WO2006038673A1

WO2006038673A1 - 熱安定性又は熱活性ｄｎａポリメラーゼ及びそれをコードするｄｎａ

Info

Publication number: WO2006038673A1
Application number: PCT/JP2005/018551
Authority: WO
Inventors: Hideji Tajima; Masaaki Takahashi; Yukiko Miyashita
Original assignee: Universal Bio Research Co., Ltd.
Priority date: 2004-10-06
Filing date: 2005-10-06
Publication date: 2006-04-13
Also published as: JP4568571B2; JP2006101791A

Abstract

　新規な熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼ、該ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、及び該組換えベクターを含む形質転換体を提供することを目的とし、新規な熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼとして、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列からなる熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、１～５７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及び／又は７８９～８３２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列

Description

明細書

熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼ及びそれをコードする DNA 技術分野

[0001] 本発明は、熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼ及びそれをコードする DNAに関する。

背景技術

[0002] 铸型 DNAの塩基配列に従って、それと相補的な塩基配列からなる DNA鎖を合成することができる DNAポリメラーゼは、 PCR (ポリメラーゼ'チェイン 'リアクション）、 D

NAの塩基配列決定、部位特異的変異導入法等をはじめとする遺伝子操作実験に必要不可欠の試薬として、日常的に利用されている。分子医学、分子生物学及び生化学の発展のために果たしてきたこの酵素の貢献度は、計り知れないものがある。

[0003] 現在までに多くの種類の DNAポリメラーゼが商品として市場に出回っている力各酵素の理化学的性質、例えば、熱安定性、合成鎖伸長能、ミス合成の校正能、铸型 DNAの好み等は異なり、実験目的によって使い分けられている。

例えば、 PCRには、熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼの利用が必要不可欠である。熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼはニ本鎖 DNAの変性の際に失活することがないので、酵素の追加等の手間を省くことができる。また、熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼを利用して高温で DNA鎖の伸長反応を行うことにより、プライマ一の非特異的なアニーリング、一本鎖 DNAの分子内高次構造 (例えばヘアピンループ等)の形成等を防止することができ、目的の伸長反応を効率よく進行させることができる。

[0004] 熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼとしては、例えば、サーマス'アクアティカス

(Thermus aquaticus)由来の DNAポリメラーゼ（Taq DNAポリメラーゼ）（特許文献 1 、 2及び 3参照）、サーモトガ 'マリティマ（Thermotoga maritima)由来の DNAポリメラーゼ (Tma DNAポリメラーゼ）（特許文献 4及び 5参照）等が知られている。

特許文献 1 :米国特許第 4, 889, 818号

特許文献 2 :米国特許第 5, 352, 600号特許文献 3 :米国特許第 5, 079, 352号

特許文献 4:米国特許第 5, 374, 553号

特許文献 5 :米国特許第 5, 420, 029号

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明は、新規な熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼ、該 DNAポリメラーゼをコードする DNA、該 DNAを含む組換えベクター、及び該組換えベクターを含む形質転換体を提供することを目的とする。

また、本発明は、新規な熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼを含む PCR用キットを提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0006] 上記目的を達成するために、本発明は、以下の発明を提供する。

(1)以下の（a)又は (b)に示すアミノ酸配列力もなる熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼ。

(a)配列番号 2記載のアミノ酸配列

(b)配列番号 2記載のアミノ酸配列のうち、 1〜572番目のアミノ酸残基力なるアミノ酸配列及び Z又は 789〜832番目のアミノ酸残基力もなるアミノ酸配列において、 1 又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列

(2)前記（1)記載の熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼをコードする DNA。

(3)以下の（c)又は (d)に示す DNAを含む前記（2)記載の DNA。

(c)配列番号 1記載の塩基配列力なる DNA

(d)前記（c)に示す DNAと相補的な DNAにストリンジェントな条件下でノ、イブリダイズし、熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼをコードする DNA

(4)前記（2)又は（3)記載の DNAを含む組換えベクター。

(5)前記 (4)記載の組換えベクターを含む形質転換体。

(6)前記（1)記載の熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼを含む PCR用キット。発明の効果 [0007] 本発明によれば、新規な熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼ、該 DNAポリメラーゼをコードする DNA、該 DNAを含む組換えベクター、及び該組換えベクターを含む形質転換体が提供される。また、本発明によれば、新規な熱安定性又は熱活性 D NAポリメラーゼを含む PCR用キットが提供される。

本発明の熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼは、 Taq DNAポリメラーゼと比較して優れた DNAポリメラーゼ活性 (プライマー伸長活性)を有してヽるので、 PCRを行う際に有用である。

図面の簡単な説明

[0008] [図 1]高温環境土壌力も抽出したゲノム DNAの電気泳動結果を示す図である。

[図 2]複数の微生物（Bacillus subtilisゝ Bacillus caldotenax, Thermus aquaticusゝ Them us thermophilus, Escherichia coli)に由来するファミリー A型 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列のァライメント結果を示す図である。

[図 3]複数の微生物 (Bacillus subtilis ^ Bacillus caldotenax^ Thermus aquaticus ^ Them us thermophilus, Escherichia coli)に由来するファミリー A型 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列のァライメント結果を示す図（図 2の続き）である。

[図 4] 数の微生物 (Bacillus caldotenax, Bacillus caldolyticus, Escherichia coli, Bac illus subtilis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus hete rohiochn, Thermus aquaticus, Themus thermophilus, Sulfolobus solfataricus)力ら抽出したゲノム DNAの存在下、縮重プライマーを用いて PCRを行うことにより得られた PCR増幅断片の電気泳動結果を示す図である。

[図 5]高温環境土壌から回収したゲノム DNAの存在下、縮重プライマーを用いて PC Rを行うことにより得られた PCR増幅断片の電気泳動結果を示す図である。

[図 6]高温環境土壌から回収したゲノム DNAの存在下、縮重プライマーを用いて PC Rを行うことにより得られた PCR増幅断片にコードされるアミノ酸配列を示す図である

[図 7]プラスミド DNA力切り出した BlplZBglll断片の電気泳動結果を示す図である

[図 8]粗 DNAポリメラーゼ画分を SDS— PAGEに供した後、 CBB (クマシーブリリアントブルー)染色した結果を示す図である。

[図 9]改変 Taqポリメラーゼと Taqポリメラーゼのプライマー伸長活性の比較を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0009] 以下、本発明について詳細に説明する。

