリメラ
ーゼ坑血清は、この免疫原中に存在する４種類全ての蛋
白質を認識する。
【００８０】免疫化のスケジュールは以下に記載すると
うりであった：マウス１をフロインドの完全補助剤（Ｆ
ＣＡ）内に含まれる、先のように調製した、２０μg の
Ｔ．リトラリスポリメラーゼで、腹腔内（ＩＰ）で免疫
化した。７日後、両方のマウスを、ＦＣＡ内に含まれる
５０μg のＴ．リトラリスポリメラーゼでＩＰ（腹腔内
注射）により免疫化した。２７日後、両方のマウスを、
フロインドの不完全補助剤内に含まれる３０μg のＴ．
リトラリスポリメラーゼで（マウス１）、５０μg の
Ｔ．リトラリスポリメラーゼで（マウス２）、ＩＰによ
り免疫化した。マウス１は２週間後に脱血し、マウス２
は２０日後に脱血した。血清は、標準的な方法により血
液から調製した（Harlow and Lane 、Antibodies: A La
boratory Manual 、1988）。
【００８１】坑−Ｔ．リトラリスポリメラーゼ坑血清
を、１％のＢＳＡ、０．１％のＮａアジド、０．１％の
ＰＭＳＦを含むＴＢＳＴＴ（２０mMのトリス、ｐＨ７．
５、１５０mMのＮａＣｌ、０．２％のＴｗｅｅｎ２０、
及び、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）内で希釈
した。
【００８２】大腸菌溶菌液に対する坑−Ｔ．リトラリス
ポリメラーゼ抗血清の前吸着 大半の血清が大腸菌の蛋白質と反応するため、以下に示
す方法を使用して、Ｔ．リトラリスポリメラーゼの抗血
清を大腸菌蛋白質に対して前吸着させて、ライブラリー
類もしくは組換え抗体類をスクリーニングする場合のバ
ックグラウンドの反応性を低減した。大腸菌の細胞ペー
ストを解凍し、超音波処理により溶菌化させ、可溶性蛋
白質を、製造元により記載されているとうりに、アフィ
ゲル１０（バイオラド社）に結合させた。４mlの大腸菌
樹脂をＴＢＳ（洗剤を含まないＴＢＳＴＴ）で２回洗浄
した。０．３５mlの血清を、ＴＢＳＴＴ、１％のＢＳ
Ａ、０．１％のＮａアジド中で約１から５倍に希釈し、
更に、樹脂と、４℃で一晩混合させた。この樹脂を遠心
によりペレット状にし、更に、洗浄した。回収された前
吸着血清は１から１７倍希釈物であり、使用するまで−
２０℃で凍結して保存した。
【００８３】スクリーニングのためには、前吸着させた
血清を、先のように、１：２００の最終濃度に希釈し
た。
【００８４】Ｂ．Ｔ．リトラリスポリメラーゼ遺伝子に
ついてのプローブの同定ラムダーgtll発現ライブラリー
の作製 Ｔ．リトラリスポリメラーゼ遺伝子のためのプローブ
は、ラムダーgtll発現ライブラリーの免疫学的なスクリ
ーニングに従って取得した。
【００８５】Ｔ．リトラリスＤＮＡを、以下に示すよう
に部分的に消化した：４μg のＴ．リトラリスＤＮＡ
を、Eco RIバッファー（Eco RIバッファー＝５０mMのＮ
ａＣｌ、１００mMのトリス、ｐＨ７．５、２０mMのＭｇ
Ｃｌ2 、１０mMのＢＭＥ）を用いる４０μl の反応液中
で、５単位のEco RIで、３７℃において消化した。３μ
l の１００mMＥＤＴＡを、３０、４５、及び、６０分
に、１５μl の試料に対して添加した。２μg のＴ．リ
トラリスＤＮＡを、Eco RIバッファーを用いる２０μl
の反応液中で、２０単位のEco RIを用いて、３７℃で９
０分間消化し、２μl の１００mMＥＤＴＡの添加により
反応を停止した。０．２μg の各消化物をアガロースゲ
ル上で電気泳動して消化の度合いを記録した。約３μg
のＴ．リトラリスＤＮＡのEco RI部分消化物（６０分消
化物からの１４μl 、及び、９０分消化物からの１９μ
l ）を一まとめにして、「Eco RIプール」を形成し、６
５℃で１５分間加熱した。
【００８６】０．５μl のEco RIプールを、標準的な連
結バッファー（連結バッファー＝６６mMのトリス、ＰＨ
７．５、１mMのＡＴＰ、１mMのスペルミジン、１０mMの
ＭｇＣｌ2 、１５mMのＤＴＴ、及び、２mg/ml のゼラチ
ン）及び０．５μl のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイン
グランド バイオラボ社、No. 202 ）を用いる５μl の
反応液中においてEco RIで切断し、細菌のアルカリフォ
スファーターゼで処理した０．２８g のラムダーgtllの
ＤＮＡに連結させた。この連結反応は、１６℃で一晩行
った。４μl のこの連結反応物は、製造元の解説書に従
い、ギガパック ゴールド（ストラッタジーン社）を使
用して封入した。室温における２時間のインキュベーシ
ョンの後、封入したファアージを３滴のクロロフォルム
を追加した５００μl のＳＭ（ＳＭ＝１００mMのＮａＣ
ｌ、８mMのＭｇＳＯ４、５０mMのトリス、ｐＨ７．５、
０．０１％のゼラチン）中で希釈した。封入したEco RI
ライブラリーを試料Ｖ６−１と呼び、これは、１．１×
１０5 の特有なファージからなるものであった。大腸菌
株ＥＲ１５７８をファージ感染のために使用した。
【００８７】ラムダーgtll発現ライブラリーの免疫学的
なスクリーニング 最初のファージライブラリーは、先に産生された抗血清
の１：２００の希釈物を用いてスクリーニングした（Yo
ung 、R.A. and R.W. Davis 、Science 、（1983） 22
2: 778 −782 ）。坑−Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラ
ーゼ抗血清と反応する３６種類のファージ（Ｖ１０−２
２からＶ１０−５５）を封入し、更に、１６種類のファ
ージを精製した。
【００８８】この１６種類の抗体陽性なファージを使用
して、大腸菌Ｋ−１２株Ｙ１０８９を溶原菌化させた。
溶原菌を熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ活性についてス
クリーニングしたが、活性は検出されなかった。
【００８９】これらの１６種類の溶原菌からのウエスタ
ンブロット（Towbin、et al.、PNAS、（1979） 76:4350
−4354）を、坑−Ｔ．リトラリスポリメラーゼ抗血清で
試験してみた。Ｔ．リトラリスポリメラーゼ抗血清と反
応するこれらの溶原菌からの全ての蛋白質は、Ｔ．リト
ラリスポリメラーゼより小さく、かつ、やはりベーター
−ガラクトシダーゼより小さく、いずれもベーター−ガ
ラクトシダーゼとの融合蛋白質ではないことが示され
た。
【００９０】１６種類の抗体陽性ファージのうちの８種
類のものを使用して、全坑血清からエピトープ特異的抗
体を親和性を利用して精製した（Beall and Mitchell、
J. Immunological Methods、（1986） 86: 217−223
）。
【００９１】親和性を利用して精製した８種類の抗体陽
性ファージを使用して、精製したＴ．リトラリスポリメ
ラーゼとＴ．リトラリスの未精製溶菌液の両方のウエス
タンブロットを試験してみた。ＮＥＢ６１８プラークか
ら精製した抗体が、精製したＴ．リトラリスポリメラー
ゼ及びＴ．リトラリスの未精製溶菌液と特異的に反応し
た。これは、ファージＮＥＢ６１８が、Ｔ．リトラリス
ポリメラーゼの約３８kDa のアミノ末端をコードしてい
ることの強い証拠であった。
【００９２】ファージＮＥＢ６１８の性質決定及びEco
RI挿入断片のサブクローニング ウエスタンブロット分析は、ファージＮＥＢ６１８が、
Ｔ．リトラリスポリメラーゼ抗血清に結合する約１５−
４０kDa のサイズの範囲にわたる数種のペプチドを合成
することを示した。ファージＮＥＢ６１８からのＤＮＡ
を、標準的な方法により液体培養物から精製した（Mani
atis、et al.、上述）。ＮＥＢ６１８ＤＮＡのEco RIで
の消化により、１．３及び１．７kbの断片が生じた。Ｎ
ＥＢ６１８ＤＮＡのEco RI消化物を、Eco RIで切断した
pBluescript のＤＮＡに連結させた。２０μl のpBlues
criptSK ＋を、４０μl のEco RIバッファー中で、４０
単位のEco RIを用いて、３７℃で３時間、その後、６５
℃で１５分間消化した。１０μg のＮＥＢ６１８ＤＮＡ
を、４０μl のEco RIバッファー中で、４０単位のEco
RIを用いて、３７℃で７５分間、その後、６５℃で１５
分間消化した。EcoRIで切断した１．７５μg のＮＥＢ
６１８ＤＮＡを、１０μl の連結バッファー中で、１μ
l のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランド バイオ
ラボズ社、No. 202 ）を用いて、Eco RIで切断した２０
ngのpBluescriptSK ＋に連結させた。この連結反応を、
１６℃において一晩行った。JM101 ＣａＣｌ感応細胞
（Maniatis、et al.上述）を５μl の結合連鎖反応混合
物で形質転換させた。調査した２４種類の組み換え体の
うち、一つを除く全てのものが１．７kbの断片を含んで
おり；クローンＶ２７−５．４が１．３ｋｂのＴ．リト
ラリスのＤＮＡ断片を含んでいた。
【００９３】Ｔ．リトラリスポリメラーゼのマウス抗血
清からの抗体を、先に記載したように、Ｖ２７−５．４
（１．３ｋｂのEco RI断片をコードする）及びＶ２７−
５．７（pBluescript 中において１．７kbのEco RI断片
をコードする）からの溶菌液について親和性を利用して
精製し、更に、精製したあるいは未精製のＴ．リトラリ
スポリメラーゼのいずれかを含むウエスタンブロット細
片と反応させた。Ｖ２７−５．４の溶菌液について選択
した抗体は、未精製及び精製した調製物の両方における
Ｔ．リトラリスポリメラーゼと反応した。更に、天然の
Ｔ．リトラリスポリメラーゼのＮ−末端蛋白質配列から
の最初の３つのアミノ酸（メチオニン−イソロイシン−
ロイシン）は、Ｖ２７−５．４クローンにおける、予想
される読み取り枠（ＯＲＦ）におけるものと同様であ
る。
【００９４】これらの結果から、Ｖ２７−５．４は、
Ｔ．リトラリスポリメラーゼのアミノ末端をコードする
ことが結論付けられた。
【００９５】Ｖ２７−５．４の１．３kbのEco RI断片
は、Fig.６のヌクレオチド１から１２７４を含む。挿入
ＤＮＡは、完全なＴ．リトラリスポリメラーゼではない
が、このクローンにより合成される最も大きいペプチド
をコードするほど充分大きいものであった。
【００９６】Ｃ．Ｔ．リトラリスの２番目のライブラリ
ーの作製及びスクリーニング 先に記載した抗体スクリーニングにより、Ｔ．リトラリ
スポリメラーゼのアミノ末端半部分をコードしているＤ
ＮＡ断片を同定した。全体の遺伝子をコードするほど充
分長い断片を発見する目的で、Ｔ．リトラリスＤＮＡの
制限消化を、クローンＶ２７−５．４内に含まれるポリ
メラーゼ遺伝子のアミノ末端半部分を用いて探索した。
制限消化は、別々の試験管内で、３９μl の制限酵素バ
ッファー（ＲＥＢ、制限酵素バッファー＝５０mMのＮａ
Ｃｌ、１０mMのトリス、ＰＨ７．５、２０mMのＭｇＣｌ
２、１０mMのＢＭＥ）中に含まれる１．２μｇのＴ．リ
トラリスＤＮＡを含むマスター混合物を使用して、その
試験管に以下に記載する１．５−２００Ｕの酵素を添加
して行った：１．５Ｕ AvrII 、９Ｕ EaeI、１０Ｕ
NheI、２０Ｕ NotI、９Ｕ SpeI、２０Ｕ XhoI、３０
Ｕ XbaI、２０ＵSacI、１０Ｕ BamHI 、２０Ｕ Cla
I、２０Ｕ HindIII 、２０Ｕ PstI、１２Ｕ NaeI、
１０Ｕ ScaI、１２Ｕ XmnI、２０Ｕ EcoRV 、２０Ｕ
Sal 、２０Ｕ EcoRI 、２００Ｕ EagI、２０Ｕ Dr
aI、５Ｕ HapI、８Ｕ NruI、４ＵSnaBI 、８Ｕ Stu
I、１０Ｕ BclI、８Ｕ BglII 、１０Ｕ RsaI、１０
Ｕ HaeIII、８Ｕ AluI、４Ｕ HincII、１０Ｕ PvuI
I 、６Ｕ SspI。
【００９７】１μl の１０mg/ml ＢＳＡをHincII消化物
に添加した。バッファー中に０mMのＮａＣｌが存在する
ことを除いては先のとうりにBalI消化物を調製した。５
０℃においてインキュベートしたBclIを除いては、全て
の消化物を３７℃で一晩インキュベートした。消化物を
アガロースゲル上で電気泳動し、更に、ＮＣに転移させ
た（Southern、J. Mol. Biol. （1975） 98: 503−517
）。このフィルターを放射能ラベルしたＶ２７−５．
４のＤＮＡで探索し、更に、ハイブリッド形成をオート
ラジオグラフィーにより検出した。BamHI （約１４k
b）、EcoRI （約１．３kb）、HindIII （約２．４、
５．４kb）、XbaI（約８kb）、ClaI（約４．４、５．５
kb）、BalI（約８．５kb）、HincII（約２．１、約２．
４kb）、NurI（約５．５kb）、BglII （約２．９kb）、
HaeIII（約１．３、約１．４kb）、及び、多数の小さい
バンドを生じるRsaIを除く大半の消化物においては、Ｖ
２７−５．４のＤＮＡは、２０kbより大きい断片に対し
てハイブリッド形成した。
【００９８】完全なポリメラーゼ遺伝子を充分コードで
きるほど大きい単一の断片を産生し、天然の蛋白質のサ
イズに基づき、２．４−３kbであると推定される消化物
はBamHI 、XbalI 、及び、NruIであった。
【００９９】BamHI ライブラリー ラムダーDashIIを使用してBamHI のゲノムライブラリー
を作製した。ラムダーDashIIは、１０−２０kbのBamHI
ＤＮＡ断片をクローン化するのに使用することができる
BamHI 置換ベクターである。先に記載したように、BamH
I で消化した２５−７５ナノグラムのＴ．リトラリスゲ
ノムＤＮＡを、BamHI で消化し、ウシの腸のフォスファ
ターゼで処理した０．５μg のラムダーDashIIのＤＮＡ
に対して、０．５μl のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイ
ングランド バイオラボズ社、No. 202 ）を含む標準的
な連結バッファー中で結合させた。３μl の連結反応物
を先に記載したように封入した（ギガパック プラス、
ストラッタジーン社）。ラムダーDashIIライブラリーか
らの８，０００プラークのプラークリフトをラベル化し
たゲルで探索し、クローンＶ２７−５．４から１．３kb
の Eco RI 断片を精製した（Manitais、et al.、上
述）。２．５％のファージは、１．３kbのEco RIのＤＮ
Ａ断片に対してハイブリッド形成し、そのうちの２つを
プラーク精製した（クローン ラムダーＮＥＢ６１９及
びラムダーＶ５６−９）。両方のファージとも、１．３
kbの Eco RI 断片に対してハイブリッド形成する１２−
１５kbのBamHI 断片を含み、かつ、約８kbのXbaI及び約
５．５kbのNruI断片を含んでいた。このBamHI 挿入断片
をpBR322内にサブクローン化した。この断片を含むコロ
ニー類は増殖が非常に悪く、かつ、先に記載したポリメ
ラーゼアッセイに基づくと、検出可能レベルの熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼを産生していなかった。
【０１００】XbaIライブラリー XbaIで消化したＴ．リトラリスのＤＮＡを、pUC19 のXb
aI部位にクローン化した。コロニーリフトを放射能ラベ
ルしたＶ２７−５．４のＤＮＡで探索した。陽性のクロ
ーンは検出されなかった。
【０１０１】ラムダーＮＥＢ６１９内のBamHI 挿入断片
からのXbaI断片（先のBamHI ライブラリー）を、pUC １
９のXbaI部位内へサブクローン化した。BamHI で消化し
た約０．３μg のＮＥＢ６１９のＤＮＡを、２０μｌの
標準連結バッファー内において２μl のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（ニューイングランド バイオラボズ社 No.202）
を使用してBamHI で消化した０．１μg のpUC １９ＤＮ
Ａに結合した。この連結物を１６℃で一晩インキュベー
トした。ＣａＣｌ2 感応細胞であるＪＭ１０１及びＸＬ
−１細胞を５μl の連結物混合物で形質転換させ、更
に、３７℃で一晩インキュベートした（Maniatis、et a
l.、上述）。コロニーリフトを、Ｖ２７−５．４のＤＮ
Ａからの、精製して放射能ラベルした１．３kbのEcoRI
断片で探索した。陽性物は検出されなかった。感応細胞
ＲＲＩを、１０μl の結合連鎖反応混合物で形質転換さ
せ、更に、３０℃で一晩インキュベートした。微小コロ
ニーを選び、ミニプラスミドの調製物を分析した（沸騰
法、Maniatis、et al.、上述）。これらのクローンの大
部分は約８kbのXbaI断片を含んでいた。この後述の実験
の原理は、BamHI クローンの増殖が乏しいため、やはり
ゆっくりと増殖するXbaIコロニからＴ．リトラリスポリ
メラーゼ遺伝子を含むプラスミドを単離する機会が増大
するということである。叉、より低温度のインキュベー
ションの結果、細胞当たりのpUC19 プラスミドのコピー
がより少なくなる。これらの結果により、Ｔ．リトラリ
スポリメラーゼ遺伝子は大腸菌にとって有毒であること
の証拠が得られた。先に記載されたポリメラーゼ活性ア
ッセイを用いては、これらのクローン中には、熱安定性
ポリメラーゼ活性は検出されなかった。制限分析によ
り、XbaIクローンは、完全なポリメラーゼ遺伝子を含む
はずであることが示された。Fig.２を参照せよ。
【０１０２】NruIライブラリー NruIで切断した約０．３μg のＮＥＢ６１９のＤＮＡ
（先のＢａｍＨＩライブラリー）を、XbaIｃライブラリ
ーについて記載したのとまさに同じように、HincIIで切
