JPH07327684A - Ｄｎａポリメラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を特定し、
該遺伝子を用いる新規ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子工学
的製造法を提供する。 【構成】 配列表の配列番号１若しくは２で示されるア
ミノ酸配列、又はそれらの一部であって、かつ、ＤＮＡ
ポリメラーゼ活性を有する部分をコードするＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子。該遺伝子に厳密な条件下でハイブリダ
イズ可能なＤＮＡポリメラーゼ遺伝子。前記いずれかの
遺伝子を含有するプラスミドを保有する形質転換体を培
養し、該培養物から相当する前記のＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子がコードするＤＮＡポリメラーゼを採取するＤＮ
Ａポリメラーゼの製造方法。 【効果】 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規のＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子及びＤＮＡポリメラーゼの遺伝子工学的製造
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】今まで遺伝子工学研究用試薬として一般
に利用されているＤＮＡポリメラーゼとしては、大腸菌
由来ＤＮＡポリメラーゼ、その変形であるクレノウ断
片、サーマス アクアティカス（Thermus aquaticus)由
来ＤＮＡポリメラーゼ、バチルスカルドテナックス（Ba
cillus caldotenax)由来ＤＮＡポリメラーゼ等がある。
これらの酵素はその有する性質に応じて、ＤＮＡの標識
化、ＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定等に利用されている。
一般にＤＮＡポリメラーゼはその起源による特異性を有
しており、その特性を生かした利用法がある。ピロディ
クティウム オクルタム（Pyrodictium occultum) は生
育至適温度が約１０５℃である超高熱性古細菌であり、
この細菌由来のＤＮＡポリメラーゼは高温で安定である
ことが予想されるため、遺伝子工学研究用試薬として有
用な用途が期待される。ところが、該細菌は生育温度が
非常に高い上に嫌気性であるのでその大量培養は困難で
ある。したがって、該細菌の培養物からＤＮＡポリメラ
ーゼを直接大量に採取することは非常に困難である。一
方、該細菌由来のＤＮＡポリメラーゼの遺伝子について
は、アブストラクト オブジ アメリカン ソサイエテ
ィ フォー マイクロバイオロジー（Abstract of The
American Society for Microbiology)、第９３巻、第１
９７頁（１９９３）に該細菌からＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子が単離された旨が記載されている。しかしながら、
８０３アミノ酸をコードし得るオープンリーディングフ
レームが存在するという以外に塩基配列等の該遺伝子を
特定するに足る記載はなく、また、該ＤＮＡポリメラー
ゼを特定するに足るアミノ酸配列や酵素化学的性質の十
分な記載もない。また、該細菌のその他のＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子についても記載されていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を特定し、該遺伝子を含有
させたプラスミドを保有する形質転換体を用いた新規Ｄ
ＮＡポリメラーゼの遺伝子工学的製造法を提供すること
にある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は配列表の配列番号１若しくは２で示
されるアミノ酸配列、又はそれらの一部であって、か
つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する部分をコードする
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に関する。本発明の第２の発
明は第１の発明のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に厳密な条
件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
に関する。本発明の第３の発明はＤＮＡポリメラーゼの
製造方法に関し、第１又は第２の発明のＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子を含有するプラスミドを保有する形質転換体
を培養し、該培養物から第１又は第２の発明のＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子がコードするＤＮＡポリメラーゼを採
取することを特徴とする。

【０００５】本発明者らは鋭意研究の結果、ピロディク
ティウム オクルタムから２種の新規ＤＮＡポリメラー
ゼ遺伝子を見出し、これらをクローニングすることに成
功した。更に、これらの遺伝子を導入した形質転換体を
作製し、ＤＮＡポリメラーゼを大量生産することに成功
し、本発明を完成した。

【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
使用する菌株としては、例えば、ピロディクティウム
オクルタムＤＳＭ２７０９^T 株〔ドイッチェ ザムルン
ク フォン ミクロオルガニズメンウント ツェルクル
チュウレン（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen) ＧｍｂＨの保存菌株：ＤＳＭ２７０
９^T 〕がある。

【０００７】本発明のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は次に
例示する工程により得ることができる。 （１）ピロディクティウム オクルタムからＤＮＡを抽
出する。 （２）α型ＤＮＡポリメラーゼに共通なアミノ酸配列を
基に遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを作製
し、（１）で得たＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。 （３）（１）で得たＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、
これに対して（２）で得た増幅ＤＮＡ断片をプローブと
してサザンハイブリダイゼーションを行う。 （４）（３）で適当な陽性シグナルが得られた制限酵素
で（１）のＤＮＡを切断し、それぞれの切断部位に合う
カセットをＤＮＡリガーゼで結合させる。 （５）カセット内の共通プライマーとプローブに用いた
ＤＮＡ断片中に貼り付くプライマーを用いてＰＣＲを行
い、増幅されるＤＮＡ断片の制限酵素マッピングを行う
ことにより、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む周辺領域
の制限酵素地図を作成する。 （６）（５）の結果を基にＤＮＡポリメラーゼをコード
する全領域を含む断片が得られる制限酵素で（１）のＤ
ＮＡを切断し、ベクターに結合させる。 （７）ＤＮＡ断片を結合させたベクターを宿主菌に導入
し、目的のＤＮＡ断片を含む形質転換体を選択する。 （８）（７）で得た形質転換体を培養し、培養菌体抽出
物のＤＮＡポリメラーゼ活性を確認する。

【０００８】上記ＤＮＡ供与体であるピロディクティウ
ム オクルタム ＤＳＭ２７０９由来ＤＮＡは、１００
℃で嫌気培養した該培養菌体より抽出する。抽出、精
製、制限酵素による切断等は公知の方法を用いることが
でき、当該方法の詳細は１９８２年 コールド スプリ
ング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス
（T.Maniatis) ほか著、モレキュラー クローニング、
ア ラボラトリー マニュアル（Molecular Cloning, A
Laboratory Manual) 第７５〜１７８頁に記載されてい
る。

【０００９】目的のＤＮＡ断片を選択する方法として
は、例えば、公知のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列
を比較し、共通のアミノ酸配列を示す領域を基にＰＣＲ
用のプライマーを作製する。これまでに知られている古
細菌由来のＤＮＡポリメラーゼはα型であることから、
例えば、公知のα型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列
を比較して、共通の領域を基にしてミックスプライマー
を作製することができる。α型ＤＮＡポリメラーゼをク
ローニングするためのプライマーとしては、特開平６−
１４７８０号公報に記載のＧＣ型、ＡＴ型、若しくは中
間型のプライマーを使用することができる。これらは目
的のＤＮＡのＧＣ含量に応じて使い分けることができ
る。

【００１０】ピロディクティウム オクルタムは、シス
テマティック アンド アプライドマイクロバイオロジ
ー（Systematic and Applied Microbiology)、第４巻、
第５３５〜５５１頁（１９８３）記載のようにＧＣ含量
が６２％と高いことから、本発明者らは配列表の配列番
号３及び４に示されるＧＣ型のプライマーを用いてピロ
ディクティウム オクルタムＤＮＡを鋳型してＰＣＲを
行った。その結果、特異的なＤＮＡ断片が増幅されるこ
とを見出した。更に、この増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を
決定したところ、その推定されるアミノ酸配列が公知の
ＤＮＡポリメラーゼと相同性を有する２種類の配列が見
出された。これら２種類の増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を
配列表の配列番号５（配列Ｉと称する）及び配列番号６
（配列IIと称する）に示す。このことから、ピロディク
ティウム オクルタムが少なくとも２種類のＤＮＡポリ
メラーゼを有することが示唆された。

【００１１】これらのＤＮＡポリメラーゼをコードする
遺伝子は、例えば該増幅ＤＮＡ断片をプローブとしてハ
イブリダイゼーションを行うことにより選択することが
できる。ハイブリダイゼーションによる選択は公知の方
法、例えば、前記モレキュラー クローニング、ア ラ
ボラトリー マニュアル、第３０９頁（１９８２）に記
載されている方法を用いることができる。サザンハイブ
リダイゼーション法により目的のＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子がピロディクティウム オクルタムＤＮＡのどの制
限酵素断片上に存在するかを分析した後、適当な制限酵
素部位を有するカセットをそれぞれの切断断片に結合さ
せ、その反応液を一部とってカセット内の共通プライマ
ーとプローブ内の領域に貼りつくプライマーとでＰＣＲ
を行い、得られた増幅断片を制限酵素分析することによ
りＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む領域の制限酵素地図
を求めることができる。この結果よりＤＮＡポリメラー
ゼをコードする全領域を含む断片をクローニングすべく
ピロディクティウム オクルタムＤＮＡを切断し、ベク
ターに組込む。プラスミドベクターとしては公知のもの
が使用でき、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＴＶ１
１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎなどが挙げられるがこれらに限
定されるものではない。また組込ませる手段についても
公知の方法が利用でき、ＤＮＡリガーゼを用いた酵素反
応で組込ませればよい。

【００１２】次いで組換えプラスミドを宿主大腸菌に導
入させるが、宿主大腸菌としては、形質転換能を有する
ものであれば野生株、変異株のいずれも使用できるが、
制限系変異株で修飾系野生株（ｒ^- ，ｍ⁺ ）であること
が望ましい。導入の手段自体は公知の方法、例えば前記
モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニ
ュアル、第２５０頁（１９８２）を用いることができ
る。このようにして目的のＤＮＡ断片を宿主に導入さ
せ、プラスミドベクターの特性、例えばｐＵＣ１８の場
合アンピシリン耐性を有するコロニーを選択することに
よりクローン化されたＤＮＡの集団を調製することがで
きる。

【００１３】次に上記集団の中から目的の断片を有する
クローンを選択する。選択の方法はベクターの種類によ
ってコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブ
リダイゼーションを用いればよく、方法自体は公知のも
のである。

【００１４】本発明者らは、以上の方法で配列Ｉを有す
る増幅ＤＮＡ断片（プローブＩ）をプローブとして約
４．２ｋｂのＤＮＡ断片をクローニングした。その塩基
配列の一部を配列表の配列番号７に示す。また、配列II
を有する増幅ＤＮＡ断片（プローブII）をプローブとし
て約３．１ｋｂのＤＮＡ断片をクローニングした。その
塩基配列の一部を配列表の配列番号８に示す。更に本発
明者らはプローブIIを用いてクローニングした約３．１
ｋｂの断片をｐＴＶ１１９Ｎに組込んだプラスミドを作
成し、ｐＰＯ５００−IIと命名した。プラスミドｐＰＯ
５００−IIを有する大腸菌を培養し、菌体の粗抽出液を
得た。該抽出液は９０℃２０分処理後も十分量のＤＮＡ
ポリメラーゼ活性を有し、発現ベクターのみを有する大
腸菌粗抽出液ではこのような活性を有しないことより、
ｐＰＯ５００−II上に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ産生情
報が存在し、かつ、大腸菌内で該情報を有する遺伝子が
発現していると結論した。ｐＰＯ５００−IIで形質転換
された大腸菌ＪＭ１０９は Escherichia coli ＪＭ１０
９／ｐＰＯ５００−IIと命名、表示され、工業技術院生
命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３６５９とし
て寄託されている。

