JP2001078786A - 酵素活性をスクリーニングする方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 熱安定性酵素の取得を目的とした酵素活性の
スクリーニング方法の提供。 【解決手段】 熱安定性酵素が得られたもとの酵素に比
べ、低温において改良された酵素活性を有する熱安定性
酵素を得る方法であって、(a) 少なくとも60℃の温度で
安定な第一の酵素をコードする、少なくとも一種のポリ
ヌクレオチドを突然変異誘発にかけて、一種または二種
以上の変異ポリヌクレオチドを得、そして(b) 前記変異
ポリヌクレオチドまたは該変異ポリヌクレオチドから得
られた変異酵素をスクリーニングして、少なくとも60℃
の温度で安定で、その至適温度範囲の少なくとも10℃低
い温度で酵素活性を有し、該変異酵素が得られたもとの
前記第一の酵素よりも高い活性を有する突然変異酵素を
取得することを含む前記方法が開示される。該方法は、
低温で改善された酵素活性を有する熱安定性タンパク質
を開発することに応用できる。
スクリーニング方法の提供。 【解決手段】 熱安定性酵素が得られたもとの酵素に比
べ、低温において改良された酵素活性を有する熱安定性
酵素を得る方法であって、(a) 少なくとも60℃の温度で
安定な第一の酵素をコードする、少なくとも一種のポリ
ヌクレオチドを突然変異誘発にかけて、一種または二種
以上の変異ポリヌクレオチドを得、そして(b) 前記変異
ポリヌクレオチドまたは該変異ポリヌクレオチドから得
られた変異酵素をスクリーニングして、少なくとも60℃
の温度で安定で、その至適温度範囲の少なくとも10℃低
い温度で酵素活性を有し、該変異酵素が得られたもとの
前記第一の酵素よりも高い活性を有する突然変異酵素を
取得することを含む前記方法が開示される。該方法は、
低温で改善された酵素活性を有する熱安定性タンパク質
を開発することに応用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、発現ライブラリーの作
製及び酵素活性についてのそのスクリーニングに関し、
特に、微生物のＤＮＡから選択されたＤＮＡを得るこ
と、選択されたＤＮＡから製造された発現ライブラリー
を酵素活性についてスクリーニングすること、ＤＮＡの
指向性突然変異誘発、及び得られた特定のタンパク質、
特に酵素、対象となる活性について突然変異を誘発され
たＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすること、及
び熱安定性酵素に関し、特に本発明は、高温で安定であ
り、低温では改良された活性を有する熱安定性酵素に関
する。
製及び酵素活性についてのそのスクリーニングに関し、
特に、微生物のＤＮＡから選択されたＤＮＡを得るこ
と、選択されたＤＮＡから製造された発現ライブラリー
を酵素活性についてスクリーニングすること、ＤＮＡの
指向性突然変異誘発、及び得られた特定のタンパク質、
特に酵素、対象となる活性について突然変異を誘発され
たＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすること、及
び熱安定性酵素に関し、特に本発明は、高温で安定であ
り、低温では改良された活性を有する熱安定性酵素に関
する。
【０００２】
【課題を解決するための手段】産業界においては、広範
な種類の産業的用途のための新規な酵素の必要性が認識
されている。そこで、種々の微生物をスクリーニングし
てその微生物が所望の酵素活性を有しているかどうか確
認することが行われてきた。そのような微生物が所望の
酵素活性を有していれば、それから酵素を回収する。本
発明は、酵素をさらなる用途、例えば広範な工業的用
途、医療用途、研究試薬として使用するためにキットに
パッケージングすること等のために酵素を得る新規な方
法を提供するものである。
な種類の産業的用途のための新規な酵素の必要性が認識
されている。そこで、種々の微生物をスクリーニングし
てその微生物が所望の酵素活性を有しているかどうか確
認することが行われてきた。そのような微生物が所望の
酵素活性を有していれば、それから酵素を回収する。本
発明は、酵素をさらなる用途、例えば広範な工業的用
途、医療用途、研究試薬として使用するためにキットに
パッケージングすること等のために酵素を得る新規な方
法を提供するものである。
【０００３】すなわち、本発明によれば、微生物から組
換え酵素が生成され、これらは種々の酵素的特徴により
分類されるものである。
換え酵素が生成され、これらは種々の酵素的特徴により
分類されるものである。
【０００４】特に、本発明の一つの形態によれば、特定
の酵素活性を有するクローンを同定するための方法であ
って、(i) 上記特定の酵素活性を有する酵素をコードす
るＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む少なくとも一種の
プローブＤＮＡを使用することにより、少なくとも一種
の微生物から得たＤＮＡから標的ＤＮＡを選択的に単離
し、(ii) 単離された標的ＤＮＡを用いて宿主を形質転
換して、活性ライブラリースクリーニングまたは核酸ラ
イブラリースクリーニング法を使用して、好ましくは上
記特定の酵素活性についてスクリーニングされるクロー
ンのライブラリーを作製することにより調製されたクロ
ーンのライブラリー中で上記の特定の酵素活性について
スクリーニングすることを含む、前記方法が提供され
る。
の酵素活性を有するクローンを同定するための方法であ
って、(i) 上記特定の酵素活性を有する酵素をコードす
るＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む少なくとも一種の
プローブＤＮＡを使用することにより、少なくとも一種
の微生物から得たＤＮＡから標的ＤＮＡを選択的に単離
し、(ii) 単離された標的ＤＮＡを用いて宿主を形質転
換して、活性ライブラリースクリーニングまたは核酸ラ
イブラリースクリーニング法を使用して、好ましくは上
記特定の酵素活性についてスクリーニングされるクロー
ンのライブラリーを作製することにより調製されたクロ
ーンのライブラリー中で上記の特定の酵素活性について
スクリーニングすることを含む、前記方法が提供され
る。
【０００５】この形態の好ましい態様においては、少な
くとも一種の微生物から得られるＤＮＡは、プローブＤ
ＮＡ配列に例えばハイブリダイゼーションにより特異的
に結合するＤＮＡから回収することにより選択される。
一種以上の微生物から得たＤＮＡはゲノムＤＮＡであっ
てもよく、あるいはゲノム遺伝子ライブラリーＤＮＡで
あってもよい。例えば、ベクター結合用に調製されたＤ
ＮＡを使用することもできる。プローブは固相に直接ま
たは間接的に結合することができ、これにより、プロー
ブにハイブリダイズしないかＤＮＡあるいは特異的に結
合しないＤＮＡからそれを分離する。前記方法は、前記
のハイブリダイズしたあるいは結合したＤＮＡを回収し
た後にそのプローブからＤＮＡを遊離させ、そのように
遊離されたＤＮＡを増幅することも含んでもよい。
くとも一種の微生物から得られるＤＮＡは、プローブＤ
ＮＡ配列に例えばハイブリダイゼーションにより特異的
に結合するＤＮＡから回収することにより選択される。
一種以上の微生物から得たＤＮＡはゲノムＤＮＡであっ
てもよく、あるいはゲノム遺伝子ライブラリーＤＮＡで
あってもよい。例えば、ベクター結合用に調製されたＤ
ＮＡを使用することもできる。プローブは固相に直接ま
たは間接的に結合することができ、これにより、プロー
ブにハイブリダイズしないかＤＮＡあるいは特異的に結
合しないＤＮＡからそれを分離する。前記方法は、前記
のハイブリダイズしたあるいは結合したＤＮＡを回収し
た後にそのプローブからＤＮＡを遊離させ、そのように
遊離されたＤＮＡを増幅することも含んでもよい。
【０００６】本発明はまた、遺伝子クラスタータンパク
質産物についての発現ライブラリーのスクリーニングを
提供し、特に、原核生物または真核生物のＤＮＡから選
択された遺伝子クラスターを得ること、及び対象の選択
された遺伝子クラスターＤＮＡの発現から得られるタン
パク質のファミリーの関連する活性を有するタンパク質
の所望の活性について発現ライブラリーをスクリーニン
グすることを提供する。
質産物についての発現ライブラリーのスクリーニングを
提供し、特に、原核生物または真核生物のＤＮＡから選
択された遺伝子クラスターを得ること、及び対象の選択
された遺伝子クラスターＤＮＡの発現から得られるタン
パク質のファミリーの関連する活性を有するタンパク質
の所望の活性について発現ライブラリーをスクリーニン
グすることを提供する。
【０００７】特に、この形態の一つの態様は、特定のタ
ンパク質活性を有するクローンを同定するための方法で
あって、(i) 対象となる特定の活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチド配
列の少なくとも一部を含む少なくとも一種のプローブポ
リヌクレオチドを使用することにより、少なくとも一種
の生物から得たＤＮＡから標的遺伝子クラスターＤＮＡ
を選択的に単離し、(ii) 単離された標的遺伝子クラス
ターＤＮＡを用いて宿主を形質転換して、上記の対象の
特定の活性についてスクリーニングされるクローンのラ
イブラリーを作製することにより調製されるクローンの
ライブラリー中で上記の特定の酵素活性についてスクリ
ーニングすることを含む前記方法が提供される。例え
ば、λベクター中のＤＮＡを使用すると、この経路を使
用してＤＮＡをパッケージし、細胞を感染させることが
できるであろう。
ンパク質活性を有するクローンを同定するための方法で
あって、(i) 対象となる特定の活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチド配
列の少なくとも一部を含む少なくとも一種のプローブポ
リヌクレオチドを使用することにより、少なくとも一種
の生物から得たＤＮＡから標的遺伝子クラスターＤＮＡ
を選択的に単離し、(ii) 単離された標的遺伝子クラス
ターＤＮＡを用いて宿主を形質転換して、上記の対象の
特定の活性についてスクリーニングされるクローンのラ
イブラリーを作製することにより調製されるクローンの
ライブラリー中で上記の特定の酵素活性についてスクリ
ーニングすることを含む前記方法が提供される。例え
ば、λベクター中のＤＮＡを使用すると、この経路を使
用してＤＮＡをパッケージし、細胞を感染させることが
できるであろう。
【０００８】この形態の特定の態様においては、生物の
ゲノムＤＮＡから得られた遺伝子クラスターＤＮＡは、
プローブＤＮＡ配列に例えばハイブリダイゼーションに
より特異的に結合するＤＮＡから回収することにより選
択される。ポリヌクレオチドプローブは固相に直接また
は間接的に結合することができ、それにより、該プロー
ブにハイブリダイズしないＤＮＡあるいは特異的に結合
しないＤＮＡがそれから分離される。本発明の方法のこ
の形態のこの態様は、前記のハイブリダイズしているか
あるいは結合したＤＮＡを回収した後にそのプローブか
ら結合ＤＮＡを遊離させ、その遊離したＤＮＡを増幅す
ることも含んでもよい。
ゲノムＤＮＡから得られた遺伝子クラスターＤＮＡは、
プローブＤＮＡ配列に例えばハイブリダイゼーションに
より特異的に結合するＤＮＡから回収することにより選
択される。ポリヌクレオチドプローブは固相に直接また
は間接的に結合することができ、それにより、該プロー
ブにハイブリダイズしないＤＮＡあるいは特異的に結合
しないＤＮＡがそれから分離される。本発明の方法のこ
の形態のこの態様は、前記のハイブリダイズしているか
あるいは結合したＤＮＡを回収した後にそのプローブか
ら結合ＤＮＡを遊離させ、その遊離したＤＮＡを増幅す
ることも含んでもよい。
【０００９】本発明の別の形態は、異種ＤＮＡ集団に由
来する特定の酵素活性を有する酵素を得るための方法で
あって、特定の酵素活性の生成に対する指向性突然変異
誘発にかけられた異種ＤＮＡ集団からのＤＮＡを含むク
ローンのライブラリーを、前記の特定の酵素活性につい
てスクリーニングすることを含む方法を提供する。
来する特定の酵素活性を有する酵素を得るための方法で
あって、特定の酵素活性の生成に対する指向性突然変異
誘発にかけられた異種ＤＮＡ集団からのＤＮＡを含むク
ローンのライブラリーを、前記の特定の酵素活性につい
てスクリーニングすることを含む方法を提供する。
【００１０】本発明の別の形態は、特定の酵素活性を有
する酵素を得るための方法であって、その特定の酵素活
性と同じであってもよく異なるものであってもよい一以
上の所望の特徴を有する酵素をコードするＤＮＡをクロ
ーンのライブラリーで生成する試みにおいて指向性突然
変異誘発にかけられたＤＮＡ集団のプールからのＤＮＡ
を含むクローンのライブラリーを、その特異的な酵素活
性についてスクリーニングすることを含む方法を提供す
る。好ましい態様においては、指向性突然変異誘発にか
けられる前記ＤＮＡプールは、少なくとも一種の酵素的
特徴、特に少なくとも一種の共通の(common)酵素活性を
有する酵素をコードするように選択されたＤＮＡのプー
ルである。
する酵素を得るための方法であって、その特定の酵素活
性と同じであってもよく異なるものであってもよい一以
上の所望の特徴を有する酵素をコードするＤＮＡをクロ
ーンのライブラリーで生成する試みにおいて指向性突然
変異誘発にかけられたＤＮＡ集団のプールからのＤＮＡ
を含むクローンのライブラリーを、その特異的な酵素活
性についてスクリーニングすることを含む方法を提供す
る。好ましい態様においては、指向性突然変異誘発にか
けられる前記ＤＮＡプールは、少なくとも一種の酵素的
特徴、特に少なくとも一種の共通の(common)酵素活性を
有する酵素をコードするように選択されたＤＮＡのプー
ルである。
【００１１】また、遺伝子クラスターの異種集団に由来
する特定の活性を有するタンパク質を得るための方法で
あって、対象となる特定のタンパク質活性の生成に対す
る指向性突然変異誘発にかけられた異種遺伝子クラスタ
ー集団からの遺伝子クラスターを含むクローンのライブ
ラリーを、前記の特定の酵素活性についてスクリーニン
グすることによる方法を提供する。
する特定の活性を有するタンパク質を得るための方法で
あって、対象となる特定のタンパク質活性の生成に対す
る指向性突然変異誘発にかけられた異種遺伝子クラスタ
ー集団からの遺伝子クラスターを含むクローンのライブ
ラリーを、前記の特定の酵素活性についてスクリーニン
グすることによる方法を提供する。
【００１２】また、特定の活性を有する遺伝子クラスタ
ータンパク質産物を得る方法であって、指向性突然変異
誘発にかけられた遺伝子クラスター集団のプールからの
遺伝子クラスターを含むクローンのライブラリーをその
特定のタンパク質活性についてスクリーニングして、前
記クローンのライブラリーにおいてその特定のタンパク
質活性と同じであってもよく異なるものであってもよい
一以上の所望の特徴を有するタンパク質をコードする遺
伝子クラスターを生成することを含む方法を提供する。
好ましくは、指向性突然変異誘発にかけられる前記遺伝
子クラスターのプールは、少なくとも一種の治療的、予
防的、あるいは生理学的制御活性の合成における酵素活
性を有するタンパク質をコードするように選択されたも
のである。
ータンパク質産物を得る方法であって、指向性突然変異
誘発にかけられた遺伝子クラスター集団のプールからの
遺伝子クラスターを含むクローンのライブラリーをその
