JP4568571B2 - 熱安定性又は熱活性ｄｎａポリメラーゼ及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents
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Description
本発明は、熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼ及びそれをコードするＤＮＡに関する。
鋳型ＤＮＡの塩基配列に従って、それと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ鎖を合成することができるＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）、ＤＮＡの塩基配列決定、部位特異的変異導入法等をはじめとする遺伝子操作実験に必要不可欠の試薬として、日常的に利用されている。分子医学、分子生物学及び生化学の発展のために果たしてきたこの酵素の貢献度は、計り知れないものがある。
現在までに多くの種類のＤＮＡポリメラーゼが商品として市場に出回っているが、各酵素の理化学的性質、例えば、熱安定性、合成鎖伸長能、ミス合成の校正能、鋳型ＤＮＡの好み等は異なり、実験目的によって使い分けられている。
例えば、ＰＣＲには、熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼの利用が必要不可欠である。熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼは二本鎖ＤＮＡの変性の際に失活することがないので、酵素の追加等の手間を省くことができる。また、熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼを利用して高温でＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことにより、プライマーの非特異的なアニーリング、一本鎖ＤＮＡの分子内高次構造（例えばヘアピンループ等）の形成等を防止することができ、目的の伸長反応を効率よく進行させることができる。
例えば、ＰＣＲには、熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼの利用が必要不可欠である。熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼは二本鎖ＤＮＡの変性の際に失活することがないので、酵素の追加等の手間を省くことができる。また、熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼを利用して高温でＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことにより、プライマーの非特異的なアニーリング、一本鎖ＤＮＡの分子内高次構造（例えばヘアピンループ等）の形成等を防止することができ、目的の伸長反応を効率よく進行させることができる。
熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（特許文献１、２及び３参照）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ）（特許文献４及び５参照）等が知られている。
米国特許第４，８８９，８１８号
米国特許第５，３５２，６００号
米国特許第５，０７９，３５２号
米国特許第５，３７４，５５３号
米国特許第５，４２０，０２９号
本発明は、新規な熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼ、該ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、及び該組換えベクターを含む形質転換体を提供することを目的とする。
また、本発明は、新規な熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ用キットを提供することを目的とする。
また、本発明は、新規な熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ用キットを提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列からなる熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼ。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、１〜５７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及び／又は７８９〜８３２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
（２）前記（１）記載の熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ。
（３）以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡを含む前記（２）記載のＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）前記（ｃ）に示すＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ
（４）前記（２）又は（３）記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（５）前記（４）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（６）前記（１）記載の熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ用キット。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列からなる熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼ。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、１〜５７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及び／又は７８９〜８３２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
（２）前記（１）記載の熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ。
（３）以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡを含む前記（２）記載のＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）前記（ｃ）に示すＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ
（４）前記（２）又は（３）記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（５）前記（４）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（６）前記（１）記載の熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ用キット。
本発明によれば、新規な熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼ、該ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、及び該組換えベクターを含む形質転換体が提供される。また、本発明によれば、新規な熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ用キットが提供される。
本発明の熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと比較して優れたＤＮＡポリメラーゼ活性（プライマー伸長活性）を有しているので、ＰＣＲを行う際に有用である。
本発明の熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと比較して優れたＤＮＡポリメラーゼ活性（プライマー伸長活性）を有しているので、ＰＣＲを行う際に有用である。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼは、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列からなる。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、１〜５７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及び／又は７８９〜８３２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
本発明の熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼは、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列からなる。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、１〜５７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及び／又は７８９〜８３２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