【００１５】また、本発明者らは、プローブＩを用いて
クローニングした約４．２ｋｂの断片をｐＴＶ１１８Ｎ
に組込んだプラスミドを作製し、ｐＰＯ１００−Ｉと命
名した。プラスミドｐＰＯ１００−Ｉを有する大腸菌を
培養し、菌体の粗抽出液を得た。該抽出液は７０℃２０
分処理後も十分量のＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、ｐ
ＰＯ１００−Ｉ上に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ産生情報
が存在し、かつ、大腸菌内で該情報を有する遺伝子が発
現していると結論した。ｐＰＯ１００−Ｉで形質転換さ
れた大腸菌ＪＭ１０９は Escherichia coli ＪＭ１０９
／ｐＰＯ１００−Ｉと命名、表示され、工業技術院生命
工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３６６０として
寄託されている。

【００１６】また、得られたＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
をプローブとして、厳密な条件下でハイブリダイゼーシ
ョンを行えば、塩基配列は少し異なるが、実質的に同一
である他のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を得ることができ
る。

【００１７】なお、かかる厳密な条件下とは、例えば、
以下のとおりである。すなわち、ＤＮＡを固定したナイ
ロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム
８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リット
ルの水に溶かしたもの）、１％ラウリル硫酸ナトリウ
ム、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハル
ツ（Denhardt's) （ウシ血清アルブミン、ポリビニルピ
ロリドン、フィコールをそれぞれ０．１％の濃度で含
む）を含む溶液中で６５℃で２０時間プローブとハイブ
リダイゼーションを行うことである。

【００１８】これらの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
法としては、培養菌体より、例えば超音波処理、熱処
理、フェニルセファロース カラム クロマトグラフィ
ー、ヘパリンセファロース カラム クロマトグラフィ
ー、モノ（Mono) Ｑ（ファルマシア社）、モノＳ（ファ
ルマシア社）の各処理を行い、該ＤＮＡポリメラーゼを
ほぼ単一のバンドとなるまで精製することができる。ｐ
ＰＯ５００−II上のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子がコード
する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
約９万ダルトンの分子量を示すポリペプチドであり、Ｄ
ＮＡ合成活性及び５′→３′，３′→５′エキソヌクレ
アーゼ活性を有していた。また、ｐＰＯ１００−Ｉ上の
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子がコードする耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約９．５万ダルトン
の分子量を示すポリペプチドであり、ＤＮＡ合成活性及
び５′→３′，３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有
していた。これらの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは遺伝子
工学研究用試薬として有用である。

【００１９】また、本発明によって古細菌から２種類の
ＤＮＡポリメラーゼが見出されたことは、以下のような
興味深い知見も提供する。すなわち、真核生物の系では
複数個のＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ複製に働いている
ということが提唱されており、リーディング鎖合成、ラ
ギング鎖合成がそれぞれ別のＤＮＡポリメラーゼによっ
て行われている可能性が示唆されている。一方原核生物
では大腸菌の系で解析が進んでおり、複製酵素であるＤ
ＮＡポリメラーゼIII が知られている。この酵素は１０
種類もの異なるタンパク質の複合体で、複合体が２量体
になるときの組合せによって非対称性が現れ、これがリ
ーディング鎖とラギング鎖合成のメカニカルな違いを説
明している。しかし、古細菌では、これまで真核細胞の
持つＤＮＡポリメラーゼαに構造が類似したＤＮＡポリ
メラーゼを有することが知られているが、ＤＮＡ複製の
メカニズムは全くわかっていない。今回、本発明者ら
は、α型と構造的に同じファミリーに属する２種類のＤ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子を見出した。真核細胞は古細菌
に真正細菌が共生して進化したと考えられており、おそ
らく本発明者らが見出した２種類のα型ＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子それぞれは、真核生物のＤＮＡポリメラーゼ
α、δ、ε、のうちの２種類のＤＮＡポリメラーゼに相
当するものと考えられる。超好熱性古細菌からＤＮＡ複
製に関与すると思われる２種類のＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子を単離したことは、生物の原始により近いＤＮＡ複
製のメカニズムを解明する手がかりを提供するものであ
る。古細菌のＤＮＡ複製メカニズムの解明は高等生物の
ＤＮＡ複製の研究に役立てることができる。

【００２０】

【実施例】以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説
明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。

【００２１】実施例１ （１）ピロディクティウム オクルタム染色体ＤＮＡの
調製 ピロディクティウム オクルタム ＤＳＭ２７０９^T を
ＤＳＭの指定する条件により嫌気的に培養した。１５０
ｍｌの培養から得た菌体を７５０μｌの２５％ショ糖、
０．０５Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）に懸濁し、１
５０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、７５ｍｌのリゾチーム
溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて２０℃で１時間放置し
た。更に６ｍｌのＳＥＴ溶液（２０ｍＭ トリス−塩酸
ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ）を加えた後、３７５μｌの１０％ＳＤＳと７５μｌ
のプロティナーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を加えて、
３７℃で１時間放置した。フェノール抽出、クロロホル
ム抽出の後エタノール沈殿を行い、長鎖ＤＮＡを回収し
た。以上の操作により約７μｇのＤＮＡが得られた。

【００２２】（２）ＰＣＲによる特異的ＤＮＡの増幅 配列表の配列番号３及び４に示す２種類のオリゴヌクレ
オチド（ＧＣ型プライマー１、２）を合成した。これら
のプライマーをそれぞれ１００ｐｍｏｌと実施例１−
（１）で調製した染色体ＤＮＡ１ｎｇを用いて全量１０
０μｌの系で９４℃で１分、４５℃で２分、７２℃で２
分の条件でＰＣＲを５０サイクル行った。反応液の５μ
ｌを取り、アガロースゲル電気泳動で分析した結果、約
４００ｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅していた。この
ＤＮＡ断片をＳｍａＩで開裂したｐＵＣ１１８ベクター
に組込んで塩基配列を決定した。その結果、２種類の配
列が見出された。配列表の配列番号５（配列Ｉ）及び配
列番号６（配列II）にその配列を示す。これらの配列は
いずれも公知のＤＮＡポリメラーゼの配列と相同性を有
していた。

【００２３】（３）ゲノミックサザン法によるＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子の検索 実施例１−（１）で調製した染色体ＤＮＡを１つの制限
酵素につき０．１５μｇを用いて、ＢａｍＨＩ、Ｅｃｏ
ＲＩ、Ｈｉｎｄ III、ＰｓｔＩ、ＸｂａＩの５種類の制
限酵素で分解してアガロースゲル電気泳動に供した。次
いでアガロースゲル上のＤＮＡをナイロン膜に移し、プ
ローブIIを用いてサザンハイブリダイゼーションを行っ
た。プローブの標識はランダムプライミング法によって
放射性標識した。ハイブリダイゼーションの条件は、５
×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５×デンハルツ液、１００
μｇ／ｍｌ仔牛胸腺ＤＮＡ中６５℃で５時間行った。２
×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、中で５．５℃１時間洗浄し
た後、イメージングプレート（富士フィルム社）に感光
して、イメージアナライザーＢＡＳ−２０００（富士フ
ィルム社）で画像データを得た。その結果、ＢａｍＨ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ III、ＰｓｔＩ、ＸｂａＩで
それぞれ２．７ｋｂ、２０ｋｂ、４．４ｋｂ、６．６ｋ
ｂ、９．４ｋｂの長さの位置に陽性シグナルを検出し
た。

【００２４】（４）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む領
域の制限酵素地図の作成 実施例１−（１）で調製した染色体ＤＮＡ０．３μｇを
ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ III、又はＰｓｔＩ
で切断した後、それぞれの切断部位を有するカセット
（宝酒造社）各５０ｎｇをＤＮＡリガーゼを用いて結合
させた。この反応液からＤＮＡをエタノール沈殿によっ
て回収し、この一部を用いてＰＣＲを行った。ネスティ
ドＰＣＲを行うために、あらかじめプローブIIの配列内
で、ＧＣ型プライマー１、２（配列番号３、４）と同方
向の特異的プライマーII−Ｓ１（配列番号１１）、II−
Ｓ２（配列番号１２）を合成した。１回目のＰＣＲはカ
セット中の配列に貼り付く配列表の配列番号９で示され
る共通のプライマー（カセットプライマーＣ１、宝酒造
社）と配列番号３又は４で表されるプライマーを組合せ
て用いて行った。次にそのＰＣＲ溶液１ｍｌを鋳型と
し、配列表の配列番号１０で表されるカセットプライマ
ーＣ２（宝酒造社）とプライマーII−Ｓ１、又はII−Ｓ
２の組合せでＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片を
ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄ III、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、Ｋ
ｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＳａｌＩなどの制限酵素
で切断して、制限酵素地図を作成した。図１にその制限
酵素地図を示す。この制限酵素地図とＰＣＲに用いたプ
ライマーの位置から、ＰｓｔＩ−ＫｐｎＩの二重切断に
よって得られる約３．１ｋｂの断片中にＤＮＡポリメラ
ーゼをコードする全領域が含まれていると推定した。

【００２５】（５）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片のクローニング 実施例１−（１）で調製した染色体ＤＮＡ４μｇをＰｓ
ｔＩとＫｐｎＩで切断し、３．１ｋｂ付近のＤＮＡをア
ガロースゲルから回収した。回収はスプレック（SUPRE
C) −０１（宝酒造社）による遠心法を用いた。ｐＴＶ
１１９Ｎ（宝酒造社）をＰｓｔＩとＫｐｎＩで切断して
開裂したものを調製し、回収断片と混合してＤＮＡリガ
ーゼで結合させた。次に大腸菌ＪＭ１０９株に導入して
得られた形質転換体の集団からプローブIIをプローブと
してコロニーハイブリダイゼーションによって目的のク
ローンを選択した。選択した形質転換体からプラスミド
を回収し、目的のＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ断片が導入されて
いることを確認し、該プラスミドをｐＰＯ５００−IIと
命名した。再度ｐＰＯ５００−IIを大腸菌ＪＭ１０９に
導入して、 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＰＯ５０
０−II（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６５９）を得た。更に、ｐ
ＰＯ５００−IIにクローニングされているＰｓｔＩ−Ｋ
ｐｎＩ断片の塩基配列を決定した。その塩基配列を配列
表の配列番号８に示す。その結果、８０３アミノ酸から
なるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が認めら
れた。そのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。

【００２６】（６）形質転換体の培養及び粗抽出液の調
製 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＰＯ５００−II（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１３６５９）をアンピシリンが１００μｇ
／ｍｌの濃度で存在するＬ培地５ｍｌに植菌し３７℃で
培養した。培養液の濁度が０．６（Ａ₆₆₀ ）のとき、誘
導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド
（ＩＰＴＧ）を添加し更に１５時間培養を行った。集菌
後１５０μｌの２５％ショ糖、５０ｍＭ トリス−塩酸
（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノール、２μＭ フェニルメタンスルホニ
ルフルオリド（ＰＭＳＦ）に懸濁し、リゾチームを０．
５ｍｇ／ｍｌの濃度で加えて０℃３０分静置、その後３
７℃に移し、更に３０分静置した。凍結融解を一度行っ
た後、遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分）により上
清を得た。得られた上清について１００℃１５分の熱処
理を行い、再度遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分）
を行って上清を回収し粗抽出液とした。

