DE547920T1 - Rekombinante thermostabile DNA-Polymerase von Archaebakterie. - Google Patents

Rekombinante thermostabile DNA-Polymerase von Archaebakterie.

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DE547920T1
DE547920T1 DE92311622T DE92311622T DE547920T1 DE 547920 T1 DE547920 T1 DE 547920T1 DE 92311622 T DE92311622 T DE 92311622T DE 92311622 T DE92311622 T DE 92311622T DE 547920 T1 DE547920 T1 DE 547920T1
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DE
Germany
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dna
nucleotides
nucleotide sequence
dna polymerase
polymerase
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DE92311622T
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Donald G Comb
William E Jack
Rebecca Kucera
Francine Perler
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New England Biolabs Inc
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New England Biolabs Inc
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria

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Claims (22)

92311622.2 M:NE2713A1 New England Biolabs Inc. Patentansprüche
1. Rekombinante wärmestabile DNA Polymerase aus Archaebakterien, welche codiert wird durch eine DNA-Sequenz, die mit einer Nukleotidsequenz hybridisiert, welche ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus:
der folgenden Nukleotidsequenz:
M WB 2? 4$ A4
GAATTCGCGA
TAAAATCTAT
CSTTITTCÄA
TTTCAAäAAC
GTAAGCATGA
GCCAAACCTC
CCGCTAACCC
TCTTGAAAAC
TCTCTCCAAA
TCTGTCCTTC
ATGAAAGCTC
ATGAGGGTCA
GTATATCTGC
AATGAGTTCG
TGAAGGGTTA
TTCTGTAGAa
CäACTCCATG
ATITTCGATT
TGGATGGGGG
&Tgr;&Tgr;&Tgr;&Agr;&Agr;&Agr;&Lgr;&Lgr;&Tgr;&Tgr;
TGGCGGAACT
&Tgr;&Tgr;&Ggr;&Agr;&Tgr;&Tgr;&Ggr;&Agr;&Agr;&Tgr;
TTGAACTCCA
GnTATATCT
GGTGGTATTT
ATGATACTGG
ACACTGATTA
CATAACAAAA
GATGGCAAGC
(213VTAATCCG
AAAG
AAAGAGTACG
GGGAGTTTAA
AAIAGAACTT
GACCCTCATT
TTCAGCCCTA
TATATATGCT
CTTCTCAAAG
TATTGAGGAG
ATAAAGGCAA
TAAAGGGCGA
GAGACATGGA
AAAACTGTGA
GAGTGCTCGA.
TGCAGTGAAA
GTCAGGAAAA AAGGGAAGTT
AäTTTTTGGG
GAAGTCTGGA
CGAGCATCCC
CAAGACGTTC
CAGCTATGCG
GGGCAAAATA
AGGGAACATC
CAGCTGTGGT
AGGGCTTGAT
TGACATTTAC
GAATATGACA
CTCAIAGACA
TCCCATGGr-G
GGAGACGAGG
AGCTTAAGCT
GATATTGAAA
CCTTGCCTTT
AATAATGATT
TGAGGGAGAT
GAATTTGGAA
AGGGCSAGAT
ATCACATGGA
AAAATATCGA
ATGAAGAAGA
GGCCAGAGTA TGTTAAAGAA
ATAAAGCGTT
TGTCCAATGA
AAGAGAAATG
GTATCTCATA
GGGGACAATT
AACTTACAAT