なお、以下、アミノ酸配列（ａ）からなる熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼを「ＤＮＡポリメラーゼ（ａ）」、アミノ酸配列（ｂ）からなる熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼを「ＤＮＡポリメラーゼ（ｂ）」という場合がある。
本発明において、「熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ」とは、熱に安定で、熱に耐性を示し、二本鎖ＤＮＡの変性に必要な温度（例えば８０〜１０５℃）下に置かれた後にも、ＤＮＡポリメラーゼ活性を保持する酵素を意味し、「熱活性ＤＮＡポリメラーゼ」とは、二本鎖ＤＮＡの変性により生じた一本鎖ＤＮＡへのプライマーの特異的なアニーリング（特異的プライミング）と、プライマー伸長とを確保するのに必要な温度（例えば５５〜８０℃）下でＤＮＡポリメラーゼ活性を発揮し得る酵素を意味する。また、「一本鎖ＤＮＡへのプライマーの特異的なアニーリング」とは、一本鎖ＤＮＡのうち目的の領域にプライマーがアニーリングすることを意味し、「ＤＮＡポリメラーゼ活性」とは、適当なデオキシリボヌクレオシド三リン酸を基質として、鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ（プライマー伸長産物）を合成する触媒作用を意味する。
ＤＮＡポリメラーゼ活性は、例えば、酵素１ユニットあたりのプライマー伸長活性（ｋｂ／分／Ｕ）で表すことができ、ＤＮＡポリメラーゼ（ａ）の７４℃におけるプライマー伸長活性は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの７４℃におけるプライマー伸長活性の約２．４倍である（実施例参照）。ＤＮＡポリメラーゼ（ｂ）の７４℃におけるプライマー伸長活性は、欠失、置換又は付加されるアミノ酸の総数及び位置に応じて変化するものと考えられるが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの７４℃におけるプライマー伸長活性の２倍以上であることが好ましく、２．４倍以上であることがさらに好ましい。なお、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のＤＮＡポリメラーゼであり、そのアミノ酸配列を配列番号４に示し、それをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示す。
ＤＮＡポリメラーゼ（ｂ）において、配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、１〜５７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及び／又は７８９〜８３２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して欠失、置換又は付加されるアミノ酸の総数及び位置は特に限定されるものではない。欠失、置換又は付加されるアミノ酸の総数は１又は複数個、好ましくは１又は数個であり、その具体的な範囲は、欠失に関しては通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個であり、置換に関しては通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個であり、付加に関しては通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。欠失、置換、付加等の変異は、１〜５７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及び７８９〜８３２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列のうち、いずれか一方のみに対して加えられてもよいし、両方に対して加えられてもよい。
ＤＮＡポリメラーゼ（ａ）及び（ｂ）は、糖鎖が付加されたタンパク質及び糖鎖が付加されていないタンパク質のいずれであってもよい。タンパク質に付加される糖鎖の種類、位置等は、タンパク質の製造の際に使用される宿主細胞の種類によって異なるが、糖鎖が付加されたタンパク質には、いずれの宿主細胞を用いて得られるタンパク質も含まれる。また、ＤＮＡポリメラーゼ（ａ）及び（ｂ）は、それらの塩であってもよい。
ＤＮＡポリメラーゼ（ａ）のアミノ酸配列（配列番号２)とＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号４）との相違点を表１に示す。これらの相違点は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号４）のうち、５７３〜７８８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を、高温土壌中に含まれる微生物由来のアミノ酸配列（配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、５７３〜７８８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列）で置換することにより生じたものである。但し、７８７番目及び７８８番目のアミノ酸の相違は、アミノ酸配列を置換するにあたり制限酵素部位Bg1IIを導入した際に生じたものである。
ＤＮＡポリメラーゼ（ａ）又は（ｂ）をコードするＤＮＡは、その塩基配列に従って化学合成により得ることができる。ＤＮＡの化学合成は、市販のＤＮＡ合成機、例えば、チオホスファイト法を利用したＤＮＡ合成機（島津製作所社製）、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機（パーキン・エルマー社製）を用いて行うことができる。
また、ＤＮＡポリメラーゼ（ａ）又は（ｂ）をコードするＤＮＡは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ（配列番号３）に、部位特異的変異誘発法等の公知の方法を用いて人為的に変異を導入することにより得ることができる。変異の導入は、例えば、変異導入用キット、例えば、Mutant-K（TAKARA社製）、Mutant-G（TAKARA社製）、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて行うことができる。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡは、例えば、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）から抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、配列番号３記載の塩基配列に基づいて合成したプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすることにより得ることができる。
ＤＮＡポリメラーゼ（ａ）又は（ｂ）をコードするＤＮＡは、オープンリーディングフレームとその３'末端に位置する終止コドンとを含む。また、ＤＮＡポリメラーゼ（ａ）又は（ｂ）をコードするＤＮＡは、オープンリーディングフレームの５'末端及び／又は３'末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる。
ＤＮＡポリメラーゼ（ａ）をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡを含むＤＮＡが挙げられる。ここで、配列番号１記載の塩基配列のうち、オープンリーディングフレームは１〜２４９６番目、翻訳開始コドンは１〜３番目、終止コドンは２４９７〜２４９９番目の塩基からなる塩基配列に位置する。ＤＮＡポリメラーゼ（ａ）をコードするＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡポリメラーゼ（ａ）をコードする限り特に限定されるものではなく、オープンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列のうち、１〜２４９６番目の塩基からなる塩基配列に限定されるものではない。
ＤＮＡポリメラーゼ（ｂ）をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含むＤＮＡが挙げられる。
「ストリンジェントな条件」としては、６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。
配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも８８％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
ＤＮＡポリメラーゼ（ａ）及び（ｂ）は、例えば、以下の工程に従って、それぞれをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させることにより製造することができる。
〔組換えベクター及び形質転換体の作製〕
組換えベクターを作製する際には、まず、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。目的とするタンパク質のコード領域の塩基配列において、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換してもよい。
〔組換えベクター及び形質転換体の作製〕
組換えベクターを作製する際には、まず、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。目的とするタンパク質のコード領域の塩基配列において、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換してもよい。