断した０．１μg のpUC19 のＤＮＡに連結した。再び、
細胞を３７℃でインキュベートした場合、ハイブリッド
形成によっては陽性物は発見されなかったが、形質転換
体を３０℃でインキュベートした場合には多くのコロニ
ーが観察された。これらの微小コロニーの大多数は、約
５．５kbのNruI挿入断片を含んでいた。先に記載したポ
リメラーゼ活性アッセイを使用しては、これらのコロニ
ー中には、熱安定性ポリメラーゼ活性は検出されなかっ
た。これらのコロニーの分析により、Ｔ．リトラリスポ
リメラーゼの転写の方向が、pUC19 内のLacZと同じであ
る場合には、そのコロニーは３７℃においては増殖せ
ず、かつ、極度に不安定であることが決定された。
【０１０３】しかしながら、クローンNru21 のように、
Ｔ．リトラリスポリメラーゼの転写の方向がpUC19 内の
LacZの反対であるコロニーは、より安定である。このこ
とは、Ｔ．リトラリスポリメラーゼの転写は大腸菌にと
って有害であることを示しており、更に、完全な遺伝子
をクローン化することがなぜそんなに困難であるのかを
説明することができる。制限地図分析は、NruIクローン
は完全なポリメラーゼ遺伝子を含むはずであることを示
していた。Fig.２を参照せよ。
【０１０４】ポリメラーゼの直接クローニングに関する結論 Ｔ．リトラリスは約９０−９５kDalであり、完全な遺伝
子をコードするには約２．４−３．０kbのＤＮＡを必要
とする。Ｔ．リトラリスポリメラーゼ遺伝子のアミノ末
端をコードし、先に論議したBamHI 、XbaI、及び、NruI
クローン内に発見される１．３kbのEcoRI 断片の制限地
図分析により、３種類全てのクローンは完全なポリメラ
ーゼ遺伝子を含むことが示される。これら全てのより大
きいクローンは大腸菌内では不安定であった。従って、
そのポリメラーゼのクローン化について、以下に示すそ
の代わりの方法を試した。
【０１０５】Ｄ．Ｔ．リトラリスポリメラーゼ遺伝子の
もう一つの半部分のクローニング Ｔ．リトラリスの完全なポリメラーゼ遺伝子を大腸菌内
でクローン化する場合、それ自身の内因性調節下にある
にもかかわらず、遺伝子内の突然変異が生じると考えら
れている。不活性な突然変異体を選択することを回避す
るため、各々を引き離すとそれぞれ不活性であり、従っ
て、互いに対照しては選択されない２つもしくはそれを
上回る数のＴ．リトラリスゲノムからそのポリメラーゼ
遺伝子をクローン化した。そのＴ．リトラリスゲノムの
制限地図分析を利用して、どの制限酵素がＴ．リトラリ
スポリメラーゼ遺伝子のもう一つの半部分をクローニン
グするのに適切である断片を産生するかを決定した。先
のデーターは、Ｔ．リトラリスポリメラーゼの発現は大
腸菌にとって有毒であることを示しはするものの、コー
ディング領域内もしくはその外側のＤＮＡ配列それ自身
も、やはり同性を有する可能性がある。従って、完全な
遺伝子をコードすることができる最低のサイズの断片
を、最高の選択物として決定した。制限分析により、恐
らくポリペラーゼ遺伝子を全て満たすことができるアミ
ノ末端の１．３kbのEcoRI 断片（Fig.２を参照せよ）の
３′端に近接する約１．６kbのEcoRI 断片が存在するこ
とが示された。
【０１０６】Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
のもう一つの半部分についてのハイブリッド形成プロー
ブ 先のクローンのいずれも熱安定性ポリメラーゼ活性を発
現しなかったため、それらが、コーディング配列内に蓄
積した突然変異を有している可能性があり、そのため、
その遺伝子のもう一つの半部分の適切な源にはなりえな
い。従って、ゲノムから下流の断片をクローン化する目
的で、ハイブリッド形成プローブが必要であった。クロ
ーンNru21 （このNru21 クローンは、そのポリメラーゼ
遺伝子の出発点から約３００bp上流で開始する約５．５
kbの挿入断片を含む）からの約３．２kbのNdeI/ClaI 断
片をpSP73 内（プロメガ社）へサブクローン化してクロ
ーンＮＣｌｌを作成した。ＣａＣｌ2 感応性ＲＲＩ細胞
を、先に示すように、連結反応混合物で形質転換させ
た。形質転換体のミニプラスミド調製物をNdeI及びClaI
での消化により分析し、Ｔ．リトラリスの３．２kbのNd
eI/ClaI 断片を含むクローンＮＣｌｌを同定した。この
クローンは大腸菌内で安定であった。このＮＣｌｌ挿入
断片の配列決定を行った（Sanger、et al.、PNAS、（19
77） 74: 5463−5467）。ClaI端は、Ｖ２７−５．４の
配列（Ｔ．リトラリスポリメラーゼのアミノ端をコード
する１．３kbのEcoRI 断片）と同一であった。この１．
３kbのEcoRI 結合点及びそれより先の配列を１．３kbの
EcoRI 断片の配列に由来するプライマーを使用して決定
した。NdeI端は、ベクター内に含まれるプライマーから
配列決定した。
【０１０７】EcoRI ゲノムライブラリーのスクリーニン
グ １０μg のＮＣｌｌを、１００μl のEcoRI バッファー
内において３０ＵのEcoRI で、３７℃で２時間消化し
た。約１．６kbのEcoRI 断片を、電気泳動後、ＤＥ−８
１ペーパー（ホワットマン社）上で精製した。約１．６
kbのEcoRI 断片を放射能ラベルし、当初のEcoRI ラムダ
ーgtllライブラリーを探索するのに用いた。感染及びプ
ラークリフトは、先のように行った。３つの陽性物を同
定し、更に、プラーク精製した。全てのものは、約１．
６kbのEcoRI 断片を含んでいたが、幾つかのものは、他
の挿入断片をも含んでいた。
【０１０８】EcoRI ライブラリーも、ラムダーZapII 中
に作製した。２μg のＴ．リトラリスＤＮＡを、２０Ｕ
のEcoRI で、２０μl のEcoRI バッファー中において３
７℃で５時間消化し、その後、６５℃で１５分間熱処理
した。約１５ナノグラムのＴ．リトラリスＤＮＡ／EcoR
I を、EcoRI で切断してフォスファターゼ処理した０．
５μg のラムダーZapII ＤＮＡ（ストラッタジーン）に
対して、０．５μl のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ニューイ
ングランド バイオラボズ社、No. 202 ）を用いて５μ
l の結合連鎖反応バッファー中で１６℃で一晩連結させ
た。４μl の連結させたＤＮＡを封入した（ギガパック
ゴールド、ストラッタジーン社）。感染及びプラーク
リフトは先のように行った。約１，５００のファージ
を、放射能ラベルした約１．６kbのEcoRI 断片で先のよ
うに探索した。５つのハイブリド形成陽性プラークを選
択し、更に、３つのプラークを精製した。２つのファー
ジ（ＮＥＢ６２０及びＶ１０９−２）を、製造元の説明
書（ストラッタジーン社）に従うインビボでの切除によ
り、pBluescript 組換え体として（Ｖ１１７−１及び１
１７−２）生かしておいた。両者とも約１．６kbのEcoR
I 断片及び異なる第２断片を含んでいた。５′端を配列
決定したところ、ＮＣｌｌから決定された配列（ClaI/N
deI 断片）に一致した。Fig.２を参照せよ。このEcoRI
断片は、Wang、et al.、上述、により記載されているよ
うな、Ｔ４のＤＮＡポリメラーゼ類の相同性群の３／６
を含む。１．６kbのEcoRI 断片は、Fig.６のヌクレオチ
ド１２６９から２８５６を含む。
【０１０９】１．６kbのEcoRI 及びClaI/NdeI 断片の配
列は、１．９kbのEcoRI 断片はポリメラーゼ遺伝子を完
全に含むのに必要であることができることを示した。Ｎ
ＥＢ６２０について先に記載したように、ラベル化した
プローブを用いて、１．９kbのEcoRI 断片を含むラムダ
ーZapII ファージ、Ｖ１１０−１からＶ１１０−７を同
定した。２つのファージ（Ｖ１１０−２及びＶ１１０−
４）は、製造元（ストラッタジーン）の説明書に従うイ
ンビボでの切除により、pBluescript 組換え体として
（Ｖ１５３−２及び１５３−４）生かしておいた。両者
とも約１．９kbのEcoRI 断片及び異なる第２断片を含ん
でいた。この１．９kbのEcoRI 断片は、ＮＣｌｌ中の重
複領域との配列相同性を有した。この１．９kbのEcoRI
断片は、Fig.６のヌクレオチド２８５１から４７７１を
含む。
【０１１０】Ｔ．リトラリスの完全なポリメラーゼ遺伝
子を、不安定でありかつ活性酵素が検出されなかったBa
mHI 、XbaI、及び、NruI断片としてクローン化した。こ
の遺伝子を、やはり、４つの断片内（１．３kbのEcoRI
断片、約１．６kbのEcoRI 断片、約１．９kbのEcoRI 断
片、及び、停止コドンを含むEcoRI/BamHI 断片）にクロ
ーン化した。１．３kbのEcoRI 断片は、安定にポリメラ
ーゼのアミノ末端蛋白質を発現する。
【０１１１】実施例３活性なＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼのクローニン
グ バクテリオファージＮＥＢ６１９（ ATCC619）の、１４
kbのBamHI 制限断片上に見いだされるＴ．リトラリスポ
リメラーゼ遺伝子を、Sanger、et al.、PNAS（1977） 7
4: 5463 −5467、の方法を使用して配列決定した。１．
３kbのEcoRI 断片の５′端から始めて５８３７bpの連続
的なＤＮＡ配列（SEQ ID NO:1 ）を決定した（位置ＮＴ
１）。Fig.６を参照せよ。
【０１１２】このＤＮＡ配列の分析から、ポリメラーゼ
遺伝子は１．３kbのEcoRI 断片内のＮＴ２９１において
開始することが決定された。ＮＴ５３９７に始まる翻訳
停止部位も探索した。Ｔ．リトラリスポリメラーゼのみ
せかけの分子量は約９０−９５kDalであったため、この
遺伝子が〜２９００bpであるはずであることが予想され
た。その代わり、１７０２のアミノ酸（ａａ）もしくは
〜１８５kDalのコーディング容量を有する５１０６bpの
読み取り枠（ＯＲＦ）を同定した。
【０１１３】他のＤＮＡポリメラーゼとの配列相同性に
より（この例はFig.７に示した）、Ｔ．リトラリスのポ
リメラーゼ遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼの共通相同領
域ＩＩＩ内のイントロンもしくは介在配列（本明細書中
においては、以後「ＩＶＳＩ」とする）により中断され
ていることが発見された。（Wang、T.、et al.、FASEB
Journal （1989） 3:14 −21、この開示は、本明細書中
において、引用文献として取り込んである）。共通ＤＮ
Ａポリメラーゼ相同領域ＩＩＩの保存されているアミノ
酸をFig.７において示している。このFig.において、保
存されているアミノ酸に下線を施してある。Fig.７にお
いて見られるように、Ｔ．リトラリスの相同性群ＩＩＩ
（SEQ ID NO:2 ）の左側は、ＮＴ１７３７において始ま
り、かつ、その共通配列に対する相同性は、Asn 及びSe
r 残基以降消失する。Ｔ．リトラリスの相同群ＩＩＩ
（SEQ ID NO:３）の右側を、ＮＴ３３８４、Asn 及びSe
r 残基において選択することができる。この２つのＴ．
リトラリスポリメラーゼのアミノ酸配列を、Fig.７にお
けるようにAsan及びSer 残基が重複するように配置する
場合、このＤＮＡポリメラーゼ相同領域ＩＩＩに対して
非常に良く調和する位置が存在することが明白であっ
た。
【０１１４】従って、相同性のデーターを使用して、あ
る介在配列がＴ．リトラリスのＤＮＡ内に存在してお
り、そのＤＮＡポリメラーゼの相同領域ＩＩＩの左半分
と右半分とを分割していることが予想された。
【０１１５】ある好ましい実施態様においては、介在配
列を、介在配列のスプライス結合点付近に存在するコー
ディング領域内における非反復の制限酵素部位を同定す
ることにより削除した。合成の二重オリゴヌクレオチド
を合成し、この２つの制限断片の間の間隙を橋渡しする
のに用いた。カルボキシ端制限断片の複数部分の結合連
鎖反応、橋渡ししたオリゴヌクレオチド、アミノ端制限
断片、及び、発現ベクターの結果、介在配列を除去した
完全なポリメラーゼ遺伝子を含む発現ベクターを形成し
た。
【０１１６】具体的には、介在配列を除去したＴ．リト
ラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む、本発明の発現
ベクターを作製すのに用いるＤＮＡ断片もしくは配列
は、以下に示すようなものである： １．ポリメラーゼのコーディング領域の開始コドンがNd
eI部位内に含まれるように、プラスミドＶ２７−５．４
（実施例２、パートＢ）内におけるオリゴヌクレオチド
特異的突然変異誘発（Kunkel、et al.、Methods in Enz
ymology （1987） 154: 367: 382）により、NdeIを作成
した。
【０１１７】 本来の配列（ヌクレオチド２８８−２９３）・・・ＴＴＴ ＡＴＧ・・・ 新しい配列 ．．．ＣＡＴ ＡＴＧ・・・ ClaI部位（約５２８塩基対）に対して新しく作成したNd
eI部位からの配列を、発現ベクターの作製に用いた。
【０１１８】２．ＮＣｌｌ（実施例２、パートＤ）のCl
aI及びPvuI部位の間の約８９９bp配列。
【０１１９】３．Fig.１２に示しているように、介在配
列を橋渡しして他の断片に由来するPvuIとBsu36I部位と
を結合させる、合成二重らせん。
【０１２０】Fig.１２においては、最初のラインは、ス
プライス結合物の５′端における本来の配列を示し（ヌ
クレオチド１７２１−１７８４、SEQ ID NO:1 ）、２番
目の列は、スプライス結合物の３′端の本来の配列を示
し（ヌクレオチド３３７５−３４１５、SEQ ID NO:1
）、かつ、３番目の列は、合成二重らせんオリゴヌク
レオチドの配列を示している。
【０１２１】４．バクテリオファージＮＥＢ６１９（実
施例２、パートＣ）に由来する、約２５００塩基対の、
Bsu36IからBamHI までの断片。
【０１２２】５．pETllc（Studier 、Methods in Enzym
onogy 、（1990） 185:66 −89）に由来する、ベクター
の支柱をなす約６２００塩基対のBamHI からNdeIｃまで
の断片であり、以下の項目を含む： ａ）遺伝子１０の蛋白質についてのＴ７phi １０のプロ
モーター及びリボソーム結合部位 ｂ）アンピシリン耐性遺伝子 ｃ）lacIq 遺伝子 ｄ）プラスミドの複製起点 ｅ）４回繰り返しているリボソーム転写ターミネーター
（ｒｒｎｂ）、Simons、et al. Gnen （1987） 53:85−
96。
【０１２３】先のＤＮＡ断片、１−５を、Ｔ４のＤＮＡ
リガーゼを使用する適切な条件下で、順々に結合した。
正しい構造を制限分析により同定し、pPR969と命名し
た。Fig.８を参照せよ。pPR969を使用して、大腸菌株Ｒ
ＲＩを形質転換させ、ＮＥＢ６８７と表示される株を作
製した。ＮＥＢ６８７の試料は、１９９０年１２月７日
に、アメリカン タイプ カルチャー コレクションに
寄託し、受託番号ＡＴＣＣ No. 68487 となっている。
【０１２４】他の好ましい実施態様においては、介在配
列を除去したＴ．リトラリスのポリメラーゼ遺伝子を、
Ｔ７のポリメラーゼ発現ベクターpETllc（Studier 、
（1990）、上述）の誘導体内へクローン化した。この組
換えプラスミド１７４−ｌＢｌを使用して大腸菌株ＢＬ
２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換し、株１７５−ｌ
Ｂｌを作成し、ＮＥＢ６７１と命名した。Fig.５及び１
０を参照せよ。
【０１２５】ＮＥＢ６７１の試料を、１９９０年１０月
１７日に、アメリカン タイプ カルチャー コレクシ
ョンに寄託し、受託番号ＡＴＣＣ No. 68447 となって
いる。
【０１２６】そのポリメラーゼの予想された分子量と、
観察された分子量との間の比較により、たとえＩＶＳＩ
が除去されているにせよ、ある矛盾が示された。領域Ｉ
ＩＩにおいてＩＶＳｌを除去した後のポリメラーゼの予
想される分子量は１３２Kbであるのに対し、天然の（実
施例１を参照せよ）もしくは組換え（実施例４を参照せ
よ）ポリメラーゼのいずれのものの観察された分子量は
約９５kDである。この分子量の矛盾は、相同領域Ｉ内の
イントロン（本明細書中、以後「ＩＶＳ２」とする）に
起因するものである。この知見は以下に示す観察結果に
基づいている：相同領域ＩＩＩとＩとの距離は、数々の
pol アルファー類においては１５−１３５アミノ酸へと
変化する（Wang、（1989）、上述）。Ｔ．リトラリスに
おいては、４０７のアミノ酸もしくは〜４４−kDが存在
して、これらの領域を分断している。Ｔ．リトラリスＤ
ＮＡポリメラーゼは、何の類似性も存在しない、保存さ
れている相同領域ＩとＩＩＩとの間の３６０アミノ酸を
除いては、ヒトのpol アルファーに非常に類似してい
る。結局、共通領域Ｉは観察されていない。
【０１２７】更に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定したと
ころ、約４２−４７kDの熱安定性エンドヌクレアーゼ
も、やはり本発明のＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ
クローンにより産生されている（実施例１０を参照せ
よ）。このエンドヌクレアーゼを、標準的なイオン交換
クロマトグラフィーにより均一物に精製し、更に、アミ
ノ末端の配列決定を行った。このエンドヌクレアーゼの
最初の３０のアミノ酸は、ポリメラーゼクローン（SEQ
ID NO:1 ）のヌクレオチド３５３４で始まってコードさ
れているアミノ酸に関連している。これは、他の既知の