【００２７】（７）ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定 反応溶液として２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ６．３、
７５℃）、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ ２−
メルカプトエタノール、２μＭ 活性化ＤＮＡ、３３μ
Ｍ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、６０ｎＭ
〔 ³Ｈ〕ＴＴＰを用意し、この溶液１５０μｌに対して
適当量の粗抽出液を加え、７５℃、５分反応させた後、
５０ｍＭ ピロリン酸、１０％トリクロロ酢酸（ＴＣ
Ａ）を１ｍｌ加えて反応を停止させた。氷中で５分間静
置した後、全量をガラスフィルター上に移し、吸引ろ過
した。１０％ＴＣＡで数回洗浄した後、７０％エタノー
ルで置換し、フィルターを乾燥して液体シンチレーショ
ンカウンターでフィルター上の放射活性を測定した。１
ｍｌの培養液から３．０Ｕ単位のＤＮＡポリメラーゼが
得られた。

【００２８】（８）プラスミドｐＰＯ５００−IIを導入
した大腸菌による耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産 大腸菌ＪＭ１０９／ｐＰＯ５００−IIの培養液３リット
ルより得られた菌体４．２ｇを緩衝液（１５０ｍＭ ト
リス−塩酸ｐＨ７．６、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２．４ｍＭ
ＰＭＳＦ）４０ｍｌに懸濁し、超音波処理にて破砕し
た。最終濃度が０．２Ｍになるように、硫酸アンモニウ
ムを加え遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分）した
上清について９０℃１０分の熱処理を行い粗抽出液を得
た。このＡ₂₈₀ を測定し１０００（Ａ₂₈₀ ）に対し、５
％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液（ｐＨ７．６）
０．５ｍｌを加え４℃で１時間かくはんした後、遠心分
離（１２，０００ｒｐｍ、２０分）して除核酸を行い、
その上清を緩衝液（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．６、
２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム）で平
衡化したフェニルセファロース カラム（６ＦＦＨｉｇ
ｈ ｓｕｂ、ファルマシア社）１ｍｌに添加した。緩衝
液５０ｍＭ トリス−塩酸ｐＨ７．６、２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、緩衝液（５０ｍＭ トリス−塩酸ｐＨ７．６、２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、２０％エチレングリコール）で順に洗浄
した後、０Ｍ〜４Ｍ尿素の直線濃度勾配で溶出して分画
し、実施例１−（７）に従ってＤＮＡ活性ポリメラーゼ
活性を調べた。次にその活性分画を集めて緩衝液〔５０
ｍＭ トリス−塩酸ｐＨ７．６、１００ｍＭ ＫＣｌ、
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％トゥイーン（Tween)２
０〕で平衡化したハイトラップ ヘパリン カラム（フ
ァルマシア社）１ｍｌに添加し１５０ｍＭ ＫＣｌ、及
び１５０ｍＭ〜６５０ｍＭ ＫＣｌの直線濃度勾配で溶
出し、活性画分を集めた。活性画分は、緩衝液（５０ｍ
Ｍ トリス−塩酸ｐＨ７．６、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．２％トゥイーン２０）で透析し、同じ緩衝液で平衡
化したモノＱ（５ｍｌ）に供し、未吸着画分を同じ緩衝
液で平衡化したモノＳ（５ｍｌ）に添加して０ｍＭ〜５
００ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配で溶出し活性画分を集
めた。モノＳ画分より２２００Ｕ酵素標品（ＰｏｃＤＮ
ＡポリメラーゼII）を得、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析したと
ころ、分子量約９万ダルトンの単一バンドを与えた。

【００２９】（９）５′→３′エキソヌクレアーゼ活性
の測定 ｐＵＣ１１９をＳｓｐＩで切断後アガロースゲルにて電
気泳動し３８６ｂｐの断片をスプレック−０１（宝酒造
社）を用いて回収した。この断片の５′末端を〔γ−³²
Ｐ〕ＡＴＰとメガラベルキット（宝酒造社）を用いて放
射性標識し、ＮＩＣＫカラム（Ｇ５０）（ファルマシア
社）でゲルろ過して遊離の〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰを除いて
基質とした。この基質１ｎｇと実施例１−（８）で得た
ＰｏｃＤＮＡポリメラーゼII ０．０５Ｕを２０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ６．３、又はｐＨ７．７）２．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂ 溶液１０μｌ中で７５℃５分、１０分、
１５分反応後エタノール２５μｌと２０μｇ／μｌグリ
コーゲン２μｌを加えてエタノール沈殿を行い、その上
清及び沈殿の放射活性をチェレンコフ法により液体シン
チレーションカウンターで測定した。ＰｏｃＤＮＡポリ
メラーゼIIを加えた場合、時間と共に５′末端のヌクレ
オチドの遊離に伴う上清の放射活性の上昇があり、５′
→３′エキソヌクレアーゼ活性が認められた。一方ＪＭ
１０９大腸菌破砕液を加えた場合、放射活性の上昇はな
く、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性は認められなか
った。

【００３０】（１０）３′→５′エキソヌクレアーゼ活
性の測定 ｐＵＣ１１９をＳａｕ３ＡＩで切断後アガロースゲルに
て電気泳動し３４１ｂｐの断片をスプレック−０１（宝
酒造社）を用いて回収した。この断片の３′末端を〔α
−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰとク
レノウ酵素を用いて放射性標識し、ＮＩＣＫカラムでゲ
ルろ過して遊離の〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰを除いて基質と
した。この基質４ｎｇを２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ
６．３、又はｐＨ７．７）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、
１．２５ｍｇ／ｍｌのλ−ＨａｅIII 分解物の溶液１０
μｌ中でＰｏｃＤＮＡポリメラーゼII ０．２Ｕ（ｐＨ
６．３）又は０．０５Ｕ（ｐＨ７．７））と７５℃５
分、１０分、１５分反応後実施例１−（９）と同様にエ
タノール沈殿を行い上清と沈殿の放射活性を測定した。
反応は１．２５ｍｇ／ｍｌのλ−Ｈａｅ III分解物を加
えることによりＫｍに対して基質大過剰の条件で行っ
た。その結果、ＰｏｃＤＮＡポリメラーゼを加えた場
合、時間と共に３′末端のヌクレオチドの遊離に伴う上
清の放射活性の上昇があり、３′→５′エキソヌクレア
ーゼ活性が認められた。一方ＪＭ１０９大腸菌破砕液を
加えた場合は放射活性の上昇はなく、３′→５′エキソ
ヌクレアーゼ活性は認められなかった。また、ＤＮＡポ
リメラーゼ活性に対する３′→５′エキソヌクレアーゼ
活性の割合を調べた結果、ｐＨ６．３の場合よりもｐＨ
７．７の場合の方が高く、約４０倍であった。

【００３１】実施例２ （１）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片のク
ローニング プローブＩを用いて実施例１−（３）と同様にしてサザ
ンハイブリダイゼーションを行った。その結果、約５．
５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片、約４．９ｋｂのＨｉｎｄ III
断片、及び約１．７ｋｂのＰｓｔＩ断片が陽性を示し
た。プローブＩの配列内でＧＣ型プライマー１、２と同
方向に特異的プライマーＩ−Ｓ１（配列番号１３）、Ｉ
−Ｓ２（配列番号１４）を合成し、実施例１−（４）と
同様にＰＣＲを行って制限酵素地図を作成した。図２に
その制限酵素地図を示す。制限酵素地図とＰＣＲに用い
たプライマーの位置から約４．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｄ III断片上にＤＮＡポリメラーゼをコードする全
領域が含まれていると推定した。次にｐＴＶ１１８Ｎ
（宝酒造社）をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ IIIで開裂したも
のを調製し、実施例１−（５）と同様にして目的のクロ
ーンを選択した。得られた組換体よりプラスミドを回収
し、目的のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ III断片が挿入されて
いることを確認し、該プラスミドをｐＰＯ１００−Ｉと
命名した。再度ｐＰＯ１００−Ｉを大腸菌ＪＭ１０９に
導入して、 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＰＯ１０
０−Ｉ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６６０）を得た。更に、ｐ
ＰＯ１００−ＩにクローニングされているＥｃｏＲＩ−
Ｈｉｎｄ III断片のうち、ＳｍａＩ−Ｈｉｎｄ III領域
の塩基配列を決定した。その塩基配列を配列表の配列番
号７に示す。その結果、塩基番号４３５〜３１７６、５
４０〜３１７６にそれぞれ９１４、８７９アミノ酸から
なるＯＲＦが認められた。９１４アミノ酸からなるＯＲ
Ｆのアミノ酸配列を、配列表の配列番号１に示す。８７
９アミノ酸からなるＯＲＦは、配列番号１のうちアミノ
酸番号３６〜９１４に相当する。

【００３２】（２）形質転換体の培養及び粗抽出液の調
製 Ｅ． coli ＪＭ１０９／ｐＰＯ１００−Ｉをアンピシリ
ンが１００μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬ培地５ｍｌに
植菌し３７℃で２０時間培養し、集菌後２００μｌの２
５％ショ糖、５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．６）、
１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、２μＭ ＰＭＳＦに懸濁し、リゾチームを０．５ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で加えて０℃３０分静置、その後３７℃
に移し更に３０分静置した。凍結融解を一度行った後遠
心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分）により上清を得
た。得られた上清について７０℃２０分の熱処理を行い
再度遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分）を行って上
清を回収し粗酵素液とした。実施例１−（７）と同様に
してＤＮＡポリメラーゼ活性を測定したところ１ｍｌの
培養液から０．２２単位の活性が得られた。

【００３３】（３）発現系の改変 発現量を上げるためにベクターｐＥＴ１５ｂ（ノバジェ
ン社）のＮｃｏＩ部位のＡＴＧよりＤＮＡポリメラーゼ
が直接発現するプラスミドを構築した。最初に公知のα
タイプのＤＮＡポリメラーゼとのホモロジーより開始コ
ドンと推定される２ヵ所のＡＴＧの領域（配列番号７の
塩基番号４３５〜４３７と５４０〜５４２）にそれぞれ
ＮｃｏＩサイトを導入するためのオリゴヌクレオチド
１、２（配列番号１５、１６）を合成した。このオリゴ
ヌクレオチド１、又は２とｐＰＯ１００−Ｉ、ミュータ
ン（Mutan)−Ｋ（宝酒造社）を用いてサイトダイレクト
ミュータジェネシスを行いｐＰＯ１００−ＩにＮｃｏＩ
サイトを導入したプラスミドｐＰＯ１００−ＩＭ１、ｐ
ＰＯ１００−ＩＭ２を構築した。次にそれぞれのプラス
ミドによりＮｃｏＩ−Ａｆｌ II （１５５１ｂｐと１４
４６ｂｐ）断片とＡｆｌ II −ＥｃｏＲＶ（１４５７ｂ
ｐ）断片を精製し（Ａｆｌ II サイトは配列番号７の塩
基番号１９８３〜１９８８にある）、ｐＥＴ−１５ｂを
ＢａｍＨＩで切断後を平滑末端化し、更にＮｃｏＩで切
断して得られるｐＥＴ−１５ｂＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ平
滑化断片と混合しＤＮＡリガーゼにより結合させた。そ
れぞれの混合液を用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換
し、得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、制限
酵素解析よりＮｃｏＩ−Ａｆｌ II 断片とＡｆｌ II −
ＥｃｏＲＶ断片が連結したプラスミドを選別しｐＰＯ２
００−ＩとｐＰＯ３００−Ｉと命名した。すなわち、ｐ
ＰＯ２００−Ｉは９１４アミノ酸（配列番号１。ただ
し、２番目のアミノ酸はＬｙｓからＧｌｕに置換されて
いる）、及び８７９アミノ酸（配列番号１のアミノ酸番
号３６〜９１４）からなる２つのＯＲＦを含んでおり、
ｐＰＯ３００−Ｉは８７９アミノ酸（配列番号１のアミ
ノ酸番号３６〜９１４）からなる１つのＯＲＦを含んで
いる。