特定のタンパク質活性についてスクリーニングして、前
記クローンのライブラリーにおいてその特定のタンパク
質活性と同じであってもよく異なるものであってもよい
一以上の所望の特徴を有するタンパク質をコードする遺
伝子クラスターを生成することを含む方法を提供する。
好ましくは、指向性突然変異誘発にかけられる前記遺伝
子クラスターのプールは、少なくとも一種の治療的、予
防的、あるいは生理学的制御活性の合成における酵素活
性を有するタンパク質をコードするように選択されたも
のである。
【００１３】これらの形態の方法はいずれも、指向性突
然変異誘発の前に、指向性突然変異誘発の前に観察され
る活性と同じであってもよく異なるものであってもよい
少なくとも一種の共通の物理学的、化学的、あるいは機
能的特徴を有するタンパク質をコードするポリシストロ
ン性配列を含む遺伝子クラスターを遺伝子クラスターの
異種集団から選択的に回収することをさらに含んでいて
もよい。好ましくは、遺伝子クラスター調製物の回収
は、対象となる遺伝子クラスターの少なくとも一部分に
ついての、固相結合ハイブリダイゼーションプローブの
ような、特異的な結合相手と遺伝子クラスター集団を接
触させることを含む。得られるタンパク質の共通の特徴
は、上記に挙げた活性の種類、すなわち共通の合成経路
の一部として関与する一連の酵素、あるいはホルモンも
しくはシグナル伝達、または代謝経路または病原体にお
けるそれらの機能等の阻害ができるタンパク質などの種
類のクラスとすることができる。遺伝子クラスターＤＮ
Ａは、対象となる活性を示す異種遺伝子クラスター集団
からのそのような遺伝子クラスターＤＮＡを含むクロー
ンから回収される。好ましくは、指向性突然変異誘発は
部位特異的指向性突然変異誘発である。この方法はさら
に、指向性突然変異誘発にかける前に、上記対象となる
活性と同じであってもよく異なるものであってもよい活
性について、クローンのライブラリーを予備スクリーニ
ングする工程を含むことができる。この活性は、例え
ば、対象となるタンパク質、あるいはタンパク質の関連
ファミリーの発現から得られるものとすることができ
る。
然変異誘発の前に、指向性突然変異誘発の前に観察され
る活性と同じであってもよく異なるものであってもよい
少なくとも一種の共通の物理学的、化学的、あるいは機
能的特徴を有するタンパク質をコードするポリシストロ
ン性配列を含む遺伝子クラスターを遺伝子クラスターの
異種集団から選択的に回収することをさらに含んでいて
もよい。好ましくは、遺伝子クラスター調製物の回収
は、対象となる遺伝子クラスターの少なくとも一部分に
ついての、固相結合ハイブリダイゼーションプローブの
ような、特異的な結合相手と遺伝子クラスター集団を接
触させることを含む。得られるタンパク質の共通の特徴
は、上記に挙げた活性の種類、すなわち共通の合成経路
の一部として関与する一連の酵素、あるいはホルモンも
しくはシグナル伝達、または代謝経路または病原体にお
けるそれらの機能等の阻害ができるタンパク質などの種
類のクラスとすることができる。遺伝子クラスターＤＮ
Ａは、対象となる活性を示す異種遺伝子クラスター集団
からのそのような遺伝子クラスターＤＮＡを含むクロー
ンから回収される。好ましくは、指向性突然変異誘発は
部位特異的指向性突然変異誘発である。この方法はさら
に、指向性突然変異誘発にかける前に、上記対象となる
活性と同じであってもよく異なるものであってもよい活
性について、クローンのライブラリーを予備スクリーニ
ングする工程を含むことができる。この活性は、例え
ば、対象となるタンパク質、あるいはタンパク質の関連
ファミリーの発現から得られるものとすることができ
る。
【００１４】これらの形態の方法はいずれも、前記指向
性突然変異誘発の前に、特定の酵素活性と同じであって
もよく異なるものであってもよい少なくとも一つの共通
の特徴を有する酵素をコードするＤＮＡ配列を、異種Ｄ
ＮＡ集団から選択的に回収することをさらに含んでいて
もよい。好ましくは、ＤＮＡ調製物の回収は、コード配
列の少なくとも部分についての、固相結合ハイブリダイ
ゼーションプローブのような、特異的な結合相手とＤＮ
Ａ集団を接触させることを含む。共通の特徴は、例えば
酵素活性の一種、例えばヒドロラーゼ活性とすることが
できる。ＤＮＡは、酵素活性の一種を示す異種ＤＮＡ集
団からのＤＮＡを含むクローンから回収される。好まし
くは、指向性突然変異誘発は部位特異的指向性突然変異
誘発である。この形態の方法はさらに、指向性の突然変
異誘発にかける前に、特定の酵素活性と同じであっても
よく異なるものであってもよい活性について、クローン
のライブラリーを予備スクリーニングする工程を含むこ
とができる。この活性は、例えば、対象となるタンパク
質の発現から得られるものとすることができる。
性突然変異誘発の前に、特定の酵素活性と同じであって
もよく異なるものであってもよい少なくとも一つの共通
の特徴を有する酵素をコードするＤＮＡ配列を、異種Ｄ
ＮＡ集団から選択的に回収することをさらに含んでいて
もよい。好ましくは、ＤＮＡ調製物の回収は、コード配
列の少なくとも部分についての、固相結合ハイブリダイ
ゼーションプローブのような、特異的な結合相手とＤＮ
Ａ集団を接触させることを含む。共通の特徴は、例えば
酵素活性の一種、例えばヒドロラーゼ活性とすることが
できる。ＤＮＡは、酵素活性の一種を示す異種ＤＮＡ集
団からのＤＮＡを含むクローンから回収される。好まし
くは、指向性突然変異誘発は部位特異的指向性突然変異
誘発である。この形態の方法はさらに、指向性の突然変
異誘発にかける前に、特定の酵素活性と同じであっても
よく異なるものであってもよい活性について、クローン
のライブラリーを予備スクリーニングする工程を含むこ
とができる。この活性は、例えば、対象となるタンパク
質の発現から得られるものとすることができる。
【００１５】ＤＮＡライブラリーが誘導される異種ＤＮ
Ａ集団はＤＮＡの複合的な混合物であり、例えば環境的
なサンプルから得られるものである。そのようなサンプ
ルは、培養できない、あるいは培養されていない、ある
いは培養された複数あるいは単一の種の生物を含むもの
とすることができる。このような環境的サンプルは、例
えば、北極及び南極の氷、水あるいは永久凍土ソース、
火山起源の材料、熱帯地域の土壌あるいは植物ソース等
から得られる。環境的サンプルを対象となる生物につい
て濃縮するためには種々の公知の技術を使用することが
でき、分別培養(differential culturing)、沈降勾配、
アフィニティーマトリックス、毛細管電気泳動、光学ピ
ンセット、蛍光活性化細胞ソーティング等が挙げられ
る。サンプルは単一の生物の培養物であってもよい。
Ａ集団はＤＮＡの複合的な混合物であり、例えば環境的
なサンプルから得られるものである。そのようなサンプ
ルは、培養できない、あるいは培養されていない、ある
いは培養された複数あるいは単一の種の生物を含むもの
とすることができる。このような環境的サンプルは、例
えば、北極及び南極の氷、水あるいは永久凍土ソース、
火山起源の材料、熱帯地域の土壌あるいは植物ソース等
から得られる。環境的サンプルを対象となる生物につい
て濃縮するためには種々の公知の技術を使用することが
でき、分別培養(differential culturing)、沈降勾配、
アフィニティーマトリックス、毛細管電気泳動、光学ピ
ンセット、蛍光活性化細胞ソーティング等が挙げられ
る。サンプルは単一の生物の培養物であってもよい。
【００１６】熱安定性酵素は60℃を越える温度で機能す
る酵素である。熱安定性酵素は産業的に、また生物医学
的研究で、特定のいくつかの工程が著しく高い温度で行
われるアッセイにおいて使用される。熱安定性酵素は、
温泉、火山起源のもの、熱帯地域等において見られる好
熱性生物から得ることができる。そのような生物の例と
しては、他の微生物の中でも、例えば、真性細菌及び古
細菌のような原核微生物(Bronneomerier, K. and Staud
enbauer, W. L., D.R. Woods (ed), the Clostridia an
d Biotechnology, Butterworth Publishers, Stoneham,
M.A. (1993))が挙げられる。
る酵素である。熱安定性酵素は産業的に、また生物医学
的研究で、特定のいくつかの工程が著しく高い温度で行
われるアッセイにおいて使用される。熱安定性酵素は、
温泉、火山起源のもの、熱帯地域等において見られる好
熱性生物から得ることができる。そのような生物の例と
しては、他の微生物の中でも、例えば、真性細菌及び古
細菌のような原核微生物(Bronneomerier, K. and Staud
enbauer, W. L., D.R. Woods (ed), the Clostridia an
d Biotechnology, Butterworth Publishers, Stoneham,
M.A. (1993))が挙げられる。
【００１７】熱安定性酵素は、その中温性の対応物と比
較してより長い貯蔵寿命と有機溶媒耐性を示す。
較してより長い貯蔵寿命と有機溶媒耐性を示す。
【００１８】所望の最低温度で酵素活性を示す熱安定性
酵素には産業上及び研究上の用途がある。この例は、分
子診断においてレポーター分子が室温またはより高い温
度での長期間の貯蔵において生存しなければならない場
合、あるいは通常ではない環境下で機能しなければなら
ない場合、ならびに熱安定性酵素の活性が一般的に非常
に低い室温においてそれを使用するアッセイを行う場合
等において見られる。
酵素には産業上及び研究上の用途がある。この例は、分
子診断においてレポーター分子が室温またはより高い温
度での長期間の貯蔵において生存しなければならない場
合、あるいは通常ではない環境下で機能しなければなら
ない場合、ならびに熱安定性酵素の活性が一般的に非常
に低い室温においてそれを使用するアッセイを行う場合
等において見られる。
【００１９】従って、本発明の別の態様は、低温におい
て改良された酵素活性を有し、酵素からなる群から選択
されるメンバーである熱安定性酵素、または該酵素をコ
ードするポリヌクレオチドを提供する方法であって、
(a) 少なくとも60℃の温度で安定な少なくとも一種の酵
素を突然変異誘発にかけ、(b) 少なくとも60℃の温度で
安定で、50℃未満の温度で酵素活性を有し、工程(a)の
酵素よりも高い活性を有する突然変異酵素、または突然
変異酵素をコードするポリヌクレオチドについて(a)で
製造された突然変異体をスクリーニングすることを含む
方法を提供する。
て改良された酵素活性を有し、酵素からなる群から選択
されるメンバーである熱安定性酵素、または該酵素をコ
ードするポリヌクレオチドを提供する方法であって、
(a) 少なくとも60℃の温度で安定な少なくとも一種の酵
素を突然変異誘発にかけ、(b) 少なくとも60℃の温度で
安定で、50℃未満の温度で酵素活性を有し、工程(a)の
酵素よりも高い活性を有する突然変異酵素、または突然
変異酵素をコードするポリヌクレオチドについて(a)で
製造された突然変異体をスクリーニングすることを含む
方法を提供する。
【００２０】本発明のこれらの形態及びその他の形態は
本明細書の教示から当業者に明らかであろう。
本明細書の教示から当業者に明らかであろう。
【００２１】用語「得られた(derived)」または「単離
された」は、物質が当初の環境（例えば天然に存在する
ものである場合は自然の環境）から取り出されているこ
とを意味する。例えば、生体動物中に存在する天然のポ
リヌクレオチドあるいはポリペプチドは単離されたもの
ではないが、自然の系において共存するいくらかあるい
は全ての物質から分離された同じポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは単離されたものである。
された」は、物質が当初の環境（例えば天然に存在する
ものである場合は自然の環境）から取り出されているこ
とを意味する。例えば、生体動物中に存在する天然のポ
リヌクレオチドあるいはポリペプチドは単離されたもの
ではないが、自然の系において共存するいくらかあるい
は全ての物質から分離された同じポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは単離されたものである。
【００２２】用語「エラーを起こしやすいＰＣＲ(error
-prone PCR)」は、ＤＮＡポリメラーゼのコピーの忠実
度(fidelity)が低い条件下でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物
の全長にわたって高い確率で点突然変異が得られるよう
にした方法をいう(Leung, D.W.ら、Technique, 1:11-15
(1989)及びCaldwell, R.C. & Joyce G.F., PCR Method
s Applic., 2:28-33 (1992))。
-prone PCR)」は、ＤＮＡポリメラーゼのコピーの忠実
度(fidelity)が低い条件下でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物
の全長にわたって高い確率で点突然変異が得られるよう
にした方法をいう(Leung, D.W.ら、Technique, 1:11-15
(1989)及びCaldwell, R.C. & Joyce G.F., PCR Method
s Applic., 2:28-33 (1992))。
【００２３】用語「オリゴヌクレオチド指向性(directe
d)突然変異誘発」は、対象となる任意のクローン化され
たＤＮＡセグメントにおいて部位特異的突然変異を生成
させることができる方法をいう(Reidhaar-Olson, J.F.
& Sauer, R.T.ら、Science,241:53-57 (1988))。
d)突然変異誘発」は、対象となる任意のクローン化され
たＤＮＡセグメントにおいて部位特異的突然変異を生成
させることができる方法をいう(Reidhaar-Olson, J.F.
& Sauer, R.T.ら、Science,241:53-57 (1988))。
【００２４】用語「アセンブリーＰＣＲ(assembly PC
R)」は、小さいＤＮＡ断片の混合物からのＰＣＲ産物の
アセンブリーを使用する方法をいう。同じバイアル中で
多数の異なるＰＣＲ反応が平行して起こり、一つの反応
の産物が他の反応の産物の生成を促す(priming)。
R)」は、小さいＤＮＡ断片の混合物からのＰＣＲ産物の
アセンブリーを使用する方法をいう。同じバイアル中で
多数の異なるＰＣＲ反応が平行して起こり、一つの反応
の産物が他の反応の産物の生成を促す(priming)。
【００２５】用語「性的(sexual)ＰＣＲ突然変異誘発」
は、配列相同性に基づいたＤＮＡ分子のランダム断片化
により起こされる、異なっているが高度に相関している
ＤＮＡ配列のＤＮＡ分子間のin vitroでの強制的な相同
的組換えと、その後のＰＣＲ反応におけるプライマー伸
長による乗換え(crossover)の固定をいう(Stemmer, W.
P., PNAS, USA, 91:10747-10751 (1994))。
は、配列相同性に基づいたＤＮＡ分子のランダム断片化
により起こされる、異なっているが高度に相関している
ＤＮＡ配列のＤＮＡ分子間のin vitroでの強制的な相同
的組換えと、その後のＰＣＲ反応におけるプライマー伸
長による乗換え(crossover)の固定をいう(Stemmer, W.