本発明の熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼは、以下の（a)又は (b)に示すァミノ酸配列力なる。

(a)配列番号 2記載のアミノ酸配列

[0010] なお、以下、アミノ酸配列（a)力もなる熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼを「D NAポリメラーゼ (a)」、アミノ酸配列 (b)カゝらなる熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼを「DNAポリメラーゼ (b)」と、う場合がある。

[0011] 本発明において、「熱安定性 DNAポリメラーゼ」とは、熱に安定で、熱に耐性を示し、二本鎖 DNAの変性に必要な温度 (例えば 80〜105°C)下に置かれた後にも、 D NAポリメラーゼ活性を保持する酵素を意味し、「熱活性 DNAポリメラーゼ」とは、二本鎖 DNAの変性により生じた一本鎖 DNAへのプライマーの特異的なアニーリング（特異的プライミング）と、プライマー伸長とを確保するのに必要な温度 (例えば 55〜8 0°C)下で DNAポリメラーゼ活性を発揮し得る酵素を意味する。また、「一本鎖 DNA へのプライマーの特異的なアニーリング」とは、一本鎖 DNAのうち目的の領域にプライマ一がアニーリングすることを意味し、「DNAポリメラーゼ活性」とは、適当なデォキシリボヌクレオシド三リン酸を基質として、铸型 DNAと相補的な DNA (プライマー伸長産物)を合成する触媒作用を意味する。

[0012] DNAポリメラーゼ活性は、例えば、酵素 1ユニットあたりのプライマー伸長活性 (kb Z分 ZU)で表すことができ、 DNAポリメラーゼ (a)の 74°Cにおけるプライマー伸長活性は、 Taq DNAポリメラーゼの 74°Cにおけるプライマー伸長活性の約 2. 4倍である（実施例参照)。 DNAポリメラーゼ (b)の 74°Cにおけるプライマー伸長活性は、欠失、置換又は付加されるアミノ酸の総数及び位置に応じて変化するものと考えられる力 Taq DNAポリメラーゼの 74°Cにおけるプライマー伸長活性の 2倍以上であることが好ましぐ 2. 4倍以上であることがさらに好ましい。なお、 Taq DNAポリメラーゼは、サーマス'アクアティカス（Thermus aquaticus)由来の DNAポリメラーゼであり、そのアミノ酸配列を配列番号 4に示し、それをコードする DNAの塩基配列を配列番号 3に示す。

[0013] DNAポリメラーゼ（b)において、配列番号 2記載のアミノ酸配列のうち、 1〜572番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及び Z又は 789〜832番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して欠失、置換又は付加されるアミノ酸の総数及び位置は特に限定されるものではない。欠失、置換又は付加されるアミノ酸の総数は 1又は複数個、好ましくは 1又は数個であり、その具体的な範囲は、欠失に関しては通常 1〜10 個、好ましくは 1〜5個、さらに好ましくは 1〜2個であり、置換に関しては通常 1〜： LO 個、好ましくは 1〜5個、さらに好ましくは 1〜2個であり、付加に関しては通常 1〜： LO 個、好ましくは 1〜5個、さらに好ましくは 1〜2個である。欠失、置換、付加等の変異は、 1〜572番目のアミノ酸残基力なるアミノ酸配列及び 789〜832番目のアミノ酸残基力もなるアミノ酸配列のうち、いずれか一方のみに対してカ卩えられてもよいし、両方に対してカ卩えられてもよ、。

[0014] DNAポリメラーゼ (a)及び (b)は、糖鎖が付加されたタンパク質及び糖鎖が付加されて、な、タンパク質の、ずれであってもよ、。タンパク質に付加される糖鎖の種類、位置等は、タンパク質の製造の際に使用される宿主細胞の種類によって異なるが、糖鎖が付加されたタンパク質には、いずれの宿主細胞を用いて得られるタンパク質も含まれる。また、 DNAポリメラーゼ（a)及び (b)は、それらの塩であってもよい。

[0015] DNAポリメラーゼ（a)のアミノ酸配列（配列番号 2)と Taq DNAポリメラーゼのァミノ酸配列（配列番号 4)との相違点を表 1に示す。これらの相違点は、 Taq DNAポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号 4)のうち、 573〜788番目のアミノ酸残基力なるァミノ酸配列を、高温土壌中に含まれる微生物由来のアミノ酸配列（配列番号 2記載のアミノ酸配列のうち、 573〜788番目のアミノ酸残基力なるアミノ酸配列）で置換することにより生じたものである。但し、 787番目及び 788番目のアミノ酸の相違は、アミノ酸配列を置換するにあたり制限酵素部位 Bglllを導入した際に生じたものである。

[表 1]

アミノ酸の位 s Taq DNAポリメラーゼ DNAポリメラーゼ（a)

596番目アルギニンリシン

60 番目卜リブ卜ファンヒスチジン

633番目グルタミンアルギニン

636番目アルギニンリシン

644番目セリンァラニン

651番目アルギニンプロリン

653番目ァラニングリシン

656番目プロリングリシン

657番目ロイシンァラニン

665番目イソロイシンバリン

683番目ァラニンセリン

690番目グルタミンァラニン

702番目リシングルタミン

708番目グルタミン酸ァラニン

709番目リシンヒスチジン

716番目アルギニンリシン

717番目アルギニンリシン

734番目グルタミン酸ァスパラギン

771番目アルギニンリシン

773番目グルタミン酸アルギニン

774番目グルタミン酸プロリン

775番目メチ才ニンロイシン

777番目ァラニンバリン

779番目メチ才ニンイソロイシン

787番目ロイシンイソロイシン

788番目バリンロイシン [0017] DNAポリメラーゼ (a)又は (b)をコードする DNAは、その塩基配列に従って化学合成により得ることができる。 DNAの化学合成は、市販の DNA合成機、例えば、チォホスファイト法を利用した DNA合成機（島津製作所社製)、フォスフォアミダイト法を利用した DNA合成機 (パーキン 'エルマ一社製)を用いて行うことができる。