ATGTGATAAT
ACATCCCGAA
GGGACAAAGA
TCAAGGGXAG
GrTCTTAGGAA
AAAAGCTGGG
AGTTCGGCTT
AATCCACTTT
GCTGTGGAAA
TGAIAGTTTT
AGAGGATGGG
GrCGATGTTG AAAGACCCCG AAACGGGCAG CCCAr1GATTC
GATCTTTTCC
120 ISO 240
300 360 420 4S0 540 600 650 720 7S0 840 900 960 1020 1080
FIG.6-
AACCTCCCAA aSTATACGCT TGAGGCAGTT TATGAAGCAG 1140
AAATTTvGGAG CAGAGGAAAT TGCCGCTATA TGGGAAACAG 1200
GCCCAGTACT CAATGGAAGA TGCTAGGGCA ACX3 1I1A1I1CaAGC 1260
ATGGAAGCTG AGCTGGCAAA GCTGATAGGT CAAAGTGTAT 1320
ACCGGCAACC TCGTGGAGTG GTAlUrriTA AGGGTGGCAT 1380
CCGAACAAAC CTGATGAGGA AGAGTATAAA CGGCGCTTAA 1440
TATGTAAAAG AGCCAGAAAA AGGTTTGTGG GAAAATATCA 1500
CTGTACCCTT CAATAATAGT TACTCACAAC GTATCCCCAG 1560
TTTATTCCCT CCATACTCGG GGACTTAATT GCAATGTvGGC 1650
AAATCCACAA TTGACCCGAT CGAAAAGAAA ATGCTCGATT 1740
TTGCTTGCAA AOGCATCTT ACCCAACGAG TGGTTTvCCAA ISOO AAATTCGTGA AAATTGGCGA GTTTATAAAC TCTTACATGG · 1360
AAAACAGTAG AGAATACTGA AGTTCTCGAA GTAAACATvCC 1920
AAAAAAATCA AAGAAAGTGA AGTCAAAATvA GTCAATvGCCC 19S0
GGGAAAGCTT ATGAGATTCA GrTTTvGCTCT GGTAGAAAAA 2040
AGTCTGTTTA CAGTTAGAAA TGGAGAAATA AAGGT-TvGTTT 2100
GGTGACCTTA TTGTAGCACC ATvAGAAAATT AAACTCT-TvTG 2160
ATTCCCGTvGT TTvATCTCAGA TCTTTCCGAG GAAGAAACAG 2220
CTTCTTTAAA GGATvTGCTGA 2230
GATAAAAGAA
AAGCATAAAC
GATGACGATT TCAGCCAAGG GCAGAAAGAA
FIG.6-2
GAACITTAAG GTGGATGTTT GGAGAAGAAA ATAGAAGGAT AAGAACATIT AATCGCTATT
TGTTCCATCT CGAAAAACTA GGCCTTATCA AACTACTGCC CCGCGGAIAT GAAGTTACTG
ACTGGGAGAG ATTAAAGAAA TATAAACAAC TTTACGAGAA GCTTGCTGGA AGCGTTAAGT
ACAACGGAAA CAAGAGAGAG TATTTAGTAA 'IUl1I1CAACGA GATCAAGGAT ITiLATATCTT
ACTlUJtJACA AAAAGAGCTC GAAGAATGGA AAATTGGAAC TCTCAATGGC TTTAGAACGA
ATTGTATTCT CAAAGTCGAT GAGGATTTTG GGAAGCTCCT AGGTTACTAT GTTAGTGAGG
GCTATGCAGG TGCACAAAAA AATAAAACTG GTGGTATCAG TTATTCGGTG AAGCTTTACA
ATGAGGACCC TAATGTTCTT GAGAGCATGA AAAATGTTGC AGAAAAATTC TTTGGCAAGG
TTAGAGTTGA CAGAAATTGC GTAAGTATAT CAAAGAAGAT GGCATACTTA GTTATGATAT
GCCTCTGTGG AGCSTTAGCC GAAAACAAGA GAATTCCTTC TGTTATACTC ACCTCTCCCG
AACCGGTACG GTGGTCATTT TTAGAGGCGT ATTITACAGG CGATGGAGAT ATACATCCAT
CAAAAAGGTT TAGGC^CTCA ACAAAAAGCG AGCTCCTTGC AAATCAGCTT GTtTrTCTTGC
TGAACTCTTT GGGAATATCC TCTGTAAAGA TAGGCTTTGA CAGTGGGGTC TATAGAGTGT
ATATAAATGA AGACCTGCAA TTTCCACAAA CGTCTAGGGA GAÄAAACACA TACTACTCTA
ACTTAATTCC CAAAGAGATC (TTTAGGGACG TGTTTGGAAA AGAGTTCCAA AAGAACATGA
CGTTCAAGAA ATITAAAGAG CTTGTTGACT CTGGAAAACT TAACAGGGAG AAAGCCAAGC