P., PNAS, USA, 91:10747-10751 (1994))。
【００２６】用語「in vivo突然変異誘発」は、一種以
上のＤＮＡ修復経路に突然変異を有する大腸菌の株にお
いてＤＮＡを増幅を使用する、対象となる任意のクロー
ン化ＤＮＡにおいてランダム突然変異を生成する方法を
いう。これらの「ミューテーター」株は野性型親株のも
のよりも高いランダム突然変異率を有する。これらの株
の一つにおけるＤＮＡの増幅により、最終的に該ＤＮＡ
中のランダム突然変異が生成される。
上のＤＮＡ修復経路に突然変異を有する大腸菌の株にお
いてＤＮＡを増幅を使用する、対象となる任意のクロー
ン化ＤＮＡにおいてランダム突然変異を生成する方法を
いう。これらの「ミューテーター」株は野性型親株のも
のよりも高いランダム突然変異率を有する。これらの株
の一つにおけるＤＮＡの増幅により、最終的に該ＤＮＡ
中のランダム突然変異が生成される。
【００２７】用語「カセット突然変異誘発」は、二本鎖
ＤＮＡ分子の小さい領域を、本来の配列とは異なる合成
オリゴヌクレオチド「カセット」により置換するための
任意の方法をいう。該オリゴヌクレオチドは、完全に及
び／または部分的にランダム化した本来の配列を含むも
のとすることが多い。
ＤＮＡ分子の小さい領域を、本来の配列とは異なる合成
オリゴヌクレオチド「カセット」により置換するための
任意の方法をいう。該オリゴヌクレオチドは、完全に及
び／または部分的にランダム化した本来の配列を含むも
のとすることが多い。
【００２８】用語「帰納的集合突然変異誘発(recursive
ensemble mutagenesis)」は、表現型が関連する変異体
の種々の集団であって、そのメンバーがアミノ酸配列に
おいて異なるものを製造するために開発されたタンパク
質処理(engineering)（タンパク質突然変異誘発）のた
めのアルゴリズムをいう。この方法では、フィードバッ
クメカニズムを使用して組合せカセット突然変異誘発の
連続的なサイクルを制御する(Arkin, A.P.及びYouvan,
D.C., PNAS, USA, 89:7811-7815 (1992))。
ensemble mutagenesis)」は、表現型が関連する変異体
の種々の集団であって、そのメンバーがアミノ酸配列に
おいて異なるものを製造するために開発されたタンパク
質処理(engineering)（タンパク質突然変異誘発）のた
めのアルゴリズムをいう。この方法では、フィードバッ
クメカニズムを使用して組合せカセット突然変異誘発の
連続的なサイクルを制御する(Arkin, A.P.及びYouvan,
D.C., PNAS, USA, 89:7811-7815 (1992))。
【００２９】用語「指数的(exponential)集合突然変異
誘発」は、ユニークで機能的な変異体を高いパーセンテ
ージで含む組合せライブラリーを生成する方法をいい、
この方法では、残基の小さい基(groups)が平行してラン
ダム化され、各変化部分で機能的なタンパク質を与える
アミノ酸が同定されるものであり(Delegrave, S. お及
び Youvan, D.C., Biotechnology Research, 11:1548-1
552 (1993))、またランダム及び部位指向性突然変異誘
発(Arnold, F.H., Current Opinion in Biotechnology,
4:450-455 (1993))をいう。上記で挙げた文献はいずれ
も引用により全体を本明細書の一部とする。上記の形態
のいずれかについて記載したように、本発明は、微生物
から得られた選択されたＤＮＡを含むクローンの酵素活
性についてのスクリーニングの方法であって、微生物の
ＤＮＡから選択されたＤＮＡを回収することにより製造
されたクローンであって、選択されたＤＮＡが特定の活
性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列の部分の全部あ
るいは一部である少なくとも一種のＤＮＡ配列へのハイ
ブリダイゼーションにより選択されたものである、複数
のクローンを含むライブラリーを特定の酵素活性につい
てスクリーニングし、宿主を、選択されたＤＮＡで形質
転換して特定の酵素活性についてスクリーニングされる
クローンを生成することを含む前記方法を提供する。
誘発」は、ユニークで機能的な変異体を高いパーセンテ
ージで含む組合せライブラリーを生成する方法をいい、
この方法では、残基の小さい基(groups)が平行してラン
ダム化され、各変化部分で機能的なタンパク質を与える
アミノ酸が同定されるものであり(Delegrave, S. お及
び Youvan, D.C., Biotechnology Research, 11:1548-1
552 (1993))、またランダム及び部位指向性突然変異誘
発(Arnold, F.H., Current Opinion in Biotechnology,
4:450-455 (1993))をいう。上記で挙げた文献はいずれ
も引用により全体を本明細書の一部とする。上記の形態
のいずれかについて記載したように、本発明は、微生物
から得られた選択されたＤＮＡを含むクローンの酵素活
性についてのスクリーニングの方法であって、微生物の
ＤＮＡから選択されたＤＮＡを回収することにより製造
されたクローンであって、選択されたＤＮＡが特定の活
性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列の部分の全部あ
るいは一部である少なくとも一種のＤＮＡ配列へのハイ
ブリダイゼーションにより選択されたものである、複数
のクローンを含むライブラリーを特定の酵素活性につい
てスクリーニングし、宿主を、選択されたＤＮＡで形質
転換して特定の酵素活性についてスクリーニングされる
クローンを生成することを含む前記方法を提供する。
【００３０】一つの態様においては、(a) 二本鎖ＤＮＡ
集団を一本鎖ＤＮＡ集団にし、(b) ハイブリダイゼーシ
ョンを可能とする条件下で(a)の一本鎖ＤＮＡ集団をリ
ガンドに結合したＤＮＡプローブと接触させて、プロー
ブとそれにハイブリダイズするＤＮＡ集団のメンバーの
二本鎖複合体を生成し、(c) (b)の二本鎖複合体を前記
リガンドの固相特異的結合相手と接触させて固相複合体
を生成し、(d) (b)の一本鎖ＤＮＡ集団から固相複合体
を分離し、(e) プローブから固相結合プローブに結合し
た集団のメンバーを遊離させ、(f) (e)の集団のメンバ
ーから二本鎖ＤＮＡを形成し、(g) (f)の二本鎖ＤＮＡ
を適当な宿主に導入して、選択されたＤＮＡを含む複数
のクローンを含むライブラリーを形成し、(h) 該ライブ
ラリーを特定の酵素活性についてスクリーニングするこ
とにより、微生物から得られたＤＮＡライブラリーを選
択手順にかけて、そこから特定の酵素活性を有する酵素
をコードするＤＮＡ配列の全部あるいは一部である一種
以上のプローブＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ
を選択する。
集団を一本鎖ＤＮＡ集団にし、(b) ハイブリダイゼーシ
ョンを可能とする条件下で(a)の一本鎖ＤＮＡ集団をリ
ガンドに結合したＤＮＡプローブと接触させて、プロー
ブとそれにハイブリダイズするＤＮＡ集団のメンバーの
二本鎖複合体を生成し、(c) (b)の二本鎖複合体を前記
リガンドの固相特異的結合相手と接触させて固相複合体
を生成し、(d) (b)の一本鎖ＤＮＡ集団から固相複合体
を分離し、(e) プローブから固相結合プローブに結合し
た集団のメンバーを遊離させ、(f) (e)の集団のメンバ
ーから二本鎖ＤＮＡを形成し、(g) (f)の二本鎖ＤＮＡ
を適当な宿主に導入して、選択されたＤＮＡを含む複数
のクローンを含むライブラリーを形成し、(h) 該ライブ
ラリーを特定の酵素活性についてスクリーニングするこ
とにより、微生物から得られたＤＮＡライブラリーを選
択手順にかけて、そこから特定の酵素活性を有する酵素
をコードするＤＮＡ配列の全部あるいは一部である一種
以上のプローブＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ
を選択する。
【００３１】別の態様においては、(a) ハイブリダイゼ
ーションを可能とする条件下で二本鎖ＤＮＡ集団をリガ
ンドに結合したＤＮＡプローブと接触させて、プローブ
とそれにハイブリダイズするＤＮＡ集団のメンバーの複
合体を生成し、(b) (a)の複合体を前記リガンドの固相
特異的結合相手と接触させて固相複合体を生成し、(c)
(b)の未結合ＤＮＡ集団から固相複合体を分離し、(d)
プローブから固相結合プローブに結合した集団のメンバ
ーを遊離させ、(e) (d)の二本鎖ＤＮＡを適当な宿主に
導入して、選択されたＤＮＡを含む複数のクローンを含
むライブラリーを形成し、(f) 該ライブラリーを特定の
酵素活性についてスクリーニングすることにより、微生
物から得られたＤＮＡライブラリーを選択手順にかけ
て、そこから特定の酵素活性を有する酵素をコードする
ＤＮＡ配列の全部あるいは一部である一種以上のプロー
ブＤＮＡ配列にハイブリダイズする二本鎖ＤＮＡを選択
する。
ーションを可能とする条件下で二本鎖ＤＮＡ集団をリガ
ンドに結合したＤＮＡプローブと接触させて、プローブ
とそれにハイブリダイズするＤＮＡ集団のメンバーの複
合体を生成し、(b) (a)の複合体を前記リガンドの固相
特異的結合相手と接触させて固相複合体を生成し、(c)
(b)の未結合ＤＮＡ集団から固相複合体を分離し、(d)
プローブから固相結合プローブに結合した集団のメンバ
ーを遊離させ、(e) (d)の二本鎖ＤＮＡを適当な宿主に
導入して、選択されたＤＮＡを含む複数のクローンを含
むライブラリーを形成し、(f) 該ライブラリーを特定の
酵素活性についてスクリーニングすることにより、微生
物から得られたＤＮＡライブラリーを選択手順にかけ
て、そこから特定の酵素活性を有する酵素をコードする
ＤＮＡ配列の全部あるいは一部である一種以上のプロー
ブＤＮＡ配列にハイブリダイズする二本鎖ＤＮＡを選択
する。
【００３２】別の形態においては、上記方法は、シグナ
ル配列すなわち分泌配列を含むＤＮＡを回収するための
予備選択を含む。このようにして、シグナル配列すなわ
ち分泌配列を含むＤＮＡのみを上記のようにしてハイブ
リダイゼーションによりＤＮＡ集団から選択することが
可能になる。以下のパラグラフに本発明のこの態様のプ
ロトコール、一般的な分泌シグナル配列の種類と機能、
及びそのような配列のアッセイや選択方法への具体的な
例示的応用をを記載する。
ル配列すなわち分泌配列を含むＤＮＡを回収するための
予備選択を含む。このようにして、シグナル配列すなわ
ち分泌配列を含むＤＮＡのみを上記のようにしてハイブ
リダイゼーションによりＤＮＡ集団から選択することが
可能になる。以下のパラグラフに本発明のこの態様のプ
ロトコール、一般的な分泌シグナル配列の種類と機能、
及びそのような配列のアッセイや選択方法への具体的な
例示的応用をを記載する。
【００３３】この形態の特に好ましい別の態様は、上記
(a)の後、(a)の前に、(i) 所与のクラスのタンパク質に
ユニークな分泌シグナル配列に相補的なリガンド結合オ
リゴヌクレオチドプローブに、ハイブリダイゼーション
を可能とする条件下で(a)の二本鎖ＤＮＡ集団を接触さ
せて二本鎖複合体を形成させ、(ii) (a i)の複合体を該
リガンドの固相特異的結合相手と接触させて固相複合体
を形成し、(iii) 該固相複合体を未結合ＤＮＡ集団から
分離し、(iv) 前記固相結合プローブに結合した集団の
メンバーを遊離させ、(v) 固相結合プローブをそれに結
合した集団のメンバーから分離することをさらに含む。
(a)の後、(a)の前に、(i) 所与のクラスのタンパク質に
ユニークな分泌シグナル配列に相補的なリガンド結合オ
リゴヌクレオチドプローブに、ハイブリダイゼーション
を可能とする条件下で(a)の二本鎖ＤＮＡ集団を接触さ
せて二本鎖複合体を形成させ、(ii) (a i)の複合体を該
リガンドの固相特異的結合相手と接触させて固相複合体
を形成し、(iii) 該固相複合体を未結合ＤＮＡ集団から
分離し、(iv) 前記固相結合プローブに結合した集団の
メンバーを遊離させ、(v) 固相結合プローブをそれに結
合した集団のメンバーから分離することをさらに含む。
【００３４】シグナル配列を含むように選択され、単離
されたＤＮＡは、次いで上記に記載した選択手順にか
け、そこから特定の酵素活性を有する酵素をコードする
ＤＮＡから得られた一種以上のプローブＤＮＡ配列に結
合するＤＮＡを選択し、単離する。
されたＤＮＡは、次いで上記に記載した選択手順にか
け、そこから特定の酵素活性を有する酵素をコードする
ＤＮＡから得られた一種以上のプローブＤＮＡ配列に結
合するＤＮＡを選択し、単離する。
【００３５】タンパク質が分類されて適切な細胞部位に
運ばれる経路は、しばしばタンパク質ターゲッティング
(targeting)経路と呼ばれている。これらターゲッティ
ング系の全てにおいて重要な要素の１つは、新しく合成
されたポリペプチドのアミノ末端にある、シグナル配列
と呼ばれる短いアミノ酸配列である。このシグナル配列
は、タンパク質を細胞内の適切な部位へ向かわせる。そ
して該タンパク質の輸送中または最終目的地へ到着した
時にシグナル配列は除去される。ほとんどのリソソーム
タンパク質、膜タンパク質または分泌タンパク質は、小
胞体内腔への輸送を定めるアミノ末端シグナル配列を有
する。このグループのタンパク質について100個以上の
シグナル配列が配列決定されている。これらの配列の長
さはさまざまで、13から36アミノ酸残基である。
運ばれる経路は、しばしばタンパク質ターゲッティング
(targeting)経路と呼ばれている。これらターゲッティ
ング系の全てにおいて重要な要素の１つは、新しく合成
されたポリペプチドのアミノ末端にある、シグナル配列
と呼ばれる短いアミノ酸配列である。このシグナル配列
は、タンパク質を細胞内の適切な部位へ向かわせる。そ
して該タンパク質の輸送中または最終目的地へ到着した
時にシグナル配列は除去される。ほとんどのリソソーム
タンパク質、膜タンパク質または分泌タンパク質は、小
胞体内腔への輸送を定めるアミノ末端シグナル配列を有
する。このグループのタンパク質について100個以上の
シグナル配列が配列決定されている。これらの配列の長
さはさまざまで、13から36アミノ酸残基である。
【００３６】pMGと称するphoA発現ベクターは、TaphoA
と同様、膜にまたがっている(membrane-spanning)配列
またはシグナルペプチドをコードする遺伝子を同定する
のに有用である。Giladiら，J. Bacteriol., 175(13):
4129-4136, 1993。このクローニング系は、外膜および
細胞周辺（periplasmic)アルカリホスファターゼ（Ａ
Ｐ）の融合タンパク質と内膜ＡＰ融合タンパク質との区
別を容易にするために、pMG 組換え体を大腸菌KS330 (S
trauchおよびBeckwith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
5:1576-1580, 1988 によって最初に記述された「ブルー
ハロー(blue halo)」アッセイに使用された菌株）中に
導入して形質転換することによって改変された。pMG/KS
330rを用いたクローニングおよびスクリーニング方法
は、開裂可能なシグナルペプチドを有するタンパク質を
コードする遺伝子を同定することができる。それゆえ、
この方法は興味のあるポリペプチドをコードする遺伝子
を同定するための第一工程として役立ちうる。
と同様、膜にまたがっている(membrane-spanning)配列
またはシグナルペプチドをコードする遺伝子を同定する
のに有用である。Giladiら，J. Bacteriol., 175(13):
4129-4136, 1993。このクローニング系は、外膜および