次いで、上記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して組換えベクターを作製する。上記ＤＮＡ断片は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは、プロモーターの他、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有することができる。
目的とするタンパク質を生産し得る形質転換体は、組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pRSET、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50）を使用することができ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）等を使用することができ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスを使用することができる。
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pRSET、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50）を使用することができ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）等を使用することができ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスを使用することができる。
宿主細胞としては、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを発現し得る限り、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを使用してもよい。また、動物個体、植物個体、カイコ虫体等を使用してもよい。
細菌を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌を宿主細胞として使用することができる。具体的には、Escherichia coli BL21、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli K12、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101等の大腸菌、Bacillus subtilis MI 114、Bacillus subtilis 207-21等の枯草菌を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、大腸菌等の細菌中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターを使用することができる。また、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも使用することができる。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を使用することができる。
酵母を宿主細胞とする場合、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomycescerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を使用することができる。
酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用することができる。
動物細胞を宿主細胞とする場合、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、動物細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTR(Long Terminal Repeat)プロモーター、CMVプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を使用することができる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を使用することができる。
昆虫細胞を宿主とする場合には、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を宿主細胞として使用することができる。Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等を使用することができる。
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用することができる。
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用することができる。
〔形質転換体の培養〕
目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを導入した形質転換体を培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを導入した形質転換体を培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌、酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地及び合成培地のいずれを使用してもよい。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を使用することができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物等を使用することができる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用することができる。
大腸菌、酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体の培養は、例えば、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は通常２５〜３７℃、培養時間は通常１２〜４８時間であり、培養期間中はｐＨを通常６〜８に保持する。ｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。培養の際、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、EagleのMEM培地、DMEM培地、Ham F12培地、Ham F12K培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用することができる。形質転換体の培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で３〜１０日間行う。培養の際、必要に応じてカナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地（ファーミンジェン社製）、Sf-900 II SFM培地（Gibco BRL社製）、ExCell400、ExCell405（JRHバイオサイエンシーズ社製）等を使用することができる。形質転換体の培養は、通常、２７℃で３〜１０日間行う。培養の際、必要に応じてゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
目的とするタンパク質は、分泌タンパク質又は融合タンパク質として発現させてもよい。融合させるタンパク質としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（His-tag）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン等を使用することができる。
〔タンパク質の単離・精製〕
形質転換体の培養物より目的とするタンパク質を採取することにより、目的とするタンパク質が得られる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。
形質転換体の培養物より目的とするタンパク質を採取することにより、目的とするタンパク質が得られる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。
目的とするタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするタンパク質を抽出する。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上清から細胞又は菌体を除去する。
得られたタンパク質は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製することができる。
ＤＮＡポリメラーゼ（ａ）及び（ｂ）は、そのアミノ酸配列に基づいて、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。この際、市販のペプチド合成機を使用することができる。
ＤＮＡポリメラーゼ（ａ）及び（ｂ）は、ＰＣＲを行う際に有用であり、ＰＣＲ用キットの構成要素として使用することができる。ＰＣＲ用キットは、ＤＮＡポリメラーゼ（ａ）又は（ｂ）以外に、ＰＣＲを行うために必要な試薬、容器、装置等を含むことができる。
〔実施例１〕高温環境土壌に含まれる微生物に由来するゲノムＤＮＡの獲得
（１）高温環境土壌の採取
ＤＮＡポリメラーゼを有効に利用するためには、ＰＣＲ等に使用できるような耐熱性を有することが重要であると考えられる。そして、耐熱性酵素を得るためには、高温環境から試料を取得することが最も効率的である。そこで、高温環境として性質（ｐＨ）の異なる温泉地帯を選択した。一つは強酸性を示す九州鹿児島霧島温泉地域で、もう一つは中性に近いｐＨを示す宮城県鬼首温泉地域及び秋田県大噴湯温泉地域である。