【００３４】（４）プラスミドｐＰＯ２００−Ｉ、ｐＰ
Ｏ３００−Ｉを導入した大腸菌による耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼの生産 大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ノバジェン社）にプラ
スミドｐＰＯ２００−Ｉ又はｐＰＯ３００−Ｉを導入し
た形質転換体をそれぞれＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＰ
Ｏ２００−Ｉ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＰＯ３００
−Ｉと命名した。ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＰＯ２０
０−ＩとＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＰＯ３００−Ｉを
それぞれ２リットルのバッフル付フラスコで５００ｍｌ
のＬ培地に植菌し濃度が０．７のとき１Ｍ ＩＰＴＧを
０．２ｍｌ加え２０時間培養した。培養液３リットルよ
り得られた菌体４．４ｇと４．３ｇより実施例１−
（８）と同様にしてＤＮＡポリメラーゼを精製した。Ｈ
ＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＰＯ２００−Ｉからはヘパリ
ン活性画分より１１２５０Ｕ得られＳＤＳ−ＰＡＧＥで
ほぼ等量の分子量約９．５万ダルトンと１０万ダルトン
の２バンドを与えた。ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＰＯ
３００−Ｉからはヘパリン活性画分より１３３５０Ｕ得
られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量約９．５万ダルトンの
単一バンドを与えた。

【００３５】ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＰＯ３００−
Ｉより精製して得られた酵素標品（ＰｏｃＤＮＡポリメ
ラーゼ−Ｉ）を用いて実施例１−（９）、１−（１０）
と同様の方法で付随するヌクレアーゼ活性の有無を調べ
た。５′→３′エキソヌクレアーゼに関してはＰｏｃＤ
ＮＡポリメラーゼII同様活性が認められた。既知のα型
古細菌株由来の酵素であるピロコッカス フリオサス
（P.furiosus) 由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＰｆｕＤＮ
Ａポリメラーゼ、ストラタジーン社）にはこの活性は認
められなかった。３′→５′エキソヌクレアーゼに関し
ては、ＰｏｃＤＮＡポリメラーゼII同様活性が認められ
ｐＨ６．３よりｐＨ７．７の反応液においてより約７倍
高い活性を示した。ＤＮＡポリメラーゼ活性に対する
３′→５′エキソヌクレアーゼ活性の割合はｐＨ６．３
の反応液でＰｏｃＤＮＡポリメラーゼIIの数１０倍、Ｐ
ｆｕＤＮＡポリメラーゼの約３．５倍、ｐＨ７．７の反
応液でＰｏｃＤＮＡポリメラーゼIIの約１４倍、Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼの約１．５倍であった。

【００３６】３′→５′エキソヌクレアーゼ活性はＤＮ
Ａポリメラーゼの有するＤＮＡ合成時の校正機能と考え
られ、鋳型ＤＮＡに対して誤った塩基を取り込んで合成
してしまったとき、これを切り離し、改めて正しい塩基
を取り込む過程で大切な活性である。本発明におけるＰ
ｏｃＤＮＡポリメラーゼＩのポリメラーゼ活性に対する
エキソヌクレアーゼ活性の比率が、本発明のＰｏｃＤＮ
ＡポリメラーゼIIや既知のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの
持つそれぞれの活性の比と比べて明らかに高いというこ
とはＰｏｃＤＮＡポリメラーゼＩが非常に高い正確性を
持ったＤＮＡ合成を行うことを示唆している。

【００３７】

【発明の効果】本発明により、遺伝子工学研究用試薬と
して有用な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝
子、及び該遺伝子を用いた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの
遺伝子工学的製造方法が提供された。

【００３８】

【配列表】

【００３９】配列番号：1 配列の長さ：914 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Lys Ala Gln Pro Gln Leu Ala Thr His Gln Gly Leu Thr Thr 1 5 10 15 Glu Lys Ala Val Val Asn Val Asp Ala Glu Thr Trp Ala Glu Gln 20 25 30 His Ala Trp Ser Thr Met Val Pro Gln Ser Ser Thr Pro Pro Ala 35 40 45 Gly Tyr Gly Asp Asp Leu Ala Gly Lys Leu Gly Ser Leu Leu Gly 50 55 60 Gly Ser Arg Gly Ala Leu Glu Arg Leu Ser Ala Leu Pro Leu Thr 65 70 75 Arg Lys Pro Leu Glu Ala Arg Asp Gly Val Glu Gly Phe Leu Leu 80 85 90 Gln Thr Met Tyr Asp Gly Glu Arg Gly Val Ala Ala Ala Lys Ile 95 100 105 Tyr Asp Asp Arg Asn Gly Ile Val Tyr Val Tyr Phe Asp Arg Thr 110 115 120 Gly Tyr Met Pro Tyr Phe Leu Thr Asp Ile Pro Pro Asp Lys Leu 125 130 135 Gln Glu Leu His Glu Val Val Arg His Lys Gly Phe Asp His Val 140 145 150 Glu Val Val Glu Lys Phe Asp Leu Leu Arg Trp Gln Arg Arg Lys 155 160 165 Val Thr Lys Ile Val Val Lys Thr Pro Asp Val Val Arg Val Leu 170 175 180 Arg Asp Lys Val Pro Arg Ala Trp Glu Ala Asn Ile Lys Phe His 185 190 195 His Asn Tyr Ile Tyr Asp Tyr Gly Leu Val Pro Gly Met Lys Tyr 200 205 210 Arg Val Gly Lys Gly Arg Leu Ile Leu Leu Gly Gly Glu Ala Ser 215 220 225 Gly Asp Asp Glu Arg His Ile Arg Glu Ile Phe Ser Gly Glu Asp 230 235 240 Glu Ser Thr Ile Glu Met Ala Val Lys Trp Leu Ser Leu Phe Glu 245 250 255 Gln Pro Pro Pro Lys Pro Arg Arg Leu Ala Val Asp Ile Glu Val 260 265 270 Phe Thr Pro Phe Lys Gly Arg Ile Pro Asp Pro Ser Thr Ala Ser 275 280 285 Tyr Pro Val Ile Ser Val Ala Met Ser Ser Asp Glu Gly Trp Arg 290 295 300 Ala Val Tyr Val Leu Ala Arg Pro Gly Val Pro Met Asn Pro Pro 305 310 315 Arg Gly Pro Leu Pro Glu Asn Leu His Val Glu Ile Phe Asp Asp 320 325 330 Glu Arg Ala Leu Ile Leu Glu Ala Phe Arg Leu Ile Ser Asn Tyr 335 340 345 Pro Val Leu Leu Thr Phe Asn Gly Asp Asn Phe Asp Leu Pro Tyr 350 355 360 Leu Tyr Asn Arg Ala Val Lys Leu Gly Ile Pro Arg Glu Tyr Ile 365 370 375 Pro Phe Arg Ala Arg Ser Asp Tyr Val Thr Leu Glu Tyr Gly Phe 380 385 390 His Ile Asp Leu Tyr Lys Phe Phe Ser Thr Lys Ala Val Gln Ala 395 400 405 Tyr Ala Phe Gly Asn Ala Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Asp Ala Ile 410 415 420 Ala Ser Ala Leu Leu Gly Glu His Lys Val Glu Val Glu Ser Thr 425 430 435 Val Ser Asp Leu Pro Phe Phe Glu Leu Val Arg Tyr Asn Val Arg 440 445 450 Asp Ala Asp Leu Thr Leu Arg Leu Thr Thr Phe Asn Asn Asp Leu 455 460 465 Val Trp Ser Leu Ile Ile Leu Leu Met Arg Ile Ser Lys Leu Pro 470 475 480 Leu Glu Asp Val Thr Arg Ser Gln Val Ser Ala Trp Val Lys Ser 485 490 495 Leu Phe Tyr Trp Glu His Arg Arg Arg Gly Tyr Leu Ile Pro Ser 500 505 510 Arg Glu Glu Ile Ile Arg Leu Lys Gly Thr Thr Arg Ser Glu Ala 515 520 525 Leu Ile Lys Gly Lys Lys Tyr Gln Gly Ala Leu Val Leu Asp Pro 530 535 540 Pro Ser Gly Ile Tyr Phe Asn Ile Val Val Leu Asp Phe Ala Ser 545 550 555 Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Lys Arg Trp Asn Leu Ser Tyr Glu Thr 560 565 570 Val Asn Pro Val Tyr Cys Pro Glu Ser Lys Leu Val Glu Val Pro 575 580 585 Asp Val Gly His Lys Val Cys Met Ser Ile Pro Gly Leu Thr Ser 590 595 600 Gln Ile Val Gly Leu Leu Arg Asp Tyr Arg Val Lys Ile Tyr Lys 605 610 615 Lys Lys Ala Lys Asp Lys Ser Leu Pro Asp Asp Val Arg Ala Trp 620 625 630 Tyr Asn Thr Val Gln Ala Ala Met Lys Val Tyr Ile Asn Ala Ser 635 640 645 Tyr Gly Val Phe Gly Ala Glu Ser Phe Pro Phe Tyr Ala Pro Pro 650 655 660 Val Ala Glu Ser Val Thr Ala Ile Gly Arg Tyr Thr Ile Lys Gln 665 670 675 Thr Leu Gln Lys Ala Gly Glu Leu Gly Leu Arg Val Leu Tyr Gly 680 685 690 Asp Thr Asp Ser Leu Phe Ile Trp Asn Pro Asp Glu Asp Lys Leu 695 700 705 Arg Glu Leu Gln Glu Tyr Val Glu Lys Asn Phe Gly Leu Asp Leu 710 715 720 Glu Val Asp Lys Val Tyr Lys Phe Val Thr Phe Ser Gly Leu Lys 725 730 735 Lys Asn Tyr Ile Gly Ala Tyr Glu Asp Gly Ser Ile Asp Val Lys 740 745 750 Gly Met Val Ala Lys Lys Arg Asn Thr Pro Glu Phe Leu Lys Lys 755 760 765 Glu Phe Ser Glu Met Leu Ala Val Ile Gly Ser Val Lys Ser Pro 770 775 780 Glu Asp Phe Ile Lys Val Arg Arg Val Ile Arg Glu Arg Leu Arg 785 790 795 Lys Val Tyr His Gly Leu Arg Asp Leu Glu Phe Asn Leu Asp Glu 800 805 810 Leu Ala Ile Arg Met Ala Leu Asn Lys Pro Val Glu Ala Tyr Thr 815 820 825 Lys Asn Thr Pro Gln His Val Lys Ala Ala Arg Gln Leu Ile Arg 830 835 840 Ala Gly Val Gln Val Leu Pro Gly Asp Val Ile Ser Phe Val Lys 845 850 855 Val Lys Gly Lys Glu Gly Val Lys Pro Val Gln Leu Ala Arg Leu 860 865 870 Pro Glu Val Asp Val Glu Lys Tyr Val Glu Ser Met Arg Asn Val 875 880 885 Phe Glu Gln Leu Leu Leu Ala Ile Ser Met Ser Trp Asp Glu Ile 890 895 900 Ile Gly Ser Ser Arg Leu Glu Ala Phe Phe Ser Arg Arg Gly 905 910