細胞周辺（periplasmic)アルカリホスファターゼ（Ａ
Ｐ）の融合タンパク質と内膜ＡＰ融合タンパク質との区
別を容易にするために、pMG 組換え体を大腸菌KS330 (S
trauchおよびBeckwith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
5:1576-1580, 1988 によって最初に記述された「ブルー
ハロー(blue halo)」アッセイに使用された菌株）中に
導入して形質転換することによって改変された。pMG/KS
330rを用いたクローニングおよびスクリーニング方法
は、開裂可能なシグナルペプチドを有するタンパク質を
コードする遺伝子を同定することができる。それゆえ、
この方法は興味のあるポリペプチドをコードする遺伝子
を同定するための第一工程として役立ちうる。
【００３７】本発明の別な実施態様は、特定の酵素活性
の生成のために人為的(directed)突然変異誘発に暴露し
た異種ＤＮＡ集団由来のＤＮＡを有するクローンライブ
ラリーを該特定の酵素活性についてスクリーニングする
ことによる、異種ＤＮＡ集団に由来する、特定の酵素活
性を有する酵素を得る方法を提供する。この方法はさら
に、上記の人為的突然変異誘発の前に、共通の特徴をコ
ードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡを上記異種ＤＮＡ集団
から選択的に回収することを含むことができる。この共
通の特徴とは、該特定の酵素活性と同一でも異なってい
てもよい。この共通の特徴は、たとえば、あるクラスの
酵素活性であることができる。このことは、異種ＤＮＡ
集団由来のＤＮＡを有するクローンから、上記クラスの
酵素活性を示すＤＮＡを回収することを意味する。
の生成のために人為的(directed)突然変異誘発に暴露し
た異種ＤＮＡ集団由来のＤＮＡを有するクローンライブ
ラリーを該特定の酵素活性についてスクリーニングする
ことによる、異種ＤＮＡ集団に由来する、特定の酵素活
性を有する酵素を得る方法を提供する。この方法はさら
に、上記の人為的突然変異誘発の前に、共通の特徴をコ
ードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡを上記異種ＤＮＡ集団
から選択的に回収することを含むことができる。この共
通の特徴とは、該特定の酵素活性と同一でも異なってい
てもよい。この共通の特徴は、たとえば、あるクラスの
酵素活性であることができる。このことは、異種ＤＮＡ
集団由来のＤＮＡを有するクローンから、上記クラスの
酵素活性を示すＤＮＡを回収することを意味する。
【００３８】この実施態様においては、好ましくは、Ｄ
ＮＡ調製物の回収はＤＮＡ集団をコード配列の少なくと
も一部に対する特異的結合パートナー（固相結合ハイブ
リダイゼーションプローブ等）と接触させることにより
行われる。
ＮＡ調製物の回収はＤＮＡ集団をコード配列の少なくと
も一部に対する特異的結合パートナー（固相結合ハイブ
リダイゼーションプローブ等）と接触させることにより
行われる。
【００３９】この実施態様の方法は、人為的突然変異誘
発に暴露する前に上記クローンライブラリーをある活性
（これは該特定の酵素活性と同じでも異なっていてもよ
い）についてプレスクリーニングすることをさらに含む
ことができる。上記クローンのプレスクリーニングは、
例えば、興味のあるタンパク質の発現についてのスクリ
ーニングでありうる。
発に暴露する前に上記クローンライブラリーをある活性
（これは該特定の酵素活性と同じでも異なっていてもよ
い）についてプレスクリーニングすることをさらに含む
ことができる。上記クローンのプレスクリーニングは、
例えば、興味のあるタンパク質の発現についてのスクリ
ーニングでありうる。
【００４０】本発明の別の実施態様は、特定の酵素活性
を有する酵素を得る方法を提供する。この方法は、該特
定の酵素活性と同じ、または異なる１つ以上の所望の特
徴を有する酵素をコードするＤＮＡをクローンライブラ
リーにおいて生成させるために、部位特異的でありうる
人為的突然変異誘発に暴露したＤＮＡ集団のプール由来
のＤＮＡを有するクローンライブラリーを該特定の酵素
活性についてスクリーニングすることを含んでなる。こ
の実施態様の方法は、人為的突然変異誘発に暴露する前
に上記異種ＤＮＡ集団から少なくとも１つの共通する酵
素特性（これは該特定の酵素活性と同じでも異なってい
てもよい）をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡを選択
的に回収することをさらに含むことができる。
を有する酵素を得る方法を提供する。この方法は、該特
定の酵素活性と同じ、または異なる１つ以上の所望の特
徴を有する酵素をコードするＤＮＡをクローンライブラ
リーにおいて生成させるために、部位特異的でありうる
人為的突然変異誘発に暴露したＤＮＡ集団のプール由来
のＤＮＡを有するクローンライブラリーを該特定の酵素
活性についてスクリーニングすることを含んでなる。こ
の実施態様の方法は、人為的突然変異誘発に暴露する前
に上記異種ＤＮＡ集団から少なくとも１つの共通する酵
素特性（これは該特定の酵素活性と同じでも異なってい
てもよい）をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡを選択
的に回収することをさらに含むことができる。
【００４１】この実施態様においては、ＤＮＡ調製物の
回収は、ＤＮＡ集団をコード配列の少なくとも一部に対
する特異的結合パートナーと接触させることにより実施
できる。特異的結合パートナーとは固相結合ハイブリダ
イゼーションプローブである。異種ＤＮＡ集団由来のＤ
ＮＡを有し、上記クラスの酵素活性を示すクローンから
ＤＮＡを回収する。
回収は、ＤＮＡ集団をコード配列の少なくとも一部に対
する特異的結合パートナーと接触させることにより実施
できる。特異的結合パートナーとは固相結合ハイブリダ
イゼーションプローブである。異種ＤＮＡ集団由来のＤ
ＮＡを有し、上記クラスの酵素活性を示すクローンから
ＤＮＡを回収する。
【００４２】出願人は、低温において向上した活性を有
する熱安定性酵素を提供することが可能であることを見
いだした。より具体的には、出願人は、好熱性酵素の温
度安定性を維持したまま、それら酵素の低温における活
性を向上させることができることを見いだしたのであ
る。さらに、熱安定性酵素、またはそのような酵素をコ
ードするポリヌクレオチドを突然変異誘発にかけ、次に
生じた変異体をスクリーニングして、熱安定性を保持
し、かつ低温において対応する非突然変異酵素に較べて
少なくとも２倍の酵素活性を有する突然変異した酵素、
または突然変異した酵素をコードするポリヌクレオチド
を同定することにより、低温における活性が向上した熱
安定性酵素を得ることができることが見いだされた。
する熱安定性酵素を提供することが可能であることを見
いだした。より具体的には、出願人は、好熱性酵素の温
度安定性を維持したまま、それら酵素の低温における活
性を向上させることができることを見いだしたのであ
る。さらに、熱安定性酵素、またはそのような酵素をコ
ードするポリヌクレオチドを突然変異誘発にかけ、次に
生じた変異体をスクリーニングして、熱安定性を保持
し、かつ低温において対応する非突然変異酵素に較べて
少なくとも２倍の酵素活性を有する突然変異した酵素、
または突然変異した酵素をコードするポリヌクレオチド
を同定することにより、低温における活性が向上した熱
安定性酵素を得ることができることが見いだされた。
【００４３】熱安定性酵素および突然変異させた熱安定
性酵素は、60℃までの温度において安定であり、好まし
くは70℃までの温度において安定であり、より好ましく
は95℃およびそれ以上の温度まで安定である。
性酵素は、60℃までの温度において安定であり、好まし
くは70℃までの温度において安定であり、より好ましく
は95℃およびそれ以上の温度まで安定である。
【００４４】突然変異させた熱安定性酵素の低温におけ
る増大した活性とは、対応する野性型酵素の活性よりも
少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、より好ま
しくは少なくとも10倍大きい活性を包含するものとす
る。
る増大した活性とは、対応する野性型酵素の活性よりも
少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、より好ま
しくは少なくとも10倍大きい活性を包含するものとす
る。
【００４５】低温における増大した酵素活性とは、50℃
以下、好ましくは40℃以下、より好ましくは30℃以下に
おいて酵素活性が増大していることを意味する。したが
って、突然変異させた酵素と非突然変異酵素の間で低温
における酵素活性を比較すると、規定された低温におけ
る突然変異させた酵素の酵素活性は、対応する非突然変
異酵素の酵素活性よりも少なくとも２倍大きい。
以下、好ましくは40℃以下、より好ましくは30℃以下に
おいて酵素活性が増大していることを意味する。したが
って、突然変異させた酵素と非突然変異酵素の間で低温
における酵素活性を比較すると、規定された低温におけ
る突然変異させた酵素の酵素活性は、対応する非突然変
異酵素の酵素活性よりも少なくとも２倍大きい。
【００４６】したがって、低温および低温範囲は、熱安
定性酵素が安定である温度よりも少なくとも５℃低い温
度を含み、この温度は55℃、50℃、45℃、40℃、35℃、
30℃、25℃および20℃より低い温度を含む。50℃より低
い温度が好ましく、40℃より低い温度がより好ましく、
30℃より低い温度（つまり、ほぼ室温）が最も好まし
い。
定性酵素が安定である温度よりも少なくとも５℃低い温
度を含み、この温度は55℃、50℃、45℃、40℃、35℃、
30℃、25℃および20℃より低い温度を含む。50℃より低
い温度が好ましく、40℃より低い温度がより好ましく、
30℃より低い温度（つまり、ほぼ室温）が最も好まし
い。
【００４７】本発明のこの側面にしたがって、そこにお
いてより大きい酵素活性が望まれる低温または低温範囲
が決定され、そして熱安定性酵素、またはそのような酵
素をコードするポリヌクレオチドが突然変異誘発にかけ
られ、生じた突然変異体をスクリーニングして、熱安定
性を保持し、かつ上記所望の温度または温度範囲におい
て酵素活性が所望される最低限の増大を有する突然変異
した酵素（または突然変異酵素をコードするポリヌクレ
オチド）が決定される。
いてより大きい酵素活性が望まれる低温または低温範囲
が決定され、そして熱安定性酵素、またはそのような酵
素をコードするポリヌクレオチドが突然変異誘発にかけ
られ、生じた突然変異体をスクリーニングして、熱安定
性を保持し、かつ上記所望の温度または温度範囲におい
て酵素活性が所望される最低限の増大を有する突然変異
した酵素（または突然変異酵素をコードするポリヌクレ
オチド）が決定される。
【００４８】熱安定性酵素とは、60℃より上の温度にお
いて活性を有する、すなわち分解しない酵素である。熱
安定性酵素はまた、より長い保存寿命を有し、また有機
溶媒に対して高い耐性を有する。
いて活性を有する、すなわち分解しない酵素である。熱
安定性酵素はまた、より長い保存寿命を有し、また有機
溶媒に対して高い耐性を有する。
【００４９】熱安定性酵素は、温泉、火山地帯および熱
帯などの高温中に見いだされる好熱性生物から単離する
ことができる。好熱性生物の例としては、好熱菌（真正
細菌および古細菌等）などの原核生物が挙げられる。
帯などの高温中に見いだされる好熱性生物から単離する
ことができる。好熱性生物の例としては、好熱菌（真正
細菌および古細菌等）などの原核生物が挙げられる。
【００５０】次に、文献に記載されている利用可能な技
法を用いて、これらの熱安定性生物由来のＤＮＡを単離
することができる。この目的のためには、IsoQuick(核
酸抽出キット（MicroProbe Corporation) が適当であ
る。
法を用いて、これらの熱安定性生物由来のＤＮＡを単離
することができる。この目的のためには、IsoQuick(核
酸抽出キット（MicroProbe Corporation) が適当であ
る。
【００５１】または、酵素が発現されて陽性な熱安定性
活性についてスクリーニング可能となるように発現ベク
ターに酵素をコードするＤＮＡを挿入し、以下に記述す
るような適切な宿主を形質転換することによって、熱安
定性を有することが知られていない酵素を熱安定性につ
いてスクリーニングすることができる。
活性についてスクリーニング可能となるように発現ベク
ターに酵素をコードするＤＮＡを挿入し、以下に記述す
るような適切な宿主を形質転換することによって、熱安
定性を有することが知られていない酵素を熱安定性につ
いてスクリーニングすることができる。
【００５２】熱安定性酵素をコードする単離されたＤＮ
Ａを、突然変異誘発技法にかける。好ましい種類の突然
変異誘発技法は本明細書に記載されている。
Ａを、突然変異誘発技法にかける。好ましい種類の突然
変異誘発技法は本明細書に記載されている。
【００５３】上に規定した突然変異誘発技法から分かる
ように、所望の活性を有する酵素をコードするＤＮＡを
単独で、すなわち裸のＤＮＡとして突然変異誘発にかけ
てもよいし、または該ＤＮＡを本明細書に記述するよう
な適切なベクターに挿入した後に突然変異誘発にかけて
もよい。これらの技法をin vitro突然変異誘発と呼ぶ。
ように、所望の活性を有する酵素をコードするＤＮＡを
単独で、すなわち裸のＤＮＡとして突然変異誘発にかけ
てもよいし、または該ＤＮＡを本明細書に記述するよう
な適切なベクターに挿入した後に突然変異誘発にかけて
もよい。これらの技法をin vitro突然変異誘発と呼ぶ。
【００５４】または、ＤＮＡが細胞または生体内にある
時に突然変異誘発にかける場合は、in vivo突然変異誘
発を行うことができる。この技法の好ましい例は、多数
の異なる突然変異が短時間に起こるように、ＤＮＡ修復
遺伝子MutH、MutLおよびMutSを欠失した大腸菌XL1 Red
株(Stratagene, Inc.) を使用する。30時間以内に10,00
0個までの突然変異が起こり得るので、当分野で公知の
手順によって、突然変異させたＤＮＡから完全な突然変
異ＤＮＡライブラリーが調製できる。
時に突然変異誘発にかける場合は、in vivo突然変異誘
発を行うことができる。この技法の好ましい例は、多数
の異なる突然変異が短時間に起こるように、ＤＮＡ修復
遺伝子MutH、MutLおよびMutSを欠失した大腸菌XL1 Red
株(Stratagene, Inc.) を使用する。30時間以内に10,00
0個までの突然変異が起こり得るので、当分野で公知の
手順によって、突然変異させたＤＮＡから完全な突然変
異ＤＮＡライブラリーが調製できる。
【００５５】突然変異が起こるのを可能とする適切な時
間が経過した後、in vivo突然変異誘発の場合は宿主細
胞から突然変異したＤＮＡを切り取り、別の適切なベク
ター中に挿入し、これを用いて非ミューテーター(mutat
or)宿主、例えば大腸菌XL1 Blue株を形質転換する。そ
して次に突然変異ＤＮＡライブラリーを調製する。invi
tro突然変異誘発の場合には、もし突然変異ＤＮＡがす
でに適切な発現ベクターに挿入されているならば、突然
変異ＤＮＡライブラリーの調製のために該ベクターを用
いて適切な非ミューテーター宿主を直接形質転換する。
もし突然変異ＤＮＡが適切な発現ベクターに挿入されて
いないならば、以下のようにする。
間が経過した後、in vivo突然変異誘発の場合は宿主細
胞から突然変異したＤＮＡを切り取り、別の適切なベク
ター中に挿入し、これを用いて非ミューテーター(mutat
or)宿主、例えば大腸菌XL1 Blue株を形質転換する。そ
して次に突然変異ＤＮＡライブラリーを調製する。invi
tro突然変異誘発の場合には、もし突然変異ＤＮＡがす