（１）高温環境土壌の採取
ＤＮＡポリメラーゼを有効に利用するためには、ＰＣＲ等に使用できるような耐熱性を有することが重要であると考えられる。そして、耐熱性酵素を得るためには、高温環境から試料を取得することが最も効率的である。そこで、高温環境として性質（ｐＨ）の異なる温泉地帯を選択した。一つは強酸性を示す九州鹿児島霧島温泉地域で、もう一つは中性に近いｐＨを示す宮城県鬼首温泉地域及び秋田県大噴湯温泉地域である。
温泉地域内の特定の領域には、マッドポット（泥が煮立っているような穴）が天然の状態（人手の入らない状態）で幾つも存在している。これらの地点から、採取地点ごとに、温度、ｐＨ等のデータとともに採取試料の色、水分量等の状態を映像等により記録した。各地点からは、十分量のＤＮＡが回収できるように、１００ｇ程度の土壌、泥又は堆積物を採取した。
（２）高温環境土壌からのゲノムＤＮＡの抽出
採取された土壌１ｇを滅菌したエッペンドルフチューブに分取した後、土壌に含まれる微生物に由来するゲノムＤＮＡを抽出した。土壌からのゲノムＤＮＡの抽出は、土壌からのＤＮＡ抽出キットであるUltra CleanTM Soil DNA Purification kit(MO Bio社製，カタログNo.12800-50，フナコシカタログNo.LM128000)を用いて行った。操作は本キットに添付されている操作手順書に従った。
実際に抽出したＤＮＡ溶液の１／５０量である２μＬを分取し、１８μＬのＴＡＥ緩衝液（０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ，０．０２Ｍ 酢酸，０．００１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））及び２μＬの電気泳動用濃縮染色液（０．２５％ブロモフェノールブルー，０．２５％キシレンシアノール，３０％グリセロール）を加え、０．８％アガロースゲル電気泳動で確認した。
採取された土壌１ｇを滅菌したエッペンドルフチューブに分取した後、土壌に含まれる微生物に由来するゲノムＤＮＡを抽出した。土壌からのゲノムＤＮＡの抽出は、土壌からのＤＮＡ抽出キットであるUltra CleanTM Soil DNA Purification kit(MO Bio社製，カタログNo.12800-50，フナコシカタログNo.LM128000)を用いて行った。操作は本キットに添付されている操作手順書に従った。
実際に抽出したＤＮＡ溶液の１／５０量である２μＬを分取し、１８μＬのＴＡＥ緩衝液（０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ，０．０２Ｍ 酢酸，０．００１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））及び２μＬの電気泳動用濃縮染色液（０．２５％ブロモフェノールブルー，０．２５％キシレンシアノール，３０％グリセロール）を加え、０．８％アガロースゲル電気泳動で確認した。
その結果、図１に示すように、量の多少は有るが、幾つかの地点からは１０キロ塩基対以上の長さのゲノムＤＮＡが回収されていることが確認できた。なお、図１中、「Ｍ」は分子量マーカーを表し、レーン１〜３８は異なる地点に関する結果を表す。この結果から、高温環境土壌中には、十分量のゲノムＤＮＡを抽出できる量の微生物が存在することが確認できた。
〔実施例２〕ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼ特異的プライマーを用いたＰＣＲ
（１）ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼ特異的プライマーの設計
複数の微生物（Bacillus subtilis、Bacillus caldotenax、Thermus aquaticus、Themus thermophilus、Escherichia coli）に由来するファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のアライメントに従い、結果を図２及び図３に示す。なお、図３は図２の続きである。
（１）ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼ特異的プライマーの設計
複数の微生物（Bacillus subtilis、Bacillus caldotenax、Thermus aquaticus、Themus thermophilus、Escherichia coli）に由来するファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のアライメントに従い、結果を図２及び図３に示す。なお、図３は図２の続きである。
図２及び図３中、四角で囲んだ２つの領域（ＤＰＮＬＱＮＩＰ及びＱＶＨＤＥＬＸ（ＸはＩ、Ｖ又はＬを表す））は、複数の微生物間で相同性が高いアミノ酸配列である。このアミノ酸配列は、その他の微生物が有するファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼにおいても保存されていると推測される。
そこで、上記アミノ酸配列に基づいて、表２に示す２種類（５'プライマー（配列番号５）及び３'プライマー（配列番号６））の縮重プライマーを設計した（Takashi Uemori, Yoshizumi Ishino, Kayo Fujita, Kiyozo Asada and Ikunoshin Kato “Cloning of the DNA Polymerase Gene of Bacillus caldotenax and Characterization of the Gene Product” (1993) J. Biocem., 113, 401-410.）。
なお、「y」はt又はcを、「s」はc又はgを、「k」はg又はtを、「r」はa又はgを、「h」はa又はt又はcを、「n」はa又はg又はc又はtを表す。
（２）ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼ特異的プライマーを用いたＰＣＲ
１０種類の微生物（Bacillus caldotenax，Bacillus caldolyticus，Escherichia coli，Bacillus subtilis，Lactobacillus bulgaricus，Lactobacillus homohiochii，Lactobacillus heterohiochii，Thermus aquaticus，Themus thermophilus，Sulfolobus solfataricus）から抽出したゲノムＤＮＡ ０．５ｎｇの存在下、上記縮重プライマー１００ｐｍｏｌを用いて、５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ及び５ユニット ＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を含む溶液中でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で２分間からなる温度サイクルを３０サイクル行った。
１０種類の微生物（Bacillus caldotenax，Bacillus caldolyticus，Escherichia coli，Bacillus subtilis，Lactobacillus bulgaricus，Lactobacillus homohiochii，Lactobacillus heterohiochii，Thermus aquaticus，Themus thermophilus，Sulfolobus solfataricus）から抽出したゲノムＤＮＡ ０．５ｎｇの存在下、上記縮重プライマー１００ｐｍｏｌを用いて、５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ及び５ユニット ＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を含む溶液中でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で２分間からなる温度サイクルを３０サイクル行った。
その結果、図４に示すように、１０種全ての微生物において、ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼに由来すると推定されるＰＣＲ増幅断片が得られた。なお、図４中、「Ｍ」は分子量マーカーを表し、レーン２はBacillus caldotenax、レーン３はBacillus caldolyticus、レーン４はEscherichia coli、レーン５はBacillus subtilis、レーン６はLactobacillus bulgaricus、レーン７はLactobacillus homohiochii、レーン８はLactobacillus heterohiochii、レーン９はThermus aquaticus、レーン１０はThemus thermophilus、レーン１１はSulfolobus solfataricusに関する結果である。
この結果から、上記縮重プライマーは、任意の微生物に由来するファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に対するプライマーとして使用できることが明らかになった。
次に、霧島温泉地域、鬼首温泉地域等の高温環境土壌より回収されたゲノムＤＮＡの全回収量の１／５０（１μＬ）の存在下、上記縮重プライマー１００ｐｍｏｌを用いて、５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３)、５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ及び５ユニット ＴＡＫＡＲＡ ＥＸ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を含む溶液中でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０サイクル行った。