【００４０】配列番号：2 配列の長さ：803 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Thr Glu Thr Ile Glu Phe Val Leu Leu Asp Ser Ser Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu Gly Lys Glu Pro Val Val Ile Leu Trp Gly Ile Thr Leu 20 25 30 Asp Gly Lys Arg Val Val Leu Leu Asp His Arg Phe Arg Pro Tyr 35 40 45 Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Arg Gly Tyr Glu Asp Met Val Glu Glu 50 55 60 Ile Ala Ala Ser Ile Arg Arg Leu Ser Val Val Lys Ser Pro Ile 65 70 75 Ile Asp Ala Lys Pro Leu Asp Lys Arg Tyr Phe Gly Arg Pro Arg 80 85 90 Lys Ala Val Lys Ile Thr Thr Met Ile Pro Glu Ser Val Arg His 95 100 105 Tyr Arg Glu Ala Val Lys Lys Ile Glu Gly Val Glu Asp Ser Leu 110 115 120 Glu Ala Asp Ile Arg Phe Ala Met Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Arg 125 130 135 Leu Tyr Pro Phe Thr Val Tyr Arg Ile Pro Val Glu Asp Ala Gly 140 145 150 Arg Asn Pro Gly Phe Arg Val Asp Arg Val Tyr Lys Val Ala Gly 155 160 165 Asp Pro Glu Pro Leu Ala Asp Ile Thr Arg Ile Asp Leu Pro Pro 170 175 180 Met Arg Leu Val Ala Phe Asp Ile Glu Val Tyr Ser Arg Arg Gly 185 190 195 Ser Pro Asn Pro Ala Arg Asp Pro Val Ile Ile Val Ser Leu Arg 200 205 210 Asp Ser Glu Gly Lys Glu Arg Leu Ile Glu Ala Glu Gly His Asp 215 220 225 Asp Arg Arg Val Leu Arg Glu Phe Val Glu Tyr Val Arg Ala Phe 230 235 240 Asp Pro Asp Ile Ile Val Gly Tyr Asn Ser Asn His Phe Asp Trp 245 250 255 Pro Tyr Leu Met Glu Arg Ala Arg Arg Leu Gly Ile Lys Leu Asp 260 265 270 Val Thr Arg Arg Val Gly Ala Glu Pro Thr Thr Ser Val Tyr Gly 275 280 285 His Val Ser Val Gln Gly Arg Leu Asn Val Asp Leu Tyr Asp Tyr 290 295 300 Ala Glu Glu Met Pro Glu Ile Lys Met Lys Thr Leu Glu Glu Val 305 310 315 Ala Glu Tyr Leu Gly Val Met Lys Lys Ser Glu Arg Val Ile Ile 320 325 330 Glu Trp Trp Arg Ile Pro Glu Tyr Trp Asp Asp Glu Lys Lys Arg 335 340 345 Gln Leu Leu Glu Arg Tyr Ala Leu Asp Asp Val Arg Ala Thr Tyr 350 355 360 Gly Leu Ala Glu Lys Met Leu Pro Phe Ala Ile Gln Leu Ser Thr 365 370 375 Val Thr Gly Val Pro Leu Asp Gln Val Gly Ala Met Gly Val Gly 380 385 390 Phe Arg Leu Glu Trp Tyr Leu Met Arg Ala Ala Tyr Asp Met Asn 395 400 405 Glu Leu Val Pro Asn Arg Val Glu Arg Arg Gly Glu Ser Tyr Lys 410 415 420 Gly Ala Val Val Leu Lys Pro Leu Lys Gly Val His Glu Asn Val 425 430 435 Val Val Leu Asp Phe Ser Ser Met Tyr Pro Ser Ile Met Ile Lys 440 445 450 Tyr Asn Val Gly Pro Asp Thr Ile Val Asp Asp Pro Ser Glu Cys 455 460 465 Pro Lys Tyr Gly Gly Cys Tyr Val Ala Pro Glu Val Gly His Arg 470 475 480 Phe Arg Arg Ser Pro Pro Gly Phe Phe Lys Thr Val Leu Glu Asn 485 490 495 Leu Leu Lys Leu Arg Arg Gln Val Lys Glu Lys Met Lys Glu Phe 500 505 510 Pro Pro Asp Ser Pro Glu Tyr Arg Leu Tyr Asp Glu Arg Gln Lys 515 520 525 Ala Leu Lys Val Leu Ala Asn Ala Ser Tyr Gly Tyr Met Gly Trp 530 535 540 Ser His Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Arg Cys Ala Glu Ala Val Thr 545 550 555 Ala Trp Gly Arg Asn Leu Ile Leu Thr Ala Ile Glu Tyr Ala Arg 560 565 570 Lys Leu Gly Leu Lys Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Ser Leu Phe 575 580 585 Val Val Tyr Asp Lys Glu Lys Val Glu Lys Leu Ile Glu Phe Val 590 595 600 Glu Lys Glu Leu Gly Phe Glu Ile Lys Ile Asp Lys Ile Tyr Lys 605 610 615 Lys Val Phe Phe Thr Glu Ala Lys Lys Arg Tyr Val Gly Leu Leu 620 625 630 Glu Asp Gly Arg Ile Asp Ile Val Gly Phe Glu Ala Val Arg Gly 635 640 645 Asp Trp Cys Glu Leu Ala Lys Glu Val Gln Glu Lys Ala Ala Glu 650 655 660 Ile Val Leu Asn Thr Gly Asn Val Asp Lys Ala Ile Ser Tyr Ile 665 670 675 Arg Glu Val Ile Lys Gln Leu Arg Glu Gly Lys Val Pro Ile Thr 680 685 690 Lys Leu Ile Ile Trp Lys Thr Leu Ser Lys Arg Ile Glu Glu Tyr 695 700 705 Glu His Asp Ala Pro His Val Met Ala Ala Arg Arg Met Lys Glu 710 715 720 Ala Gly Tyr Glu Val Ser Pro Gly Asp Lys Val Gly Tyr Val Ile 725 730 735 Val Lys Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Arg Ala Tyr Pro Tyr Phe 740 745 750 Met Val Asp Pro Ser Thr Ile Asp Val Asn Tyr Tyr Ile Asp His 755 760 765 Gln Ile Val Pro Ala Ala Leu Arg Ile Leu Ser Tyr Phe Gly Val 770 775 780 Thr Glu Lys Gln Leu Lys Ala Ala Ala Thr Val Gln Arg Ser Leu 785 790 795 Phe Asp Phe Phe Ala Ser Lys Lys 800

【００４１】配列番号：3 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： WSSYTSTACC CSWSSATCAT 20

【００４２】配列番号：4 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TCNGTRTCNC CRTARATNAC 20

【００４３】配列番号：5 配列の長さ：416 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： AGC CTG TAC CCC AGT ATC ATA AAG AGG TGG AAC CTA AGC TAC GAG 45 Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Lys Arg Trp Asn Leu Ser Tyr Glu 1 5 10 15 ACC GTA AAC CCC GTA TAC TGC CCC GAA TCG AAG CTA GTG GAG GTT 90 Thr Val Asn Pro Val Tyr Cys Pro Glu Ser Lys Leu Val Glu Val 20 25 30 CCC GAT GTA GGG CAT AAG GTG TGC ATG AGC ATA CCC GGC CTG ACC 135 Pro Asp Val Gly His Lys Val Cys Met Ser Ile Pro Gly Leu Thr 35 40 45 TCG CAG ATA GTT GGC CTG CTT AGG GAC TAT CGA GTC AAG ATA TAC 180 Ser Gln Ile Val Gly Leu Leu Arg Asp Tyr Arg Val Lys Ile Tyr 50 55 60 AAG AAG AAG GCC AAG GAT AAG AGT CTG CCG GAT GAT GTT AGA GCA 225 Lys Lys Lys Ala Lys Asp Lys Ser Leu Pro Asp Asp Val Arg Ala 65 70 75 TGG TAT AAT ACA GTC CAG GCA GCC ATG AAG GTG TAT ATA AAT GCC 270 Trp Tyr Asn Thr Val Gln Ala Ala Met Lys Val Tyr Ile Asn Ala 80 85 90 AGC TAT GGA GTC TTC GGG GCC GAG AGC TTC CCG TTC TAC GCG CCG 315 Ser Tyr Gly Val Phe Gly Ala Glu Ser Phe Pro Phe Tyr Ala Pro 95 100 105 CCG GTA GCG GAG AGC GTC ACA GCC ATA GGC AGG TAT ACT ATC AAG 360 Pro Val Ala Glu Ser Val Thr Ala Ile Gly Arg Tyr Thr Ile Lys 110 115 120 CAG ACG CTG CAG AAG GCT GGC GAA CTA GGG CTC CGC GTG ATC TAT 405 Gln Thr Leu Gln Lys Ala Gly Glu Leu Gly Leu Arg Val Leu Tyr 125 130 135 GGC GAT ACG GA 416 Gly Asp Thr

【００４４】配列番号：6 配列の長さ：422 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TCC ATG TAC CCG AGC ATA ATG ATA AAG TAC AAC GTG GGC CCC GAC 45 Ser Met Tyr Pro Ser Ile Met Ile Lys Tyr Asn Val Gly Pro Asp 1 5 10 15 ACT ATA GTC GAC GAC CCC TCG GAG TGC CCA AAG TAC GGC GGC TGC 90 Thr Ile Val Asp Asp Pro Ser Glu Cys Pro Lys Tyr Gly Gly Cys 20 25 30 TAT GTA GCC CCC GAG GTC GGG CAC CGG TTC CGT CGC TCC CCG CCA 135 Tyr Val Ala Pro Glu Val Gly His Arg Phe Arg Arg Ser Pro Pro 35 40 45 GGC TTC TTC AAG ACC GTG CTC GAG AAC CTA CTG AAG CTA CGC CGA 180 Gly Phe Phe Lys Thr Val Leu Glu Asn Leu Leu Lys Leu Arg Arg 50 55 60 CAG GTA AAG GAG AAG ATG AAG GAG TTT CCG CCT GAC AGC CCC GAG 225 Gln Val Lys Glu Lys Met Lys Glu Phe Pro Pro Asp Ser Pro Glu 65 70 75 TAC AGG CTC TAC GAT GAG CGC CAG AAG GCG CTC AAG GTT CTT GCG 270 Tyr Arg Leu Tyr Asp Glu Arg Gln Lys Ala Leu Lys Val Leu Ala 80 85 90 AAC GCG AGC TAT GGC TAC ATG GGG TGG AGC CAT GCC CGC TGG TAC 315 Asn Ala Ser Tyr Gly Tyr Met Gly Trp Ser His Ala Arg Trp Tyr 95 100 105 TGC AAA CGC TGC GCC GAG GCT GTC ACA GCC TGG GGC CGT AAC CTT 360 Cys Lys Arg Cys Ala Glu Ala Val Thr Ala Trp Gly Arg Asn Leu 110 115 120 ATA CTG ACA GCT ATC GAG TAT GCC AGG AAG CTC GGC CTA AAG GTG 405 Ile Leu Thr Ala Ile Glu Tyr Ala Arg Lys Leu Gly Leu Lys Val 125 130 135 ATA TAT GGG TAC ACC GA 422 Ile Tyr Gly Asp Thr 140