でに適切な発現ベクターに挿入されているならば、突然
変異ＤＮＡライブラリーの調製のために該ベクターを用
いて適切な非ミューテーター宿主を直接形質転換する。
もし突然変異ＤＮＡが適切な発現ベクターに挿入されて
いないならば、以下のようにする。
【００５６】適切な生物を形質転換することによって、
スクリーニングのためにライブラリーを調製する。突然
変異したＤＮＡを有するベクターを、形質転換を促進す
る条件下で接種することにより人工的に導入して、宿
主、特に本明細書に好ましいと具体的に同定されている
宿主を形質転換する。
スクリーニングのためにライブラリーを調製する。突然
変異したＤＮＡを有するベクターを、形質転換を促進す
る条件下で接種することにより人工的に導入して、宿
主、特に本明細書に好ましいと具体的に同定されている
宿主を形質転換する。
【００５７】次に、このようにして得られた形質転換ク
ローンのライブラリーを、酵素活性の表現型アッセイを
用いてスクリーニングし、興味のある酵素の活性を示す
クローンを選択する。
ローンのライブラリーを、酵素活性の表現型アッセイを
用いてスクリーニングし、興味のある酵素の活性を示す
クローンを選択する。
【００５８】例えば、上記の技法の１つによって突然変
異させたＤＮＡから多数のクローンを調製した後、興味
のある特定の酵素活性についてこれらのクローンをスク
リーニングする。
異させたＤＮＡから多数のクローンを調製した後、興味
のある特定の酵素活性についてこれらのクローンをスク
リーニングする。
【００５９】例えば、突然変異したＤＮＡを有するクロ
ーンをスクリーニングにかけ、高温範囲内および所望の
低温範囲内における活性を測定し、突然変異させていな
い対応する野性型熱安定性酵素に較べて該低温範囲内に
おいて所望の活性増加を有する突然変異体を同定する。
ーンをスクリーニングにかけ、高温範囲内および所望の
低温範囲内における活性を測定し、突然変異させていな
い対応する野性型熱安定性酵素に較べて該低温範囲内に
おいて所望の活性増加を有する突然変異体を同定する。
【００６０】陽性であると同定されたクローン、すなわ
ち熱安定性であって、かつ低温範囲内の温度において対
応する野性型酵素に較べて少なくとも２倍増大した活性
を有する熱安定性酵素を発現する突然変異ＤＮＡ配列を
有するクローンを単離し、配列決定し、該ＤＮＡ配列を
同定する。例えば、上記クローンを、つまりは熱安定性
酵素を低温に暴露し、そして適切な基質を開裂する能力
を試験することによって、所望の低温範囲におけるホス
ファターゼ活性を同定することができる。
ち熱安定性であって、かつ低温範囲内の温度において対
応する野性型酵素に較べて少なくとも２倍増大した活性
を有する熱安定性酵素を発現する突然変異ＤＮＡ配列を
有するクローンを単離し、配列決定し、該ＤＮＡ配列を
同定する。例えば、上記クローンを、つまりは熱安定性
酵素を低温に暴露し、そして適切な基質を開裂する能力
を試験することによって、所望の低温範囲におけるホス
ファターゼ活性を同定することができる。
【００６１】実施例７においては、野性型酵素と突然変
異誘発にかけた酵素を比較して、ホスファターゼ活性お
よびβ-ガラクトシダーゼ活性が測定される。報告され
る結果から分かるように、野性型ホスファターゼおよび
β-ガラクトシダーゼ好熱性酵素の突然変異誘発は、対
応する野性型酵素よりも室温の低温範囲内においてそれ
ぞれ３倍および2.5倍活性な突然変異酵素をもたらし
た。
異誘発にかけた酵素を比較して、ホスファターゼ活性お
よびβ-ガラクトシダーゼ活性が測定される。報告され
る結果から分かるように、野性型ホスファターゼおよび
β-ガラクトシダーゼ好熱性酵素の突然変異誘発は、対
応する野性型酵素よりも室温の低温範囲内においてそれ
ぞれ３倍および2.5倍活性な突然変異酵素をもたらし
た。
【００６２】タンパク質を作製する場合には、好熱性酵
素を突然変異誘発にかけた後、突然変異した酵素を所望
の活性（すなわち、高温における活性を保持しつつ低温
における活性が増大している）についてスクリーニング
する。タンパク質突然変異誘発のための公知技法の任意
のものを用いることができるが、特に好ましい突然変異
誘発技法は上に論じた技法である。
素を突然変異誘発にかけた後、突然変異した酵素を所望
の活性（すなわち、高温における活性を保持しつつ低温
における活性が増大している）についてスクリーニング
する。タンパク質突然変異誘発のための公知技法の任意
のものを用いることができるが、特に好ましい突然変異
誘発技法は上に論じた技法である。
【００６３】微生物由来のＤＮＡは、選択手順にかけて
特定の酵素活性を有する酵素をコードするＤＮＡ由来の
ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを選択し単離するの
に先立って、好ましくは適切なベクター（一般に、発現
をもたらすための適切な調節配列を有するベクター）に
挿入される。
特定の酵素活性を有する酵素をコードするＤＮＡ由来の
ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを選択し単離するの
に先立って、好ましくは適切なベクター（一般に、発現
をもたらすための適切な調節配列を有するベクター）に
挿入される。
【００６４】ライブラリーを調製することができる微生
物は、真正細菌および古細菌等の原核微生物、ならびに
真菌、ある種の藻類および原生動物等の下等真核微生物
を含む。これらの微生物は培養微生物であってもよい
し、または環境サンプルから得た非培養微生物であって
もよい。そして、これらの微生物は好熱菌、超好熱菌、
好冷菌、低温菌等の好局限性細菌であってよい。
物は、真正細菌および古細菌等の原核微生物、ならびに
真菌、ある種の藻類および原生動物等の下等真核微生物
を含む。これらの微生物は培養微生物であってもよい
し、または環境サンプルから得た非培養微生物であって
もよい。そして、これらの微生物は好熱菌、超好熱菌、
好冷菌、低温菌等の好局限性細菌であってよい。
【００６５】上に示すように、環境サンプルからライブ
ラリーを作製することが可能である。この場合、ＤＮＡ
は微生物を培養せずに回収してもよいし、または培養微
生物から回収してもよい。
ラリーを作製することが可能である。この場合、ＤＮＡ
は微生物を培養せずに回収してもよいし、または培養微
生物から回収してもよい。
【００６６】そこから標的ＤＮＡを得るための出発材料
ライブラリーとしての微生物ＤＮＡの供給源は、環境サ
ンプルを含むことが特に意図されている。例えば、北極
および南極の氷、水または永久凍結帯の資源、火山性起
源の物質、熱帯地方の土壌または植物に由来する物質、
等から得られた環境サンプルである。したがって、例え
ば培養可能または培養不可能な微生物からＤＮＡを回収
し、それを用いて適切な組換え発現ライブラリーを作製
し、次に酵素活性を測定することができる。
ライブラリーとしての微生物ＤＮＡの供給源は、環境サ
ンプルを含むことが特に意図されている。例えば、北極
および南極の氷、水または永久凍結帯の資源、火山性起
源の物質、熱帯地方の土壌または植物に由来する物質、
等から得られた環境サンプルである。したがって、例え
ば培養可能または培養不可能な微生物からＤＮＡを回収
し、それを用いて適切な組換え発現ライブラリーを作製
し、次に酵素活性を測定することができる。
【００６７】細菌および多くの真核生物は、それらの産
物が関連プロセスに関与する複数の遺伝子を調節するた
めの整合された(coordinated)作用機構を有する。これ
らの遺伝子は１本の染色体上に「遺伝子クラスター」と
呼ばれる形で群をなしており、１つの調節配列（全クラ
スターの転写を開始させる１個のプロモーターを含む）
の制御下で一緒に転写される。遺伝子クラスター、プロ
モーター、および調節に機能する付加的配列は全体とし
て「オペロン」と呼ばれ、通常は2〜6個、最大で20個以
上の遺伝子を含むことができる。したがって、遺伝子ク
ラスターとは、通常は機能に関して、同一または関連し
ている隣接する遺伝子の１群である。
物が関連プロセスに関与する複数の遺伝子を調節するた
めの整合された(coordinated)作用機構を有する。これ
らの遺伝子は１本の染色体上に「遺伝子クラスター」と
呼ばれる形で群をなしており、１つの調節配列（全クラ
スターの転写を開始させる１個のプロモーターを含む）
の制御下で一緒に転写される。遺伝子クラスター、プロ
モーター、および調節に機能する付加的配列は全体とし
て「オペロン」と呼ばれ、通常は2〜6個、最大で20個以
上の遺伝子を含むことができる。したがって、遺伝子ク
ラスターとは、通常は機能に関して、同一または関連し
ている隣接する遺伝子の１群である。
【００６８】幾つかの遺伝子ファミリーは複数の同一メ
ンバーからなっている。クラスターをなす遺伝子は必ず
しも同一ではないが、クラスターを形成することは遺伝
子間の同一性を維持するための必要条件である。遺伝子
クラスターは、隣接する関連遺伝子に対して複製が生成
される極端な場合から、数百の同一の遺伝子がタンデム
な列をなして存在する場合まで異なっている。時々、特
定の遺伝子の反復に何ら重要性が認められない場合があ
る。この主な例は、他の哺乳動物種においては１個のイ
ンスリン遺伝子で十分であるのに、幾つかの種において
発現される重複インスリン遺伝子である。
ンバーからなっている。クラスターをなす遺伝子は必ず
しも同一ではないが、クラスターを形成することは遺伝
子間の同一性を維持するための必要条件である。遺伝子
クラスターは、隣接する関連遺伝子に対して複製が生成
される極端な場合から、数百の同一の遺伝子がタンデム
な列をなして存在する場合まで異なっている。時々、特
定の遺伝子の反復に何ら重要性が認められない場合があ
る。この主な例は、他の哺乳動物種においては１個のイ
ンスリン遺伝子で十分であるのに、幾つかの種において
発現される重複インスリン遺伝子である。
【００６９】遺伝子クラスター、およびそれによっても
たらされるタンパク質を発現するために該クラスターの
全長はどの程度まで必要か、をさらに研究することは重
要である。さらに、遺伝子クラスターは継続的再編成を
受ける。したがって、例えば細菌または他の原核生物源
から遺伝子クラスターの異種ライブラリーを作製する能
力は、新規なタンパク質、特に、例えば多数の有用な活
性を有するポリケチドの合成に関与するポリケチドシン
ターゼ等の酵素を含めて、タンパク質の供給源を決定す
るうえで価値がある。遺伝子クラスターの産物であるタ
ンパク質の他の種類もまた、例えば抗生物質、抗ウイル
ス剤、抗腫瘍剤、インスリン等の調節タンパク質を含め
て考慮されている。
たらされるタンパク質を発現するために該クラスターの
全長はどの程度まで必要か、をさらに研究することは重
要である。さらに、遺伝子クラスターは継続的再編成を
受ける。したがって、例えば細菌または他の原核生物源
から遺伝子クラスターの異種ライブラリーを作製する能
力は、新規なタンパク質、特に、例えば多数の有用な活
性を有するポリケチドの合成に関与するポリケチドシン
ターゼ等の酵素を含めて、タンパク質の供給源を決定す
るうえで価値がある。遺伝子クラスターの産物であるタ
ンパク質の他の種類もまた、例えば抗生物質、抗ウイル
ス剤、抗腫瘍剤、インスリン等の調節タンパク質を含め
て考慮されている。
【００７０】ポリケチドは、抗生物質（テトラサイクリ
ンおよびエリスロマイシン）、抗癌剤（ダウノマイシ
ン）、免疫抑制剤（FK506およびラパマイシン）、およ
び動物薬（モネンシン）を含む生物活性の極めて豊かな
供給源である分子である。多くのポリケチド（ポリケチ
ドシンターゼによって生成される）は、治療剤として有
益である。ポリケチドシンターゼとは、長さ並びに官能
性および環化のパターンが異なる極めて多様な炭素鎖の
生合成を触媒する多機能酵素である。ポリケチドシンタ
ーゼ遺伝子は遺伝子クラスターに該当し、少なくとも１
種類（Ｉ型と称する）のポリケチドシンターゼは大きい
サイズの遺伝子および酵素を有し、それらは遺伝子操作
およびこれら遺伝子／タンパク質のin vitro研究を複雑
にしている。
ンおよびエリスロマイシン）、抗癌剤（ダウノマイシ
ン）、免疫抑制剤（FK506およびラパマイシン）、およ
び動物薬（モネンシン）を含む生物活性の極めて豊かな
供給源である分子である。多くのポリケチド（ポリケチ
ドシンターゼによって生成される）は、治療剤として有
益である。ポリケチドシンターゼとは、長さ並びに官能
性および環化のパターンが異なる極めて多様な炭素鎖の
生合成を触媒する多機能酵素である。ポリケチドシンタ
ーゼ遺伝子は遺伝子クラスターに該当し、少なくとも１
種類（Ｉ型と称する）のポリケチドシンターゼは大きい
サイズの遺伝子および酵素を有し、それらは遺伝子操作
およびこれら遺伝子／タンパク質のin vitro研究を複雑
にしている。
【００７１】研究用の新規なポリケチドの作製のため
に、ポリケチドおよびポストポリケチド生合成遺伝子の
ライブラリーから所望の成分を選択して組み合わせる能
力は興味深い。本発明の方法は、新規なポリケチドシン
ターゼのクローン化を容易にする。なぜなら、（特にｆ
因子に基づくベクターを用いた場合は）大きい挿入断片
を有するクローンを用いて遺伝子バンクを作製できるか
らであり、これは遺伝子クラスターのクローン化を容易
にする。
に、ポリケチドおよびポストポリケチド生合成遺伝子の
ライブラリーから所望の成分を選択して組み合わせる能
力は興味深い。本発明の方法は、新規なポリケチドシン
ターゼのクローン化を容易にする。なぜなら、（特にｆ
因子に基づくベクターを用いた場合は）大きい挿入断片
を有するクローンを用いて遺伝子バンクを作製できるか
らであり、これは遺伝子クラスターのクローン化を容易
にする。
【００７２】好ましくは、遺伝子クラスターＤＮＡはベ
クターに連結される。特に、検出可能なタンパク質の産
生、または連結した遺伝子クラスター由来のタンパク質
に関連する多数の活性を制御および調節することのでき
る発現調節配列をさらに含むベクターに連結することが
好ましい。外因性ＤＮＡ導入のための極端に大きい容量
を有するベクターの使用は、そのような遺伝子クラスタ
ーと共に使用するのに特に適切であり、例として大腸菌
のｆ因子（または稔性因子）を含むものを本明細書に記
述する。この大腸菌のｆ因子とは、接合中にそれ自身の
高頻度移行をもたらすプラスミドであって、混合微生物
サンプル由来の遺伝子クラスター等の大きいＤＮＡ断片
を獲得し、それを安定に増殖させるのに理想的である。
クターに連結される。特に、検出可能なタンパク質の産
生、または連結した遺伝子クラスター由来のタンパク質
に関連する多数の活性を制御および調節することのでき
る発現調節配列をさらに含むベクターに連結することが
好ましい。外因性ＤＮＡ導入のための極端に大きい容量
を有するベクターの使用は、そのような遺伝子クラスタ
ーと共に使用するのに特に適切であり、例として大腸菌
のｆ因子（または稔性因子）を含むものを本明細書に記
述する。この大腸菌のｆ因子とは、接合中にそれ自身の
高頻度移行をもたらすプラスミドであって、混合微生物
サンプル由来の遺伝子クラスター等の大きいＤＮＡ断片
を獲得し、それを安定に増殖させるのに理想的である。
【００７３】次に、文献に記載されている利用可能な技
法を用いて、ＤＮＡを単離することができる。この目的
のためには、IsoQuick(核酸抽出キット（MicroProbe Co
rporation) が適当である。
法を用いて、ＤＮＡを単離することができる。この目的
のためには、IsoQuick(核酸抽出キット（MicroProbe Co
rporation) が適当である。
【００７４】これらの微生物に由来する、またはそれら
から単離されたＤＮＡは、選択されたＤＮＡを用いて釣
り上げる前に、好ましくはベクターまたはプラスミドに
挿入することができる。そのようなベクターまたはプラ
スミドは、好ましくはプロモーター、エンハンサー、等
を含む発現調節配列を有するものである。そのようなポ