ポリメラーゼとの相同性を持たないポリメラーゼの一部
分に関連している。このエンドヌクレアーゼは、坑−Ｔ
・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ抗血清と反応しない。
このエンドヌクレアーゼがポリメラーゼの外へスプライ
スされてくる正確な機構は未知であるにもかかわらず、
それは大腸菌及びＴ．リトラリスの両方において自発的
に生じる。
【０１２８】実施例４組換えＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼの精製 大腸菌ＮＥＢ６７１（ＡＴＣＣ No. 68447）を、１００
リットルの発酵器内で、１０g/リットルのトリプトン、
５g/リットルのイースト抽出物、５g/リットルのＮａＣ
ｌ、及び、１００mg/ リットルのアンピリシンを含む培
地中で、３５℃において増殖させ、更に、中間対数増殖
期において０．３mMのＩＰＴＧで誘導し、更に叉４時間
インキュベートした。この細胞を遠心により収集し、−
７０℃に保存した。
【０１２９】５８０グラムの細胞を解凍し、バッファー
Ａ（１００mMのＮａＣｌ、ｐＨ７．０の２５mMのＫＰＯ
4 、０．１mMのＥＤＴＡ、０．０５％のTriton X−１０
０、及び、１０％のグリセロール）中に懸濁して、総容
量を２４００mlとした。この細胞を、ゴーリンのホモジ
ナイザーを通すことにより溶菌化させた。この未精製抽
出物を遠心により清澄化させた。清澄化させた未精製抽
出物の容量を、さきのバッファーで２２００mlに合わ
せ、更に、７５℃で３０分間加熱した。粒状物質を遠心
により除去し、残存している上清は、約３１２０mgの可
溶性蛋白質を含んでいた。
【０１３０】この上清を、フォスフォセルロースカラム
（５×１１cm；２１６mlの支持体容量）に接続してある
ＤＥＡＥ−セファロースカラム（５×１３cm; ２５５ml
の支持体容量）に供した。大量の酵素を含むＤＥＡＥ−
セファロースの通り抜け分画は直ちにフォスフォセルロ
ースカラムへ移っていった。両方のカラムを、３００ml
のバッファーＡで洗浄し、２本のカラムの接続をはず
し、更に、フォフォセルロースカラム上の蛋白質を、バ
ッファーＡ中に形成されている０．１M から１MのＮａ
Ｃｌの２リットルの直線濃度勾配液で溶出した。
【０１３１】このカラム分画をＤＮＡポリメラーゼ活性
についてアッセイした。簡潔に述べると、１−４μl の
分画を、３０μM の各ｄＮＴＰ、及び、 3Ｈ−ラベルし
たＴＴＰ、０．２mg/ml の活性化したウシ胸腺ＤＮＡ、
及び、１００μg/mlのアセチル化したＢＳＡ（アセチル
化されていないＢＳＡが好ましいことが知られている
が）を含む、５０μl の１× Ｔ．リトラリスＤＮＡポ
リメラーゼバッファー（１０mMのＫＣｌ、２０mMのトリ
ス−ＨＣｌ（２４℃においてｐＨ８．８）、１０mMの
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２mMのＭｇＳＯ４、及び、０．１
％のTritonX −１００）内で７５℃で５−１０分間イン
キュベートした。この混合物をホワットマンの３mmフィ
ルターに供し、更に、そのフィルターを、１０％のＴＣ
Ａでの３回の洗浄、次には、冷却したイソプロパノール
での２回の洗浄に供した。フィルターの乾燥後、ＤＮＡ
内への３Ｈ−ＴＴＰの取り込みを表す結合した放射活性
を測定した。活性分画を一まとめにし、更に、ｄＮＴＰ
レベルを２００μM の各ｄＮＴＰに引き上げたことを除
く先のアッセイ条件を使用して、各プールにおける酵素
活性レベルを評定した。これらの条件下では、１単位の
酵素活性を、７５℃３０分において、酸不溶性物質内へ
１０ｎモルのｄＮＴＰを取り込む酵素の量として定義し
た。
【０１３２】６６mgの蛋白質を含む、３００ml容量から
なる活性分画を、バッファーＢ（４００mMのＮａＣｌ、
ｐＨ７．０での１０mMのＫＰＯ4 、０．１mMのＥＤＴ
Ａ、０．０５％のTriton X−１００、及び、１０％のグ
リセロール）で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム
（２．５×５cm; ２５mlの支持体容量）へ供した。この
蛋白質を、バッファーＢ中に形成される１０mMから５０
０mMのＫＰＯ4 の２５０mlの直線濃度勾配液で溶出し
た。２７mg蛋白質を含む５９mlからなる活性分画を一ま
とめにし、バッファーＣ（２００mMのＮａＣｌ、ｐＨ
７．５での１０mMのトリス−ＨＣｌ、０．１mMのＥＤＴ
Ａ、０．０５％のTriton X−１００、及び、１０％のグ
リセロール）に対して透析した。
【０１３３】その透析物をヘパリン−セファロースカラ
ム（１．４×４cm; ６mlの支持体容量）に供し、２０ml
のバッファーＣで洗浄した。バッファーＣ中に形成され
る２００mMから７００mMのＮａＣｌの１００mlの直線濃
度勾配液をそのカラムに供した。１６mg蛋白質を含に４
０mlからなる活性分画を一まとめにし、バッファーＣに
対して透析した。
【０１３４】この透析物をアフィゲル ブルークロマト
グラフィーカラム（１．４×４cm;６mlの支持体容量）
に供し、２０mlのバッファーＣで洗浄し、更に、蛋白質
を、バッファーＣ中に形成される０．２M から２M のＮ
ａＣｌの９５mlの直線濃度勾配液で溶出した。１１mgの
蛋白質を含む、３０ml容量からなる活性分画を、２００
mMのＫＣｌ、１０mMのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、
１mMのＤＴＴ、０．１mMのＥＤＴＡ、０．１％のTriton
X−１００、１００μg/mlのＢＳＡ、及び、５０％のグ
リセロールを含む保存バッファーに対して透析した。
【０１３５】先に取得されたＴ．リトラリスＤＮＡポリ
メラーゼは、２０，０００−４０，０００単位／mgの特
異活性を有した。
【０１３６】組換えＴ．リトラリスポリメラーゼの性質決定 組換え及び天然のＴ．リトラリスポリメラーゼは、５−
１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥの密度勾配ゲルにおいて電気
泳動する場合、同一のみかけ上の分子量を有した。組換
えＴ．リトラリスポリメラーゼは、天然のＴ．リトラリ
スポリメラーゼと同様の３′→５′エキソヌクレアーゼ
活性を有しており、これは、ｄＮＴＰによる阻害につい
ても感受性を示す。
【０１３７】実施例５セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
の過剰発現 例えば、実施例３において取得されたＶ１７４−ｌＢｌ
のような、ＩＶＳ１を削除してあるＴ．リトラリスＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子を、数々の方法、もしくはそれを
組み合わせたものに使用して、クローン化したＴ．リト
ラリスＤＮＡポリメラーゼの最高の発現を得ることがで
きる。
【０１３８】このようなある方法は、Ｔ．リトラリスＤ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子をその内因性調節要素から分離
し、その後、そのポリメラーゼ遺伝子を、Ｔ７発原ベク
ター（Rosenberg 、et al.、Gene（1987） 56:125 −13
5 ）のような非常に協力に調節されているプロモーター
に遺伝子操作を利用して結合させることを含む。強力な
プロモーターの挿入は、Ｔ．リトラリスのＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子の両端付近の都合の良い制限標的、及び、
プロモーター付近のベクター上の適合性制限標的を同定
すること、あるいは、部位特異的突然変異誘発（Kunke
l、（1984）、上述）を用いる制限標的の作製、及び、
強力なプロモーターの転写及び翻訳調節下におけるもと
同一の方向で、ベクター内にＴ．リトラリスＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子を転移することにより行うことができ
る。
【０１３９】Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼは、
Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の上流に位置
する強力なリボソーム結合部位を利用することにより過
剰発現させてその遺伝子の発現を増大させることができ
る。Shine and Dalgarno、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
（1974） 71: 1342 −1346、これは、本明細書中に引用
文献として取り込んである、を参照せよ。
【０１４０】Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
の発現を増大させるための他の方法は、部位特異的突然
変異誘発もしくは再合成によりその遺伝子のＤＮＡ配列
を変化させて、大腸菌よりもより効果的に利用される開
始コドンを含むようにすることを含む。
【０１４１】結局、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ
は、イースト及びバキュロバイラスのような真核生物系
においてより安定であることができる。
【０１４２】Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼは、
Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を所有するク
ローンから、適切な抗生物質を含む栄養分に富む培地中
における発酵器内での増殖により産生することができ
る。その後、細胞を遠心により収集し、更に、超音波処
理により破壊してＴ．リトラリスのポリメラーゼ活性を
含む未精製の細胞抽出物を産生する。
【０１４３】Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ活性を
含むこの未精製抽出物を、実施例１に記載されている方
法により、あるいは、親和性−クロマトグラフィーもし
くはイオン交換クロマトグラフィーのような標準的な産
物精製技術により精製する。
【０１４４】実施例６Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼの３′から５′への
エキソヌクレアーゼ変異体の産生 asp141及びglu143についてのコドンをアラニンについて
のコドンに変えるための部位特異的突然変異誘発を使用
して、３′から５′方向へのエキソヌクレアーゼ活性を
持たないＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼを作製し
た。部位特異的突然変異誘発を使用して、phi29 （Cell
（1989） 59: 219−228 ）のＤＮＡポリメラーゼＩ（Sc
ience （1988） 240: 199 −201 ）、及び、Ｔ７のＤＮ
Ａポリメラーゼ類（米国特許番号No. 4,942,130 ）を含
む、エキソヌクレアーゼ活性を低減することが報告され
ているＤＮＡポリメラーゼの変異体を作製した。
【０１４５】本発明のポリメラーゼの部位特異的突然変
異誘発は、Kunkel、T.A.、PNAS（1985） 82: 488−492
（この開示は、本明細書中において引用文献として取り
込んである）、により記載されている技術の改良法を使
用して行った。Ｖ２７−５．４プラスミド（実施例２の
パートＢを参照せよ）を、部位特異的突然変異体を作製
するのに用いた。Ｖ２７−５．４は、pBluescript SK+
中に存在する１．３kbのEcoRI 断片をコードする。デオ
キシチミジンの代わりにデオキシウラシルを取り込み、
Ｖ２７−５．４プラスミドを含む株である大腸菌株ＣＪ
２３６（Kunkel、et al.、Methods in Enzymology （19
87） 154:367−382 ）を、ｆ１のヘルパーファージＩＲ
１（Virology、（1982） 122:222−226 ）で重感染させ
て、このプラスミドの１本らせん版を産生した。
【０１４６】簡潔に述べると、部位特異的突然変異体
は、以下に示す方法を利用して作製した。最初に、３５
塩基分の長さである突然変異体オリゴヌクレオチドプラ
イマーを標準的な方法を使用して合成した。このオリゴ
ヌクレオチドを一本鎖の鋳型に対してハイブリッド形成
させた。ハイブリッド形成後、このオリゴヌクレオチド
をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを使用して伸張した。結果と
して得られる２重らせんのＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼでの処理により、閉じた環状のｄｓＤＮＡに変換し
た。以下に示すような、変化させられた塩基と重複する
PvuI部位の作製により、突然変異後にこの探索対象物を
含むプラスミドを同定した。このようなプラスミドの一
つを同定し、pAJG2 と命名した。
【０１４７】 アミノ酸残基についての、本来の及び改変した配列は１４１、１４２、及び、 １４３である： ・・ａｓｐ ｉｌｅ ｇｌｕ 本来のもの： ・・ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＡＡ ・・ａｌａ ｉｌｅ ａｌａ 改変したもの： ．．ＧＣＧ ＡＴＣ ＧＣＡ 改変についてのスクリーニングに使用される、新しく作
製されたPvuI部位に下線を施した。中間のコドンを変化
させているが、その新しいコドンによりコードされるア
ミノ酸は、以前のものと同一であることに注目せよ。
【０１４８】Ｖ１７４−ｌＢｌ（実施例３を参照せよ）
からの約１２０bpのClaIからNcoIまでの断片を相関する
断片で置き換え、pAJG2 から先の置換体を生じ、pCAS4
を産生した（Fig.９を参照せよ）。従って、４つの塩基
対、つまり、先に記載したものがＶ１７４−ＩＢ１とは
異なっている。
【０１４９】大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）plysS （Method
s in Enzymology （1990） 185：60−89）をpCAS4 で形
質転換させて株ＮＥＢ６８１を作製した。突然変異体
Ｔ．リトラリスポリメラーゼの発現は、ＩＰＴＧの添加
により誘導した。
【０１５０】ＮＥＢ６８１の試料は、１９９０年１１月
８日にアメリカン タイプ カルチャー コレクション
に寄託し、ＡＴＣＣ No. 68473 となっている。
【０１５１】天然のＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ
及び大腸菌ＮＥＢ６８１から単離したエキソヌクレアー
ゼマイナス変異体中における比較エキソヌクレアーゼ活
性を、一様に［ 3Ｈ］ラベルした大腸菌ＤＮＡ基質を使
用して決定した。野生型のＴ．リトラリスＤＮＡポリメ
ラーゼは、ニューイングランド バイオラボズ社により
現在市販されている高度に精製したロットからのもので
ある。エキソヌクレアーゼマイナス変異体を、ＤＥＡＥ
セファロース及びフォスフォセルロースカラムを通して
部分的に精製して、エキソヌクレアーゼアッセイを妨害
する混入物類を除去した。表示されているポリメラーゼ
の単位数を、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼバッフ
ァー［２０mMのトリス−ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ
８．８）、１０mMのＫＣｌ、１０mMの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ
4 、５mMのＭｇＳＯ4 、０．１％のTriton X−１０
０］、０．１mg/ml のウシ血清アルブミン、及び、３μ
g/mlのＤＮＡ基質（特異活性２００，０００cmp/μｇ）
を含む０．１mlの反応物に添加し、更に、この反応物に
無機油を重層して反応物の蒸発を防いだ。同一の反応物
は、更に２０μＭのｄＮＴＰを含み、それについては、
以前に、野生型の酵素のエキソヌクレアーゼ活性を阻害
することを示してある。完全な反応混合物を７０℃で６
０分間インキュベートし、次に、その０．０８mlを除去
し、０．０２mlの０．５ｍｇ／ｍｌの超音波処理したニ
シンの精子ＤＮＡ（完全なＤＮＡの沈殿を補助するた
め）、及び、０．２mlの１０％トリクロロ酢酸と４℃下
で混合した。混合後、この反応物を、氷上で５分間イン
キュベートし、更にその後、ＤＮＡを、エッペンドルフ
社の遠心機内で、４℃において５分間ペレット化させ
た。０．２５mlの上清を、シンチレーション溶液と混合
し計数した。バックグラウンド値を補正した試料計数の
結果をFig.１１に示した。
【０１５２】Fig.１１においてFig.示されるように、エ
キソヌクレアーゼマイナス変異体は、天然のポリメラー
ゼが明らかにエキソヌクレアーゼ活性を示す条件下にお
いて、ｄＮＴＰが存在していても、存在していなくて
も、実質的にエキソヌクレアーゼ活性を有さなかった。
内輪には、バックグラウンド値を２倍以上越える活性レ
ベルが検出されたものと見積り、これにより、エキソヌ
クレアーゼ活性は、この変異体においては少なくとも６
０倍低減したことを示す。
【０１５３】実施例７Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼの半減期の決定 実施例１において先に記載したように調製したＴ．リト
ラリスＤＮＡポリメラーゼの熱安定性もしくは半減期