その結果、図５に示すように、幾つかの地点から回収したゲノムＤＮＡを鋳型とした場合、ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼに由来すると推定されるＤＮＡ断片が増幅された。ＤＮＡ断片の長さが予測とほぼ一致していた場合に、ＤＮＡ断片がファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼに由来するＤＮＡ断片であると推定した。なお、図５中、「Ｍ」は分子量マーカーを表し、レーン１〜２９は異なる地点に関する結果を表す。
（３）増幅断片のクローニング
ＰＣＲ終了後の反応液に等量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加えた後、水溶液と等量の水飽和フェノール／クロロフォルム液を加えてよく攪拌し、７０℃で１０分間加温した後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上層水溶液画分を注意して分取した。分取した水溶液画分を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（ミリポア社製）に加え、２５００ｒｐｍで１５分間遠心した。再度、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５)及び１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を２００μＬ加え、２，５００ｒｐｍで１５分間遠心した。以上の操作により、未反応プライマー、ヌクレオチド、塩等を除去した。
ＰＣＲ終了後の反応液に等量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加えた後、水溶液と等量の水飽和フェノール／クロロフォルム液を加えてよく攪拌し、７０℃で１０分間加温した後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上層水溶液画分を注意して分取した。分取した水溶液画分を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（ミリポア社製）に加え、２５００ｒｐｍで１５分間遠心した。再度、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５)及び１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を２００μＬ加え、２，５００ｒｐｍで１５分間遠心した。以上の操作により、未反応プライマー、ヌクレオチド、塩等を除去した。
ＰＣＲ増幅断片 約０．０５μｇと、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５)及び１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に溶解したｐＧＥＭ Ｔ−ベクター（Promega社製） ０．１μｇと、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５)／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液８μＬとを混合した後、ライゲーションキット・バージョン２（タカラバイオ社製）１０μＬを加えて１６℃で３０分間保温することにより、ＰＣＲ増幅断片をプラスミドＤＮＡにライゲートさせた。ＰＣＲ増幅断片がライゲートされたプラスミドＤＮＡ １μＬを、氷中で溶解したカルシウム処理済大腸菌ＤＨ１０Ｂ ５０μＬに加え、氷上で２０分間静置し、４２℃で２分間加温した後、９５０μＬの液体ＬＢ培地（１Ｌあたり１０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出液、５ｇ塩化ナトリウム及び１ｇグルコースを含む）を加え、３７℃で６０分間震盪培養した。震盪培養終了後の培養物１５０μＬを、１００μｇ／ｍＬ アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に植菌し、一晩３７℃で培養を行った。
（４）ＰＣＲ増幅断片の塩基配列の解読
寒天培地上に増幅した大腸菌のコロニーを１００μｇ／ｍＬ アンピシリン約２ｍＬを含むＬＢ培地に植菌し、一晩３７℃で震盪培養した。増殖した菌体を１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心で集菌し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製，カタログNo.27104）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。回収されたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、塩基配列解読用プライマー（Ｍ１３プライマー Ｍ４及びＴプロモータープライマー）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲには、ダイターミネーターサイクルシーケンシングキット（ABI社製）を使用し、塩基配列の解読には、ABI社製3700自動塩基配列検出装置を使用した。
寒天培地上に増幅した大腸菌のコロニーを１００μｇ／ｍＬ アンピシリン約２ｍＬを含むＬＢ培地に植菌し、一晩３７℃で震盪培養した。増殖した菌体を１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心で集菌し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製，カタログNo.27104）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。回収されたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、塩基配列解読用プライマー（Ｍ１３プライマー Ｍ４及びＴプロモータープライマー）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲには、ダイターミネーターサイクルシーケンシングキット（ABI社製）を使用し、塩基配列の解読には、ABI社製3700自動塩基配列検出装置を使用した。
（５）ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列の確定
決定されたＰＣＲ増幅断片の塩基配列は機械的な誤差を含む場合があるので、塩基配列を人手によって修正して機械的な誤差を除いた後、塩基配列にコードされるアミノ酸配列を決定した。公共のタンパク質データベースを使用して相同性検索を行い、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列と、既知のファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼ（Thermus aquaticus由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ））のアミノ酸配列と比較を行った。
決定されたＰＣＲ増幅断片の塩基配列は機械的な誤差を含む場合があるので、塩基配列を人手によって修正して機械的な誤差を除いた後、塩基配列にコードされるアミノ酸配列を決定した。公共のタンパク質データベースを使用して相同性検索を行い、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列と、既知のファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼ（Thermus aquaticus由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ））のアミノ酸配列と比較を行った。
その結果、図６に示すように、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列には、ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼの機能ドメインのアミノ酸配列が含まれていることが確認された。
なお、図６中、「Ｔａｑ」はＴａｑＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を表し、「No.1」、「No.2」及び「No.3」は、異なる地点から回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列を表し、それぞれＴａｑＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と90％、57％及び52％の相同性を示す。また、「No.1」、「No.2」及び「No.3」に関するアミノ酸配列は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと異なるアミノ酸配列のみを示す。
また、表３に示すように、異なる地点（ａ〜ｇ）から回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列は、それぞれ異なる微生物に由来するファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と相同性を示したことから、数多くの未知ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼが高温環境中に存在することが確認できた。
〔実施例３〕改変ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを有するプラスミドの構築