リヌクレオチドはベクターおよび／または構成物の一部
であることができ、かつ、そのようなベクターおよび／
または構成物は該ポリヌクレオチドの天然の環境ではな
いという意味で、該ポリヌクレオチドは単離されている
ことができる。特に好ましいファージまたはプラスミド
およびそれらへの導入およびパッケージング方法は、本
明細書に定めるプロトコールに詳細に記述されている。
から単離されたＤＮＡは、選択されたＤＮＡを用いて釣
り上げる前に、好ましくはベクターまたはプラスミドに
挿入することができる。そのようなベクターまたはプラ
スミドは、好ましくはプロモーター、エンハンサー、等
を含む発現調節配列を有するものである。そのようなポ
リヌクレオチドはベクターおよび／または構成物の一部
であることができ、かつ、そのようなベクターおよび／
または構成物は該ポリヌクレオチドの天然の環境ではな
いという意味で、該ポリヌクレオチドは単離されている
ことができる。特に好ましいファージまたはプラスミド
およびそれらへの導入およびパッケージング方法は、本
明細書に定めるプロトコールに詳細に記述されている。
【００７５】以下は、培養可能な微生物および培養不可
能な微生物の両方から発現ライブラリーを作製するため
の一般的手順の概略を示す。それらのライブラリーを特
定のプローブＤＮＡで釣り上げて、ハイブリダイズする
ＤＮＡ配列を選択することができる。 環境サンプル バイオマスを得る。 ＤＮＡの単離（種々の方法）。 ＤＮＡを剪断する（25ゲージの針）。 ＤＮＡを平滑末端とする（マングビーンヌクレアー
ゼ）。 ＤＮＡをメチル化する（Eco RIメチラーゼ）。 Eco RIリンカーに連結する（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）。 リンカーを切り戻す（Eco RI制限エンドヌクレアー
ゼ）。 大きさにより分画する（ショ糖勾配）。 λベクターに連結する（λ ZAP II およびgt11)。 パッケージする（in vitro λパッケージング抽出
物）。 大腸菌宿主上に播き、増幅させる。 目的の酵素活性を有するクローンをスクリーニングによ
って同定する。このスクリーニングは、ハイブリダイゼ
ーションによって目的の酵素をコードするＤＮＡの存在
を同定すること、または目的の酵素活性を検出すること
のいずれかによって実施することができる。
能な微生物の両方から発現ライブラリーを作製するため
の一般的手順の概略を示す。それらのライブラリーを特
定のプローブＤＮＡで釣り上げて、ハイブリダイズする
ＤＮＡ配列を選択することができる。 環境サンプル バイオマスを得る。 ＤＮＡの単離（種々の方法）。 ＤＮＡを剪断する（25ゲージの針）。 ＤＮＡを平滑末端とする（マングビーンヌクレアー
ゼ）。 ＤＮＡをメチル化する（Eco RIメチラーゼ）。 Eco RIリンカーに連結する（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）。 リンカーを切り戻す（Eco RI制限エンドヌクレアー
ゼ）。 大きさにより分画する（ショ糖勾配）。 λベクターに連結する（λ ZAP II およびgt11)。 パッケージする（in vitro λパッケージング抽出
物）。 大腸菌宿主上に播き、増幅させる。 目的の酵素活性を有するクローンをスクリーニングによ
って同定する。このスクリーニングは、ハイブリダイゼ
ーションによって目的の酵素をコードするＤＮＡの存在
を同定すること、または目的の酵素活性を検出すること
のいずれかによって実施することができる。
【００７６】少なくとも１つの微生物由来のＤＮＡから
目的の標的ＤＮＡを選択的に単離するために用いるプロ
ーブＤＮＡは、公知の活性を有する酵素のＤＮＡの全長
コード領域配列または部分コード領域配列であってよ
い。元のＤＮＡライブラリーを、好ましくは、特定の酵
素活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列の少なくと
も一部を含む混合プローブを用いてプローブすることが
できる。これらのプローブまたはプローブライブラリー
は好ましくは一本鎖であり、プローブされる微生物ＤＮ
Ａは好ましくは一本鎖に変換されている。特に適切なプ
ローブは、スクリーニングされるべき特定の酵素活性に
類似した、または同一の活性を有する酵素をコードする
ＤＮＡに由来するものである。
目的の標的ＤＮＡを選択的に単離するために用いるプロ
ーブＤＮＡは、公知の活性を有する酵素のＤＮＡの全長
コード領域配列または部分コード領域配列であってよ
い。元のＤＮＡライブラリーを、好ましくは、特定の酵
素活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列の少なくと
も一部を含む混合プローブを用いてプローブすることが
できる。これらのプローブまたはプローブライブラリー
は好ましくは一本鎖であり、プローブされる微生物ＤＮ
Ａは好ましくは一本鎖に変換されている。特に適切なプ
ローブは、スクリーニングされるべき特定の酵素活性に
類似した、または同一の活性を有する酵素をコードする
ＤＮＡに由来するものである。
【００７７】プローブＤＮＡは少なくとも約10塩基であ
り、好ましくは少なくとも15塩基である。１つの実施態
様においては、プローブとして全コード領域を用いるこ
とができる。少なくとの１つのＤＮＡプローブの使用に
より標的ＤＮＡが選択的に単離されるハイブリダイゼー
ションの条件は、少なくとも約50%の配列同一性をもた
らすハイブリダイゼーションストリンジェンシー、特に
少なくとも約70%、好ましくは75%の配列同一性をもたら
すストリンジェンシーを提供するように設計される。
り、好ましくは少なくとも15塩基である。１つの実施態
様においては、プローブとして全コード領域を用いるこ
とができる。少なくとの１つのＤＮＡプローブの使用に
より標的ＤＮＡが選択的に単離されるハイブリダイゼー
ションの条件は、少なくとも約50%の配列同一性をもた
らすハイブリダイゼーションストリンジェンシー、特に
少なくとも約70%、好ましくは75%の配列同一性をもたら
すストリンジェンシーを提供するように設計される。
【００７８】微生物ＤＮＡライブラリーをプローブして
潜む目的のＤＮＡを単離するハイブリダイゼーション技
法は当分野で周知であり、そして、文献に記載されてい
る任意の技法、特に該微生物由来の残りのＤＮＡから分
離するために固相に直接または間接的に結合したプロー
ブＤＮＡを用いる技法は、本発明に使用するのに適す
る。プローブを固相に結合させた後、液相ハイブリダイ
ゼーションを行うことが好ましい。
潜む目的のＤＮＡを単離するハイブリダイゼーション技
法は当分野で周知であり、そして、文献に記載されてい
る任意の技法、特に該微生物由来の残りのＤＮＡから分
離するために固相に直接または間接的に結合したプロー
ブＤＮＡを用いる技法は、本発明に使用するのに適す
る。プローブを固相に結合させた後、液相ハイブリダイ
ゼーションを行うことが好ましい。
【００７９】好ましくは、プローブＤＮＡは特異的結合
ペアの一方のパートナー（すなわちリガンド）を用いて
「標識」され、ペアの他方のパートナーは固相マトリッ
クスに結合されて、標的をその供給源から分離するのを
容易にする。リガンドおよび特異的結合パートナーは以
下のものから、どちらの方向にも、選択することができ
る。すなわち、(1)抗原またはハプテンおよび抗体また
はその特異的結合断片;(2)ビオチンまたはイミノビオチ
ンおよびアビジンまたはストレプトアビジン;(3)糖およ
びそれに特異的なレクチン;(4)酵素およびそのインヒビ
ター;(5)アポ酵素および補因子;(6)相補的ホモポリマー
性オリゴヌクレオチド; および(7)ホルモンおよびその
受容体である。固相は好ましくは(1)ガラスまたはポリ
マー表面;(2)ポリマービーズを充填したカラム;および
(3)磁性または常磁性粒子から選択される。
ペアの一方のパートナー（すなわちリガンド）を用いて
「標識」され、ペアの他方のパートナーは固相マトリッ
クスに結合されて、標的をその供給源から分離するのを
容易にする。リガンドおよび特異的結合パートナーは以
下のものから、どちらの方向にも、選択することができ
る。すなわち、(1)抗原またはハプテンおよび抗体また
はその特異的結合断片;(2)ビオチンまたはイミノビオチ
ンおよびアビジンまたはストレプトアビジン;(3)糖およ
びそれに特異的なレクチン;(4)酵素およびそのインヒビ
ター;(5)アポ酵素および補因子;(6)相補的ホモポリマー
性オリゴヌクレオチド; および(7)ホルモンおよびその
受容体である。固相は好ましくは(1)ガラスまたはポリ
マー表面;(2)ポリマービーズを充填したカラム;および
(3)磁性または常磁性粒子から選択される。
【００８０】上記のように調製されたクローンライブラ
リーは、培養物の増殖、増幅、または他の補助的手順を
必要とせずに、酵素活性について直接スクリーニングす
ることが可能である。しかし、１つの好ましい実施態様
においては、各クローンから回収されたＤＮＡをＰＣＲ
等によって増幅するとが望ましいと考えられる。
リーは、培養物の増殖、増幅、または他の補助的手順を
必要とせずに、酵素活性について直接スクリーニングす
ることが可能である。しかし、１つの好ましい実施態様
においては、各クローンから回収されたＤＮＡをＰＣＲ
等によって増幅するとが望ましいと考えられる。
【００８１】さらに、単離された標的ＤＮＡの増幅を実
施することは任意であるが、望ましい。この実施態様に
おいては、標的ＤＮＡは単離後プローブＤＮＡから分離
される。次に、宿主の形質転換に用いる前に該単離され
たＤＮＡを増幅する。あらかじめ定められたＤＮＡ配列
を少なくともその一部として含むように選択された二本
鎖ＤＮＡを一本鎖に変換し、増幅にかけ、再度アニーリ
ングして、増幅された数の選択された二本鎖ＤＮＡをも
たらすことができる。当分野では現在多数の増幅方法論
が周知である。
施することは任意であるが、望ましい。この実施態様に
おいては、標的ＤＮＡは単離後プローブＤＮＡから分離
される。次に、宿主の形質転換に用いる前に該単離され
たＤＮＡを増幅する。あらかじめ定められたＤＮＡ配列
を少なくともその一部として含むように選択された二本
鎖ＤＮＡを一本鎖に変換し、増幅にかけ、再度アニーリ
ングして、増幅された数の選択された二本鎖ＤＮＡをも
たらすことができる。当分野では現在多数の増幅方法論
が周知である。
【００８２】次に、選択されたＤＮＡを用いて適切な生
物を形質転換することによってスクリーニングのための
ライブラリーを調製することができる。宿主、特に本明
細書中で好ましいと特に同定された宿主は、そのような
形質転換を導く条件下で標的ＤＮＡを含むベクターを接
種することによって人工的に導入して形質転換される。
２本鎖環状または直鎖状ＤＮＡを用いて形質転換するこ
とが可能でり、または、１本鎖環状または直鎖状ＤＮＡ
を用いて形質転換する場合もあり得る。
物を形質転換することによってスクリーニングのための
ライブラリーを調製することができる。宿主、特に本明
細書中で好ましいと特に同定された宿主は、そのような
形質転換を導く条件下で標的ＤＮＡを含むベクターを接
種することによって人工的に導入して形質転換される。
２本鎖環状または直鎖状ＤＮＡを用いて形質転換するこ
とが可能でり、または、１本鎖環状または直鎖状ＤＮＡ
を用いて形質転換する場合もあり得る。
【００８３】次に、このようにして得られた形質転換さ
れたクローンのライブラリーを酵素活性の表現型アッセ
イにおいて、目的の酵素活性を示すクローンをスクリー
ニングする。
れたクローンのライブラリーを酵素活性の表現型アッセ
イにおいて、目的の酵素活性を示すクローンをスクリー
ニングする。
【００８４】ある生物から選択的に単離したＤＮＡに由
来する多数のクローンを調製した後、これらのクローン
を特定の酵素活性についてスクリーニングし、特定の酵
素特性を有するクローンを同定する。
来する多数のクローンを調製した後、これらのクローン
を特定の酵素活性についてスクリーニングし、特定の酵
素特性を有するクローンを同定する。
【００８５】酵素活性に関するスクリーニングは、個々
の発現クローンを用いて実施してもよいし、または最初
に発現クローンの混合物を用いて実施して該混合物が１
以上の特定の酵素活性を有するかどうかを確認してもよ
い。もし混合物が特定の酵素活性を有するならば、次に
その酵素活性またはより具体的な活性について個々のク
ローンを再スクリーニングすることができる。したがっ
て、例えばもしクローン混合物がヒドロラーゼ活性を有
するならば、次に個々のクローンを回収し、そしてスク
リーニングしてどのクローンがドロラーゼ活性を有する
か決定することができる。
の発現クローンを用いて実施してもよいし、または最初
に発現クローンの混合物を用いて実施して該混合物が１
以上の特定の酵素活性を有するかどうかを確認してもよ
い。もし混合物が特定の酵素活性を有するならば、次に
その酵素活性またはより具体的な活性について個々のク
ローンを再スクリーニングすることができる。したがっ
て、例えばもしクローン混合物がヒドロラーゼ活性を有
するならば、次に個々のクローンを回収し、そしてスク
リーニングしてどのクローンがドロラーゼ活性を有する
か決定することができる。
【００８６】使用できる発現ベクターの代表的なものと
して、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プ
ラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌
性人工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニアウ
イルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウ
イルスおよびＳＶ４０誘導体）、Ｐ１に基づく人工染色
体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および目的の特
定の宿主（枯草菌、アスペルギルス属菌、酵母、等）に
特異的な他の任意のベクターを挙げることができる。し
たがって、例えば、ＤＮＡはポリペプチドを発現するた
めの種々の発現ベクターのうちの任意の１つに含まれて
いればよい。そのようなベクターは染色体、非染色体お
よび合成ＤＮＡ配列を含む。多数の適切なベクターが当
業者には公知であり、市販されている。例として以下の
ベクターを挙げる。すなわち、細菌性：pQE70, pQE60,
pQE-9 (Qiagen); psiX174, pBluescript SK, pBluescri
ptKS (Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pD
R540, pRIT2T (Pharmacia);真核細胞性: pWLNEO, pSV2C
AT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pM
SG, pSVLSV40 (Pharmacia)。しかし、宿主中で複製可能
で、かつ生存可能であるかぎり、他の任意のプラスミド
またはベクターを用いることができる。
して、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プ
ラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌
性人工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニアウ
イルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウ
イルスおよびＳＶ４０誘導体）、Ｐ１に基づく人工染色
体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および目的の特
定の宿主（枯草菌、アスペルギルス属菌、酵母、等）に