を、以下に示す方法により決定した。精製したＴ．リト
ラリスＤＮＡポリメラーゼ（２５単位）を、以下に示す
バッファー中で１００℃において予めインキュベートし
た：７０mMのトリス−ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ８．
８）、１７mMの硫酸アンモニウム、７mMのＭｇＣｌ2 、
１０mMのベーター−メルカプトエタノール、２００μM
の各デオキシヌクレオチド、及び、２００μg/mlのＤＮ
アーゼ処理したＤＮＡ。当初の試料を時間ゼロに採取
し、５％の酵素混合物に等価な小分注を、１０、２０、
４０、６０、９０、１２０、１５０、及び、１８０分に
除去した。ポリメラーゼ活性を、以前に記載したよう
に、ＤＮＡ内へのデオキシヌクレオチドの取り込みを決
定することにより測定した。
【０１５４】ニューイングランド バイオラボズ社から
取得したＴａｑのＤＮＡポリメラーゼの試料を先のアッ
セイに供した。当初の試料を時間ゼロに採取し、５％の
酵素混合物に等価な小分注を、４、７、及び、１０分に
除去した。Fig.３に示されるように、１００℃における
Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼの半減期は６０分で
あり、一方、１００℃におけるＴａｑのポリメラーゼの
半減期は４．５分であった。
【０１５５】Fig.３Ａに示されるように、安定剤が存在
しない状態における１００℃でのＴ．リトラリスＤＮＡ
ポリメラーゼの半減期は６０分であるのに対し、安定剤
であるTriton X−１００（０．１５％）、あるいは、Ｂ
ＳＡ（１００μg/ml）の存在下における半減期は９５分
であった。これは、安定剤の存在下あるいは非存在下に
おいて４．５分である、１００℃でのＴａｑのＤＮＡポ
リメラーゼの半減期に対してはっきりとした対照を見せ
た。
【０１５６】実施例４において先に記載したように精製
した組換えＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼの熱安定
性もしくは半減期は、約９０℃を越える温度において、
２相性の加熱不活性化曲線を有することを発見した。こ
れらの２つの相を、約５分及び７時間の半減期により性
質決定した（Fig.３Ｂ）。極端な温度におけるより一貫
性のある動態を提供するために、追加的な精製段階を使
用して、このポリメラーゼのより熱感受性な要素を除去
することができる。
【０１５７】具体的には、実施例４の最終酵素調製物を
１００℃で１５分間加熱し、その後、氷上で３０分間冷
却した。沈殿した蛋白質を、１２，０００×g におけ
る、４℃での１０分間の遠心により除去した。初期のポ
リメラーゼ活性の約２０％がこの過程で消失した。残存
しているＤＮＡポリメラーは１相性の加熱不安定化曲線
を示し、９５℃における半減期は約７時間であった。結
果として生じたポリメラーゼも叉、天然の酵素、及び、
実施例４にしたがって調製した組換え酵素に類似する、
７５℃における動力学的性質を示した。
【０１５８】実施例８３′−５′プルーフリーディング活性の決定 １．デオキシヌクレオチド類の非存在もしくは存在に対
するＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼの反応 ポリメラーゼ類に関連するエキソヌクレアーゼ活性のレ
ベルにより、デオキシヌクレオチド類に対して非常に異
なる反応が示される。非プルーフリーディング５′−
３′エキソヌクレアーゼは、デオキシヌクレオチド類の
存在に付随して生じる重合化により１０倍もしくはそれ
を越える程度刺激化される一方で、プルーフリーディン
グ３′−５′エキソヌクレアーゼは、付随して起こる重
合化により完全に阻害される。Lehman、I.R.、ARB （19
67） 36: 645。
【０１５９】Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ、ある
いは、性質が良く分析されているエキソヌクレアーゼ機
能を有するポリメラーゼ類（Ｔ４のポリメラーゼ、クレ
ノウ断片）を、重合化バッファー（７０mMのトリス（２
４℃でｐＨ８．８）、２mMのＭｇＣｌ２、０．１％のTr
iton、及び、１００μg/mlのウシ血清アルブミン）中に
おいて、１μg の３Ｈ−チミジン−ラベルした２重らせ
んのＤＮＡ（１０5 ＣＭＰ /μg ）を加えてインキュベ
ートした。７０℃（好熱性ポリメラーゼ）もしくは３７
℃（中温性ポリメラーゼ）のいずれかにおける、３時間
（実験１）もしくは４時間（実験２）のインキュベーシ
ョン期間後、エキソヌクレアーゼの加水分解した塩基
を、酸可溶性の放射能ラベルした塩基の測定により定量
化した。
【０１６０】表１に示すように、５′−３′エキソヌク
レアーゼ活性を有するＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、デ
オキシヌクレオチド類が３０μM で存在する場合に、エ
キソヌクレアーゼ活性の刺激化を示す。しかしながら、
Ｔ４ポリメラーゼ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノウ断
片、もしくは、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼのよ
うな、３′−５′プルーフリーディングエキソヌクレア
ーゼ活性を有するポリメラーゼは、デオキシヌクレオチ
ド類の存在に対して、逆のある阻害的反応を示した。
【０１６１】
【表１】 Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼと、大腸菌のＤＮＡ
ポリメラーゼの性質が良く分析されているクレノウ断片
との、デオキシヌクレオチド類の存在もしくは非存在に
対する反応の類似性をFig.４に示す。各ポリメラーゼの
２０単位を、先に記載した３５０μg の重合化バッファ
ー中で、９μg の３Ｈ−チミジン−ラベルした２重らせ
んのＤＮＡ（１０5 ＣＭＰ/ μg ）と共に、３０μM の
デオキシヌクレオチドの存在下もしくは非存在下におい
てインキュベートした。各時点で、５０μl を除去し、
更に、酸可溶性の放射能ラベルした塩基を測定した。Fi
g.４が示すように、３′−５′プルーフリーディングエ
キソヌクレアーゼ活性を含む、Ｔ．リトラリスＤＮＡポ
リメラーゼと性質が良く分析されている大腸菌のＤＮＡ
ポリメラーゼのクレノウ断片との動態は非常に類似して
いる。
【０１６２】２．デオキシヌクレオチドの増加濃度に対
するＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼの反応 ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、重合化中に
存在するデオキシヌクレオチド類のレベルにより、それ
らのレベルが重合化に影響を与えるのと同じくらいの影
響を受ける。デオキシヌクレオチドレベルを酵素のKm
（ミカエリス係数）まで引き上げると、重合の速度が上
昇する。重合化の速度に対して感受性を示すポリメラー
ゼ類のエキソヌクレアーゼ機能については、エキソヌク
レアーゼ活性における変化が、デキシヌクレオチド濃度
の増大に対応する。重合化速度の増大は、プルーフリー
ディング３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を劇的に減
少させ、重合化に依存する５′−３′エキソヌクレアー
ゼ活性の増大を伴う。
【０１６３】デオキシヌクレオチド濃度を１０μM から
１００μM まで増大させて、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリ
メラーゼのエキソヌクレアーゼ機能を、他のポリメラー
ゼ類の良く性質が分析されているエキソヌクレアーゼ機
能のものと比較した。エキソヌクレアーゼ活性を、３０
分のインキュベーション期間を使用して（１）に記載し
たように測定した。表２に要約してあるように、Ｔ．リ
トラリスＤＮＡポリメラーゼは、３′−５′プルーフリ
ーディングエキソヌクレアーゼ（大腸菌のＤＮＡポリメ
ラーゼＩのクレノウ断片）を所有することが知られてい
るポリメラーゼに類似して、デオキシヌクレオチドのレ
ベルの増加に対して反応した。この反応は、このプルー
フリーディング機能を所有しないことが知られているポ
リメラーゼ、つまり、ＴａｑのＤＮＡポリメラーゼのも
のと正反対であった。このポリメラーゼは、デオキシヌ
クレオチドのレベルの増大に反応し、その５′−３′エ
キソヌクレアーゼ活性に起因するエキソヌクレアーゼ機
能の増大を伴っていた。
【０１６４】
【表２】 ３．平衡化させたデオキシュクレオチド状態から非平衡
化状態への変化に対するＴ．リトラリスＤＮＡポリメラ
ーゼの反応 重合化は、ＤＮＡ合成中に存在する等価レベルの４種類
全てのデオキシヌクレーチド類に依存する。デオキシヌ
クレオチドレベルが等価でない場合には、ポリメラーゼ
は重合化速度を減少し、更に、恐らく誤った塩基を挿入
するものと思われる。このような条件は、５′−３′エ
キソヌクレアーゼ活性を減少させる一方で、プルーフリ
ーディング３′−５′エキソヌクレアーゼ活性をかなり
増加させる。Lehman、I.R.、ARB （1967） 36: 645。
【０１６５】Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼを、平
衡化させたデオキシヌクレオチドレベル（３０μM ）、
と、dCTPが他の３種類のデオキシヌクレオチドのレベル
の１／１０もしくは１／１００であるという性質であ
る、２種類の非平衡化のレベルの両方を使用してインキ
ュベートした。その後、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラ
ーゼの反応を、３′−５′もしくは５′−３′エキソヌ
クレアーゼ機能のいずれかを所有する３種類のポリメラ
ーゼのものと比較した。全てのアッセイは、以下に明細
を記録するdCTP濃度を除外しては、（１）において記載
されているように行った。以下に示す表３に示すよう
に、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼは、プルーフリ
ーディング３′−５′エキソヌクレアーゼを含むポリメ
ラーゼについて予想される動態を伴い、つまり、デオキ
シヌクレオチドプール中の非平衡は、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼもしくは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ
断片のものと類似する様式でエキソヌクレアーゼ活性を
増大させた。この反応とは対照的に、重合化が阻害され
る地点に非平衡を上昇させるまで、ＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼのエキソヌクレアーゼは影響を受けなかった。
【０１６６】
【表３】 ４．エキソヌクレアーゼ活性の方向性 プルーフリーディングエキソヌクレアーゼは、ＤＮＡに
ついて３′−５′の方向性を有するが、一方で、ＤＮＡ
ポリメラーゼ類に関連する非プルーフリーディングエキ
ソヌクレアーゼは５′−３′の方向性を有する。Ｔ．リ
トラリスＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性
の方向を認識するために、アデノウイルスの５′を遮断
したＤＮＡを利用した。このＤＮＡの５′端は蛋白質に
よって遮断されているため、方向性が５′−３′である
酵素活性は、この２重らせんＤＮＡを消化することがで
きないが、しかしながら、エキソヌクレアーゼＩＩＩも
しくはプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ含有性
ポリメラーゼのような、３′−５′である酵素活性はア
デノウイルスＤＮＡを消化することができる。
【０１６７】２５単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩ、あ
るいは、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４のＤ
ＮＡポリメラーゼ（良く性質分析されている３′−５′
エキソヌクレアーゼ活性を所有する）、もしくは、Ｔａ
ｑのＤＮＡポリメラーゼ（そのような活性を所有しな
い）のいずれかの２０単位を、５μg のアデノウイルス
のＤＮＡと最高３０分までの期間、３７℃（Ｔ４ポリメ
ラーゼ及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ）もしくは７０℃
（Ｔａｑポリメラーゼ、及び、Ｔ．リトラリスポリメラ
ーゼ）のいずれかで、７０mMのトリス−ＨＣｌ、２５℃
においてｐＨ８．８、２mMのＭｇＣｌ2 、及び、１００
μg/mlのＢＳＡの存在下においてインキュベートした。
各インキュベーション時間の最後に、アデノウイルスＤ
ＮＡのフェノール抽出により酵素活性を停止させ、次
に、HpaI消化を３７℃で１時間、２０mMのトリス、２５
℃でｐＨ７．９、１０mMの酢酸マグネシウム、５０mMの
酢酸カリウム、及び、１mMのＤＴＴ内において行った。
このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供し、結果
として得られる、経時的分解及び引き続き生じる２重ら
せんＤＮＡ断片の消失の様式を査定した。
【０１６８】エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ．リトラリ
スＤＮＡポリメラーゼ、及び、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
の３′−５′エキソヌクレアーゼ活性が、アデノウイル
スＤＮＡの遮断してある５′端に由来する２重らせんＤ
ＮＡ断片の消失の原因となっており、その３′端が反応
の的となり易いことを示している。それと対照的に、
５′−３′重合化依存的エキソヌクレアーゼ活性を有す
るＴａｑＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ断片の消失を示さ
なかった。
【０１６９】実施例９ＰＣＲ法におけるＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼの
反応効率 Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼがポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を行う能力をも調査した。実施例４にお
いて記載したバッファーを含む１００μl 容量中におい
て、４３５５bp及び２８９５bpの２つの断片を生じるCl
aI消化により切断されたＭ１３ｍｐ１８のＤＮＡの変化
量を、任意の非特異的吸着効果を低減させるための担体
ＤＮＡとして存在する２００ngのウシの胸腺ＤＮＡと共
にインキュベートした。正方向及び逆方向のプライマー
が、１μM で存在した（正方向のプライマー＝５′ｄ
（ＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＴＡＧＴＴＴＧＡＧＴ
Ｔ）３′であり、かつ、逆方向のプライマー＝５′ｄ
（ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡ
Ｃ）３′である）。これらのプライマーは、Ｍ１３ｍｐ
１８の総ＤＮＡの１４％を表す配列で、先に記載した４
３５５bpの断片上の１kbのＤＮＡ配列の両端を挟み込
む。更に、２００μM の各ｄＮＴＰ、１００μg/mlのＢ
ＳＡ、１０％のＤＭＳＯ、及び、２．５単位のＴ．アク
アティクスＤＮＡポリメラーゼ（T. aquaticus）（０．
５％のＮＰ４０及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０の存在
下もしくは非存在下）、あるいは、Ｔ．リトラリスＤＮ
Ａポリメラーゼ（０，１０％のTriton X‐１００の存在
下もしくは非存在下）が存在した。最初の周期は、９５
℃で５分、５０℃で５分（そのポリメラーゼ及びＢＳＡ
が添加される間）、及び、７０℃で５分からなってい
た。引き続き起こる各ＰＣＲ周期の区分を以下に示す：
９３℃で１分、５０℃で１分、及び、７０℃で５分。
０、１３、２３、及び、４０周期後、１００μl 容量の
内のＴｗｅｅｎ２０μl の量を除去し、１kbのＤＮＡ配
列の増幅化を定量化するために臭化エチジウムが存在す
るアガロースゲル電気泳動に供した。
【０１７０】２８ng及び２．8ng で存在するこの標的Ｄ
ＮＡ配列を用いる当初の実験により、ポリメラーゼ連鎖
反応を触媒化するＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼの
能力が立証され、産生率は、Ｔ．アクアティクスＤＮＡ
ポリメラーゼに見られるものと比較できる量もしくは多
くて２倍程度であった。
【０１７１】しかしながら、ポリメラーゼ機能の差異が
最も顕著であったのは、標的ＤＮＡ配列のより低いレベ
ル、２．８フェムトグラムにおいてであった。各周期中
のＤＮＡ伸長において、最高のポリメラーゼ安定性及び
／叉は効率を必要とするこれらの条件下において、Ｔ．
リトラリスＤＮＡポリメラーゼは、２３周期以内では、
Ｔ．アクアティクスＤＮＡポリメラーゼと比較して４倍
を越える大きさの量の増幅化されたＤＮＡを産生した。
【０１７２】より少ない周期で非常に少量のＤＮＡを増
幅する能力は、ＰＣＲの多くの応用法にとって重要であ
り、それは、増幅化のためにかなりの回数の周期を利用
することは、そのＰＣＲ過程中の希望しない人工産物の
作製に関係してくるためである。