【００４５】配列番号：7 配列の長さ：3437 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：ピロディクティウム オクルタム (Pyrodicti
um occultum) 株名：DSM2709 ^T 配列： CCCGGGCCAC TCCATCCATA GGCTCAAGGC GCTCCAGGCT CCTTTTAAAC ATTACATGCA 60 ATTCTAAGGG ACTCTGCGCG CGGCTTAGGT CACCCACCTT ATACGGTGAT ACGTGGGAGC 120 TGGATAGGGG GCGGTGCGTG GTTAGGCGCT CAAAGAGGCG TGGAGGGGAG CGCGACCTAC 180 TCGAGTTCCT AGCTGGTGGC GTAACCGGCG CCCGCAGGGC TAAGGGCCGA ACCACCGAGA 240 GCGGGGATGG TACGGGCAGC GAGAGGGATG GTGCTAAGCC CCTCTGGGAG GGGAATACGG 300 CCAGGAGGGC CGGGGTGGAG AGGCTATACG ATAACAGCCT CTACGAACTG TTATCGGAAA 360 TATCCTCATC TAGGAGACGC GGGTCTAGCC ATCCAAGAGA CGATGATCGG GAGGGGGCTG 420 ATCTCACTGG CGGC ATG AAG GCT CAG CCG CAG CTT GCT ACG CAC CAA GGG 470 Met Lys Ala Gln Pro Gln Leu Ala Thr His Gln Gly 1 5 10 CTA ACG ACA GAG AAG GCC GTG GTG AAC GTG GAT GCA GAA ACC TGG 515 Leu Thr Thr Glu Lys Ala Val Val Asn Val Asp Ala Glu Thr Trp 15 20 25 GCT GAG CAG CAT GCA TGG AGC ACT ATG GTG CCT CAG AGC TCT ACG 560 Ala Glu Gln His Ala Trp Ser Thr Met Val Pro Gln Ser Ser Thr 30 35 40 CCC CCC GCG GGG TAT GGA GAT GAT CTG GCA GGG AAG CTG GGT TCG 605 Pro Pro Ala Gly Tyr Gly Asp Asp Leu Ala Gly Lys Leu Gly Ser 45 50 55 CTG CTA GGG GGC TCA CGG GGT GCC CTT GAG AGA CTT TCC GCT CTC 650 Leu Leu Gly Gly Ser Arg Gly Ala Leu Glu Arg Leu Ser Ala Leu 60 65 70 CCG CTT ACG CGC AAA CCC CTG GAA GCG CGT GAT GGG GTT GAG GGT 695 Pro Leu Thr Arg Lys Pro Leu Glu Ala Arg Asp Gly Val Glu Gly 75 80 85 TTC CTG CTT CAA ACA ATG TAT GAC GGG GAG AGG GGT GTT GCG GCG 740 Phe Leu Leu Gln Thr Met Tyr Asp Gly Glu Arg Gly Val Ala Ala 90 95 100 GCT AAG ATA TAT GAC GAC CGT AAT GGC ATT GTC TAC GTC TAC TTT 785 Ala Lys Ile Tyr Asp Asp Arg Asn Gly Ile Val Tyr Val Tyr Phe 105 110 115 GAT AGG ACT GGT TAC ATG CCA TAC TTT CTA ACC GAT ATA CCA CCG 830 Asp Arg Thr Gly Tyr Met Pro Tyr Phe Leu Thr Asp Ile Pro Pro 120 125 130 GAC AAG CTG CAG GAG CTT CAC GAG GTG GTG CGG CAT AAG GGG TTC 875 Asp Lys Leu Gln Glu Leu His Glu Val Val Arg His Lys Gly Phe 135 140 145 GAC CAT GTT GAG GTT GTG GAG AAG TTT GAT CTC CTG CGT TGG CAG 920 Asp His Val Glu Val Val Glu Lys Phe Asp Leu Leu Arg Trp Gln 150 155 160 CGT AGG AAG GTT ACT AAG ATC GTT GTA AAG ACC CCC GAT GTG GTG 965 Arg Arg Lys Val Thr Lys Ile Val Val Lys Thr Pro Asp Val Val 165 170 175 AGG GTG CTC CGT GAC AAG GTT CCA CGC GCC TGG GAG GCC AAT ATA 1010 Arg Val Leu Arg Asp Lys Val Pro Arg Ala Trp Glu Ala Asn Ile 180 185 190 AAG TTT CAC CAC AAC TAT ATA TAT GAT TAT GGG CTA GTG CCT GGA 1055 Lys Phe His His Asn Tyr Ile Tyr Asp Tyr Gly Leu Val Pro Gly 195 200 205 ATG AAG TAC CGC GTC GGG AAG GGC AGG CTA ATC CTC CTG GGG GGA 1100 Met Lys Tyr Arg Val Gly Lys Gly Arg Leu Ile Leu Leu Gly Gly 210 215 220 GAG GCT AGC GGG GAC GAT GAG CGC CAT ATA CGC GAG ATA TTC AGT 1145 Glu Ala Ser Gly Asp Asp Glu Arg His Ile Arg Glu Ile Phe Ser 225 230 235 GGT GAG GAT GAA AGC ACT ATT GAG ATG GCA GTA AAA TGG CTC TCC 1190 Gly Glu Asp Glu Ser Thr Ile Glu Met Ala Val Lys Trp Leu Ser 240 245 250 CTG TTT GAG CAG CCT CCC CCT AAG CCT CGT AGA CTT GCA GTG GAC 1235 Leu Phe Glu Gln Pro Pro Pro Lys Pro Arg Arg Leu Ala Val Asp 255 260 265 ATC GAG GTA TTC ACT CCC TTC AAG GGC CGT ATA CCA GAC CCT TCC 1280 Ile Glu Val Phe Thr Pro Phe Lys Gly Arg Ile Pro Asp Pro Ser 270 275 280 ACA GCC AGC TAC CCT GTA ATC AGT GTA GCT ATG TCC TCG GAC GAG 1325 Thr Ala Ser Tyr Pro Val Ile Ser Val Ala Met Ser Ser Asp Glu 285 290 295 GGG TGG CGC GCG GTC TAT GTG CTG GCG CGC CCG GGC GTG CCT ATG 1370 Gly Trp Arg Ala Val Tyr Val Leu Ala Arg Pro Gly Val Pro Met 300 305 310 AAT CCC CCG CGT GGC CCA TTA CCC GAG AAT CTA CAC GTA GAG ATA 1415 Asn Pro Pro Arg Gly Pro Leu Pro Glu Asn Leu His Val Glu Ile 315 320 325 TTC GAC GAT GAG CGT GCA CTC ATA TTG GAG GCG TTC CGG CTT ATA 1460 Phe Asp Asp Glu Arg Ala Leu Ile Leu Glu Ala Phe Arg Leu Ile 330 335 340 TCA AAC TAC CCG GTG CTG CTC ACC TTC AAC GGT GAT AAC TTT GAC 1505 Ser Asn Tyr Pro Val Leu Leu Thr Phe Asn Gly Asp Asn Phe Asp 345 350 355 CTC CCC TAC CTC TAC AAC CGG GCA GTA AAA CTA GGC ATA CCA CGC 1550 Leu Pro Tyr Leu Tyr Asn Arg Ala Val Lys Leu Gly Ile Pro Arg 360 365 370 GAG TAC ATA CCA TTC CGT GCT AGA AGC GAC TAT GTG ACA TTG GAG 1595 Glu Tyr Ile Pro Phe Arg Ala Arg Ser Asp Tyr Val Thr Leu Glu 375 380 385 TAC GGC TTC CAT ATA GAC CTC TAT AAG TTC TTC AGC ACC AAG GCG 1640 Tyr Gly Phe His Ile Asp Leu Tyr Lys Phe Phe Ser Thr Lys Ala 390 395 400 GTT CAG GCA TAT GCC TTC GGC AAC GCT TAC CAG GAG TTC ACC CTT 1685 Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Asn Ala Tyr Gln Glu Phe Thr Leu 405 410 415 GAT GCT ATA GCC TCT GCG TTG CTG GGG GAG CAC AAG GTG GAG GTC 1730 Asp Ala Ile Ala Ser Ala Leu Leu Gly Glu His Lys Val Glu Val 420 425 430 GAG TCT ACT GTA AGC GAC CTA CCA TTC TTT GAG CTG GTC AGG TAT 1775 Glu Ser Thr Val Ser Asp Leu Pro Phe Phe Glu Leu Val Arg Tyr 435 440 445 AAT GTG CGT GAC GCT GAT CTA ACC CTT AGG CTA ACA ACG TTC AAC 1820 Asn Val Arg Asp Ala Asp Leu Thr Leu Arg Leu Thr Thr Phe Asn 450 455 460 AAC GAC CTG GTA TGG TCC CTT ATC ATA CTG CTA ATG CGT ATC TCC 1865 Asn Asp Leu Val Trp Ser Leu Ile Ile Leu Leu Met Arg Ile Ser 465 470 475 AAG CTG CCT CTG GAG GAT GTC ACG AGA AGC CAG GTC TCA GCT TGG 1910 Lys Leu Pro Leu Glu Asp Val Thr Arg Ser Gln Val Ser Ala Trp 480 485 490 GTG AAG AGC TTA TTC TAC TGG GAG CAT AGG AGG AGG GGC TAC CTA 1955 Val Lys Ser Leu Phe Tyr Trp Glu His Arg Arg Arg Gly Tyr Leu 495 500 505 ATA CCA TCA AGG GAG GAG ATA ATA CGG CTT AAG GGC ACC ACC CGC 2000 Ile Pro Ser Arg Glu Glu Ile Ile Arg Leu Lys Gly Thr Thr Arg 510 515 520 TCT GAA GCC CTG ATA AAG GGT AAG AAG TAT CAG GGG GCG CTA GTC 2045 Ser Glu Ala Leu Ile Lys Gly Lys Lys Tyr Gln Gly Ala Leu Val 525 530 535 CTT GAC CCG CCT AGC GGC ATA TAC TTC AAC ATA GTG GTG CTT GAC 2090 Leu Asp Pro Pro Ser Gly Ile Tyr Phe Asn Ile Val Val Leu Asp 540 545 550 TTC GCC AGC CTG TAC CCC AGT ATA ATA AAG AGG TGG AAC CTA AGC 2135 Phe Ala Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Lys Arg Trp Asn Leu Ser 555 560 565 TAC GAG ACC GTA AAC CCC GTA TAC TGC CCC GAA TCG AAG CTA GTG 2180 Tyr Glu Thr Val Asn Pro Val Tyr Cys Pro Glu Ser Lys Leu Val 570 575 580 GAG GTT CCC GAT GTA GGG CAT AAG GTG TGC ATG AGC ATA CCC GGC 2225 Glu Val Pro Asp Val Gly His Lys Val Cys Met Ser Ile Pro Gly 585 590 595 CTG ACC TCG CAG ATA GTT GGC CTG CTT AGG GAC TAT CGA GTC AAG 2270 Leu Thr Ser Gln Ile Val Gly Leu Leu Arg Asp Tyr Arg Val Lys 600 605 610 ATA TAC AAG AAG AAG GCC AAG GAT AAG AGT CTG CCG GAT GAT GTT 2315 Ile Tyr Lys Lys Lys Ala Lys Asp Lys Ser Leu Pro Asp Asp Val 615 620 625 AGA GCA TGG TAT AAT ACA GTC CAG GCA GCC ATG AAG GTG TAT ATA 2360 Arg Ala Trp Tyr Asn Thr Val Gln Ala Ala Met Lys Val Tyr Ile 630 635 640 AAT GCC AGC TAT GGA GTC TTC GGG GCC GAG AGC TTC CCG TTC TAC 2405 Asn Ala Ser Tyr Gly Val Phe Gly Ala Glu Ser Phe Pro Phe Tyr 645 650 655 GCG CCG CCG GTA GCG GAG AGC GTC ACA GCC ATA GGC AGG TAT ACT 2450 Ala Pro Pro Val Ala Glu Ser Val Thr Ala Ile Gly Arg Tyr Thr 660 665 670 ATC AAG CAG ACG CTG CAG AAG GCT GGC GAA CTA GGG CTC CGC GTG 2495 Ile Lys Gln Thr Leu Gln Lys Ala Gly Glu Leu Gly Leu Arg Val 675 680 685 CTC TAT GGC GAT ACG GAC TCA CTA TTC ATA TGG AAT CCA GAT GAG 2540 Leu Tyr Gly Asp Thr Asp Ser Leu Phe Ile Trp Asn Pro Asp Glu 690 695 700 GAT AAG CTG CGG GAG CTG CAA GAG TAT GTA GAG AAG AAC TTT GGC 2585 Asp Lys Leu Arg Glu Leu Gln Glu Tyr Val Glu Lys Asn Phe Gly 705 710 715 CTA GAC CTT GAG GTT GAT AAG GTC TAT AAA TTC GTG ACA TTT AGC 2630 Leu Asp Leu Glu Val Asp Lys Val Tyr Lys Phe Val Thr Phe Ser 720 725 730 GGC CTG AAG AAG AAC TAT ATA GGC GCC TAC GAG GAT GGA AGC ATC 2675 Gly Leu Lys Lys Asn Tyr Ile Gly Ala Tyr Glu Asp Gly Ser Ile 735 740 745 GAT GTC AAG GGT ATG GTC GCT AAG AAG CGT AAT ACG CCG GAG TTC 2720 Asp Val Lys Gly Met Val Ala Lys Lys Arg Asn Thr Pro Glu Phe 750 755 760 CTC AAG AAG GAG TTT AGC GAG ATG CTA GCA GTT ATA GGC TCT GTT 2765 Leu Lys Lys Glu Phe Ser Glu Met Leu Ala Val Ile Gly Ser Val 765 770 775 AAG AGC CCT GAG GAC TTC ATA AAG GTG AGG AGA GTT ATA CGT GAA 2810 Lys Ser Pro Glu Asp Phe Ile Lys Val Arg Arg Val Ile Arg Glu 780 785 790 AGG CTG CGC AAA GTA TAC CAT GGC CTG CGC GAC CTG GAG TTC AAC 2855 Arg Leu Arg Lys Val Tyr His Gly Leu Arg Asp Leu Glu Phe Asn 795 800 805 TTA GAC GAG CTA GCC ATA AGG ATG GCT TTA AAC AAG CCC GTT GAG 2900 Leu Asp Glu Leu Ala Ile Arg Met Ala Leu Asn Lys Pro Val Glu 810 815 820 GCC TAT ACC AAG AAT ACG CCC CAG CAT GTG AAG GCT GCG CGG CAG 2945 Ala Tyr Thr Lys Asn Thr Pro Gln His Val Lys Ala Ala Arg Gln 825 830 835 CTC ATA AGG GCG GGG GTG CAG GTG CTG CCA GGT GAT GTC ATA TCC 2990 Leu Ile Arg Ala Gly Val Gln Val Leu Pro Gly Asp Val Ile Ser 840 845 850 TTC GTT AAA GTG AAG GGC AAG GAG GGT GTT AAG CCG GTC CAA CTC 3035 Phe Val Lys Val Lys Gly Lys Glu Gly Val Lys Pro Val Gln Leu 855 860 865 GCA AGA CTG CCG GAG GTT GAT GTA GAG AAG TAT GTG GAG AGC ATG 3080 Ala Arg Leu Pro Glu Val Asp Val Glu Lys Tyr Val Glu Ser Met 870 875 880 AGG AAT GTG TTT GAA CAG CTA CTG CTT GCA ATA AGT ATG TCG TGG 3125 Arg Asn Val Phe Glu Gln Leu Leu Leu Ala Ile Ser Met Ser Trp 885 890 895 GAT GAG ATA ATA GGC TCC TCG AGG CTT GAG GCC TTC TTT AGC CGC 3170 Asp Glu Ile Ile Gly Ser Ser Arg Leu Glu Ala Phe Phe Ser Arg 900 905 910 CGG GGC TAGCTTGAAG AAAGCTATCT TTTCCGGCTT CTACGCCTCT TCTTAGGCCT 3226 Arg Gly CTCCTCTAGC TCTTCCAAGC CTTCCTCGAG TCGCTTGATC TCCTCTTCGC CAAGCGATAG 3286 CTGTGCCTCC CCGCCCATCT TCTTGGGCTC TTTTGTTGCC TCTATGGCGT ACTCCTCTAG 3346 CTGTCGTTTT GCCGCCTCGT CAAGGTAGTA GGATATCACA TACATGCGTC TGTCAAGGTA 3406 TGCGTCCTCG AGCCATGCAT TATCGAAGCT T 3437