[0018] また、 DNAポリメラーゼ（a)又は（b)をコードする DNAは、 Taq DNAポリメラーゼをコードする DNA (配列番号 3)に、部位特異的変異誘発法等の公知の方法を用いて人為的に変異を導入することにより得ることができる。変異の導入は、例えば、変異導入用キット、例えば、 Mutant- K (TAKARA社製）、 Mutant- G (TAKARA社製）、 TAK ARA社の LA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて行うことができる。

[0019] Taq DNAポリメラーゼをコードする DNAは、例えば、サーマス'アクアティカス（Th ermus aquaticus)から抽出した mRNAを用いて cDNAライブラリーを作製し、配列番号 3記載の塩基配列に基づ、て合成したプローブを用いて、 cDNAライブラリーから目的の DNAを含むクローンをスクリーニングすることにより得ることができる。

[0020] DNAポリメラーゼ（a)又は（b)をコードする DNAは、オープンリーディングフレームとその 3'末端に位置する終止コドンとを含む。また、 DNAポリメラーゼ (a)又は (b)をコードする DNAは、オープンリーディングフレームの 5'末端及び/又は 3'末端に非翻訳領域 (UTR)を含むことができる。

[0021] DNAポリメラーゼ（a)をコードする DNAとしては、例えば、配列番号 1記載の塩基配列からなる DNAを含む DNAが挙げられる。ここで、配列番号 1記載の塩基配列のうち、オープンリーディングフレームは 1〜2496番目、翻訳開始コドンは 1〜3番目、終止コドンは 2497〜2499番目の塩基力もなる塩基配列に位置する。 DNAポリメラーゼ（a)をコードする DNAの塩基配列は、 DNAポリメラーゼ（a)をコードする限り特に限定されるものではなぐオープンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号 1 記載の塩基配列のうち、 1〜2496番目の塩基力もなる塩基配列に限定されるものではない。

[0022] DNAポリメラーゼ (b)をコードする DNAとしては、例えば、配列番号 1記載の塩基配列からなる DNAと相補的な DNAにストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする DNAを含む DNAが挙げられる。 [0023] 「ストリンジェントな条件」としては、例えば、 42°C、 2 X SSC及び 0. 1%SDSの条件、好ましくは 65°C、 0. I X SSC及び 0. 1%SDSの条件が挙げられる。

[0024] 配列番号 1記載の塩基配列力なる DNAと相補的な DNAにストリンジントな条件下でハイブリダィズする DNAとしては、配列番号 1記載の塩基配列からなる DNA と少なくとも 88%以上、好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上の相同性を有する DNAが挙げられる。

[0025] DNAポリメラーゼ (a)及び (b)は、例えば、以下の工程に従って、それぞれをコードする DNAを宿主細胞中で発現させることにより製造することができる。

〔組換えベクター及び形質転換体の作製〕

組換えベクターを作製する際には、まず、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さの DNA断片を調製する。目的とするタンパク質のコード領域の塩基配列において、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換してもよい。

[0026] 次いで、上記 DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して組換えベクターを作製する。上記 DNA断片は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは、プロモーターの他、ェンハンサ一等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリ A付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（SD配列）等を含有することができる。

[0027] 目的とするタンパク質を生産し得る形質転換体は、組換えベクターを適当な宿主細胞〖こ導人すること〖こより得ることがでさる。

発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウィルスベクター等を使用することができる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド (例えば、 pRSET、 pBR322、 pBR325、 pUC118、 pUC119、 pUC18、 pUC19)、枯草菌由来のプラスミド（例えば、 pUB110、 pTP5)、酵母由来のプラスミド（例えば、 ΥΕρ13、 ΥΕρ24、 YCp50)を使用することができ、ファージベクターとしては、例えば、 λファージ (例えば、 Charon4A、 Charon21Aゝ EMBL3、 EMBL4、 gtl0、 gtll、 λ ZAP)等を使用することができ、ウィルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウィルス等の動物ウィルス、バキュロウィルス等の昆虫ウィルスを使用することができる。

[0028] 宿主細胞としては、目的とするタンパク質をコードする DNAを発現し得る限り、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを使用してもよい。また、動物個体、植物個体、カイコ虫体等を使用してもよい。

[0029] 細菌を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒァ 'コリ（Escherichia coli)等のェシエリヒア属、バチルス'ズブチリス（Bacillus subtilis)等のバチルス属、シユードモナス' プチダ（Pseudomonas putida)等のシユードモナス属、リゾビゥム 'メリロティ（Rhizobium meliloti)等のリゾビゥム属に属する細菌を宿主細胞として使用することができる。具体的【こ fま、 Escherichia coli BL21、 Escherichia coli XL 1 -Blue ^ Escherichia coli XL2— Blue、 Escherichia coli DH1、 Escherichia coli K12、 Escherichia coli JM109、 Escheric hia coli HB101等の大腸菌、 Bacillus subtilis MI 114、 Bacillus subtilis 207- 21等の枯草菌を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、大腸菌等の細菌中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、 trpプロモーター、 lac プロモーター、 pプロモーター、 Pプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来する

L R

プロモーターを使用することができる。また、 tacプロモーター、 lacT7プロモーター、 let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも使用することができる

[0030] 細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌に DNAを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクト口ポレーション法等を使用することができる。

[0031] 酵母を宿主細胞とする場合、サッカロミセス ·セレビシェ（Saccharomycescerevisiae)

、シゾサッカロミセス 'ボンべ（Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア'パストリス（Pichia pastoris)等を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、 gallプロモーター、 gallOプ口モーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、 1プロモーター、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 AOX1プロモーター等を使用することができる。 [0032] 酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母に DNAを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクト口ポレーシヨン法、スフエロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用することができる。

[0033] 動物細胞を宿主細胞とする場合、サル細胞 COS-7、 Vero、チャイニーズノヽムスター卵巣細胞 (CHO細胞）、マウス L細胞、ラット GH3、ヒト FL細胞等を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、動物細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、 SR aプロモーター、 SV40プロモーター、 LTR(Long T erminal Repeat)プロモーター、 CMVプロモーター、ヒトサイトメガロウィルスの初期遺伝子プロモーター等を使用することができる。

[0034] 動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞に DNAを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクト口ポレーシヨン法、リン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法等を使用することができる。