【０１７３】実施例１０イントロンをコードする組換えＴ．リトラリスエンドヌ
クレアーゼの精製 実施例９において記載されているように増殖する大腸菌
ＮＥＢ６７１（ＡＴＣＣ No. 68447 ）を解凍し（７０
グラム）、ml当たり２００μg のリゾチームを含むバッ
ファーＡ中に、最終容量が３００mlになるように懸濁し
た。この混合物を３７℃で２分間、その後、７５℃で３
０分間インキュベートした。加熱した混合物を、２０，
０００×ｇで３０分間遠心し、熱安定性エンドヌクレア
ーゼの更に進んだ精製のためにその上清を回収した。大
腸菌に由来する全てのヌクレアーゼは熱処理により不活
性化されたため、この段階における調製物をイントロン
をコードするエンドヌクレアーゼの性質分析に使用する
ことができた。この７５℃の上清溶液中にも存在する組
換えＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼからこの酵素を
分離するために、この溶液をＤＥＡＥ−セファロースカ
ラム（５cm×５cm、１００mlの支持体容量）を通し、更
に、２００mlのバッファーＡで洗浄した。主に全てのＤ
ＮＡポリメラーゼ活性はカラムを通過する一方、エンド
ヌクレアーゼ活性は吸着する。このエンドヌクレアーゼ
活性を、バッファーＡ中に形成される０．１M から０．
８M のＮａＣｌの１リットルの直線濃度勾配液で溶出
し、それを、１０mMのＫＣｌ、２０mMのトリス−ＨＣｌ
（２４℃でｐＨ８．８）、１０mMの（ＮＨ4 ）4 Ｓ
Ｏ4 、１０mMのＭｇＳＯ４、０．１％のTriton X−１０
０、及び、１μg のpBR322を０．０５mlの反応混合物当
たり含むバッファー内でアッセイした。この反応混合物
を７５℃でインキュベートし、ＤＮＡ開裂の範囲をアガ
ロースゲル電気泳動により決定した。低い温度において
は、殆どもしくは全くエンドヌクレアーゼ活性が検出さ
れなかった。ピークを示す活性を含む試験管を一まとめ
にして、バッファーＡに対して一晩透析し、その後、フ
ォスフォセルロースカラム（２．５cm×６．５cm、３２
mlの支持体容量）に供し、バッファーＡで洗浄し、更
に、エンドヌクレアーゼ活性を、バッファーＡ中に形成
した０．１Mから１．５M のＮａＣｌの１リットルの直
線濃度勾配液で溶出した。酵素は約０．８M のＮａＣｌ
で溶出された。活性分画を一まとめにし、バッファーＡ
に対して一晩透析し、ＨＰＬＣモノ−Ｓカラム（ファル
マシア社）を通し、更に、０．０５M から１．０M のＮ
ａＣｌの直線濃度勾配液で溶出した。活性は単一のピー
クとして溶出され、かつ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると均
一であり：つまり、単一の４２−４７kdのバンドがクマ
シーブルー染色により検出され、更に、このバンドをゲ
ルから溶出させ、変成させた時点で、それはゲル上で検
出されるエンドヌクレアーゼ活性のみを含んでいた。
【０１７４】この酵素は、多様なＤＮＡ上の好ましい切
断部位を有する。大過剰で、更に、火道ポリメラーゼバ
ッファー（ニューイングランド バイオラボズ社、ビバ
リー、マサチューセッツ州）中で使用する場合、この酵
素は、ラムダーＤＮＡ上に複数の切断部位を、更に、pB
R322上に３ケ所の切断部位を有する。pBR322上の２つの
急速部位の配列を決定した： 位置１６４の切断部位を含む領域： ５′ ＴＴＧＧＴＴＡＴＧＣＣＧＧＴＡＣ ＴＧＣＣＧＧＣＣＴＣＴＴ ３′ ３′ ＡＡＣＣＡＡＴＡＣＧＧＣ ＣＡＴＧＡＣＧＧＣＣＧＧＡＧＡＡ ５′ 位置２４１１の切断部位を含む領域： ５′ ＴＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＧＡＴＡＣ ＣＧＣＴＣＧＣＣＧＣＡＧ ３′ ３′ ＡＡＣＴＣＡＣＴＣＧＡＣ ＴＡＴＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＴＣ ５′ ＩＶＳ２をpBR969から削除する場合、結果として生じる
プラスミド、pAKK4 （実施例１１）は、エキソン接続点
において非常に感受性の高い高速反応部位を含む： ＩＶＳ２接続点における切断部位を含む領域： ５′ ＧＧＴＴＣＴＴＴＡＴＧＣＧＧＡＣ＊ＡＣ／ＴＧＡＣＧＧＣＴＴＴＡＴＧ ３′ ３′ ＣＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＧＣＣ／ＴＧ＊ＴＧＡＣＴＧＣＣＧＡＡＡＴＡＣ ５′ 星印（＊）は、左側のエキソンと右側のエキソンとの間
の領域を示し、それらは、ＩＶＳ２の削除により互いに
結合されている。
【０１７５】Ｉ−Ｔｌｉ Ｉのホーミング部位における
開裂は、５０℃における、５０mMのＴＲＩＳ（ｐＨ７．
９）、１０mMのＭｇＣｌ2 、１００mMのＮａＣｌ、及
び、１mMのＤＴＴの反応条件を使用すると、「星印」の
部位におけるものより１００倍もより速く起こる。これ
らの条件下では、この酵素は大腸菌のＤＮＡを６−１０
倍切断する。「星印」の開裂は、ＮＨ4 （１０mM）、高
めの温度（７０−８０℃）、及び、高めのｐＨ９８．８
−１０）により促進される。
【０１７６】従って、Ｔ．リトラリスからのエンドヌク
レアーゼは、切断部位における４種類の塩基の３′伸長
がたびたび存在しかつ認識配列における同義性が存在す
ることがあるとして報告さている、イントロンをコード
する他のエンソヌクレアーゼ類に類似している。
【０１７７】イントロンの突然変異遺伝子内のこの切断
部位は、イントロンをコードするエンドヌクレアーゼの
ホーミング部位として引用される。この分野において
は、イントロンをコードしているエンソヌクレアーゼ
は、そのイントロンを持たない遺伝子内の切断部位を認
識し、かつ、このエンドヌクレアーゼによるそのＤＮＡ
の切断は、ホーミング部位におけるイントロンの挿入を
結果として生じると考えられている。
【０１７８】本発明の熱安定性エンドヌクレアーゼは、
このような活性が希望される遺伝子操作技術に使用する
ことができる。
【０１７９】実施例１１ＩＶＳ２を削除したＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ
発現ベクターの作製 他のアルファークラスのＤＮＡポリメラーゼ類、及び、
１１７０bpの介在配列中のエンドヌクレアーゼと比較し
てＴ．リトラリス遺伝子のアミノ酸配列を演繹して分析
したところ、このイントロンはアルファーポリメラーゼ
の領域Ｉを妨害することが示唆された。このエンドヌク
レアーゼの前にある最初の３つのアミノ酸（Tyr Ala As
p ）が、ａａ１４７２におけるＴｈｒに結合している場
合には、良好な共通配列Ｉが確立される（下線を施した
残基は相同性を示す）： 領域Ｉ：ＴＹＲ ＧＬＹ ＡＳＰ ＴＨＲ ＡＳＰ Ｓ
ＥＲ 左側の接合配列：ＴＹＲ ＡＬＡ ＡＳＰ ＳＥＲ Ｖ
ＡＬ ＳＥＲ 右側の接合配列：ＶＡＬ ＨＩＳ ＡＳＮ ＴＨＲ Ａ
ＳＰ ＧＬＹ 火道ポリメラーゼの領域Ｉ：ＴＹＲ ＡＬＡ ＡＳＰ
ＴＨＲ ＡＳＰ ＧＬＹ この作製物を利用するために、以下に示すように、Ｌｙ
ｓ １０７６及びＶａｌ １０７７のコドン用法を変化
させることによりScaI部位をＰＣＲプライマー内に作成
した： アミノ酸： ＰＨＥ ＬＹＳ ＶＡＬ ＬＥＵ
ＴＹＲ ＡＬＡ ＡＳＰ 当初の配列： ＴＴＴ ＡＡＧ ＧＴＴ ＣＴＴ 変化させた配列：ＴＴＴ ＡＡＡ ＧＴＡ ＣＴＴ ScaI部位： Ａ ＧＴＡ ＣＴ 発現プラスミドpAKK4 を、以下に示す成分に由来する３
方向連結法において作成した： １） pPR969の約７９５９bpの断片を、HindIII 及びEc
oRI での開裂により誘導化した。９μのpPR969ＤＮＡ
を、４０単位のHindIII エンドヌクレアーゼ及び４０単
位のEcoRI エンドヌクレアーゼを含む総量０．１mlの１
×ＮＥバッファー２を用いて３７℃で１時間インキュベ
ートした。開裂産物を、０．７％のＧＴＧ等級のアガロ
ースゲル（ＦＭＣ）上で、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡバ
ッファーを流して分離した。約８kbp の適切なバンド
を、製造元の推薦する操作条件を利用して、エルトラッ
プ溶出装置（シュレイカー アンド シューレ社）を使
用しての電気溶出により単離した。溶出の後に、分画を
エタノール沈殿により濃縮し、更に、アガロースゲル電
気泳動における既知の重量標準物との比較により、回収
率を定量化した。
【０１８０】２） ScaI及びEcoRI 末端を有する約６３
８bpの断片をＰＣＲ産物から誘導化した。この反応混合
物は、１×ＮＥＢ火道ポリメラーゼバッファー、０．１
mg/ml のウシ血清アルブミン、０．２mMのｄＮＴＰ（各
ヌクレオチドが等モルである）、０．９μg/mlのｐＶ１
７４．１Ｂ１プラスミドＤＮＡ鋳型、及び、０．０１Ａ
260 Ｕ／mlのプライマー７２−１５０（５′ＡＴＡＡＡ
ＧＴＡＣＴＴＴＡＡＡＧＣＣＧＡＡＣＴＴＴＴＣＣＴＣ
ＴＡ３′）、及び、プライマー「ＪＡＣＫ」（５′ＣＧ
ＧＣＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＡＣＡＣＴＧＡＴＴ
ＡＣ３′）を含んでいた。０．１mlの反応混合物を各々
５本の試験管内に配し、更に、その試料をパーキン−エ
ルマー社のサーモサイキュラー（熱循環機）内で、３−
５分間、９５℃に加熱した。１Ｕの火道ＤＮＡポリメラ
ーゼを各試験管に添加して、９４℃−０．５分、５０℃
−０．５分、及び、７２℃−２分からなる１５周期を熱
循環機内で行った。試料を一まとめにし、フェノール抽
出し、更に、エタノール沈殿させた。試料を、５０μl
のトリス−ＥＤＴＡバッファー中に懸濁させ、更に、４
０μ lのｄＨ２Ｏ、１０μl の１０×ＮＥバッファー
３、６０単位のScaIエンドヌクレアーゼ、及び、６０単
位のEcoRI エンドヌクレアーゼと混合した。３７℃で
１．７５時間インキュベートした後、この反応産物を
１．５％のアガロースゲル上で分離し、更に、約６３８
bpの断片を電気溶出し、以下に示すように定量化した。
【０１８１】３） HindIII 及びScaI末端を有する約３
５８bpの断片をＰＣＲ産物から誘導化した。この反応混
合物は、１×ＮＥＢ火道ポリメラーゼバッファー、０．
１mg/ml のウシ血清アルブミン、０．２mMのｄＮＴＰ
（各ヌクレオチドが等モルである）、０．９μg/mlのｐ
Ｖ１７４．１Ｂ１プラスミドのＤＮＡ鋳型、及び、０．
０２ Ａ260 Ｕ／mlのプライマー６９８（５′ＧＡＧＡ
ＣＴＣＧＣＧＧＡＧＡＡＡＣＴＴＧＧＡＣＴ３′）、及
び、プライマー７３−１４３（５′ＴＡＣＡＧＴＡＣＴ
ＴＴＡＴＧＣＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＧＧＣＴＴＴＴＡＴ
ＧＣＣＡＣ３′）を含んでいた。０．１mlの反応混合物
を５本の試験管の各々の中に配し、更に、この試料をパ
ーキン−エルマー社のサーモサイキュラー内で３−５分
間、９５℃に加熱した。１ＵのベントＤＮＡポリメラー
ゼを各反応試験管に添加し、９４℃−０．５分、５０℃
−０．５分、及び、７２℃−１分からなる２０周期を、
熱循環機上で行った。この試料を一まとめにし、フェノ
ール抽出し、更に、エタノール沈殿させた。この試料を
５０μl のトリス−ＥＤＴＡバッファー中に再懸濁し、
更に、HindIII 及びScaIインドヌクレアーゼで開裂し
た。この反応産物を１．５％のアガロースゲル上で分離
し、更に、３５８bpの断片を電気溶出し、以下に示すよ
うに定量化した。
【０１８２】この結合連鎖反応物は、約１μg/mlの、先
に記載したpPR969断片、０．８μl/mlの、先に示した６
３８bpの断片、０．４μl/mlの、先に示した３５８bpの
断片、１×ＮＥＢ結合連鎖反応バッファー、及び、１０
０、０００単位/ml のＴ４ＤＮＡリガーゼを含んでい
た。結合連鎖反応は、１６℃で５時間行った。先に示し
たように、正しく作成された組み換え体をScaI消化パタ
ーンにより同定し、更に、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓ
Ｓ内に形質転換させて誘導可能な活性をスクリーニング
した。このような２種類の単離物であるｐＡＫＫ４及び
ｐＡＫＫ１５を、この次の研究に使用した。これら２種
類の単離物は、それらを独立した単離物から単離したに
もかかわらず、同一であるように思われる。
【０１８３】新しい作製物であるpAKK４からの発現は、
１１７０bpのイントロンからのエンドヌクレアーゼの発
現を伴わないpPR969に比べて、３−１０倍多いＴ．リト
ラリスＤＮＡポリメラーゼを産生するように思われる。
【０１８４】Ｔ．リトラリスポリメラーゼのエキソヌク
レアーゼ欠損変異体の産生のための発現ベクターは、pA
KK１５からの１４１７bpのClaI−SphI断片を、元来のエ
キソヌクレアーゼ欠損Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラー
ゼ作製物であるpCBA1 からの疑似的な１４１７bp断片で
置換することにより作製した。このような組み換え体の
一つをpAKM8 と命名し、更に性質を分析した。
【０１８５】実施例１２ピロコッカス・スピーシス（Pyrococcus species）から
の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの精製 ピロコッカス ｓｐ．（Pyrococcus sp ）株のＧＢ−Ｄ
（ＡＴＣＣ No. 55239 ）を、８本の１リットル用ビン
中で、１０g/l の必須イオウを含む、Belkin、et al.、
上述、に記載されている培地中で、９４℃において２日
間増殖させた。この細胞を室温に冷却し、デカンテーシ
ョンにより未使用のイオウから分離し、遠心により回収
し、更に、−７０℃に保存した。細胞の回収率は、リッ
トル当たり１．４g であった。
【０１８６】先に記載したように取得された１１．５g
の細胞を、０．１M のＮａＣｌを含む２８mlのバッファ
ーＡ（１０mMのＫＰＯ4 バッファー、ＰＨ７．４；０．
１mMのＥＤＴＡ、１．０mMのベーター−メルカプトエタ
ノール）中に懸濁した。この溶菌液を、４℃において１
５，０００g で３０分間遠心した。上清溶液を、１８ml
のアフィゲル ブルーカラム（バイオラド社）に通し
た。その後、このカラムを、０．１M のＮａＣｌを含む
５０mlのバッファーＡで洗浄した。このカラムを、バッ
ファーＡに含まれる０．１から２．０M のＮａＣｌの３
００mlの直線濃度勾配液で溶出した。ＤＮＡポリメラー
ゼは約１．３M のＮａＣｌにおける単一のピークとして
溶出され、これは、カラムに供した活性の９０％を示し
た。ＤＮＡポリメラーゼのピークの活性（２５ml）を１
００mMのＮａＣｌを含む１リットルのバッファーＡに対
して透析し、その後、１００mMのＮａＣｌを含むバッフ
ァーＡで平衡化した１５mlのフォスフォセルロースカラ
ムに供した。このカラムを１００mMのＮａＣｌを含む５
０mlのバッファーＡで洗浄し、更に、酵素活性を、バッ
ファーＡに含まれる０．１から１．０M のＮａＣｌの２
００mlの直線濃度勾配液で溶出した。活性は０．６M の
ＮａＣｌにおける単一のピークとして溶出され、カラム
に供した活性の７０％を示した。一まとめにした活性
（４２ml）を５００mlのバッファーＡに対して透析し、
更に、２５mlのＤＥＡＥカラムに供した。このカラム
を、０．１M のＮａＣｌを含む５０mlのバッファーＡで
洗浄し、酵素活性の３分の２がカラムを通過した。活性
分画を一まとめにし（３０ml）、更に、１．０mlのＨＰ
ＬＣモノ−Ｓ カラム（ファルマシア社）に供し、０．
０５から１．０M のＮａＣｌがバッファーＡ中に含まれ
る１００mlの直線濃度勾配液で溶出した。活性は、０．
２２M における単一のピークとして溶出され、カラムに
供した活性の８０％を示した。
【０１８７】精製したピロコッカス ｓｐ．ポリメラー
ゼをＳＤＳ １０−２０％ポリアクリルアミドゲル内で
電気泳動し、更に、蛋白質を検出するために以前に記載
したクマーシーブルーあるいはコロイド染色（ＩＳＳプ
ロブルー）のいずれかで染色した。微かに染色された蛋
白質のバンドが、約９２，０００から９７，０００ダル
トンにおいて観察され；この分子量を、以下に示すマー
カー蛋白質類（ベセスダ リザーチ ラボラトリーズ
社）の移動に対する同一ゲル上での比較により取得され
た：ミオシン、２００，０００ダルトン；フォスフォリ
ラーゼＢ、９７，４００ダルトン；ＢＳＡ、６８，００
０ダルトン；オバルブミン、４３，０００ダルトン；カ
ルボニックアンヒドラーゼ、２９，０００ダルトン；ｂ
−ラクトグロブリン、１８，４００ダルトン；リゾチー
ム、１４，３００ダルトン。
【０１８８】実施例１３ピロコッカス ｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクロ
ーニング Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子から調製され
た放射性プローブを使用するピロコッカスゲノムＤＮＡ
ライブラリーのクロスハイブリッド形成は、ピロコッカ
スＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの同定及び単
離を考慮してのことである。これは、以下に示すように
実行した。
【０１８９】ピロコッカスゲノムライブラリーの調製に
おいてどの制限酵素が最も有用であるかを決定する目的
で、ピロコッカス ｓｐ．ＤＮＡを、EcoRI 、BamHI 、
及び、HindIII で完全に切断した。このＤＮＡを、アガ
ロースゲル電気泳動（Fig.１３Ａ）、及び、以下に示す
用に調製したＤＮＡプローブを使用するサザンハイブリ