（１）制限酵素部位を導入するためのプライマーの設計
実施例２で得られたＰＣＲ増幅断片は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の中心を担う領域をカバーするものであるから、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のうち、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示す領域が、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列で置換された改変ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼとは異なるＤＮＡポリメラーゼ活性を示すと考えられ、向上したＤＮＡポリメラーゼ活性を示す可能性がある。また、改変ＤＮＡポリメラーゼの機能は、高温土壌中に存在する未知ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼの機能を反映していると考えられる。
（１）制限酵素部位を導入するためのプライマーの設計
実施例２で得られたＰＣＲ増幅断片は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の中心を担う領域をカバーするものであるから、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のうち、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示す領域が、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列で置換された改変ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼとは異なるＤＮＡポリメラーゼ活性を示すと考えられ、向上したＤＮＡポリメラーゼ活性を示す可能性がある。また、改変ＤＮＡポリメラーゼの機能は、高温土壌中に存在する未知ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼの機能を反映していると考えられる。
そこで、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡのうち、ＰＣＲ増幅断片で置換される領域の外側に制限酵素部位（BlpI部位及びBglII部位）を導入するために、表３に示す２種類のプライマーＡ（配列番号７）及びプライマーＢ（配列番号８）を設計した。プライマーＡは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列に影響することなく、新たな制限酵素部位としてBlpI認識配列を導入できるように設計されている。プライマーＢは、新たな制限酵素部位としてBglII認識配列を導入できるように設計されているが、プライマーＢによりBglII認識配列が導入されると、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの７８７番目のアミノ酸残基Ｌｅｕはそれと類似した性質のアミノ酸残基Ｉｌｅに、７８８番目のアミノ酸残基Ｖａｌはそれと類似した性質のアミノ酸残基Ｌｅｕに置換される。
一方、ＰＣＲ増幅断片の外側に制限酵素部位（BlpI部位及びBglII部位）を導入するために、表４に示す２種類のプライマーＣ（配列番号９）及びプライマーＤ（配列番号１０）を設計した。プライマーＣは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列に影響することなく、新たな制限酵素部位としてBlpI認識配列を導入できるように設計されている。新たな制限酵素部位としてBglII認識配列を導入できるように設計されているが、プライマーＢによりBglII認識配列が導入されると、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの７８７番目のアミノ酸残基Ｌｅｕはそれと類似した性質のアミノ酸残基Ｉｌｅに、７８８番目のアミノ酸残基Ｖａｌはそれと類似した性質のアミノ酸残基Ｌｅｕに置換される。
なお、表４中、一重下線部分は新たに導入されるBlpI部位を表し、二重下線部分は新たに導入されるBglII部位を表す。
（２）制限酵素部位導入プライマーを用いたＰＣＲ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡをプラスミドベクターｐＴＶ１Ｎ（タカラバイオ社）にクローニングした。（Ishino Y, Ueno T, Miyagi M, Uemori T, Imamura M, Tsunasawa S, Kato I.“Overproduction of Thermus aquaticus DNA polymerase and its structural analysis by ion-spray mass spectrometry” (1994) J Biochem (Tokyo), 116(5), 1019-24に掲載の文献を参照した）。１０ｎｇの存在下、プライマーＡ及びＢ ２ｐｍｏｌを用いて、５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ及び２．５ユニット PfuUltra ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）を含む溶液中でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１５分間の温度サイクルを２０サイクル行った。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡをプラスミドベクターｐＴＶ１Ｎ（タカラバイオ社）にクローニングした。（Ishino Y, Ueno T, Miyagi M, Uemori T, Imamura M, Tsunasawa S, Kato I.“Overproduction of Thermus aquaticus DNA polymerase and its structural analysis by ion-spray mass spectrometry” (1994) J Biochem (Tokyo), 116(5), 1019-24に掲載の文献を参照した）。１０ｎｇの存在下、プライマーＡ及びＢ ２ｐｍｏｌを用いて、５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ及び２．５ユニット PfuUltra ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）を含む溶液中でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１５分間の温度サイクルを２０サイクル行った。
次に、実施例２で得られたプラスミドクローン１０ｎｇの存在下、プライマーＣ及びＤ ２ｐｍｏｌを用いて、５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ及び２．５ユニット PfuUltra ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）を含む溶液中でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０サイクル行った。
（３）ＰＣＲ増幅断片の制限酵素処理
ＰＣＲ増幅断片を制限酵素BlpI及びBglIIで切断した。すなわち、各ＰＣＲ増幅反応液５０μＬに１０倍濃縮制限酵素用緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８．２)、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、６００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ）５μＬ、滅菌蒸留水４２μＬ及び制限酵素BlpI ３μＬを加えて、十分に混合した後、３７℃で３時間保温した。次に、５Ｍ ＮａＣｌ溶液を４μＬ及び制限酵素BglII ３μＬを加えて、十分に混合した後、６０℃で３時間保温した。保温終了後、１０μＬの１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び２％ＳＤＳ液を加えて、反応を止めた。
ＰＣＲ増幅断片を制限酵素BlpI及びBglIIで切断した。すなわち、各ＰＣＲ増幅反応液５０μＬに１０倍濃縮制限酵素用緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８．２)、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、６００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ）５μＬ、滅菌蒸留水４２μＬ及び制限酵素BlpI ３μＬを加えて、十分に混合した後、３７℃で３時間保温した。次に、５Ｍ ＮａＣｌ溶液を４μＬ及び制限酵素BglII ３μＬを加えて、十分に混合した後、６０℃で３時間保温した。保温終了後、１０μＬの１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び２％ＳＤＳ液を加えて、反応を止めた。
０．８％アガロースゲル電気泳動により切断された各ＤＮＡ断片を分離した後、QUIAGEN社製 QuiaQuickTipを用いて各ＤＮＡ断片を回収・精製した。
（４）制限酵素処理されたＤＮＡ断片のライゲーション
回収・精製された各ＤＮＡ断片０．５μｇ（１μＬ）を氷上で混合し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液３μＬ加え、さらにタカラバイオ社製 Takara Ligation Kit version2を５μＬ加えて、よく混合した後、１６℃で１時間保温した。