'1GAGTT CITCATTAAT GGAGATATTG TCCTTGACAG AGTCAAAAGT GTTAAAGAAA
AGGACTATGA AGGGTATGTC TATGACCTAA GCGTTGAGGA TAACGAGAAC xi-i'w-.-vjj.-iG
' GCTCTATGCT CACAACAGCT ATTACGGCTA TATGGGGTAT CCTAAGGCAA
GATGGTACTC GAAGGAATGT GCTGAAAGCG TTACCGCATG GGGGAGACAC TACATAGAGA
2340 2400 2460
2S20 2S30 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3130 3240 3300 3360 3420 3430
FIG.6-3
TGACGATAAG AGAAATAGAG GAAAAUTICu GCnTAAGGT IX-TITATGCG GACAGTGTCT CAGGAGAAAG TGAGATCATA ATAAGGCAAA ACGGAAAGAT TAGATTTGTG AAAATAAAGG
ATcrrrrcTC TAAGGTGGAC tacagcattg gcgaaaaaga atactgcatt ctcgaaggtg
TTGAAGCACT AACTCTGGAC GATGACGGAA AGCTTGTCTg GAAGCCCGTC CCCTACGTGA TGAGGCACAG AGCGAATAAA AGAATGTTCC GCATCTGGCT GACCAACAGC TGGTATATAG ATGTTACTGA GGSTCATTCT CTCATAGGCT ATCTAAACAC GTCAAAAACG AAAACTGCCA AAAAAATCGG GGAAAGACTA AAGGAAGTAA AGOCTTTTGA ATTAGGCAAA GCAGT7AAAT OGCTCATATG CCCAAATGCA CCGTTAAAGG ATGAGAATAC CAAAACTAGC GAAATAGCAG TAAAATTCTG GGAGCTCGTA GGAXHjATTG TAGGAGATGG AAACTGGGGT GGAGATTCTC GTTGGGCAGA GGAAA CAGGCAAAGA TGCAGAAGAG ATAAAGCAAA AACTTCTGGA ACCCCTAAAA ACTTATGGAG TAATCTCAAA CTATTäCCCA AAAAACGAGA AAGGGGACTT CAACATCTTG GCAAAGAGCC TTGTAAAGTT TATGAAAAGG OCTTTr-J1GG ACGAAAAAGG AAGACGAAAA ATTCCAGAGT TCATGTATGA GCTTCCGGTT ACTTACATAG AGGCATTTCT ACGAGGACTG TITTCAGCTG ATGGTACTGT AACTATCAGG AAGGGAGTTC
GCTAACAAAC ATTGATGCTG AAG GGTuAGTAAGG AAGCTTCTGT GGATTGTTGG AATTTCAAAT TCAATATTTG CTGAGACTAC TCCAAATCGC TACAATGCTG TTTCTACTGG AACCTACTCA AAGCATCTAA GGATCAAAAA l^GTGGCGT TTTGCTGAAA GGATTiGGCTT TTTAATCGTvG AGAAAGCAGA AGAGACTTTT AGTu1VZATTTA AAATCAGCGA GGGTAAAAAG GAAIACCATA GA1 1GCT TTGATCTTGT GCATGTGAAA AAAGTCGAAG
3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4250 4320 4380 4440 4S00 4S60 4620
FiG.6-4
°) 2 JI&EEacgr; 22. Z
AGAXACCAXA. CGaGGOTrAC GTTTAXGACA TTGAAGTCGA. AGAGACGCäT AGGTDCTITG CAAACAACAX CCTGGTACAC AATACTGACG GCTTITATGC CACAATACCC GGGGAAAAGC CTGAACTCAT TAAAAAGAAA GCCAAGGAAT TCCTAAACTA CÄTAAACTCC AAACTTCCAG GTCTGCTTGA GCTTGAGTAT GAGGGCnTT ACTTGAGAGG ATTCTTTGTT ACAAAAAAGC GCTATGCAGT CATAGATGAA GAGGGCAGGA TAACAACAAG GGGCTTGGAA GTAGTAAGGA GAGATTGGAG TGAGATAGCT AAGGAGACTC AGGCAAAGGT TTTAGAGGCT ATSCTTTAAG AGGGAAGTGT TGAAAAAGCT GTAGAAGTTG TTAGAGATGT TGTAGTiGAAA ATAGCAAAAT ACAGGGTTCC ACTTGAAAAG CTTGTTATCC ATGAGCAGAT TACCAGGGAT TTAAAGGACT IVCA.VjGCCAT
GTCG
»TAG CAAAAAGACT TGCCGCIAAGA GGGATTiAAAG