【００４６】配列番号：8 配列の長さ：3068 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：ピロディクティウム オクルタム (Pyrodicti
um occultum) 株名：DSM2709 ^T 配列の特徴： 配列： CTGCAGCTCT CGGGGCTACA GCTCCTTCGT GCTCGAGGTG GAGGCCGGCA ACTATCCAGC 60 GCAGAGCCTA TATGCGAGAA GCTCCTTCAA GCCCGTCATG ATAGTGCCCG ACTACTATGG 120 CGAGGGCCGG CACGCTGTGG TCATGGCGTT GTTGGGGGAG AGGCCCTGCT GCCTAGACGG 180 CTAGCCGTCC TCATGCGTTA GCGGGCAGAG GCAGGCAATG ATATACGATT ATGTAGGGGC 240 GGGTGGTGGT AGATTCTCCA GGGCAGAGCC AGCCC ATG ACA GAG ACT ATA GAG TTC 296 Met Thr Glu Thr Ile Glu Phe 1 5 GTG CTG CTA GAC TCT AGC TAC GAG ATA CTG GGG AAG GAG CCG GTA 341 Val Leu Leu Asp Ser Ser Tyr Glu Ile Leu Gly Lys Glu Pro Val 10 15 20 GTA ATC CTC TGG GGG ATA ACG CTT GAC GGT AAA CGT GTC GTG CTT 386 Val Ile Leu Trp Gly Ile Thr Leu Asp Gly Lys Arg Val Val Leu 25 30 35 CTA GAC CAC CGC TTC CGC CCC TAC TTC TAC GCC CTC ATA GCC CGG 431 Leu Asp His Arg Phe Arg Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Arg 40 45 50 GGC TAT GAG GAT ATG GTG GAG GAG ATA GCA GCT TCC ATA AGG AGG 476 Gly Tyr Glu Asp Met Val Glu Glu Ile Ala Ala Ser Ile Arg Arg 55 60 65 CTT AGT GTG GTC AAG AGT CCG ATA ATA GAT GCC AAG CCT CTT GAT 521 Leu Ser Val Val Lys Ser Pro Ile Ile Asp Ala Lys Pro Leu Asp 70 75 80 AAG AGG TAC TTC GGC AGG CCC CGT AAG GCG GTG AAG ATT ACC ACT 566 Lys Arg Tyr Phe Gly Arg Pro Arg Lys Ala Val Lys Ile Thr Thr 85 90 95 ATG ATA CCC GAG TCT GTT AGA CAC TAC CGC GAG GCG GTG AAG AAG 611 Met Ile Pro Glu Ser Val Arg His Tyr Arg Glu Ala Val Lys Lys 100 105 110 ATA GAG GGT GTG GAG GAC TCC CTC GAG GCA GAT ATA AGG TTT GCA 656 Ile Glu Gly Val Glu Asp Ser Leu Glu Ala Asp Ile Arg Phe Ala 115 120 125 ATG AGA TAT CTG ATA GAT AAG AGG CTC TAC CCG TTC ACG GTT TAC 701 Met Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Arg Leu Tyr Pro Phe Thr Val Tyr 130 135 140 CGG ATC CCC GTA GAG GAT GCG GGC CGC AAT CCA GGC TTC CGT GTT 746 Arg Ile Pro Val Glu Asp Ala Gly Arg Asn Pro Gly Phe Arg Val 145 150 155 GAC CGT GTC TAC AAG GTT GCT GGC GAC CCG GAG CCC CTA GCG GAT 791 Asp Arg Val Tyr Lys Val Ala Gly Asp Pro Glu Pro Leu Ala Asp 160 165 170 ATA ACG CGG ATC GAC CTT CCC CCG ATG AGG CTG GTA GCT TTT GAT 836 Ile Thr Arg Ile Asp Leu Pro Pro Met Arg Leu Val Ala Phe Asp 175 180 185 ATA GAG GTG TAT AGC AGG AGG GGG AGC CCT AAC CCT GCA AGG GAT 881 Ile Glu Val Tyr Ser Arg Arg Gly Ser Pro Asn Pro Ala Arg Asp 190 195 200 CCA GTG ATA ATA GTG TCG CTG AGG GAC AGC GAG GGC AAG GAG AGG 926 Pro Val Ile Ile Val Ser Leu Arg Asp Ser Glu Gly Lys Glu Arg 205 210 215 CTC ATA GAA GCT GAA GGC CAT GAC GAC AGG AGG GTT CTG AGG GAG 971 Leu Ile Glu Ala Glu Gly His Asp Asp Arg Arg Val Leu Arg Glu 220 225 230 TTC GTA GAG TAC GTG AGA GCC TTC GAC CCC GAC ATA ATA GTG GGC 1016 Phe Val Glu Tyr Val Arg Ala Phe Asp Pro Asp Ile Ile Val Gly 235 240 245 TAT AAC AGT AAC CAC TTC GAC TGG CCC TAC CTA ATG GAG CGC GCC 1061 Tyr Asn Ser Asn His Phe Asp Trp Pro Tyr Leu Met Glu Arg Ala 250 255 260 CGT AGG CTC GGG ATT AAG CTC GAC GTT ACA CGC CGT GTG GGG GCA 1106 Arg Arg Leu Gly Ile Lys Leu Asp Val Thr Arg Arg Val Gly Ala 265 270 275 GAG CCC ACC ACC AGC GTC TAC GGC CAC GTC TCG GTG CAG GGT AGG 1151 Glu Pro Thr Thr Ser Val Tyr Gly His Val Ser Val Gln Gly Arg 280 285 290 CTG AAC GTG GAC CTC TAC GAC TAT GCC GAG GAG ATG CCG GAG ATA 1196 Leu Asn Val Asp Leu Tyr Asp Tyr Ala Glu Glu Met Pro Glu Ile 295 300 305 AAG ATG AAG ACG CTT GAG GAG GTA GCG GAG TAC CTA GGC GTT ATG 1241 Lys Met Lys Thr Leu Glu Glu Val Ala Glu Tyr Leu Gly Val Met 310 315 320 AAG AAG AGC GAG CGT GTG ATA ATA GAG TGG TGG AGG ATA CCC GAG 1286 Lys Lys Ser Glu Arg Val Ile Ile Glu Trp Trp Arg Ile Pro Glu 325 330 335 TAC TGG GAT GAC GAG AAG AAG AGG CAG CTG CTA GAG CGC TAC GCG 1331 Tyr Trp Asp Asp Glu Lys Lys Arg Gln Leu Leu Glu Arg Tyr Ala 340 345 350 CTC GAC GAT GTG AGG GCT ACC TAC GGC CTC GCG GAA AAG ATG CTA 1376 Leu Asp Asp Val Arg Ala Thr Tyr Gly Leu Ala Glu Lys Met Leu 355 360 365 CCG TTC GCC ATA CAG CTC TCC ACT GTT ACG GGT GTG CCT CTC GAC 1421 Pro Phe Ala Ile Gln Leu Ser Thr Val Thr Gly Val Pro Leu Asp 370 375 380 CAG GTA GGT GCT ATG GGC GTA GGC TTC CGC CTA GAG TGG TAT CTC 1466 Gln Val Gly Ala Met Gly Val Gly Phe Arg Leu Glu Trp Tyr Leu 385 390 395 ATG CGT GCA GCC TAC GAT ATG AAC GAG CTG GTG CCG AAC CGG GTG 1511 Met Arg Ala Ala Tyr Asp Met Asn Glu Leu Val Pro Asn Arg Val 400 405 410 GAG AGG AGG GGG GAG AGC TAC AAG GGT GCA GTA GTG TTA AAG CCT 1556 Glu Arg Arg Gly Glu Ser Tyr Lys Gly Ala Val Val Leu Lys Pro 415 420 425 CTC AAG GGA GTC CAT GAG AAT GTT GTG GTG CTC GAT TTC AGT TCC 1601 Leu Lys Gly Val His Glu Asn Val Val Val Leu Asp Phe Ser Ser 430 435 440 ATG TAC CCG AGC ATA ATG ATA AAG TAC AAC GTG GGC CCC GAC ACT 1646 Met Tyr Pro Ser Ile Met Ile Lys Tyr Asn Val Gly Pro Asp Thr 445 450 455 ATA GTC GAC GAC CCC TCG GAG TGC CCA AAG TAC GGC GGC TGC TAT 1691 Ile Val Asp Asp Pro Ser Glu Cys Pro Lys Tyr Gly Gly Cys Tyr 460 465 470 GTA GCC CCC GAG GTC GGG CAC CGG TTC CGT CGC TCC CCG CCA GGC 1736 Val Ala Pro Glu Val Gly His Arg Phe Arg Arg Ser Pro Pro Gly 475 480 485 TTC TTC AAG ACC GTG CTC GAG AAC CTA CTG AAG CTA CGC CGA CAG 1781 Phe Phe Lys Thr Val Leu Glu Asn Leu Leu Lys Leu Arg Arg Gln 490 495 500 GTA AAG GAG AAG ATG AAG GAG TTT CCG CCT GAC AGC CCC GAG TAC 1826 Val Lys Glu Lys Met Lys Glu Phe Pro Pro Asp Ser Pro Glu Tyr 505 510 515 AGG CTC TAC GAT GAG CGC CAG AAG GCG CTC AAG GTT CTT GCG AAC 1871 Arg Leu Tyr Asp Glu Arg Gln Lys Ala Leu Lys Val Leu Ala Asn 520 525 530 GCG AGC TAT GGC TAC ATG GGG TGG AGC CAT GCC CGC TGG TAC TGC 1916 Ala Ser Tyr Gly Tyr Met Gly Trp Ser His Ala Arg Trp Tyr Cys 535 540 545 AAA CGC TGC GCC GAG GCT GTC ACA GCC TGG GGC CGT AAC CTT ATA 1961 Lys Arg Cys Ala Glu Ala Val Thr Ala Trp Gly Arg Asn Leu Ile 550 555 560 CTG ACA GCT ATC GAG TAT GCC AGG AAG CTC GGC CTA AAG GTT ATA 2006 Leu Thr Ala Ile Glu Tyr Ala Arg Lys Leu Gly Leu Lys Val Ile 565 570 575 TAT GGA GAC ACC GAC TCC CTC TTC GTG GTC TAT GAC AAG GAG AAG 2051 Tyr Gly Asp Thr Asp Ser Leu Phe Val Val Tyr Asp Lys Glu Lys 580 585 590 GTT GAG AAG CTG ATA GAG TTT GTC GAG AAG GAG CTG GGC TTT GAG 2096 Val Glu Lys Leu Ile Glu Phe Val Glu Lys Glu Leu Gly Phe Glu 595 600 605 ATA AAG ATA GAC AAG ATC TAC AAG AAA GTG TTC TTC ACG GAG GCT 2141 Ile Lys Ile Asp Lys Ile Tyr Lys Lys Val Phe Phe Thr Glu Ala 610 615 620 AAG AAG CGC TAT GTA GGT CTC CTC GAG GAC GGA CGT ATA GAC ATC 2186 Lys Lys Arg Tyr Val Gly Leu Leu Glu Asp Gly Arg Ile Asp Ile 625 630 635 GTG GGC TTT GAA GCA GTC CGC GGC GAC TGG TGC GAG CTG GCT AAG 2231 Val Gly Phe Glu Ala Val Arg Gly Asp Trp Cys Glu Leu Ala Lys 640 645 650 GAG GTG CAG GAG AAG GCG GCT GAG ATA GTG TTG AAT ACG GGG AAC 2276 Glu Val Gln Glu Lys Ala Ala Glu Ile Val Leu Asn Thr Gly Asn 655 660 665 GTG GAC AAG GCT ATA AGC TAC ATA AGG GAG GTA ATA AAG CAG CTC 2321 Val Asp Lys Ala Ile Ser Tyr Ile Arg Glu Val Ile Lys Gln Leu 670 675 680 CGC GAG GGC AAG GTG CCA ATA ACA AAG CTT ATC ATA TGG AAG ACG 2366 Arg Glu Gly Lys Val Pro Ile Thr Lys Leu Ile Ile Trp Lys Thr 685 690 695 CTG AGC AAG AGG ATA GAG GAG TAC GAG CAT GAC GCG CCT CAT GTG 2411 Leu Ser Lys Arg Ile Glu Glu Tyr Glu His Asp Ala Pro His Val 700 705 710 ATG GCT GCA CGG CGT ATG AAG GAG GCA GGC TAC GAG GTG TCT CCC 2456 Met Ala Ala Arg Arg Met Lys Glu Ala Gly Tyr Glu Val Ser Pro 715 720 725 GGC GAT AAG GTG GGC TAC GTC ATA GTT AAG GGT AGC GGG AGT GTG 2501 Gly Asp Lys Val Gly Tyr Val Ile Val Lys Gly Ser Gly Ser Val 730 735 740 TCC AGC AGG GCC TAC CCC TAC TTC ATG GTT GAT CCA TCG ACC ATC 2546 Ser Ser Arg Ala Tyr Pro Tyr Phe Met Val Asp Pro Ser Thr Ile 745 750 755 GAC GTC AAC TAC TAT ATT GAC CAC CAG ATA GTG CCG GCT GCT CTG 2591 Asp Val Asn Tyr Tyr Ile Asp His Gln Ile Val Pro Ala Ala Leu 760 765 770 AGG ATA CTC TCC TAC TTC GGA GTC ACC GAG AAA CAG CTC AAG GCG 2636 Arg Ile Leu Ser Tyr Phe Gly Val Thr Glu Lys Gln Leu Lys Ala 775 780 785 GCG GCT ACG GTG CAG AGA AGC CTC TTC GAC TTC TTC GCC TCA AAG 2681 Ala Ala Thr Val Gln Arg Ser Leu Phe Asp Phe Phe Ala Ser Lys 790 795 800 AAA TAGCTCCTCC ACCCGGCTAG CTTTATTAAA CGCGTAGGCA CAAGCTCTCC 2734 Lys GAGAGGCCTG GAGGGTAAGG GGTGCAATAG AGCCAGCCTC TCCGCCGAGG CCGTGCGCTC 2794 TTGGGTGGCT TGGAATGATC CTCGCATCCT GGAGATCCTT GGCGTGGATA GTAAGGCGTG 2854 TCGACGTAGT ACTCGAGGTT GTCGATGCGC GCGACCCGGT CTCGACAAGG AGCCTGCGGC 2914 TAGAGAGGAT GGTGCAGAGC CTAGGGAAGC GCCTCCTAAT AGTCATCAAT AAGGCTGACC 2974 TGGTGCCCCG CGGGGTCGCT GAGAAGTGGA AGCGCATCCT CGAGGATCAG GGTTACCGTA 3034 CTGTCTACAT GGCTGCCCGC GATCACAAGG GTAC 3068