[0035] 昆虫細胞を宿主とする場合には、 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、 Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を宿主細胞として使用することができる

。 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としては S19、 Sf21等、 Trichoplusia niの卵巣細胞としては High 5、 ΒΤΙ-ΤΝ-5Β1-4 (インビトロジェン社製)等、カイコ卵巣由来の培養細胞としては Bombyx mori N4等を使用することができる。

昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞に DNAを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法、エレクト口ポレーシヨン法等を使用することができる。

[0036] 〔形質転換体の培養〕

目的とするタンパク質をコードする DNAを組み込んだ組換えベクターを導入した形質転換体を培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。

[0037] 大腸菌、酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地及び合成培地の、ずれを使用してちょい。 [0038] 炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を使用することができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ-ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸又は有機酸のアンモ-ゥム塩、ぺプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物等を使用することができる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシゥム、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用することができる。

[0039] 大腸菌、酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体の培養は、例えば、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は通常 25〜37°C、培養時間は通常 12〜48時間であり、培養期間中は pHを通常 6〜8 に保持する。 pHの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。培養の際、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ、。

[0040] プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、 lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル一 β—D—チォガラタトピラノシド等を、 trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添カ卩してもよい。

[0041] 動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されている RPMI1640培地、 Eagleの MEM培地、 DMEM培地、 Ham F12培地、 Ha m F12K培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用することができる。形質転換体の培養は、通常、 5%CO存在下、 37°Cで 3〜10日間行う。培養

2

の際、必要に応じてカナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添カ卩してもよい。

[0042] 昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されている TNM- FH培地（ファーミンジェン社製）、 Sf- 900 II SFM培地（G¾co BR L社製）、 ExCell400、 ExCell405 (JRHバイオサイエンシーズ社製）等を使用することができる。形質転換体の培養は、通常、 27°Cで 3〜10日間行う。培養の際、必要に応じてゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

[0043] 目的とするタンパク質は、分泌タンパク質又は融合タンパク質として発現させてもよい。融合させるタンパク質としては、例えば、 j8—ガラタトシダーゼ、プロテイン A、プ口ティン Aの IgG結合領域、クロラムフエ-コール'ァセチルトランスフェラーゼ、ポリ（ Arg)、ポリ（Glu)、プロテイン G、マルトース結合タンパク質、グルタチオン S-トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（His-tag)、 Sペプチド、 DNA結合タンパク質ドメイン、 T ac抗原、チォレドキシン、グリーン 'フルォレツセント'プロテイン等を使用することができる。

[0044] 〔タンパク質の単離 '精製〕

形質転換体の培養物より目的とするタンパク質を採取することにより、目的とするタンパク質が得られる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物の、ずれもが含まれる。

[0045] 目的とするタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするタンパク質を抽出する。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上清から細胞又は菌体を除去する。

[0046] 得られたタンパク質は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジェチルアミノエチル（DEAE)—セファロース、イオン交換クロマトグラフィ一法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィー法等により精製することができる。

[0047] DNAポリメラーゼ（a)及び（b)は、そのアミノ酸配列に基づ!/、て、 Fmoc法（フルォレ -ルメチルォキシカルボ-ル法）、 tBoc法（t ブチルォキシカルボ-ル法）等の化学合成法によって製造することもできる。この際、市販のペプチド合成機を使用することができる。

[0048] DNAポリメラーゼ (a)及び (b)は、 PCRを行う際に有用であり、 PCR用キットの構成要素として使用することができる。 PCR用キットは、 DNAポリメラーゼ (a)又は (b)以外に、 PCRを行うために必要な試薬、容器、装置等を含むことができる。

実施例

[0049] 〔実施例 1〕高温環境土壌に含まれる微生物に由来するゲノム DNAの獲得

(1)高温環境土壌の採取

DNAポリメラーゼを有効に利用するためには、 PCR等に使用できるような耐熱性を有することが重要であると考えられる。そして、耐熱性酵素を得るためには、高温環境力試料を取得することが最も効率的である。そこで、高温環境として性質 (_PH)の異なる温泉地帯を選択した。一つは強酸性を示す九州鹿児島霧島温泉地域で、もう一つは中性に近い pHを示す宮城県鬼首温泉地域及び秋田県大噴湯温泉地域である。

[0050] 温泉地域内の特定の領域には、マッドポット（泥が煮立って、るような穴）が天然の状態 (人手の入らない状態)で幾つも存在している。これらの地点から、採取地点ごとに、温度、 pH等のデータとともに採取試料の色、水分量等の状態を映像等により記録した。各地点からは、十分量の DNAが回収できるように、 lOOg程度の土壌、泥又は堆積物を採取した。

[0051] (2)高温環境土壌からのゲノム DNAの抽出

採取された土壌 lgを滅菌したエツペンドルフチューブに分取した後、土壌に含まれる微生物に由来するゲノム DNAを抽出した。土壌力ものゲノム DNAの抽出は、土壌からの DNA抽出キットである Ultra Clean™ Soil DNA Purification kit(MO Bio社製，カタログ No.12800-50,フナコシカタログ No丄 M128000)を用いて行った。操作は本キットに添付されて、る操作手順書に従った。

実際に抽出した DNA溶液の 1Z50量である 2 μ Lを分取し、 18 μ Lの ΤΑΕ緩衝液 (0. 04Μ Tris, 0. 02M酢酸， 0. 001M EDTA(pH8. 0) )及び Lの電気泳動用濃縮染色液（0. 25%ブロモフエノールブルー， 0. 25%キシレンシァノール， 3 0%グリセロール）をカ卩え、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動で確認した。

[0052] その結果、図 1に示すように、量の多少は有るが、幾つかの地点からは 10キロ塩基対以上の長さのゲノム DNAが回収されていることが確認できた。なお、図 1中、「M」は分子量マーカーを表し、レーン 1〜38は異なる地点に関する結果を表す。この結果から、高温環境土壌中には、十分量のゲノム DNAを抽出できる量の微生物が存在することが確認できた。