ッド形成（Fig.１３Ｂ）に供した。市販のランダムプラ
イミングキット（ニューイングランド バイオラボズ
社）内における鋳型として、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子（bp １−１２７４、バクテリオファー
ジＮＥＢ＃６１８から取得することができる、ＡＴＣＣ
No. 40794 ）の最初のEcoRI 断片の１μg を含む反応
混合物を、３７℃で１時間インキュベートして、高い特
異的活性のＤＮＡプローブを作製した。このプローブ
を、中程度の緊縮条件下において先に調製したピロコッ
カス ｓｐ．のＤＮＡに対してハイブリッド形成させた
（ハイブリッド形成：５０℃で一晩、４×ＳＥＴ、０．
１M のリン酸ナトリウム、ｐＨ７、０．１％のピロリン
酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１×デンハーズ溶
液；洗浄条件：３×２０−３０分の洗浄、４５℃、０．
１×ＳＥＴ、０．１M のリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、
０．１％のピロリン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ。
Maniatis、et al.、上述）。約５kbにおける単一の主要
なバンドがBamHI で切断したピロコッカスＤＮＡ中に検
出された。EcoRI 及びHindIII は、このプローブを使用
すると複数のバンドを生じ、これらの酵素はピロコッカ
スポリメラーゼ遺伝しないを切断することを示してい
る。
【０１９０】これらの結果に基づき、ファージベクター
λＤＡＳＨ（ストラッタジーン社）を使用してBamHI ゲ
ノムライブラリーを作製した。ピロコッカスＤＮＡの部
分的及び完全なBamHI 消化物を調製した。部分的及び完
全にBamHI 消化したＤＮＡの混合物を、λＤＡＳＨのBa
mHI ｖ部位内へ結合させた。この結合混合物を製造元の
説明書に従って、ギガパックゴールド（ストラッタジー
ン社）を用いて封入し、大腸菌ＥＲ１４５８上で平板培
養した。封入したファージライブラリーは、ml当たり１
×１０6 のファージを含んでいた。
【０１９１】Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
（ＮＥＢ＃６１９から取得できる、ＡＴＣＣ No. 4079
5 ）の３つの断片（ bp １−１２７４、１６５６−２６
６０、及び、３０６９−３７３７）の32Ｐ−ラベルした
ＤＮＡプローブを、市販のプライマーキット（ニューイ
ングランド バオラボズ社）を使用して調製した。Bent
on & Davis（Maniatis、et al.、上述）の方法に従い、
先に記載したハイブリッド形成条件を使用してピロコッ
カスのゲノムライブラリーをスクリーニングするのにこ
のブローブを使用した。このプラークの約１パーセント
は陽性であり、１０個の陽性プラークを選択し、再感染
により精製し、更に、３回平板培養した（各単離物につ
いて、９０−１００％のプラークが陽性になるまで）。
大量のファージを各単離物から調製し、大腸菌を感染す
るのに用いた。具体的には、ファージのプレート溶菌液
（Maniatis et al. 、上述）を各単離物から調製し、大
腸菌細胞を感染するのに使用した。０．１mlの各プレー
ト溶菌液を０．２mlの細胞（ＯＤ600 ＝２）を含む大腸
菌と混合した。この細菌性細胞を溶菌直前に収集し、
０．０５M のＮａＣｌ、０．０１M のトリス（ｐＨ８．
０）、０．１mMのＥＤＴＡ、０．１％の Triton Ｘ−１
００、及び、２００μg/mlのリゾチーム（細胞の容量当
たり３倍の容量）中に懸濁し、更に、約１分間もしくは
細胞溶菌が起こるまで３７℃に加熱した。この溶菌化し
た抽出物を直ちに７５℃で３０分間加熱し、遠心し、更
に、先に記載した方法に従い、その上清溶液を熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼについてアッセイした。１０種類の
単離物の内の３種類が有意なポリメラーゼ活性を示し、
最も高い活性を示したクローン（Ｂ９）を更に調査し
た。
【０１９２】ファージＤＮＡをＢ９から単離し、挿入Ｄ
ＮＡを制限酵素消化により調査した。SalIでの消化によ
り、２本のλＤＡＳＨと１５kbの挿入断片とを生じた。
BamHI での消化により、２本のλＤＡＳＨと７、４．
８、及び、３kbの３つの挿入断片を生じた。これらの断
片の各々をアガロースゲル電気泳動により精製し、溶出
し、更に、ｐＵＣ１９のBamHI 部位に結合した。この結
合混合物を使用して大腸菌ＥＲ２２０７を形質転換させ
たが、この大腸菌は、プラスミドが挿入断片を含む場合
には白色のコロニーを生じ、かつ、標識としてのアガロ
ース培地（Ｘ−ｇａｌとＩＰＴＧ）上に挿入断片が存在
しなければ、青色のコロニーを生じる。７kbの断片では
白色の形質転換体は取得されなかった。４．８kbの断片
では３個の白色、及び、２７個の青色形質転換体が取得
され、更に、３kbの断片では、２０個の白色、及び、２
１個の青色形質転換体が取得された。３個の４．８kbの
白色コロニー形質転換体の全ては熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼ活性を発現した。３kbの断片での形質転換体のい
ずれも、熱安定性ポリメラーゼ活性を発現しなかった。
４．８kbのピロコッカスＤＮＡ断片を保持するこの３つ
のクローンは、全て、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにつ
いて、ほぼ同じ特異活性を有し、一つのものを更に進ん
だ研究のために選択した（ＮＥＢ＃７２０）。ＮＥＢ＃
７２０と表示されるこのクローンを、１９９１年１０月
１日に、アメリカン タイプ カルチャー コレクショ
ンに寄託し、受託番号ＡＴＣＣ No. 68723 となった。
ピロコッカス ｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含
む、４．８kbのBamHI 断片の制限エンドヌクレアーゼ地
図をFig.１４に示した。bp３６３におけるポリメラーゼ
遺伝子の出発点、及び、介在ヌクレオチド配列（bp１８
３９−３４２０）の一部分を含むピロコッカス ｓｐ．
ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ７２０）をコードする部分
的なＤＮＡヌクレオチド配列をFig.１８に示す。ＮＥＢ
＃７２０は細胞のグラム当たり１７００単位のＤＮＡポ
リメラーゼ活性を産生し、更に、これをこの酵素の大量
調製に使用した。
【０１９３】ピロコッカス ｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼ
のクローンの一部分の配列を決定した（Fig.１８、bp１
−３４２０）。ピロコッカス ｓｐ．ＤＮＡポリメラー
ゼの配列は、ＤＮＡ及び蛋白質レベルの両方において、
Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼに非常に類似してい
る（類似性は、ＧＣＧベストフィットプログラムを使用
して算出した、Smith and Waterman、Advances in Apli
ed Mathmatics 、2:482 （1981））。総体的に、その遺
伝子は、成熟したＤＮＡポリメラーゼのアミノ末端領域
（ピロコッカス ｓｐ．のＤＮＡポリメラーゼにおける
bp３６３−１８３８）においては、６９％の相同性で６
６％が相同であり、かつ、現在までに配列決定されてい
るＩＶＳ１の一部分（ピロコッカス ｓｐ．のＤＮＡポ
リメラオゼにおけるbp１８３９−３４２０）において６
３％が相同である。上流領域（ピロコッカス ｓｐ．の
ＤＮＡポリメラーゼにおけるbp１−３６２、Fig.１８、
及び、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼにおけるbp１
−２９０、Fig.６）は、ベストフィットプログラムによ
ると何の類似性も示していない。
【０１９４】蛋白質レベルにおける類似性はより高めで
さえある。ピロコッカス ｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼの
コーディング領域の１０１９個のアミノ酸においては、
この２種類のポリメラーゼは、８３％の類似性及び６８
％の相同性を有する（Fig.１９）。成熟したポリメラー
ゼのアミノ末端及びＩＶＳ１へと分割した場合、ポリメ
ラーゼのコーディングエキソンは、介在配列よりもより
類似しており、成熟したポリメラーゼのアミノ末端（ピ
ロコッカス ｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼにおけるａａ
１−４９２）は８９％類似しておりかつ７８％相同であ
り、更に、ＩＶＳ１（ピロコッカス ｓｐ．のＤＮＡポ
リメラーゼにおけるａａ ４９３−１０１９）は７８％
類似しておりかつ６０％相同である。
【０１９５】実施例１４ＤＮＡレベルにおける古細菌ＤＮＡポリメラーゼの類似
性 Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と、３種類の
他の好熱性古細菌及びＴａｑのＤＮＡからのＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子との間のクロスハイブリッド形成の度合
いを、サザンブロットハイブリッド形成（Maniatis、上
述）により調査した。Ｔ．リトラリス及びピロコッカス
ｓｐ．（株ＧＢ−Ｄ）、Ｔ．アクアチクス（T.aquati
cus ）、及び、他の２種類のピロコッカス株、Ｇ−１−
Ｊ及びＧ−１−Ｈ、からの染色体ＤＮＡを、EcoRI もし
くはBAmHI のいずれかで開裂した。５μg の各ＤＮＡ
を、２０単位のEcoRI エンドヌクレアーゼもしくは２０
単位のBamHI エンドヌクレアーゼを含む６０μl の総容
量の１×ＮＥバッファー（EcoRI エンドヌクレアーゼの
ためのEcoRI バッファー、及び、BamHI エンドヌクレア
ーゼのためのBamHI バッファー＋１×ＢＳＡ）を用いて
３７℃で２時間インキュベートした。４重検証のため、
開裂したＤＮＡの各試料の０．７５μg を、トリス酢酸
ＥＤＴＡバッファーで使用している１％のアガロース
（シーケム ＬＥ社）ゲル上にのせて電気栄動させた
（Maniatis、上述）。このゲルを、室温で２０分間、臭
化エチジウム（１μg/ml）で染色し、更に、定規を横に
おいてゲルの写真を撮影した。
【０１９６】サザン（Maniatis、上述）により開発され
た方法を使用して、このＤＮＡを、ゲルからニトロセル
ロース紙上に転移させた。ニトロセルロースフィルター
紙（０．４５μm ）をゲルのサイズに切り、３７℃にお
いて２００mlの６×ＳＳＣ（０．９M のＮａＣｌ、０．
０９M のクエン酸ナトリウム）中に１時間を越える期間
浸した。その間、ゲルを、２００mlの０．２５M 塩酸中
で室温において１５分間インキュベートし、その後、蒸
留水ですすいだ。その後、ゲルを、２００mlの０．５M
水酸化ナトリウム、１M の塩酸ナトリウム中で、室温で
３０分間インキュベートし、その後、蒸留水ですすい
だ。その後、ゲルを、２００mlの１M トリスＨＣｌ、ｐ
Ｈ７．５、３M の塩化ナトリウム中で、室温で３０分間
インキュベートした。ゲルからニトロセルロースへのＤ
ＮＡの転移を、１８×ＳＳＣ（２．７M の塩化ナトリウ
ム、０．２７M のクエン酸ナトリウム）、１M の酢酸ア
ンモニウム中で、４℃において行った。６時間後、ニト
ロセルロースを除去し、１×ＳＳＣ（０．１５M の塩化
ナトリウム及び０．０１５M クエン酸ナトリウム）中
で、３０秒間洗浄した。ニトロセルロースフィルターを
空気乾燥させ、更に、その後、８０℃で２時間より長い
時間をかけて引圧乾燥させ、その後、室温に保存した。
【０１９７】Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼＤＮＡ
のゲル精製した４種類の断片（５′ポリメラーゼコーデ
ィング領域を表すbp１−１２７４；３′ポリメラーゼコ
ーディング領域を表すbp４７１８−５４３７；ＩＶＳ１
の一部分を表すbp２４４８−２８８２；及び、ＩＶＳ２
の一部分を表すbp３６６６−４２４２、からの１．３kb
のzEcoRI断片、Fig.６及び１５）を、ニューイングラン
ド バイオラボズ社のランダムプライマーキットを使用
して放射能ラベルした。各３５，５μl の容量である先
の鋳型ＤＮＡの１００ngを沸騰させた湯浴槽内で５分間
沸騰させ、その後、氷上で５分間冷却し、遠心で沈殿化
させた。鋳型ＤＮＡを、５０μl の総容量中に含まれる
１×ラベル用バッファー（ランダムなヘキサヌクレオチ
ド類を含む）、１／１０容量のｄＮＴＰ混合物、２５μ
Ｃｉのα32Ｐ ｄＣＴＰ、及び、５単位のＤＮＡポリメ
ラーゼＩ−クレノウ断片を用いて３７℃で１時間インキ
ュベートした。この反応を０．０１８M のＥＤＴＡで停
止した。プローブは、製造元の推薦する溶出条件に従
い、エルチップ ミニカラム（シュレイカー アンドシ
ュール社）を用いて精製した。カウント総数を、全ての
精製プローブについて算出した。１．３kbのEcoRI 断片
プローブ（bp１−１２７４）は２４×１０6cmp 、３′
ポリメラーゼプローブ（bp４７１８−５４３６）は２２
×１０6 cmp、ＩＶＳ１プローブは５４×１０6 cmp 、
及び、ＩＶＳ２プローブは４７×１０6 cmp を産生し
た。
【０１９８】ハイブリッド形成は、以下に示すように実
行した（Maniatis、上述）。ニトロセルロースフィルタ
ーを、５mlのハイブリッド形成バッファー（０．７５M
の塩化ナトリウム、０．１５M のトリス、１０mMのＥＤ
ＴＡ、０．１％のピロリン酸ナトリウム、０．１％のラ
ウリル硫酸ナトリウム、０．２％のウシ血清アルブミ
ン、０．２％のフィコール４００、０．２％のＰＶＰ、
及び、１００μg/mlの煮沸させたウシ胸腺ＤＮＡ）中
で、５０℃において３０分間インキュベートした。その
後、各ニトロセルロースフィルターを、５mlのハイブリ
ッド形成バッファー（０．０３％のウシ血清アルブミ
ン、０．０３％のフィコール４００、及び、０．０３％
のＰＶＰを除いては先のものと同様）を含む別々のバッ
グ内へ入れた。各区分を、２２−２５×１０6 cpm の変
成させたプローブと、５０℃で一晩ハイブリッド形成さ
せた。
【０１９９】ニトロセルロースフィルターをそのバッグ
から除去し、更に、０．１×ＳＥＴＷａｓｈ（１５mMの
ＮａＣｌ、３mMのトリス塩基、０．２mMのＥＤＴＡ、
０．１％のＳＤＳ、０．１％のピロリン酸ナトリウム、
及び、０．１M のリン酸バッファー）を用いて、４５℃
において３×３０分インキュベートした。このフィルタ
ーを湿潤させたままに保ち、サランラップで包み、４時
間から３日の範囲の様々な時間Ｘ線フィルムに露出し
た。
【０２００】結果をFig.１６に示した。Fig.６におい
て、パートＡからパートＤは、４重検証したサザンブロ
ットのオートラジオグラフィーである。ライン１−５は
EcoRIで切断したＤＮＡ。ライン６−１０はBamHI で切
断したＤＮＡ。ライン１及び６はピロコッカス ｓｐ．
のＧ−１−ＪのＤＮＡ；ライン２及び７はピロコッカス
ｓｐ．のＧ−１−ＨのＤＮＡ；ライン３及び８はＴ．リ
トラリスのＤＮＡ；ライン４及び９はピロコッカス ｓ
ｐ．のＧＢ−ＤのＤＮＡ；ライン５及び１０はＴ．リト
ラリスのＤＮＡ。ハイブリッド形成プローブは、以下に
示すとおりである：パートＡ、Ｔ．リトラリスＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子の５′コーディング領域、bp１−１２
７４；パートＢ、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子の３′コーディング領域、bp４７１８−５４３７；
パートＣ、部分的なＩＶＳ２のプローブ、bp３６６６−
４２４２；パートＤ、部分的なＩＶＳ２のプローブ、bp
２４４８−２８８２。パートＣとパートＤの上段及び下
段の写真は、各々、短時間及び長時間の露出の同一ブロ
ットである。
【０２０１】４つのブローブのいずれもＴａｑＤＮＡに
対してはハイブリッド形成しなかった。両方のポリメラ
ーゼのコーディング領域のプローブとも、サーモコッカ
ス及びピロコッカスＤＮＡの全てにおける特異的バンド
に対してハイブリッド形成したが、ＴａｑＤＮＡに対し
てはハイブリッド形成しなかった。両方のプローブを使
用して良好なシグナルが取得され、これは、Ｔ．リトラ
リスＤＮＡポリメラーゼのコーディング領域のアミノ及
びカルボキシ末端の両方が強く保存されていることを示
している。Ｔ．リトラリス及びピロコッカス ｓｐ．の
ＧＢ−Ｄのアミノ末端領域は約６９％相同であり（例え
ば、Fig.６及び１８を参照せよ）、かつ、蛋白質レベル
において非常に類似している（Fig.１９）。ＩＶＳ１の
プローブは、Ｔ．リトラリス及びピロコッカス ｓｐ．
ＧＢ−ＤのＤＮＡに対して強くハイブリッド形成し（１
５８２bp領域について約６３％相同）、かつ、ピロコッ
カス ｓｐ．Ｇ−１−ＨのＤＮＡに対しては弱くハイブ
リッド形成した。ＩＶＳ２プローブは、Ｔ．リトラリス
ＤＮＡに対しては強力にハイブリッド形成し、かつ、ピ
ロコッカス ｓｐ．Ｇ−１−ＨのＤＮＡに対しては弱く
ハイブリッド形成した。
【０２０２】実施例１５抗体レベルにおける古細菌ＤＮＡポリメラーゼの類似性 Ｔ．リトラリス、及び、ピロコッカス株の１mlの培養物
からのペレットを、１００μl の尿素溶菌バッファー
（４M の尿素、０．１２M のトリス、４％のラウリル硫