（４）制限酵素処理されたＤＮＡ断片のライゲーション
回収・精製された各ＤＮＡ断片０．５μｇ（１μＬ）を氷上で混合し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液３μＬ加え、さらにタカラバイオ社製 Takara Ligation Kit version2を５μＬ加えて、よく混合した後、１６℃で１時間保温した。
（５）大腸菌への導入
ライゲーション反応液のうち１μＬをカルシウム処理済大腸菌JM１０９菌体液２０μＬと氷上で混合し、３０分間静置し、４２℃で３０秒間の熱処理後、ＬＢ液体培地９８０μＬを加え、３７℃で６０分間震盪培養を行った。次いで、１００μＬを分取し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む寒天ＬＢ培地上に均一に植菌した後、一晩３７℃で保温した。
ライゲーション反応液のうち１μＬをカルシウム処理済大腸菌JM１０９菌体液２０μＬと氷上で混合し、３０分間静置し、４２℃で３０秒間の熱処理後、ＬＢ液体培地９８０μＬを加え、３７℃で６０分間震盪培養を行った。次いで、１００μＬを分取し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む寒天ＬＢ培地上に均一に植菌した後、一晩３７℃で保温した。
（６）組み換えの確認
寒天培地上に植菌された大腸菌のうち、プラスミドＤＮＡを有するもののみが寒天培地上で増殖しコロニーを形成した。形成されたコロニーのうち、無作為に１０個を選択し、２ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩震盪培養した後、QIAGEN社製 QIAprep Spin Miniprep Kit（カタログNo.27104）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。回収したプラスミドＤＮＡをBlpI及びBglIIで処理し、BlpI／BglII断片を切り出した。その結果、図７に示すように、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを含むプラスミドにＰＣＲ増幅断片が組み込まれていること、すなわち、改変ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを有すると予想される発現用プラスミドを構築できたことが確認された。なお、図７中、「Ｍ」はマーカーを表し、レーン１〜３は、それぞれ異なる地点から回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ増幅断片が組み込まれた組み換えプラスミドに関する結果を示す。
寒天培地上に植菌された大腸菌のうち、プラスミドＤＮＡを有するもののみが寒天培地上で増殖しコロニーを形成した。形成されたコロニーのうち、無作為に１０個を選択し、２ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩震盪培養した後、QIAGEN社製 QIAprep Spin Miniprep Kit（カタログNo.27104）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。回収したプラスミドＤＮＡをBlpI及びBglIIで処理し、BlpI／BglII断片を切り出した。その結果、図７に示すように、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを含むプラスミドにＰＣＲ増幅断片が組み込まれていること、すなわち、改変ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを有すると予想される発現用プラスミドを構築できたことが確認された。なお、図７中、「Ｍ」はマーカーを表し、レーン１〜３は、それぞれ異なる地点から回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ増幅断片が組み込まれた組み換えプラスミドに関する結果を示す。
（７）ＰＣＲ増幅断片の塩基配列決定
図７のレーン２に示した改変ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡのうち、ＰＣＲ増幅断片部分の塩基配列を以下のように決定した。
組み換えプラスミドを鋳型として用い、Beckman Coulter社のCQE Dye terminator cycle sequencing with quick start kitを用いてサイクルジデオキシ反応を行った。この際、５’側のプライマーとして、5'-tccaccccaggacgggccgcctccac-3'を用い、３’側のプライマーとして、5'-cccctccatgacctccttggccagcc-3'を用いた。３００ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び５ｐｍｏｌのプライマーを用いて、９６℃で２０秒、５０℃で２０秒、６０℃で４分を１サイクルとして３０サイクルの反応を行った。反応溶液をSephadex G-50カラムに通すことによって未反応基質を除いた。反応溶液を乾固させた後、４０μＬの電気泳動用溶液に溶解した後、Beckman Coulter 社のCEQ 2000XL DNA Analysis Systemで塩基配列を決定した。
図７のレーン２に示した改変ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡのうち、ＰＣＲ増幅断片部分の塩基配列を以下のように決定した。
組み換えプラスミドを鋳型として用い、Beckman Coulter社のCQE Dye terminator cycle sequencing with quick start kitを用いてサイクルジデオキシ反応を行った。この際、５’側のプライマーとして、5'-tccaccccaggacgggccgcctccac-3'を用い、３’側のプライマーとして、5'-cccctccatgacctccttggccagcc-3'を用いた。３００ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び５ｐｍｏｌのプライマーを用いて、９６℃で２０秒、５０℃で２０秒、６０℃で４分を１サイクルとして３０サイクルの反応を行った。反応溶液をSephadex G-50カラムに通すことによって未反応基質を除いた。反応溶液を乾固させた後、４０μＬの電気泳動用溶液に溶解した後、Beckman Coulter 社のCEQ 2000XL DNA Analysis Systemで塩基配列を決定した。
図７のレーン２に示した改変ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示し、この塩基配列（配列番号１）から推定される改変ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を配列番号２に示す。このアミノ酸配列から、組み換えた部分がＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の一部であると予想された。なお、配列番号２記載の塩基配列のうち、１〜５７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及び７８９〜８３２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに由来し、５７３〜７８８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに組み込まれたＰＣＲ増幅断片に由来する。
〔実施例４〕改変ＤＮＡポリメラーゼの産生及び機能解析
（１）組み換えプラスミドの発現用大腸菌への導入
図７のレーン２に示した改変ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを有する発現用プラスミドを、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。
大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RILのコンピテント細胞を融解して、ファルコンチューブに０．１ｍＬずつ移した。その中に、発現用プラスミド１０ｎｇに相当する溶液を加え、氷中に３０分間放置した後、４２℃のヒートショックを３０秒間行い、そこにＳＯＣ培地０．９ｍＬを加え、３７℃で１時間振とう培養した。その後、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/ST0452-1を得た。
（１）組み換えプラスミドの発現用大腸菌への導入
図７のレーン２に示した改変ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを有する発現用プラスミドを、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。
大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RILのコンピテント細胞を融解して、ファルコンチューブに０．１ｍＬずつ移した。その中に、発現用プラスミド１０ｎｇに相当する溶液を加え、氷中に３０分間放置した後、４２℃のヒートショックを３０秒間行い、そこにＳＯＣ培地０．９ｍＬを加え、３７℃で１時間振とう培養した。その後、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/ST0452-1を得た。
（２）改変ＤＮＡポリメラーゼの産生