[0053] 〔実施例 2〕ファミリー A型 DNAポリメラーゼ特異的プライマーを用いた PCR

(1)ファミリー A型 DNAポリメラーゼ特異的プライマーの設計

¾数の微生物 (Bacillus subtiiis、 Bacillus caldotenax、 Thermus aquaticus、 Themus thermophilus, Escherichia coli)に由来するファミリー A型 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列のァライメントに従い、結果を図 2及び図 3に示す。なお、図 3は図 2の続きである

[0054] 図 2及び図 3中、四角で囲んだ 2つの領域（DPNLQNIP及び QVHDELX (Xは I、 V又は Lを表す)）は、複数の微生物間で相同性が高いアミノ酸配列である。このアミノ酸配列は、その他の微生物が有するファミリ一 A型 DNAポリメラーゼにおいても保存されていると推測される。

[0055] そこで、上記アミノ酸配列に基づいて、表 2に示す 2種類（5'プライマー（配列番号 5 )及び 3'プライマー（配列番号 6) )の縮重プライマーを設計した（Takashi Uemori, Yo shizumi Ishino, Kayo Fujita, Kiyozo Asada and i unosnin Kato "し loning of the DNA Polymerase Gene of Bacillus caldotenax and Characterization of the Gene Product (1993) J. Biocem., 113, 401—410.)。

[0056] [表 2]

[0057] なお、「y」は t又は cを、「s」は c又は gを、「k」は g又は tを、「r」は a又は gを、「h」は a又は t又は cを、「n」は a又は g又は c又は tを表す。

[0058] (2)ファミリー A型 DNAポリメラーゼ特異的プライマーを用いた PCR 10種類の微生物 (Bacillus caldotenax, Bacillus caldolyticus, Escherichia coli, Baci llus subtilis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus homohiochn, Lactobacillus heter ohiochii, Thermus aquaticus, Themus thermophilus, Sulfolobus solfataricus)力ら抽出したゲノム DNA 0. 5ngの存在下、上記縮重プライマー lOOpmolを用いて、 50 Lの 10mM Tris— HCl (pH8. 3)、 50mM KC1、 15mM MgCl、 200 μ M dNTP

2

及び 5ユニット TAKARA Ex Taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を含む溶液中で PCRを行った。 PCRは、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 1分間、 72°Cで 2分間からなる温度サイクルを 30サイクル行った。

[0059] その結果、図 4に示すように、 10種全ての微生物において、ファミリー A型 DNAポリメラーゼに由来すると推定される PCR増幅断片が得られた。なお、図 4中、「M」は分子量マーカーを表し、レーン 2は Bacillus caldotenax^レーン 3は Bacillus caldolyticus 、レ ~~ ~ ^Escherichia coli、レ ~~ン 5 ίま Bacillus suotilis、レ ~~ン 6i Lactobacillus bul gancus、レ ~~ン 7i¾LactoDacilms homohiochu、レ ~~ン 8 ίま Lactobacillus heteroniochn 、レ ~~ン 9i¾ fhermus aquaticus ^レ ~~ン 10ίま Themus thermophilus ^レ ~~ン 11 ίま; ilfoi obus solfataricusに関するホ吉果で teる。

[0060] この結果から、上記縮重プライマーは、任意の微生物に由来するファミリー A型 DN Aポリメラーゼ遺伝子に対するプライマーとして使用できることが明らかになった。

[0061] 次に、霧島温泉地域、鬼首温泉地域等の高温環境土壌より回収されたゲノム DNA の全回収量の 1 50 ( 1 の存在下、上記縮重プライマー lOOpmolを用いて、 50 μ Lの 10mM Tris -HCl (pH8. 3)、 50mM KC1、 15mM MgCl、 200 μ M dNT

2

P及び 5ユニット TAKARA EX Taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を含む溶液中で PCRを行った。 PCRは、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 1分間、 72°Cで 2分間の温度サイタルを 30サイクル行った。

[0062] その結果、図 5に示すように、幾つかの地点から回収したゲノム DNAを铸型とした場合、ファミリー A型 DNAポリメラーゼに由来すると推定される DNA断片が増幅された。 DNA断片の長さが予測とほぼ一致していた場合に、 DNA断片がファミリー A型 DNAポリメラーゼに由来する DNA断片であると推定した。なお、図 5中、「M」は分子量マーカーを表し、レーン 1〜29は異なる地点に関する結果を表す。 [0063] (3)増幅断片のクローニング

PCR終了後の反応液に等量の 10mM Tris-HCl (pH7. 5)及び ImM EDTA 溶液を加えた後、水溶液と等量の水飽和フエノール Zクロロフオルム液をカ卩えてよく攪拌し、 70°Cで 10分間加温した後、 10, OOOrpmで 5分間遠心し、上層水溶液画分を注意して分取した。分取した水溶液画分を、 MicroconlOO (ミリポア社製）に加え、 2500rpmで 15分間遠心した。再度、 10mM Tris—HCl(pH7. 5)及び ImM ED TA溶液を 200 L加え、 2, 500rpmで 15分間遠心した。以上の操作により、未反応プライマー、ヌクレオチド、塩等を除去した。

[0064] PCR増幅断片約 0. 05 μ gと、 10mM Tris—HCl(pH7. 5)及び ImM EDTA溶液に溶解した pGEM T—ベクター（Promega社製） 0. 1 ^ gと、 10mM Tris— HC1( pH7. 5)/ ImM EDTA溶液 8 Lとを混合した後、ライゲーシヨンキット'バージョン 2 (タカラバィォ社製） 10 Lを加えて 16°Cで 30分間保温することにより、 PCR増幅断片をプラスミド DNAにライゲートさせた。 PCR増幅断片がライゲートされたプラスミド DNA 1 μ Lを、氷中で溶解したカルシウム処理済大腸菌 DH10B 50 Lにカロえ、氷上で 20分間静置し、 42°Cで 2分間加温した後、 950 1^の液体1^培地（11^ぁたり 10gトリプトン、 5g酵母抽出液、 5g塩ィ匕ナトリウム及び lgグルコースを含む）をカ卩え、 3 7°Cで 60分間震盪培養した。震盪培養終了後の培養物 150 Lを、 lOO ^ g/mL アンピシリンを含む LB寒天培地上に植菌し、ー晚 37°Cで培養を行った。