特異的な他の任意のベクターを挙げることができる。し
たがって、例えば、ＤＮＡはポリペプチドを発現するた
めの種々の発現ベクターのうちの任意の１つに含まれて
いればよい。そのようなベクターは染色体、非染色体お
よび合成ＤＮＡ配列を含む。多数の適切なベクターが当
業者には公知であり、市販されている。例として以下の
ベクターを挙げる。すなわち、細菌性：pQE70, pQE60,
pQE-9 (Qiagen); psiX174, pBluescript SK, pBluescri
ptKS (Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pD
R540, pRIT2T (Pharmacia);真核細胞性: pWLNEO, pSV2C
AT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pM
SG, pSVLSV40 (Pharmacia)。しかし、宿主中で複製可能
で、かつ生存可能であるかぎり、他の任意のプラスミド
またはベクターを用いることができる。
【００８７】本発明に用いるのに特に好ましい種類のベ
クターは、ｆ因子複製起点を有する。大腸菌のｆ因子
（または稔性因子）は、接合中にそれ自身の高頻度移
行、および細菌染色体自体のより頻度の低い移行をもた
らすプラスミドである。特に好ましい実施態様は、「フ
ォスミド(fosmid)」または細菌性人工染色体（ＢＡＣ）
ベクターと呼ばれるクローニングベクターを用いるもの
である。これらは、ＤＮＡの大きいセグメントを安定に
組み込むことができる大腸菌ｆ因子に由来するものであ
る。混合未培養環境サンプル由来のＤＮＡと統合された
時、このベクターは大きいゲノム断片を安定した「環境
ＤＮＡライブラリー」の形で獲得することを可能とす
る。
クターは、ｆ因子複製起点を有する。大腸菌のｆ因子
（または稔性因子）は、接合中にそれ自身の高頻度移
行、および細菌染色体自体のより頻度の低い移行をもた
らすプラスミドである。特に好ましい実施態様は、「フ
ォスミド(fosmid)」または細菌性人工染色体（ＢＡＣ）
ベクターと呼ばれるクローニングベクターを用いるもの
である。これらは、ＤＮＡの大きいセグメントを安定に
組み込むことができる大腸菌ｆ因子に由来するものであ
る。混合未培養環境サンプル由来のＤＮＡと統合された
時、このベクターは大きいゲノム断片を安定した「環境
ＤＮＡライブラリー」の形で獲得することを可能とす
る。
【００８８】微生物由来のＤＮＡを種々の手順によって
ベクター中に挿入することができる。一般に、該ＤＮＡ
配列は当分野で公知の手順によって適切な制限エンドヌ
クレアーゼ部位に挿入される。このような手順およびそ
の他は当業者の技術の範囲内であると認められる。
ベクター中に挿入することができる。一般に、該ＤＮＡ
配列は当分野で公知の手順によって適切な制限エンドヌ
クレアーゼ部位に挿入される。このような手順およびそ
の他は当業者の技術の範囲内であると認められる。
【００８９】発現ベクター中の該ＤＮＡ配列は、ｍＲＮ
Ａの合成を指令するため、適切な発現制御配列（プロモ
ーター）に機能しうる形で連結される。特に名前を挙げ
る細菌性プロモーターは、lacI, lacZ, T3, T7, gpt,λ
PR, PLおよびtrp を含む。真核細胞プロモーターは、CM
V即時型、HSVチミジンキナーゼ、初期および後記SV40、
レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネ
イン-Iプロモーターを含む。適切なベクターおよびプロ
モーターの選択は、十分当業者の技術レベルの範囲内に
ある。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結
合部位および転写ターミネーターをも含む。ベクターは
発現を増幅させるための適切な配列を含むこともでき
る。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコール
トランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有
する他のベクターを用いて任意の所望の遺伝子から選択
することができる。
Ａの合成を指令するため、適切な発現制御配列（プロモ
ーター）に機能しうる形で連結される。特に名前を挙げ
る細菌性プロモーターは、lacI, lacZ, T3, T7, gpt,λ
PR, PLおよびtrp を含む。真核細胞プロモーターは、CM
V即時型、HSVチミジンキナーゼ、初期および後記SV40、
レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネ
イン-Iプロモーターを含む。適切なベクターおよびプロ
モーターの選択は、十分当業者の技術レベルの範囲内に
ある。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結
合部位および転写ターミネーターをも含む。ベクターは
発現を増幅させるための適切な配列を含むこともでき
る。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコール
トランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有
する他のベクターを用いて任意の所望の遺伝子から選択
することができる。
【００９０】さらに、発現ベクターは形質転換宿主細胞
の選択のために、好ましくは表現型的特徴を提供する１
以上の選択マーカー遺伝子（例えば、真核細胞培養物の
ためにはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン
耐性、あるいは大腸菌においてはテトラサイクリンある
いはアンピシリン耐性、等）を含む。
の選択のために、好ましくは表現型的特徴を提供する１
以上の選択マーカー遺伝子（例えば、真核細胞培養物の
ためにはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン
耐性、あるいは大腸菌においてはテトラサイクリンある
いはアンピシリン耐性、等）を含む。
【００９１】一般に、組換え発現ベクターは複製起点、
宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー（例え
ば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびS.セレビシ
エ(S.cerevisiae)のTRP1遺伝子）、および下流構造配列
の転写を指令するための、高発現遺伝子由来のプロモー
ターを含む。このようなプロモーターは、とりわけ3-ホ
スホグリセリン酸キナーゼ（PGK)等の解糖酵素、α因
子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質
をコードするオペロン由来のものであり得る。異種構造
配列は、適切な段階で、翻訳開始および終結配列、なら
びに好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔また
は細胞外の培地への分泌を指令することのできるリーダ
ー配列と共に組み立てられる。
宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー（例え
ば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびS.セレビシ
エ(S.cerevisiae)のTRP1遺伝子）、および下流構造配列
の転写を指令するための、高発現遺伝子由来のプロモー
ターを含む。このようなプロモーターは、とりわけ3-ホ
スホグリセリン酸キナーゼ（PGK)等の解糖酵素、α因
子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質
をコードするオペロン由来のものであり得る。異種構造
配列は、適切な段階で、翻訳開始および終結配列、なら
びに好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔また
は細胞外の培地への分泌を指令することのできるリーダ
ー配列と共に組み立てられる。
【００９２】上記のように選択し、単離したＤＮＡを適
切な宿主に導入し、ライブラリーを調製する。このライ
ブラリーは、所望の酵素活性についてスクリーニングさ
れる。好ましくは、選択されたＤＮＡは適切な制御配列
を含むベクター中にすでに挿入されていて、酵素をコー
ドする選択されたＤＮＡをそれによって発現させ、所望
の活性を検出する。宿主細胞は、哺乳動物細胞等の高等
真核細胞、または酵母細胞等の下等真核細胞でありう
る。または、宿主細胞は細菌細胞等の原核細胞でありう
る。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムト
ランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランス
フェクション、またはエレクトロポレーションによって
実施することができる(Davis, L., Dibner, M., Batte
y, I., Basic Methods in Molecular Biology, (198
6))。
切な宿主に導入し、ライブラリーを調製する。このライ
ブラリーは、所望の酵素活性についてスクリーニングさ
れる。好ましくは、選択されたＤＮＡは適切な制御配列
を含むベクター中にすでに挿入されていて、酵素をコー
ドする選択されたＤＮＡをそれによって発現させ、所望
の活性を検出する。宿主細胞は、哺乳動物細胞等の高等
真核細胞、または酵母細胞等の下等真核細胞でありう
る。または、宿主細胞は細菌細胞等の原核細胞でありう
る。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムト
ランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランス
フェクション、またはエレクトロポレーションによって
実施することができる(Davis, L., Dibner, M., Batte
y, I., Basic Methods in Molecular Biology, (198
6))。
【００９３】適切な宿主の代表的な例としては、大腸
菌、ストレプトミセス(Streptomyces)、ネズミチフス菌
(Salmonella typhimurium)等の細菌細胞；酵母等の真菌
細胞；ショウジョウバエ(Drosophila) S2 およびスポド
プテラ(Spodoptera) Sf9等の昆虫細胞；CHO、COSまたは
Bowes黒色腫等の動物細胞；アデノウイルス；植物細
胞、等が挙げられる。適切な宿主細胞の選択は、本明細
書の教示より当業者の技術的範囲内にあると見なされ
る。
菌、ストレプトミセス(Streptomyces)、ネズミチフス菌
(Salmonella typhimurium)等の細菌細胞；酵母等の真菌
細胞；ショウジョウバエ(Drosophila) S2 およびスポド
プテラ(Spodoptera) Sf9等の昆虫細胞；CHO、COSまたは
Bowes黒色腫等の動物細胞；アデノウイルス；植物細
胞、等が挙げられる。適切な宿主細胞の選択は、本明細
書の教示より当業者の技術的範囲内にあると見なされ
る。
【００９４】組換えタンパク質を発現するのに用いるこ
とができる種々の哺乳動物細胞培養系を特に挙げるなら
ば、哺乳動物発現系の例はGluzman, Cell, 23:175 (198
1)によって記述されているサル腎臓繊維芽細胞COS-7 細
胞系、および和合性の(compatible)ベクターを発現する
ことができる他の細胞系、例えばC127、3T3、CHO、HeLa
およびBHK 細胞系等を含む。哺乳動物発現ベクターは複
製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、およ
び任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部
位、スプライス供与および受容部位、転写終止配列、お
よび5'隣接非転写配列を含む。SV40のスプライスおよび
ポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列を用いて必要とさ
れる非転写遺伝子エレメントを提供することができる。
とができる種々の哺乳動物細胞培養系を特に挙げるなら
ば、哺乳動物発現系の例はGluzman, Cell, 23:175 (198
1)によって記述されているサル腎臓繊維芽細胞COS-7 細
胞系、および和合性の(compatible)ベクターを発現する
ことができる他の細胞系、例えばC127、3T3、CHO、HeLa
およびBHK 細胞系等を含む。哺乳動物発現ベクターは複
製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、およ
び任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部
位、スプライス供与および受容部位、転写終止配列、お
よび5'隣接非転写配列を含む。SV40のスプライスおよび
ポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列を用いて必要とさ
れる非転写遺伝子エレメントを提供することができる。
【００９５】宿主細胞は一般にベクターを用いて遺伝子
工学的に操作（形質導入または形質転換またはトランス
フェクション）される。操作された宿主細胞は、プロモ
ーターを活性化させ、形質転換体を選択し、または遺伝
子を増幅するのに適切なように改変された常用の栄養培
地中で培養することができる。培養条件（温度、ｐＨ、
等）は発現のために選択された宿主細胞に対して以前に
用いられたものであり、当業者には明らかである。
工学的に操作（形質導入または形質転換またはトランス
フェクション）される。操作された宿主細胞は、プロモ
ーターを活性化させ、形質転換体を選択し、または遺伝
子を増幅するのに適切なように改変された常用の栄養培
地中で培養することができる。培養条件（温度、ｐＨ、
等）は発現のために選択された宿主細胞に対して以前に
用いられたものであり、当業者には明らかである。
【００９６】当分野で公知の手順により、ライブラリー
を特定の酵素活性についてスクリーニングすることがで
きる。例えば、６つのＩＵＢクラス、すなわちオキシド
レダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リ
アーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼの１以上について
酵素活性をスクリーニングすることができる。次に、１
以上のＩＵＢクラスについて陽性であると確認された組
換え酵素を、より特異的な酵素活性について再スクリー
ニングすることができる。
を特定の酵素活性についてスクリーニングすることがで
きる。例えば、６つのＩＵＢクラス、すなわちオキシド
レダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リ
アーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼの１以上について
酵素活性をスクリーニングすることができる。次に、１
以上のＩＵＢクラスについて陽性であると確認された組
換え酵素を、より特異的な酵素活性について再スクリー
ニングすることができる。
【００９７】または、より特殊化した酵素活性について
ライブラリーをスクリーニングすることができる。例え
ば、ヒドロラーゼ活性について一般的にスクリーニング
する代わりに、より特殊化した活性、すなわちヒドロラ
ーゼが作用する結合の種類についてライブラリーをスク
リーニングすることができる。したがって、例えばライ
ブラリーをスクリーニングして、１以上の特定の化学的