TGAAACCGGG CACAATAATA AGCTATATCG TTCTCAAAGG GAGCGGAAAG ATAAGCGATA GGGTAATTTT ACTTACAGAA TÄCGATCCTA GAAAACACAA GTACGATCCG GACTACTTiCA TAGAAAACCA AGTTTTGCCG GCAGTACTTA GGAIACTCGA AGCGTTTGGA TACAGATtAGG AGGATTTAAG GTÄTCAAAGC TCAAAACAAA CCGGCTTAGA TGCATGGCTC AAGTÄTTAGC TCTGTTGCTT TTTAGTCCAA GTTTCTCCGC GAGTCTCTCT äTCTCTCTTT TGTATTCTGC TATGTGGTTT TCTATTCACTA TTAAGTAGTC CGCCAAAGCC AXAACGCTTC CIAATTCCAAA CTTGAGCTCT TTCCAGTCTC TGGCCTCAAA TTCACTCCAT GTTTTTGGAT (-üi-L^jv-'i-iUi1 &igr;_-._,'_-"-Jl"&lgr;.&iacgr;^&tgr; CTAAGCCTCT CGAATCTTTT TCTTGGCGAA GAGTGTACTiG CTATGATGAT TaVXJlX-1I1ICC TCTGGAAACG CATCTTTAAA CGTCTGAATT TCATCTA.GAG ACCTCACTCC GTCGATTATA ACTCCCTTGT ACTTCTTTAG TAGTTCTTTT ACCTTTGGGA TCGTTAATTT TGCCACGGCA TI^TCCCCa GCTCCTGCCT AAGCTGAATG CTCACACTGT TCATT^CTTC GGGAGTTCTT GGGATCC
4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 57 50 5320 5837
FIG.6-5
92311622.2
M:NE2713A1
New England Biolabs Inc.
oder eines Teiles davon, den Nukleotiden 1 - 1274 dieser Nukleotidsequenz, den Nukleotiden 1269 - 2856 dieser Sequenz und den Nukleotiden 2851 - 4771 dieser Sequenz.
2. Die rekombinante wärmestabile Polymerase nach Anspruch 1, wobei der Teil der Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 wenigstens 20 Nukleotide an Länge aufweist.
3. Die rekombinante wärmestabile Polymerase nach Anspruch 1, wobei der Bereich der Nukleotidsequenzteil gemäß Anspruch 1 wenigstens 50 Nukleotide an Länge aufweist.
4. Die rekombinante wärmestabile Polymerase nach Anspruch 1, wobei der Nukleotidsequenzteil gemäß Anspruch 1 wenigstens 150 Nukleotide an Länge aufweist.
5. Rekombinante wärmestabile DNA-Polymerase aus Archaebakterien, welche an eine Antikörpersonde hybridisiert, welche antigene Spezifität für T. litoralis-DNA Polymerase aufweist.
6. Isolierte DNA, welche für die rekombinante wärmestabile DNA-Polymerase nach Anspruch 1 codiert.
7. Ein Klonierungsvektor, welcher die isolierte DNA gemäß Anspruch 6 umfaßt.
8. Eine Wirtszelle, welche durch den Vektor gemäß Anspruch 7 transformiert wurde.
9. Ein Verfahren zum Herstellen einer rekombinanten wärmestabilen DNA-Polymerase aus Archaebakterien, welche das
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M:NE2713A1
New England Biolabs Inc.
Kultivieren einer Wirtszelle umfaßt, die mit dem Vektor gemäß Anspruch 7 unter Bedingungen transformiert wurde, welche für die Expression der DNA-Polymerase geeignet sind.