[0065] (4) PCR増幅断片の塩基配列の解読

寒天培地上に増幅した大腸菌のコロニーを 100 μ g/mLアンピシリン約 2mLを含む LB培地に植菌し、ー晚 37°Cで震盪培養した。増殖した菌体を 10, OOOrpmで 10 分間の遠心で集菌し、 QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製，カタログ No.27104 )を用いてプラスミド DNAを回収した。回収されたプラスミド DNAを铸型とし、塩基配列解読用プライマー（Ml 3プライマー M4及び Tプロモータープライマー）を用いて PCRを行った。 PCRには、ダイターミネータ一サイクルシーケンシングキット（ABI社製)を使用し、塩基配列の解読には、 ABI社製 3700自動塩基配列検出装置を使用した。

[0066] (5) PCR増幅断片にコードされるアミノ酸配列の確定決定された PCR増幅断片の塩基配列は機械的な誤差を含む場合があるので、塩基配列を人手によって修正して機械的な誤差を除いた後、塩基配列にコードされるアミノ酸配列を決定した。公共のタンパク質データベースを使用して相同性検索を行い、 PCR増幅断片にコードされるアミノ酸配列と、既知のファミリー A型 DNAポリメラーゼ（Thermus aquaticus由来の DNAポリメラーゼ（Taq DNAポリメラーゼ））のァミノ酸配列と比較を行った。

[0067] その結果、図 6に示すように、 PCR増幅断片にコードされるアミノ酸配列には、フアミリー A型 DNAポリメラーゼの機能ドメインのアミノ酸配列が含まれていることが確認された。

[0068] なお、図 6中、「Taq」は TaqDNAポリメラーゼのアミノ酸配列を表し、「No.l」、「No.

2」及び「No.3」は、異なる地点から回収されたゲノム DNAを铸型として得られた PCR 増幅断片にコードされるアミノ酸配列を表し、それぞれ TaqDNAポリメラーゼのァミノ酸配列と 90%、 57%及び 52%の相同性を示す。また、「No.l」、「No.2」及び「No.3」に関するアミノ酸配列は、 TaqDNAポリメラーゼと異なるアミノ酸配列のみを示す。

[0069] また、表 3に示すように、異なる地点（a〜g)から回収されたゲノム DNAを铸型として得られた PCR増幅断片にコードされるアミノ酸配列は、それぞれ異なる微生物に由来するファミリー A型 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列と相同性を示したことから、数多くの未知ファミリー A型 DNAポリメラーゼが高温環境中に存在することが確認できた。

[0070] [表 3]

試料 No. 微生物の種類相同性

a Anaerocel lum thermophi lum 44% b Thermoanaerobacter yonseines 52% c Thermomicrobium roseum 55% d E. col i klenow fragment 49% e Chlorobium tepidum 61% f The面 s f i 1 i formis 65% g Thermus aquat icus 95%

[0071] 〔実施例 3〕改変 DNAポリメラーゼをコードする DNAを有するプラスミドの構築

(1)制限酵素部位を導入するためのプライマーの設計

実施例 2で得られた PCR増幅断片は、 DNAポリメラーゼ活性の中心を担う領域をカバーするものであるから、 Taq DNAポリメラーゼのアミノ酸配列のうち、 PCR増幅断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示す領域が、 PCR増幅断片にコードされるアミノ酸配列で置換された改変 DNAポリメラーゼは、 Taq DNAポリメラーゼとは異なる DNAポリメラーゼ活性を示すと考えられ、向上した DNAポリメラーゼ活性を示す可能性がある。また、改変 DNAポリメラーゼの機能は、高温土壌中に存在する未知ファミリー A型 DNAポリメラーゼの機能を反映していると考えられる。

[0072] そこで、 Taq DNAポリメラーゼをコードする DNAのうち、 PCR増幅断片で置換される領域の外側に制限酵素部位 (Blpl部位及び Bglll部位)を導入するために、表 3に示す 2種類のプライマー A (配列番号 7)及びプライマー B (配列番号 8)を設計した。プライマー Aは、 Taq DNAポリメラーゼのアミノ酸配列に影響することなぐ新たな制限酵素部位として Blpl認識配列を導入できるように設計されている。プライマー Bは、新たな制限酵素部位として Bglll認識配列を導入できるように設計されているが、ブライマ一 Bにより Bglll認識配列が導入されると、 Taq DNAポリメラーゼの 787番目のァミノ酸残基 Leuはそれと類似した性質のアミノ酸残基 lieに、 788番目のアミノ酸残基 Valはそれと類似した性質のアミノ酸残基 Leuに置換される。 [0073] 一方、 PCR増幅断片の外側に制限酵素部位 (Blpl部位及び Bglll部位)を導入するために、表 4に示す 2種類のプライマー C (配列番号 9)及びプライマー D (配列番号 1 0)を設計した。プライマー Cは、 Taq DNAポリメラーゼのアミノ酸配列に影響することなぐ新たな制限酵素部位として Blpl認識配列を導入できるように設計されている。新たな制限酵素部位として Bglll認識配列を導入できるように設計されているが、ブライマ一 Bにより Bglll認識配列が導入されると、 Taq DNAポリメラーゼの 787番目のァミノ酸残基 Leuはそれと類似した性質のアミノ酸残基 lieに、 788番目のアミノ酸残基 Valはそれと類似した性質のアミノ酸残基 Leuに置換される。

[0074] [表 4]

[0075] なお、表 4中、一重下線部分は新たに導入される Blpl部位を表し、二重下線部分は新たに導入される Bglll部位を表す。

[0076] (2)制限酵素部位導入プライマーを用いた PCR

Taq DNAポリメラーゼをコードする DNAをプラスミドベクター pTVIN (タカラバイォ社）にクローユングした。（Ishino Y, Ueno T, Miyagi M, Uemori T, Imamura M, Tsu nasawa S, Kato I. "Overproduction of Thermus aquaticus DNA polymerase and its st ructural analysis by ion-spray mass spectrometry" (1994) J Biochem (Tokyo), 116(5) , 1019-24に掲載の文献を参照した）。 10ngの存在下、プライマー A及び B 2pmolを用ヽて、 50 μ L( 10mM Tris -HCl (pH8. 3)、 50mM KC1、 15mM MgCl