酸ナトリウム、１０％のβ−メルカプトエタノール、２
０％のグリセロール、及び、０．００２％のブロモフェ
ノールブルー）中に再懸濁し、更に、３分間煮沸した。
煮沸した試料を２５Ｇ５／８の注射針で剪断して試料の
粘性を低減させた。Ｔ．リトラリス、及び、ピロコッカ
ス株Ｇ−１−Ｊ及びＧ−１−Ｈの試料、及び、精製した
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌のＤＮＡポリメラー
ゼ、及び、ピロコッカス ｓｐ．（ＧＢ−Ｄ）から精製
したＤＮＡポリメラーゼの試料の２重検証としてのそれ
ぞれ１０μl を１０−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに
のせ、蛋白質流出バッファー（０．１％のラウリル硫酸
ナトリウム、０．１９M のグリシン、及び、０．０２５
M のトリス塩基）中で流出させた。ニトロセルロースフ
ィルター（４５μm ）を上流水中に５分間浸し、その
後、転移バッファー（０．１５％のエタノールアミン、
２０mMのグリシン、及び、２０％のメタノール）中に３
０分間浸した。ゲル上の蛋白質を転移バッファー（Towb
in、et al.、PNAS（1979） 76: 4350 −4354）中で、ニ
トロセルロースフィルター上に電気溶出させた（３０ボ
ルト、４℃で一晩）。
【０２０３】ニトロセルロースを除去し、ボールペンで
印を付け、ＴＢＳＴＴ（２０mMのトリス、１５０mMの塩
酸ナトリウム、０．２％のＴｗｅｅｎ２０、及び、０．
０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中で５分間洗浄し
た。このフィルターをＴＢＳＴＴ＋３％の脱脂粉乳（カ
ーネーション社）中で３０分間遮断し、３×３分間ＴＢ
ＳＴＴ内で洗浄した。坑−Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメ
ラーゼ抗血清を部分的に精製した天然のＤＮＡポリメラ
ーゼ調製物に対して作成した。Ｔ．リトラリスＤＮＡポ
リメラーゼ特異血清を、精製した天然酵素のウエスタン
ブロット切片上における親和性を利用する精製法により
調製した（Beall et al.、J. Immunological Methods 8
6:217 −233 （1983））。親和性を利用して精製した坑
−Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼマウス抗体（Ｖ７
６−２＋３）及び、モノクローナルな坑−Ｔａｑポリメ
ラーゼ抗体（ＴＢＳＴＴ中において１：１００に希釈し
たもの）を、各ニトロセルロースフィルターに対して別
々に、室温において５時間添加した。このフィルターを
ＴＢＳＴＴで３×３分洗浄し、その後、アルカリフォス
ファターゼ（プロメガ社）と複合化させた坑−マウス２
次抗体の１：７５００希釈物と、ＴＢＳＴＴ中で、室温
において１時間反応させた。このニトロセルロースフィ
ルターを、製造元（プロメガ社）による指示どうりに、
ＮＢＴ／ＢＣＩＰで展開した。Ｔａｑモノクローナルを
使用した結果をFig.１７に示した。Fig.１７は、親和性
を利用して精製した坑−Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラ
ーゼ抗体（パートＡ）、及び、坑−ＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼモノクローナル抗体（パートＢ）と反応させた、
Ｔ．リトラリス（Ｖ）、ピロコッカス ｓｐ．Ｇ−１−
Ｊ（Ｊ）、及び、ピロコッカス ｓｐ．Ｇ−１−Ｈ
（Ｈ）からの未精製溶菌液類、あるいは、ピロコッカス
ｓｐ．ＧＢ−Ｄ（ＤＶ）、Ｔ．アクアティクス
（Ｔ）、もしくは、大腸菌（Ｅ）からの精製したポリメ
ラーゼ類のウエスタンブロットである。矢印は、Ｔ．リ
トラリス及びピロコッカス ｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼ
蛋白質の位置を示す。パートＢにおける反応性はバック
グラウンド蛋白質に対するものであり、パートＡにおい
て見られるように、ＤＮＡポリメラーゼに対するもので
はない。
【０２０４】ＴａｑＤＮＡポリメラーゼに対して特異的
なモノクローナル抗体は、テストしたピロコッカス及び
セルモコッカス株からの蛋白質とは交差反応しない。
【０２０５】しかしながら、Ｔ．リトラリス及び３種類
のピロコッカス株からの、９０−９５，０００ダルトン
のＤＮＡポリメラーゼ蛋白質は、親和性を利用して精製
した坑−Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ抗体と反応
した。これは、Ｔ．リトラリス及びピロコッカス ｓ
ｐ．ＧＢ−ＤのＤＮＡポリメラーゼの間の高度な類似性
及び相同性の両方を考えれば、驚くべきことではない
（Fig.１９）。
【０２０６】Fig.１９は、組換えＴ．リトラリスの演繹
したアミノ酸配列の一部分と、組換えピロコッカス ｓ
ｐ．ＤＮＡポリメラーゼの部分的配列の比較である。ピ
ロコッカスＤＮＡポリメラーゼの演繹したアミノ酸を上
の列に記載し、組換えＴ．リトラリスＤＮＡポリメラー
ゼの演繹したアミノ酸配列を下の列に記載してある。総
同性を垂直な実線により示し、類似性を１つもしくは２
つの点で示し、非保存的置換はこの２つの配列間を空白
にして示してある。
【０２０７】実施例１６ 標的古細菌から組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを取
得する目的で、標的ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクロー
ニングするための様々な基本的方法を行うことができ
る。初めには、本発明の実施例１５において記載されて
いるように、坑−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼもしくは坑
−Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ血清を使用する、
精製したポリメラーゼ（未精製のポリメラーゼ溶菌液も
感度が低減するが使用することができる）のウエスタン
ブロット分析により、新しいポリメラーゼがPOL αもし
くはPol I 類の一員であるかどうかを免疫学的に決定す
る一ことを試みる（Fig.１７）。新しいポリメラーゼが
坑−Ｔａｑポリメラーゼモノクローナルと反応する場合
には、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼから作製され
た試薬を使用しては、恐らく簡単にはそれをクローン化
することはできない。新しいポリメラーゼが坑−Ｔ．リ
トラリス血清と交差反応する場合には、以下に示す方法
でそれをクローン化することができるはずである。新し
いポリメラーゼがいずれの血清とも反応しない場合に
は、この実験は結論を得ることができないものと考え
て、次の段階であるＤＮＡクロスハイブリッド形成へ進
むべきである。
【０２０８】至適プローブとＤＮＡとのハイブリッド形
成条件を、各新しい生物について実験的に決定する必要
がある。同時に、Ｔ．リトラリスプローブに対してハイ
ブリッド形成しかつ新しいポリメラーゼを充分コードす
るほど長い断片を産生する酵素を発見する目的で、新し
い生物からの様々な制限消化をテストする。
【０２０９】プローブ選択は、Ｔ．リトラリスＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子のサイズ及び領域に関連して変化する
ことがある。至適プローブを、大きめもしくは小さめの
ＤＮＡ断片、あるいは、オリゴマーさえ用いる、以下に
記載するような試験的なサザンブロットを行うことによ
り決定することができる。ＩＶＳ配列内に含まれるもの
に完全に由来するプローブを選択して、新しい古細菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子内のＩＶＳの存在を探索するこ
とができるか、あるいは、プローブは成熟したポリメラ
ーゼコーディング領域に限定されている可能性がある。
プローブとして完全なＴ．リトラリスＤＮＡポリメラー
ゼ遺伝子を使用することには数々の長所及び短所があ
る。主要な短所は、プローブが大きければ大きいほど、
非常に低い緊縮度において見せ掛けのハイブリッド形成
を産生しやすくなることである。より大きいプローブを
使用することの利点には、（１）それらが、ポリメラー
ゼのある小さな部分において、Ｔ．リトラリスＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子から主に分岐してきた他のポリメラー
ゼに対してクロスハイブリッド形成をよりしやすいこ
と、及び、（２）プローブがＴ．リトラリスＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子のアミノ及びカルボキシ末端にまたがる
ため、それらは、新しいポリメラーゼ遺伝子内に存在す
る内側の制限部位を検出しやすいことである。プローブ
選択の最初の段階においては、様々な制限酵素を使用し
て、新しい古細菌からのＤＮＡを開裂し、Ｔ．リトラリ
スＤＮＡポリメラーゼプローブに対してハイブリッド形
成しかつ新しいポリメラーゼを充分コードするほど長
い、好ましくは一つもしくはせいぜい２つのバンドを産
生する、一つもしくは複数の酵素を発見することが重要
である。新しいポリメラーゼに必要な最小のコーディン
グ配列を、ウエスタンブロットにより（希望であれば、
ＩＶＳについての因子を仮定して）、あるいは、最初の
近似として４KBを上回るものを推測することにより決定
される新しいポリメラーゼのサイズから概算することが
できる。最大断片サイズは、希望するベクターのクロー
ニング能により限定される。
【０２１０】至適ハイブリッド形成条件は、様々な洗浄
温度において試験的なサザンブロットを行うことにより
実験的に決定する。ハイブリッド形成は、５０℃におい
て、４×ＳＥＴ、０．１M のリン酸ナトリウム、ｐＨ
７、０．１％のピロリン酸ナトリウム、０．１％のＳＤ
Ｓ、１×デンハート溶液中で行うが、任意の低緊縮性ハ
イブリッド形成条件も適当である（Maniatis）。洗浄条
件は、３７−５５℃まで変化し、３×３０分、０．１×
ＳＥＴ洗浄液（１５mMのＮａＣｌ、３mMのトリス塩基、
０．２mMのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ、０．１％のピ
ロリン酸ナトリウム、及び、０．１mMのリン酸バッファ
ー）を用いるが、任意の低緊縮性洗浄条件を使用するこ
ともできる。本実験パートの要点は、プローブをハイブ
リッド形成させ、更に、サザンブロットを低緊縮度で洗
浄して、非特異的クロスハイブリッド形成を含むことさ
えあるクロスハイブリッド形成のある程度のレベルを保
証することである。次には、洗浄の緊縮度を上昇させる
が、それは例えば、洗浄温度を３−５℃増大させ、その
後、オートグラフィー上のシグナルの減少により決定さ
れるハイブリッド形成したプローブの消失を記録する。
最初には、低緊縮度においてプローブに対してハイブリ
ッド形成している多数のバンドを観察することが期待さ
れる。洗浄の緊縮度を増大させるにつれて、弱くハイブ
リッド形成している配列が解離し、オートラジオグラフ
から消失する。洗浄の緊縮度を増大させるにつれて、一
本もしくは数本のみのバンドが依然としてプローブに対
してハイブリッド形成するところで条件が確立する。こ
れらがこれからの実験において使用すべき条件である。
緊縮度がこの点を越える時点で全てのハイブリッドシグ
ナルが消失する。目的は、全てのハイブリッド形成シグ
ナルが消失鶴以前に、消化物当たり一本もしくは数本の
バンドが依然としてハイブリッド形成する最も緊縮度の
高い条件を決定することである。
【０２１１】巨大なＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子断片を用いる最初のプローブ選択が、どのような
ハイブリッド条件を用いても鮮明なパターンを生じない
場合には、プローブサイズとハイブリッド形成条件の良
好な協力関係が得られるまで小さめのプローブをテスト
することができる。それに代わる方法として、本発明の
実施例１４は、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝
子（アミノ末端、ＩＶＳ１、ＩＶＳ２、及び、カルボキ
シ末端、Fig.１５及び１６）の様々な領域に広がる多数
の断片を、別々ではあるが、同時に並行してテストする
サザンブロットに使用することができることを示してい
る。
【０２１２】至適制限消化物でライブラリーを作製し、
更に、至適化させたプローブとハイブリッド形成させ
る。並行して行われる方法は、発現ベクター内へクロー
ン化させ、更に、坑−Ｔ．リトラリス抗血清で直接スク
リーニングすることである。いずれかのプライマー法
が、活性もしくは不活性産物を産生することができる。
活性ポリメラーゼが検出されない場合には、挿入断片の
サイズ及び坑−Ｔ．リトラリス血清に対する反応性につ
いてそのクローンをチェックする。坑−Ｔ．リトラリス
血清に対する反応性が何ら存在しない場合には、ポリメ
ラーゼは、大腸菌内におけるそれ自身の調節配列からは
発現されないことがあってよく、かつ、プラスミド挿入
断片の配列を決定して、大腸菌のプロモーター及び恐ら
くは翻訳シグナルに対して新しいポリメラーゼを遺伝子
操作を利用して結合する必要がある。
【０２１３】本発明において我々は、Ｔ．リトラリス及
びピロコッカス ｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の両
方におけるPol α保存領域モチーフ内のイントロンも
しくは介在配列を同定した。そのため、我々は、他の古
細菌ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が保存されているモチー
フ内においてもイントロンを有することができると予測
している。新しいポリメラーゼクローンが不活性である
場合、介在配列の存在についてチェックするべきであ
る。これらのイントロンは２つの方法において同定する
ことができる。これらのイントロンがＴ．リトラリス及
びピロコッカスｓｐ．のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子内に
発見されるイントロンに関連している場合には、これら
を、Ｔ．リトラリス及びピロコッカス ｓｐ．のＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子のイントロン配列に由来するＤＮＡ
プローブに対する、低緊縮度のハイブリッド形成により
同定することができる。ＩＶＳが発見される場合、この
クローンの配列を決定してＩＶＳの除去のための対策を
開発する。クローンが不活性であり、かつ、クロスハイ
ブリッド形成するＩＶＳが発見されない場合には、プラ
スミドの配列を決定して新しいＩＶＳを探し出す。古細
菌ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の配列をＤＮＡレベルにお
いて決定し、更に、その配列を、（１）他のＤＮＡポリ
メラーゼと比較して非類似区分を同定し、（２）保存さ
れているモチーフと比較して領域Ｉ−ＶＩのうちの存在
していないものを突き止め、次に、存在していない領域
における分断点を同定する。一度同定しさえすれば、イ
ントロンを、当業者にしられている任意の多数の技術に
より、インビトロにおいて除去することができ、これら
の方法の内の幾つかは、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子からのＩＶＳ１及びＩＶＳ２の除去に関する
本方法内に記載されている。
【０２１４】最初のライブラリースクリーニングが、活
性な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを合成するクローンを
産生しないが、（１）ＤＮＡレベルにおけるクロスハイ
ブリッド形成、（２）抗体レベルにおける交差反応性、
及び、（３）ＤＮＡ配列もしくは演繹したアミノ酸配列
レベルにおける他のＤＮＡポリメラーゼとの類似性、に
より決定される部分的な遺伝子クローンを結果として生
じる場合、より多い量のゲノムサザンブロットを最初の
クローンで探索して、次のライブラリーを作製するため
に選択するべき制限酵素を同定する。第２ライブラリー
は、完全なポリメラーゼ遺伝子をより含んでいそうなよ
り大きい断片を含むべきである。このライブラリーを、
抗体、あるいは、好ましくは、最初の新しいポリメラー
ゼからクローン化した配列のいずれかを使用してスクリ
ーニングする。結果として陽性になるものを熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性についてチェックする。この第２
回目において活性な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが検出
されない場合には、介在配列をクロスハイブリッド形成
及びＤＮＡ配列決定によりスクリーニングすることがで
きる。ＤＮＡ配列決定によっても、ポリメラーゼの読み
取り枠内において、全ての保存されたポリメラーゼモチ
ーフ及び停止コドンの存在を立証することにより、果た
してそのクローン化した遺伝子が完成されたものである
か否かが示される。最終的に活性な熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼをクローニングする前には、数回のスクリーニ