5
10. Eine DNA-Sonde, welche an die DNA-Sequenz hybridisiert, die für die wärmestabile DNA-Polymerase gemäß Anspruch 1 aus Archaebakterien codiert, wobei die DNA-Sonde ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus:
der Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 oder eines Teiles davon, den Nukleotiden 1 - 1274 dieser Sequenz, den Nukleotiden 1269 - 2856 dieser Sequenz und den Nukleotiden 2851 - 4771.
11. Die DNA-Sonde nach Anspruch 10, wobei der Nukleotidsequenzteil wenigstens ungefähr 20 Nukleotide an Länge aufweist.
12. Die DNA-Sonde nach Anspruch 10, wobei der Nukleotidsequenzteil wenigstens ungefähr 50 Nukleotide an Länge aufweist.
13. Die DNA-Sonde nach Anspruch 10, wobei der Nukleotidsequenzteil wenigstens ungefähr 150 Nukleotide an Länge aufweist.
14. Ein Verfahren zum Isolieren von DNA, welche für wärmestabile DNA-Polymerase aus Archaebakterium codiert, die folgenden Schritte umfassend:
(a) Bilden einer Genombibliothek für das Archaebakterium;
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(b) Transformieren oder Transfizieren einer geeigneten Wirtszelle mit der Bibliothek aus Schritt (a);
(C) In-Kontakt-Bringen der DNA aus der transformierten oder transfizierten Wirtszelle mit einer DNA-Sonde, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
der Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 oder eines
Teiles davon, den Nukleotiden 1 - 1274 dieser Sequenz, den Nukleotiden 1269 - 2856 dieser Sequenz und den Nukleotiden 2851 - 4771;
(d) Untersuchen der transformierten oder transfizierten Zelle gemäß Schritt (c), welche mit der DNA-Sonde für DNA-Polymerase-Aktivität hybridisiert; und
(e) Isolieren eines DNA-Fragmentes, welches für die
wärmestabile DNA-Polymnerase codiert.
15. Ein Verfahren zum Isolieren von DNA, welche für wärmestabile DNA-Polymerase aus Archaebakterium codiert, welches die Schritte umfaßt:
(a) Bilden einer Genombibliothek aus dem Archaebakterium;
(b) Transformieren oder Transfizieren einer geeigneten Wirtszelle mit der Bibliothek gemäß Schritt (a);
(c) In-Kontakt-Bringen eines Extraktes aus der
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transformierten oder transfizierten Wirtszelle mit einer Antikörpersonde, welche spezifische Affinität für T. litoralis DNA-Polymerase aufweist;
5
(d) Untersuchen der transformierten oder transfizierten Zelle gemäß Schritt (c), welche mit der Antikörpersonde für DNA-Polymerase Aktivität kreuzreagiert; und
(e) Isolieren eines DNA-Fragmentes, welches für die wärmestabile DNA Polymerase codiert.
16· Ein Verfahren zum Erhöhen der Expression einer wärmestabilen DNA Polymerase aus Archaebakterien, die Schritte umfassend:
(a) Identifizieren und Lokalisieren irgendwelcher intervenierender Nukleotidsequenz in der isolierten DNA gemäß Anspruch 14 oder 15; und
(b) Entfernen der intervenierenden Nukleotidsequenz aus der isolierten DNA.
17. Das Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das Archaebakterium T. litoralis umfaßt.
18. Das Verfahren nach Anspruch 17, wobei die intervenierende Nukleotidsequenz ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus IVSl, IVS2 oder IVSl und IVS2.
19. Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei die intervenierende Nukleotidsequenz mit einer DNA-Sonde, welche für ein Intron aus der DNA-Sequenz, welche T. litoralis-DNA
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M:NE2713A1
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Polymerase codiert, identifiziert und lokalisiert wird.
20. Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei die DNA-Sonde ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus:
einer 1614 bp Nukleotidseguenz gemäß Anspruch 1, die Nukleotide 1776 - 3389 oder einen Teil davon umfassend und eine 1170 bp Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, die Nukleotide 3544 - 4703 oder einen Teil davon umfassend. 10
21. Eine wärmestabile Endonuklease, erhältlich aus T. litoralis, welche doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure pBR322 an den Positionen 164 und 2411 spaltet.
22. Die Endonuklease nach Anspruch 21, welche ein Molekulargewicht von ungefähr 33 000 bis 37 000 aufweist.
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