2、 20

O ^ M dNTP及び 2. 5ユニット PlUUltra DNAポリメラーゼ（Stratagene社製）を含む溶液中で PCRを行った。 PCRは、 95°Cで 1分間、 55°Cで 1分間、 72°Cで 15分間の温度サイクルを 20サイクル行った。

[0077] 次に、実施例 2で得られたプラスミドクローン 10ngの存在下、プライマー C及び D 2 pmolを用いて、の lOmM Tris— HCl (pH8. 3)、 50mM KC1、 15mM Mg CI、 200 M dNTP及び 2. 5ユニット PlUUltra DNAポリメラーゼ（Stratagene社製）

2

を含む溶液中で PCRを行った。 PCRは、 95°Cで 1分間、 55°Cで 1分間、 72°Cで 2分間の温度サイクルを 30サイクル行つた。

[0078] (3) PCR増幅断片の制限酵素処理

PCR増幅断片を制限酵素 Blpl及び Bglllで切断した。すなわち、各 PCR増幅反応液 50 /z Lに 10倍濃縮制限酵素用緩衝液（200mM Tris— HCl (pH8. 2)、 100m M MgCl、 600mM NaCl、 lOmM DTT) 5 L、滅菌蒸留水 42 μ L及び制限酵

2

素 Blpl 3 μ Lをカ卩えて、十分に混合した後、 37°Cで 3時間保温した。次に、 5M NaC 1溶液を及び制限酵素 Bglll 3 Lをカ卩えて、十分に混合した後、 60°Cで 3時間保温した。保温終了後、 10 _iu Lの10mM EDTA及び 2%SDS液を加えて、反応を止めた。

[0079] 0. 8%ァガロースゲル電気泳動により切断された各 DNA断片を分離した後、 QUI AGEN社製 QuiaQuickTipを用いて各 DNA断片を回収 ·精製した。

(4)制限酵素処理された DNA断片のライゲーシヨン

回収'精製された各 DNA断片 0. 5 g (1 L)を氷上で混合し、 10mM Tris— H Cl(pH7. 5)及び ImM EDTA溶液 3 μ Lカロえ、さらにタカラバィォ社製 Takara Liga tion Kit version2を 5 μ L加えて、よく混合した後、 16°Cで 1時間保温した。

[0080] (5)大腸菌への導入

ライゲーシヨン反応液のうち 1 Lをカルシウム処理済大腸菌 JM109菌体液 20 μ L と氷上で混合し、 30分間静置し、 42°Cで 30秒間の熱処理後、 LB液体培地 980 μ L を加え、 37°Cで 60分間震盪培養を行った。次いで、 100 /z Lを分取し、 100 /z gZm Lアンピシリンを含む寒天 LB培地上に均一に植菌した後、ー晚 37°Cで保温した。

[0081] (6)組み換えの確認

寒天培地上に植菌された大腸菌のうち、プラスミド DNAを有するもののみが寒天培地上で増殖しコロニーを形成した。形成されたコロニーのうち、無作為に 10個を選択し、 2mLの LB液体培地に植菌し、 37°Cでー晚震盪培養した後、 QIAGEN社製 QIA prep Spin Miniprep Kit (カタログ No.27104)を用いてプラスミド DNAを回収した。回収したプラスミド DNAを Blpl及び Bglllで処理し、 BlplZBglll断片を切り出した。その結果、図 7に示すように、 Taq DNAポリメラーゼをコードする DNAを含むプラスミドに P CR増幅断片が組み込まれていること、すなわち、改変 DNAポリメラーゼをコードする DNAを有すると予想される発現用プラスミドを構築できたことが確認された。なお、図 7中、「M」はマーカーを表し、レーン 1〜3は、それぞれ異なる地点から回収されたゲノム DNAを铸型として得られた PCR増幅断片が組み込まれた組み換えプラスミド〖こ関する結果を示す。

[0082] (7) PCR増幅断片の塩基配列決定

図 7のレーン 2に示した改変 DNAポリメラーゼをコードする DNAのうち、 PCR増幅断片部分の塩基配列を以下のように決定した。

組み換えプラスミドを铸型として用い、 Beckman Coulter社の CQE Dye terminator c ycle sequencing with quick start kitを用いてサイタノレジデォキシ反応を行った。この際、 5，側のプライマーとして、 5'- tccaccccaggacgggccgcctccac- 3'を用い、 3，側のプライマ一として、 5'- cccctccatgacctccttggccagcc- 3'を用いた。 300ngの铸型 DNA及び 5pmolのプライマーを用いて、 96°Cで 20秒、 50°Cで 20秒、 60°Cで 4分を 1サイクルとして 30サイクルの反応を行った。反応溶液を Sephadex G-50カラムに通すことによつて未反応基質を除いた。反応溶液を乾固させた後、 40 Lの電気泳動用溶液に溶解した後、 Beckman Coulter社の CEQ 2000XL DNA Analysis Systemで塩基配列を決定した。

[0083] 図 7のレーン 2に示した改変 DNAポリメラーゼをコードする DNAの塩基配列を配列番号 1に示し、この塩基配列（配列番号 1)力推定される改変 DNAポリメラーゼのァミノ酸配列を配列番号 2に示す。このアミノ酸配列から、組み換えた部分が DNAポリメラーゼ遺伝子の一部であると予想された。なお、配列番号 2記載の塩基配列のうち、 1〜572番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及び 789〜832番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は Taq DNAポリメラーゼに由来し、 573〜788番目のァミノ酸残基カゝらなるアミノ酸配列は Taq DNAポリメラーゼに組み込まれた PCR増幅断片に由来する。

[0084] 〔実施例 4〕改変 DNAポリメラーゼの産生及び機能解析 (1)組み換えプラスミドの発現用大腸菌への導入

図 7のレーン 2に示した改変 DNAポリメラーゼをコードする DNAを有する発現用プラスミドを、大腸菌 JM109株に形質転換した。

大腸菌 BL21-CodonPlus(DE3)-RILのコンビテント細胞を融解して、ファルコンチューブに 0. lmLずつ移した。その中に、発現用プラスミド lOngに相当する溶液をカロえ、氷中に 30分間放置した後、 42°Cのヒートショックを 30秒間行い、そこに SOC培地 0 . 9mLを加え、 37°Cで 1時間振とう培養した。その後、アンピシリンを含む LB寒天プレート上に適量まき、 37°Cでー晚培養し、形質転換体大腸菌 BL21- CodonPlus(DE3) - RIL/ST0452- 1を得た。