寒天培地上に現れた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬ中、３７℃で、６００ｎｍにおける吸光度（Ａ600）が０．４〜０．６に達するまで培養した後、ＩＰＴＧ（Isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside）を１ｍＭになるように加え、さらに３０℃で１０時間培養した。培養後、遠心分離（６，０００ｒｐｍで２０分間）により集菌を行った。
寒天培地上に現れた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬ中、３７℃で、６００ｎｍにおける吸光度（Ａ600）が０．４〜０．６に達するまで培養した後、ＩＰＴＧ（Isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside）を１ｍＭになるように加え、さらに３０℃で１０時間培養した。培養後、遠心分離（６，０００ｒｐｍで２０分間）により集菌を行った。
集菌した菌体を７５℃で３０分間加熱処理した後、２倍量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１錠のプロテアーゼ阻害剤（Complete EDTA-free, Roche社製）を加え、懸濁した。得られた懸濁液を超音波破砕し、７５℃で６０分間保温した後、遠心分離（１１，０００ｒｐｍで２０分間）により上清を得た。これに終濃度０．１５％になるように５％ポリエチレンイミン溶液を加え、氷中で６０分間放置した。遠心分離後、上清に１００％飽和となるように硫酸アンモニ ウムを加えた。遠心分離後、沈殿を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオライド）及び１ｍＭ ＥＤＴＡに透析した。不溶物を、遠心分離により除去した後、上清に、０．５Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加えた後、１,８０００×ｇで１０分間遠心し、上清を得た。この上清をHiTrapフェニールHPカラムで処理した後、HiTrapヘパリンHPカラムで処理し、粗ＤＮＡポリメラーゼ画分とした。
粗ＤＮＡポリメラーゼ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色した結果を図８に示す。図８中、「Ｍ」は分子量マーカーを表し、「Ｔ」は、野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを含む発現用プラスミドを有する大腸菌から得られた粗ＤＮＡポリメラーゼ画分に関する結果を表す。また、図８中、レーン２が、図７のレーン２に示した改変ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを有する発現用プラスミドを発現させて得られた粗ＤＮＡポリメラーゼ画分に関する結果を表す。図８に示すように、粗ＤＮＡポリメラーゼ画分はほぼ均一なタンパク質評品であった。
（３）改変ＤＮＡポリメラーゼの機能解析
（２）で精製されたＤＮＡポリメラーゼを用いて、デオキシヌクレオチドの取り込み活性を測定し、図８のレーン２に示した改変ＤＮＡポリメラーゼの比活性を求めた。反応溶液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍＬ 仔牛胸腺ＤＮＡ（ＤＮＡａｓｅにより活性化したもの）、各４０μＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、６０ｎＭ [メチル３Ｈ] ｄＴＴＰを含む溶液を用意し、反応溶液４５ｍＬに対して、フラクション溶液５ｍＬを加え、７０℃で反応させた後、その一部をＤＥ８１ペーパーにスポットし、次いで、これを５％Ｎａ２ＨＰＯ４溶液で５回洗浄した。そして、ＤＥ８１ペーパーフィルター上に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。これにより、各酵素標品の活性濃度をユニットで表示したところ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの比活性は３．９×１０５ユニット／ｍｇ、改変ＤＮＡポリメラーゼの比活性は２．８×１０５ユニット／ｍｇであった。
（２）で精製されたＤＮＡポリメラーゼを用いて、デオキシヌクレオチドの取り込み活性を測定し、図８のレーン２に示した改変ＤＮＡポリメラーゼの比活性を求めた。反応溶液として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍＬ 仔牛胸腺ＤＮＡ（ＤＮＡａｓｅにより活性化したもの）、各４０μＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、６０ｎＭ [メチル３Ｈ] ｄＴＴＰを含む溶液を用意し、反応溶液４５ｍＬに対して、フラクション溶液５ｍＬを加え、７０℃で反応させた後、その一部をＤＥ８１ペーパーにスポットし、次いで、これを５％Ｎａ２ＨＰＯ４溶液で５回洗浄した。そして、ＤＥ８１ペーパーフィルター上に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。これにより、各酵素標品の活性濃度をユニットで表示したところ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの比活性は３．９×１０５ユニット／ｍｇ、改変ＤＮＡポリメラーゼの比活性は２．８×１０５ユニット／ｍｇであった。
図８のレーン２に示した改変ＤＮＡポリメラーゼについて、プライマー伸長活性測定による評価を行い、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの活性と比較を行った。
プライマー伸長活性測定は、以下のように行った。まず、０．１ｐｍｏｌの３２Ｐ標識プライマーを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、５ｍＭ塩化マグネシウム、１４ｍＭ ２−メルカプトエタノールに溶解した０．２μｇのＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡに加えた。１００℃で５分間熱処理を行った後、ゆっくり冷ますことによってアニーリングさせた。このＤＮＡ溶液に０．２ｍＭになるようにｄＮＴＰ溶液を加えた。改変ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ０．２５ユニット加え、７４℃で反応を行った（反応系３０μＬ）。反応開始後２．５、５、１０分にそれぞれ８μＬを取り、２μＬの反応停止液（９８％脱イオン化ホルムアミド、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ キシレンシアノール、０．１％ ブロモフェノールブルー）を加え、電気泳動に供した。電気泳動には、５０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１％アガロースゲルを用い、３０ｍＡで１６時間泳動を行った。
プライマー伸長活性測定は、以下のように行った。まず、０．１ｐｍｏｌの３２Ｐ標識プライマーを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、５ｍＭ塩化マグネシウム、１４ｍＭ ２−メルカプトエタノールに溶解した０．２μｇのＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡに加えた。１００℃で５分間熱処理を行った後、ゆっくり冷ますことによってアニーリングさせた。このＤＮＡ溶液に０．２ｍＭになるようにｄＮＴＰ溶液を加えた。改変ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ０．２５ユニット加え、７４℃で反応を行った（反応系３０μＬ）。反応開始後２．５、５、１０分にそれぞれ８μＬを取り、２μＬの反応停止液（９８％脱イオン化ホルムアミド、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ キシレンシアノール、０．１％ ブロモフェノールブルー）を加え、電気泳動に供した。電気泳動には、５０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１％アガロースゲルを用い、３０ｍＡで１６時間泳動を行った。
測定結果を図９に示す。図９に示すように、改変ＤＮＡポリメラーゼのプライマー伸長活性は１１．２０ｋｂ／分／ユニット、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのプライマー伸長活性は４．６７ｋｂ／分／ユニットであり、改変ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの約２．４倍のプライマー伸長活性を有していた。
Claims (6)
- 配列番号２記載のアミノ酸配列からなる熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼ。
- 請求項１記載の熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ。
- 以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡを含む請求項２記載のＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）前記（ｃ）に示すＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ - 請求項２又は３記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
- 請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項１記載の熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ用キット。
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