【００４７】配列番号：9 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTACATATTG TCGTTAGAAC GCG 23

【００４８】配列番号：10 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TAATACGACT CACTATAGGG AGA 23

【００４９】配列番号：11 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGGGTCGTCG ACTATAGT 18

【００５０】配列番号：12 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATACTGACAG CTATCGAG 18

【００５１】配列番号：13 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTATACGGGG TTTACGGT 18

【００５２】配列番号：14 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATCAAGCAGA CGCTGCAG 18

【００５３】配列番号：15 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATCTCACTGG CGCCATGGAG GCTCAGCCGC 30

【００５４】配列番号：16 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGCATGGAGC ACCATGGTGC CTCAG 25

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＰＯ５００−IIに挿入されている約３．１ｋ
ｂのＤＮＡ断片の制限酵素地図、及びＰＣＲに用いたプ
ライマーの位置を示す図である。

【図２】ｐＰＯ１００−Ｉに挿入されている約４．２ｋ
ｂのＤＮＡ断片の制限酵素地図、及びＰＣＲに用いたプ
ライマーの位置を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１若しくは２で示され
   るアミノ酸配列、又はそれらの一部であって、かつ、Ｄ
   ＮＡポリメラーゼ活性を有する部分をコードするＤＮＡ
   ポリメラーゼ遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ遺
   伝子に厳密な条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡポリ
   メラーゼ遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のＤＮＡポリメラ
   ーゼ遺伝子を含有するプラスミドを保有する形質転換体
   を培養し、該培養物から請求項１又は２に記載のＤＮＡ
   ポリメラーゼ遺伝子がコードするＤＮＡポリメラーゼを
   採取することを特徴とするＤＮＡポリメラーゼの製造方
   法。