[0085] (2)改変 DNAポリメラーゼの産生

寒天培地上に現れた形質転換体を、アンピシリンを含む LB培地 5mL中、 37°Cで、 600nmにおける吸光度 (A )が 0. 4〜0. 6に達するまで培養した後、 IPTG (Isopro

600

pyl-b-D-thiogalactopyranoside)を ImMになるようにカロえ、さらに 30°Cで 10時間培養した。培養後、遠心分離 (6, OOOrpmで 20分間）により集菌を行った。

[0086] 集菌した菌体を 75°Cで 30分間加熱処理した後、 2倍量の 50mMトリス塩酸緩衝液

(pH7. 5)、 1錠のプロテアーゼ阻害剤（Complete EDTA- free, Roche社製）を加え、懸濁した。得られた懸濁液を超音波破砕し、 75°Cで 60分間保温した後、遠心分離（ 11, OOOrpmで 20分間）により上清を得た。これに終濃度 0. 15%になるように 5%ポリエチレンィミン溶液を加え、氷中で 60分間放置した。遠心分離後、上清に 100%飽和となるように硫酸アンモ-ゥムを加えた。遠心分離後、沈殿を 50mMトリス塩酸緩衝液（ρΗ8. 0)、 ImM PMSF (フエ-ルメチルスルフォ-ルフルオライド）及び ImM EDTAに透析した。不溶物を、遠心分離により除去した後、上清に、 0. 5Mとなるように硫酸アンモ-ゥムをカ卩えた後、 1,8000 X gで 10分間遠心し、上清を得た。この上清を HiTrapフエニール HPカラムで処理した後、 HiTrapへパリン HPカラムで処理し、粗 DNAポリメラーゼ画分とした。

[0087] 粗 DNAポリメラーゼ画分を SDS— PAGEに供した後、 CBB (クマシ一ブリリアントブルー）染色した結果を図 8に示す。図 8中、「M」は分子量マーカーを表し、「T」は、野生型 Taq DNAポリメラーゼをコードする DNAを含む発現用プラスミドを有する大腸菌から得られた粗 DNAポリメラーゼ画分に関する結果を表す。また、図 8中、レーン 2が、図 7のレーン 2に示した改変 DNAポリメラーゼをコードする DNAを有する発現用プラスミドを発現させて得られた粗 DNAポリメラーゼ画分に関する結果を表す。図 8に示すように、粗 DNAポリメラーゼ画分はほぼ均一なタンパク質評品であった。

[0088] (3)改変 DNAポリメラーゼの機能解析

(2)で精製された DNAポリメラーゼを用いて、デォキシヌクレオチドの取り込み活性を測定し、図 8のレーン 2に示した改変 DNAポリメラーゼの比活性を求めた。反応溶液として、 20mM Tris— HCl(pH8. 0)、 2mM MgCl、 2mM 2—メルカプトエタノ

2

ール、 0. 2mg/mL仔牛胸腺 DNA(DNAaseにより活性化したもの）、各 40 M d ATP、 dGTP、 dCTP、 60nM [^チル ³H] dTTPを含む溶液を用意し、反応溶液 45 mLに対して、フラクション溶液 5mLをカ卩え、 70°Cで反応させた後、その一部を DE8 1ペーパーにスポットし、次いで、これを 5%Na HPO溶液で 5回洗浄した。そして、

2 4

DE81ペーパーフィルター上に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターで測定した。これにより、各酵素標品の活性濃度をユニットで表示したところ、 Taq D NAポリメラーゼの比活性は 3. 9 X 10⁵ユニット Zmg、改変 DNAポリメラーゼの比活性は 2. 8 X 10⁵ユニット Zmgであった。

[0089] 図 8のレーン 2に示した改変 DNAポリメラーゼについて、プライマー伸長活性測定による評価を行い、 Taq DNAポリメラーゼの活性と比較を行った。

プライマー伸長活性測定は、以下のように行った。まず、 0. lpmolの³² P標識ブライマ一を 20mMトリス塩酸緩衝液（pH8. 8)、 5mM塩化マグネシウム、 14mM 2—メルカプトエタノールに溶解した 0. 2 _iu gのM13mpl8—本鎖DNAに加ぇた。 100°C で 5分間熱処理を行った後、ゆっくり冷ますことによってアニーリングさせた。この DN A溶液に 0. 2mMになるように dNTP溶液をカ卩えた。改変 DNAポリメラーゼ及び Taq DNAポリメラーゼをそれぞれ 0. 25ユニット加え、 74°Cで反応を行った (反応系 30 L)。反応開始後 2. 5、 5、 10分にそれぞれ 8 Lを取り、 2 Lの反応停止液（98 %脱イオン化ホルムアミド、 ImM EDTA、 0. 1%キシレンシァノール、 0. 1%ブロモフエノールブルー）をカ卩え、電気泳動に供した。電気泳動には、 50mM NaOH、 1 mM EDTAを含む 1%ァガロースゲルを用い、 30mAで 16時間泳動を行った。測定結果を図 9に示す。図 9に示すように、改変 DNAポリメラーゼのプライマー伸長活性は 11. 20kbZ分 Zユニット、 Taq DNAポリメラーゼのプライマー伸長活性は 4. 67kbZ分 Zユニットであり、改変 DNAポリメラーゼは、 Taq DNAポリメラーゼの約 2. 4倍のプライマー伸長活性を有していた。

Claims

請求の範囲

[1] 以下の（a)又は (b)に示すアミノ酸配列力もなる熱安定性又は熱活性 DNAポリメラ一で。

(a)配列番号 2記載のアミノ酸配列

[2] 請求項 1記載の熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼをコードする DNA。

[3] 以下の（c)又は (d)に示す DNAを含む請求項 2記載の DNA。

(c)配列番号 1記載の塩基配列力なる DNA

[4] 請求項 2又は 3記載の DNAを含む組換えベクター。

[5] 請求項 4記載の組換えベクターを含む形質転換体。

[6] 請求項 1記載の熱安定性又は熱活性 DNAポリメラーゼを含む PCR用キット。