ング及び再スクリーニングが必要である。
【０２１５】先のスクリーニング及び再スクリーニング
法は、遺伝子内に存在する毒性要素のために、新しい熱
安定性ポリメラーゼ遺伝子をクローニングするのに充分
なものでないことがあってよい。この場合には、ＤＮＡ
もしくは蛋白質レベルにおける交差反応性がクローニン
グの卓越した方法であり、それは、一部分のみの不活性
産物を最初にクローニングすることができ、その後に完
全な遺伝子をクローニングすることができるためであ
る。先に概要を記載した手法を使用しては、完全な遺伝
子を取得することが簡単でない場合には、クローン化さ
せる場合に非常に有毒であるＩＶＳ２のような介在配列
の存在を探索するべきである。これは、ポリメラーゼク
ローン内の欠損及び配列転位の探索、あるいは、既知の
有毒なＴ．リトラリス配列の探索のいずれかにより行わ
れる。２重検証でのサザンブロットをポリメラーゼのコ
ーディング領域及びＩＶＳ配列で探索して、ポリメラー
ゼのコーディング領域に近位する有毒なＩＶＳの位置を
決定する。配列転位もしくは有毒なＩＶＳを発見した場
合、適切な対策は、最初に遺伝子操作を利用してポリメ
ラーゼのアミノ末端を本出願において記載されているよ
うな強力に調節されている発原型に対して結合させるこ
とである。一度成功すれば、ポリメラーゼ遺伝子の残り
の部分をクローン化し、更に、アミノ末端に接続して、
Ｔ．リトラリスＩＶＳ２配列のような有毒な要素の発現
を低減させることができる。これに代わる方法として、
ポリメラーゼ遺伝子のクロスハイブリッド形成させたサ
ブフラグメントを単離し、ハイブリッド形成もしくはＤ
ＮＡ配列決定によりＩＶＳについてチェックすることが
できる。ＩＶＳは、当業者にしられている方法により、
これらの領域からインビトロにおいて除去することがで
きる。その後、有毒な要素を既に除去してあるサブフラ
グメントの結合により、完全なポリメラーゼ遺伝子を作
製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Fig.１Ａは、実施例１のＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲルの電気泳動の写真である。
【図２】Fig.１Ｂは、Fig.１Ａにおけるゲルのライン２
から溶出された蛋白質のポリメラーゼ活性及びエキソヌ
クレアーゼ活性を示すグラフである。
【図３】Fig.２は、バクテリオファージＮＥＢ６１９の
BamHI 断片内に完全に含まれるＴ．リトラリスＤＮＡポ
リメラーゼをコードする遺伝子を含むXba 断片の制限部
位地図である。
【図４】Fig.３Ａ及びFig.３Ｂは、それぞれ、天然及び
組換えＴ．リトラリスＤＮＡの半減期を示すグラフであ
る。
【図５】Fig.３Ａ及びFig.３Ｂは、それぞれ、天然及び
組換えＴ．リトラリスＤＮＡの半減期を示すグラフであ
る。
【図６】Fig.４は、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ
及びクレノウ断片の、デオキシヌクレオチドの存在もし
くは不在に対する反応を示すグラフである。
【図７】Fig.５は、天然のＤＮＡ（ＮＥＢ６１９のBamH
I 断片）及び大腸菌ＮＥＢ６７１とＮＥＢ６８７におけ
るＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の体制を示
す制限部位地図である。
【図８】Fig.６は、１．３kb、１．６kb、及び、１．９
kbのEcoRI 断片、及び、EcoRI/BamHI 断片の一部を含
む、バクテリオファージＮＥＢ６１９の１４kbのBamHI
制限断片の部分的なヌクレオチド配列である。
【図９】Fig.６は、１．３kb、１．６kb、及び、１．９
kbのEcoRI 断片、及び、EcoRI/BamHI 断片の一部を含
む、バクテリオファージＮＥＢ６１９の１４kbのBamHI
制限断片の部分的なヌクレオチド配列である。
【図１０】Fig.６は、１．３kb、１．６kb、及び、１．
９kbのEcoRI 断片、及び、EcoRI/BamHI 断片の一部を含
む、バクテリオファージＮＥＢ６１９の１４kbのBamHI
制限断片の部分的なヌクレオチド配列である。
【図１１】Fig.６は、１．３kb、１．６kb、及び、１．
９kbのEcoRI 断片、及び、EcoRI/BamHI 断片の一部を含
む、バクテリオファージＮＥＢ６１９の１４kbのBamHI
制限断片の部分的なヌクレオチド配列である。
【図１２】Fig.６は、１．３kb、１．６kb、及び、１．
９kbのEcoRI 断片、及び、EcoRI/BamHI 断片の一部を含
む、バクテリオファージＮＥＢ６１９の１４kbのBamHI
制限断片の部分的なヌクレオチド配列である。
【図１３】Fig.７は、ＤＮＡポリメラーゼの共通相同領
域ＩＩＩにおけるアミノ酸とＴ．リトラリスの相同群Ｉ
ＩＩのアミノ酸との比較である。
【図１４】ベクターpPR969の説明図である。
【図１５】ベクターpCAS4の説明図である。
【図１６】ベクターV174−1B1 の説明図である。
【図１７】Fig.１１は、検出可能な３′から５′方向へ
のエキソヌクレアーゼ活性をもたない、実施例６におい
て作製したＴ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ変異体を
説明するグラフである。
【図１８】Fig.１２は、実施例ＩＩＩにおいて使用され
るプライマーのヌクレオチド配列である。
【図１９】Fig.１３Ａは、EcoRI （ライン３）、 BamHI
（ライン４）、 HindIII（ライン５）で切断したピロコ
ッカス ｓｐ．ＤＮＡの、臭化エチジウムで染色したア
ガロースゲルの電気泳動の写真である。ライン１は、マ
ーカーとしての、HindIIIで切断したλＤＮＡであり、
ライン２は、マーカーとしてのpBI322である。Fig.１３
Ｂは、Fig.１３Ａにおける同一ゲルの、サザンハイブリ
ッド形成のオートラジオグラフィーの電気泳動の写真で
ある。32Ｐ−ＤＮＡプローブは、Ｔ．リトラリスＤＮＡ
ポリメラーゼのアミノ末端部分をコードする、１．３kb
のEcoRI 断片から調製した。BamHI で切断したピロコッ
カス ｓｐ．ＤＮＡがそのプローブで約４−５kbの単一
なバンドを生じることに注目せよ。HindIII で切断した
λＤＮＡの２３kbのバンドがフィルム上に示されるとい
う事実は、そのバンド中に存在する大量のＤＮＡに対す
る非特異的なハイブリッド形成のためである。プラスミ
ドpBR322が照らしだされているという事実は、プローブ
内の相同な配列のためである。
【図２０】Fig.１４は、大腸菌２２７０（ＮＥＢ＃７２
０）のpUC19 プラスミド内のピロコッカス ｓｐ．ＤＮ
Ａポリメラーゼを含む遺伝子を含む、４．８kbのBamHI
断片の制限部位地図である。
【図２１】Fig.１５は、他の標的古細菌についてのＤＮ
Ａの類似性を分析するために使用したプローブを説明し
ている。
【図２２】Fig.１６は、Ｔ．リトラリス及びピロコッカ
ス ｓｐ．のＤＮＡに対してプローブがハイブリッド形
成するが、Ｔ．アクアティクスのＤＮＡに対してはハイ
ブリッド形成しないことを説明する、実施例１４におい
て記載した４重検証のサザンブロットのオートラジオグ
ラフィーの電気泳動の写真である。
【図２３】Fig.１６は、Ｔ．リトラリス及びピロコッカ
ス ｓｐ．のＤＮＡに対してプローブがハイブリッド形
成するが、Ｔ．アクアティクスのＤＮＡに対してはハイ
ブリッド形成しないことを説明する、実施例１４におい
て記載した４重検証のサザンブロットのオートラジオグ
ラフィーの電気泳動の写真である。
【図２４】Fig.１７は、親和性を利用して精製した坑−
火道ＤＮＡポリメラーゼ抗体（パートＡ）、もしくは、
坑−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ抗体（パートＢ）と反応
させた、Ｔ．リトラリス（Ｖ）、ピロコッカス ｓｐ．
Ｇ−Ｉ−Ｊ（Ｊ）、ピロコッカス ｓｐ．Ｇ−Ｉ−Ｈ
（Ｈ）からの未精製溶菌液、あるいは、ピロコッカスｓ
ｐ．ＧＢ−Ｄ（ＤＶ）、Ｔ．アクアティクス（Ｔ）、も
しくは、大腸菌（Ｅ）からの精製したポリメラーゼのウ
エスタンブロットの電気泳動の写真である。矢印は、
Ｔ．リトラリス及びピロコッカス ｓｐ．のＤＮＡポリ
メラーゼ蛋白質の位置を示す。パートＢにおける反応性
はバックグラウンドの蛋白質に対するものであり、パー
トＡにおいて示されるようなＤＮＡポリメラーゼに対す
るものではない。
【図２５】Fig.１８は、ピロコッカス ｓｐ．ＤＮＡポ
リメラーゼをコードする遺伝子の部分的なＤＮＡヌクレ
オチド配列である。
【図２６】Fig.１８は、ピロコッカス ｓｐ．ＤＮＡポ
リメラーゼをコードする遺伝子の部分的なＤＮＡヌクレ
オチド配列である。
【図２７】Fig.１９は、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラ
ーゼに対するピロコッカス ｓｐ．のＤＮＡポリメラー
ゼの演繹したアミノ酸配列の比較である。
【図２８】Fig.１９は、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラ
ーゼに対するピロコッカス ｓｐ．のＤＮＡポリメラー
ゼの演繹したアミノ酸配列の比較である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 フランシーン・パーラー アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02146、ブルツクリン、フラー・ストリー ト・74・エイ (72)発明者 レベツカ・クセラ アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01915、ビバリー、ネプチユーン・ストリ ート・29 (72)発明者 ウイリアム・イー・ジヤツク アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01984、ウエーナム、メイフラワー・ドラ イブ・31

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Fig.６のヌクレオチド配列もしくはその
    一部分、Fig.６のヌクレオチド１から１２７４まで、Fi
    g.６のヌクレオチド１２６９から２８５６まで、及び、
    Fig.６のヌクレオチド２８５１から４７７１までからな
    る群から選択されるヌクレオチド配列に対してハイブリ
    ッド形成するＤＮＡ配列によりコードされている、古細
    菌からの組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
  2. 【請求項２】 Fig.６のヌクレオチド配列の一部分が少
    なくとも約２０ヌクレオチド分の長さである、請求項１
    の組換え熱安定性ポリメラーゼ。
  3. 【請求項３】 Fig.６のヌクレオチド配列の部分が少な
    くとも約５０ヌクレオチド分の長さである、請求項１の
    組換え熱安定性ポリメラーゼ。
  4. 【請求項４】 Fig.６のヌクレオチド配列の部分が少な
    くとも約１５０ヌクレオチド分の長さである、請求項１
    の組換え熱安定性ポリメラーゼ。
  5. 【請求項５】 Ｔ．リトラリス（T. litoralis）のＤＮ
    Ａポリメラーゼに対する抗原特異性を有する抗体プロー
    ブに対してハイブリッド形成する、古細菌からの組換え
    熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
  6. 【請求項６】 実施例１の組換え熱安定性ＤＮＡポリメ
    ラーゼをコードする、単離されたＤＮＡ。
  7. 【請求項７】 請求項６の単離されたＤＮＡを含むクロ
    ーニングベクター。
  8. 【請求項８】 請求項７のベクターにより形質転換させ
    られた宿主細胞。
  9. 【請求項９】 古細菌からの組換え熱安定性ＤＮＡポリ
    メラーゼを産生させるための方法であって、そのＤＮＡ
    ポリメラーゼの発現に適する条件下において、請求項７
    のベクターで形質転換させた宿主細胞を培養することを
    含む、上記方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１の古細菌熱安定性ＤＮＡポリ
    メラーゼをコードするＤＮＡ配列に対してハイブリッド
    形成するＤＮＡプローブであって、このＤＮＡプローブ
    が、Fig.６のヌクレオチド配列もしくはその一部分、Fi
    g.６のヌクレオチド１から１２７４まで、Fig.６のヌク
    レオチド１２６９から２８５６まで、及び、Fig.６のヌ
    クレオチド２８５１から４７７１までからなる群から選
    択される、上記ＤＮＡプローブ。
  11. 【請求項１１】 請求項１０のＤＮＡプローブであっ
    て、Fig.６のヌクレオチド配列の一部分が少なくとも約
    ２０ヌクレオチド分の長さである、上記ＤＮＡプロー
    ブ。
  12. 【請求項１２】 請求項１０のＤＮＡプローブであっ
    て、Fig.６のヌクレオチド配列の一部分が少なくとも約
    ５０ヌクレオチド分の長さである、上記ＤＮＡプロー
    ブ。
  13. 【請求項１３】 請求項１０のＤＮＡプローブであっ
    て、Fig.６のヌクレオチド配列の一部分が少なくとも約
    １５０ヌクレオチド分の長さである、上記ＤＮＡプロー
    ブ。
  14. 【請求項１４】 以下の段階： （ａ）古細菌からゲノムライブラリーを形成すること； （ｂ）適切な宿主細胞を、段階（ａ）からのライブラリ
    ーで形質転換もしくはトランスフェクトさせること； （ｃ）形質転換もしくはトランスフェクトさせた宿主細
    胞からのＤＮＡを、Fig.６のヌクレオチド配列もしくは
    その一部分、Fig.６のヌクレオチド１から１２７４ま
    で、Fig.６のヌクレオチド１２６９から２８５６まで、
    及び、Fig.６のヌクレオチド２８５１から４７７１まで
    からなる群から選択されるＤＮＡプローブと接触させる
    こと； （ｄ）そのＤＮＡプローブに対してハイブリッド形成す
    る、段階（ｃ）の形質転換もしくはトランスフェクトさ
    せた細胞を、ＤＮＡポリメラーゼ活性についてアッセイ
    すること；及び、 （ｅ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ
    断片を単離すること、を含む、古細菌からの熱安定性Ｄ
    ＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを単離するための
    方法。
  15. 【請求項１５】 以下の段階： （ａ）古細菌からゲノムライブラリーを形成すること； （ｂ）適切な宿主細胞を、段階（ａ）からのライブラリ
    ーで形質転換もしくはトランスフェクトさせること； （ｃ）形質転換もしくはトランスフェクトさせた宿主細
    胞からの抽出物を、Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼ
    についての特異的親和性を有する抗体プローブと接触さ
    せること； （ｄ）その抗体プローブに交差反応する、段階（ｃ）の
    形質転換もしくはトランスフェクトさせた細胞を、ＤＮ
    Ａポリメラーゼ活性についてアッセイすること；及び、 （ｅ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ
    断片を単離すること、を含む、古細菌からの熱安定性Ｄ
    ＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを単離するための
    方法。
  16. 【請求項１６】 以下の段階： （ａ）請求項１４もしくは１５の単離されたＤＮＡ中の
    任意の介在ヌクレオチド配列を同定しかつ位置を決定す
    ること；及び、 （ｂ）この単離されたＤＮＡから介在ヌクレオチド配列
    を除去すること、を含む、古細菌からの熱安定性ＤＮＡ
    ポリメラーゼの発現を増加させる方法。
  17. 【請求項１７】 古細菌がＴ．リトラリスを含む、請求
    項１６の方法。
  18. 【請求項１８】 介在ヌクレオチド配列が、ＩＶＳ１、
    ＩＶＳ２、もしくは、ＩＶＳ１とＩＶＳ２の群から選択
    される、請求項１７の方法。
  19. 【請求項１９】 Ｔ．リトラリスＤＮＡポリメラーゼを
    コードするＤＮＡ配列からのイントロンをコードするＤ
    ＮＡプローブを用いて、介在ヌクレオチド配列の同定及
    び位置を決定する、請求項１６の方法。
  20. 【請求項２０】 ＤＮＡプローブが、ヌクレオチド１７
    ７６から３３８９までもしくはその一部分を含むFig.６
    の１６１４ｂｐのヌクレオチド配列、及び、ヌクレオチ
    ド３５４４から４７０３もしくはその一部分を含むFig.
    ６の１１７０ｂｐのヌクレオチド配列からなる群より選
    択される、請求項１９の方法。
  21. 【請求項２１】 位置１６４及び２４１１において二重
    らせんのデオキシヌクレオチド酸pBR ３２２を切断す
    る、Ｔ．リトラリスから取得することができる熱安定性
    エンドヌクレアーゼ。
  22. 【請求項２２】 約３３，０００−３７，０００の分子
    量を有する、請求項２１のエンドヌクレアーゼ。
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