官能性、例えば(a)アミド（ペプチド結合）、すなわち
プロテアーゼ；(b)エステル結合、すなわちエステラー
ゼおよびリパーゼ；(c)アセタール、すなわちグリコシ
ダーゼ、等に作用するヒドロラーゼを突き止めることが
できる。
ライブラリーをスクリーニングすることができる。例え
ば、ヒドロラーゼ活性について一般的にスクリーニング
する代わりに、より特殊化した活性、すなわちヒドロラ
ーゼが作用する結合の種類についてライブラリーをスク
リーニングすることができる。したがって、例えばライ
ブラリーをスクリーニングして、１以上の特定の化学的
官能性、例えば(a)アミド（ペプチド結合）、すなわち
プロテアーゼ；(b)エステル結合、すなわちエステラー
ゼおよびリパーゼ；(c)アセタール、すなわちグリコシ
ダーゼ、等に作用するヒドロラーゼを突き止めることが
できる。
【００９８】次に、特定の酵素活性を有すると同定され
たクローンを配列決定して、該特定の活性を有する酵素
をコードするＤＮＡ配列を同定することができる。した
がって、本発明によれば、(i)特定の酵素活性を有する
酵素をコードするＤＮＡ、(ii)そのような活性を有する
酵素（そのアミノ酸配列を含む）を単離し同定して、そ
して(iii)そのような活性を有する組換え酵素を作製す
ることができる。
たクローンを配列決定して、該特定の活性を有する酵素
をコードするＤＮＡ配列を同定することができる。した
がって、本発明によれば、(i)特定の酵素活性を有する
酵素をコードするＤＮＡ、(ii)そのような活性を有する
酵素（そのアミノ酸配列を含む）を単離し同定して、そ
して(iii)そのような活性を有する組換え酵素を作製す
ることができる。
【００９９】または、その活性についてスクリーニング
を行なった酵素活性を有することが判明したクローンを
配列決定し、次に人為的突然変異誘発にかけて所望の活
性を有する新しい酵素を開発するか、または野性型酵素
には存在しない、あるいはそれほど顕著でない特に望ま
しい特性（例えば、熱または有機溶媒に対する安定性）
を有する改変酵素を開発することができる。人為的突然
変異誘発のための公知技法のうち任意のものを本発明に
適用することができる。例えば、本発明にしたがって使
用するのに特に好ましい突然変異誘発技法は、以下に記
載の技法を含む。本発明は、例えば下記の用途に用いる
ことができる下記の活性を有する新規な酵素を同定また
は作製するのに用いることができる。 １．リパーセ／エステラーゼ ａ．エステル（脂質）／チオエステルのエナンチオ選択
的加水分解 １）ラセミ混合物の分割 ２）メソジエステルからの光学活性な酸またはアルコー
ルの合成 ｂ．選択的合成 １）炭水化物エステルの位置特異的加水分解 ２）環状第二級アルコールの選択的加水分解 ｃ．光学活性なエステル、ラクトン、酸、アルコールの
合成 １）活性化／非活性化エステルのエステル交換反応 ２）インターエステリフィケーション ３）ヒドロキシエステル由来の光学活性ラクトン ４）無水物の位置選択的およびエナンチオ選択的開環 ｄ．界面活性剤 ｅ．脂肪／油変換 ｆ．チーズの熟成 ２．プロテアーゼ ａ．エステル／アミド合成 ｂ．ペプチド合成 ｃ．アミノ酸エステルのラセミ混合物の分割 ｄ．非天然アミノ酸の合成 ｅ．界面活性剤／タンパク質加水分解 ３．グリコシダーゼ／グリコシルトランスフェラーゼ ａ．糖／ポリマー合成 ｂ．グリコシド結合を開裂して単糖、二糖およびオリゴ
糖を形成 ｃ．複合オリゴ糖の合成 ｄ．UDP-ガラクトシルトランスフェラーゼを用いたグリ
コシド合成 ｅ．二糖、フッ化グリコシル、アリールガラクトシドの
グリコシル転移 ｆ．オリゴ糖合成におけるグリコシル転移 ｇ．β−グルコシルスルホキシドのジアステレオ選択的
開裂 ｈ．非対称グリコシル化 ｉ．食品加工 ｊ．紙加工 ４．ホスファターゼ／キナーゼ ａ．リン酸エステルの合成／加水分解 １）位置選択的、エナンチオ選択的リン酸化 ２）リン酸エステルの導入 ３）リン脂質前駆体の合成 ４）制御されたポリヌクレオチド合成 ｂ．生物学的分子の活性化 ｃ．保護基の不在下における選択的リン酸結合形成 ５．モノ／ジオキシゲナーゼ ａ．活性化されていない有機基質の直接的オキシファン
クショナリゼーション(oxyfunctionalization) ｂ．アルカン、芳香族化合物、ステロイドのヒドロキシ
ル化 ｃ．アルケンのエポキシ化 ｄ．エナンチオ選択的スルフォキシド化 ｅ．位置選択的および立体選択的バイヤー−ビリガー(B
ayer-Villiger)酸化 ６．ハロペロキシダーゼ ａ．求核部位へのハロゲン化物イオンの酸化的付加 ｂ．次亜ハロゲン酸のオレフィン結合への添加 ｃ．シクロプロパンの環開裂 ｄ．オルトまたはパラ誘導体に変換された活性化芳香族
基質 ｅ．２−ハロ−誘導体に変換された1.3 ジケトン ｆ．硫黄および窒素含有基質のヘテロ原子酸化 ｇ．酢酸エノール、アルキン、および活性化芳香族環の
酸化 ７．リグニンペルオキシダーゼ／ジアリールプロパンペ
ルオキシダーゼ ａ．Ｃ−Ｃ結合の酸化的開裂 ｂ．ベンジルアルコールのアルデヒドへの酸化 ｃ．ベンジルカーボンのヒドロキシル化 ｄ．フェノール二量体化 ｅ．二重結合をヒドロキシル化して、ジオールを形成 ｆ．リグニンアルデヒドの開裂 ８．エポキシドヒドロラーゼ ａ．鏡像異性体的に純粋な生物活性化合物の合成 ｂ．エポキシドの位置選択的およびエナンチオ選択的加
水分解 ｃ．モノオキシゲナーゼにより芳香族およびオレフィン
をエポキシ化し、エポキシドを形成 ｄ．ラセミエポキシドの分割 ｅ．ステロイドエポキシドの加水分解 ９．ニトリルヒドラターゼ／ニトリラーゼ ａ．脂肪族ニトリルのカルボキシアミドへの加水分解 ｂ．芳香族、複素環式、不飽和脂肪族ニトリルの対応す
る酸への加水分解 ｃ．アクリロニトリルの加水分解 ｄ．芳香族およびカルボキシアミド、カルボン酸（ニコ
チンアミド、ピコリンアミド、イソニコチンアミド）の
生産 ｅ．アクリルジニトリルの位置選択的加水分解 ｆ．α-ヒドロキシニトリル由来のα-アミノ酸 10. トランスアミナーゼ ａ．オキソ酸へのアミノ基の転移 11. アミダーゼ／アシラーゼ ａ．アミド、アミジン、および他のＣ−Ｎ結合の加水分
解 ｂ．非天然アミノ酸の分割および合成
を行なった酵素活性を有することが判明したクローンを
配列決定し、次に人為的突然変異誘発にかけて所望の活
性を有する新しい酵素を開発するか、または野性型酵素
には存在しない、あるいはそれほど顕著でない特に望ま
しい特性（例えば、熱または有機溶媒に対する安定性）
を有する改変酵素を開発することができる。人為的突然
変異誘発のための公知技法のうち任意のものを本発明に
適用することができる。例えば、本発明にしたがって使
用するのに特に好ましい突然変異誘発技法は、以下に記
載の技法を含む。本発明は、例えば下記の用途に用いる
ことができる下記の活性を有する新規な酵素を同定また
は作製するのに用いることができる。 １．リパーセ／エステラーゼ ａ．エステル（脂質）／チオエステルのエナンチオ選択
的加水分解 １）ラセミ混合物の分割 ２）メソジエステルからの光学活性な酸またはアルコー
ルの合成 ｂ．選択的合成 １）炭水化物エステルの位置特異的加水分解 ２）環状第二級アルコールの選択的加水分解 ｃ．光学活性なエステル、ラクトン、酸、アルコールの
合成 １）活性化／非活性化エステルのエステル交換反応 ２）インターエステリフィケーション ３）ヒドロキシエステル由来の光学活性ラクトン ４）無水物の位置選択的およびエナンチオ選択的開環 ｄ．界面活性剤 ｅ．脂肪／油変換 ｆ．チーズの熟成 ２．プロテアーゼ ａ．エステル／アミド合成 ｂ．ペプチド合成 ｃ．アミノ酸エステルのラセミ混合物の分割 ｄ．非天然アミノ酸の合成 ｅ．界面活性剤／タンパク質加水分解 ３．グリコシダーゼ／グリコシルトランスフェラーゼ ａ．糖／ポリマー合成 ｂ．グリコシド結合を開裂して単糖、二糖およびオリゴ
糖を形成 ｃ．複合オリゴ糖の合成 ｄ．UDP-ガラクトシルトランスフェラーゼを用いたグリ
コシド合成 ｅ．二糖、フッ化グリコシル、アリールガラクトシドの
グリコシル転移 ｆ．オリゴ糖合成におけるグリコシル転移 ｇ．β−グルコシルスルホキシドのジアステレオ選択的
開裂 ｈ．非対称グリコシル化 ｉ．食品加工 ｊ．紙加工 ４．ホスファターゼ／キナーゼ ａ．リン酸エステルの合成／加水分解 １）位置選択的、エナンチオ選択的リン酸化 ２）リン酸エステルの導入 ３）リン脂質前駆体の合成 ４）制御されたポリヌクレオチド合成 ｂ．生物学的分子の活性化 ｃ．保護基の不在下における選択的リン酸結合形成 ５．モノ／ジオキシゲナーゼ ａ．活性化されていない有機基質の直接的オキシファン
クショナリゼーション(oxyfunctionalization) ｂ．アルカン、芳香族化合物、ステロイドのヒドロキシ
ル化 ｃ．アルケンのエポキシ化 ｄ．エナンチオ選択的スルフォキシド化 ｅ．位置選択的および立体選択的バイヤー−ビリガー(B
ayer-Villiger)酸化 ６．ハロペロキシダーゼ ａ．求核部位へのハロゲン化物イオンの酸化的付加 ｂ．次亜ハロゲン酸のオレフィン結合への添加 ｃ．シクロプロパンの環開裂 ｄ．オルトまたはパラ誘導体に変換された活性化芳香族
基質 ｅ．２−ハロ−誘導体に変換された1.3 ジケトン ｆ．硫黄および窒素含有基質のヘテロ原子酸化 ｇ．酢酸エノール、アルキン、および活性化芳香族環の
酸化 ７．リグニンペルオキシダーゼ／ジアリールプロパンペ
ルオキシダーゼ ａ．Ｃ−Ｃ結合の酸化的開裂 ｂ．ベンジルアルコールのアルデヒドへの酸化 ｃ．ベンジルカーボンのヒドロキシル化 ｄ．フェノール二量体化 ｅ．二重結合をヒドロキシル化して、ジオールを形成 ｆ．リグニンアルデヒドの開裂 ８．エポキシドヒドロラーゼ ａ．鏡像異性体的に純粋な生物活性化合物の合成 ｂ．エポキシドの位置選択的およびエナンチオ選択的加
水分解 ｃ．モノオキシゲナーゼにより芳香族およびオレフィン
をエポキシ化し、エポキシドを形成 ｄ．ラセミエポキシドの分割 ｅ．ステロイドエポキシドの加水分解 ９．ニトリルヒドラターゼ／ニトリラーゼ ａ．脂肪族ニトリルのカルボキシアミドへの加水分解 ｂ．芳香族、複素環式、不飽和脂肪族ニトリルの対応す
る酸への加水分解 ｃ．アクリロニトリルの加水分解 ｄ．芳香族およびカルボキシアミド、カルボン酸（ニコ
チンアミド、ピコリンアミド、イソニコチンアミド）の
生産 ｅ．アクリルジニトリルの位置選択的加水分解 ｆ．α-ヒドロキシニトリル由来のα-アミノ酸 10. トランスアミナーゼ ａ．オキソ酸へのアミノ基の転移 11. アミダーゼ／アシラーゼ ａ．アミド、アミジン、および他のＣ−Ｎ結合の加水分
解 ｂ．非天然アミノ酸の分割および合成
【０１００】
【実施例】以下の実施例は本発明を説明するものであっ
て、その範囲を限定するものではない。
て、その範囲を限定するものではない。
【０１０１】実施例１ 哺乳動物ＤＮＡライブラリーの調製 以下に、潜水調査中にSanta Catalina Basinの深さ1240
メートルで見つけたクジラの骨の外部表面サンプルから
遺伝子ライブラリーを作製するのに用いた方法の概要を
説明する。
メートルで見つけたクジラの骨の外部表面サンプルから
遺伝子ライブラリーを作製するのに用いた方法の概要を
説明する。
【０１０２】ＤＮＡの単離 製造業者の指示に従うIsoQuick法。
【０１０３】ＤＮＡの剪断 １．25G二重ハブ針および１ccシリンジにより約500回、
ＤＮＡを激しく押引する。
ＤＮＡを激しく押引する。
【０１０４】２．該ＤＮＡの大半が所望のサイズの範囲
内（約３〜６kb）であることを確認するために、0.8％
アガロースゲル上で少量（0.5μg）を調べる。
内（約３〜６kb）であることを確認するために、0.8％
アガロースゲル上で少量（0.5μg）を調べる。
【０１０５】ＤＮＡの平滑化 １．以下のものを加える： H2O 最終容量が405μlになるまで 45μl 10×Mung Bean緩衝液 2.0μl Mung Beanヌクレアーゼ（150u/μl）。
【０１０６】２．37℃で15分間インキュベートする。
【０１０７】３．フェノール／クロロホルムで１回抽出
する。
する。
【０１０８】４．クロロホルムで１回抽出する。
【０１０９】５．氷冷エタノール１mlを加えて沈殿させ
る。
る。
【０１１０】６．氷上に10分間放置する。
【０１１１】７．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心
する。
する。
【０１１２】８．70％エタノール１mlで洗浄する。
【０１１３】９．ミクロフュージ中、高速で10分間遠心
し、乾燥する。
し、乾燥する。
【０１１４】ＤＮＡのメチル化 １．ＤＮＡを26μl TEに穏やかに再懸濁する。
【０１１５】２．以下のものを加える： 4.0μl 10×EcoRIメチラーゼ緩衝液 0.5μl SAM（32mM） 5.0μl EcoRIメチラーゼ（40u/μl）。
【０１１６】３．37℃で１時間インキュベートする。
【０１１７】平滑末端の確保 １．該メチル化反応へ以下のものを加える： 5.0μl 100mM MgCl2 8.0μl dNTP混合物（dGTP、dATP、dTTP、dCTPの
それぞれの2.5mM） 4.0μl クレノウ（５u/μl） ２．12℃で30分間インキュベートする。
それぞれの2.5mM） 4.0μl クレノウ（５u/μl） ２．12℃で30分間インキュベートする。
【０１１８】３．450μl １×STEを加える。
【０１１９】４．フェノール／クロロホルムで１回抽出
する。
する。
【０１２０】５．クロロホルムで１回抽出する。
【０１２１】６．氷冷エタノール１mlを加えて沈殿さ
せ、氷上に10分間放置する。
せ、氷上に10分間放置する。
【０１２２】７．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心
する。
する。
【０１２３】８．70％エタノール１mlで洗浄する。
【０１２４】９．ミクロフュージ中、高速で10分間遠心
し、乾燥する。
し、乾燥する。
【０１２５】リンカーの連結 １．ＤＮＡをTris−EDTA（TE）７μlに穏やかに再懸濁
する。
する。
【０１２６】２．以下のものを加える： 14μl リン酸化EcoRIリンカー（200ng/μl） 3.0μl 10×連結緩衝液 3.0μl 10mM rATP 3.0μl T4 ＤＮＡリガーゼ（４Wu/μl）。
【０１２７】３．４℃で一晩インキュベートする。
【０１２８】EcoRI切断 １．連結反応を68℃で10分間加熱して失活させる。
【０１２９】２．以下のものを加える： 237.9μl H2O 30μl 10×EcoRI緩衝液 2.1μl EcoRI制限酵素（100u/μl）。
【０１３０】３．37℃で1.5時間インキュベートする。
【０１３１】４．0.5M EDTA 1.5μlを加える。
【０１３２】５．氷上に放置する。
【０１３３】ショ糖勾配（2.2ml）サイズ分画 １．サンプルを65℃に10分間加熱する。
【０１３４】２．ショ糖勾配2.2ml上に穏やかにローデ
ィングする。
ィングする。
【０１３５】３．ミニの超遠心機中、45K、20℃で４時
間遠心する（中断なし）。
間遠心する（中断なし）。
【０１３６】４．勾配管の底に20G針で穴をあけ、その
針を通してショ糖を流すことにより、画分を集める。Fa
lcon2059管内に最初の20滴を集め、ついで10個の１滴画
分（１〜10と標識）を集める。各滴は、約60μlの容量
である。
針を通してショ糖を流すことにより、画分を集める。Fa
lcon2059管内に最初の20滴を集め、ついで10個の１滴画
分（１〜10と標識）を集める。各滴は、約60μlの容量
である。
【０１３７】５．各画分５μlを0.8％アガロースゲル上
を流し、そのサイズを確認する。
を流し、そのサイズを確認する。
【０１３８】６．画分１〜４（約10〜1.5kb）をプール
し、別の管内に画分５〜７（約５〜0.5kb）をプールす
る。
し、別の管内に画分５〜７（約５〜0.5kb）をプールす
る。
【０１３９】７．氷冷エタノール１mlを加えて沈殿さ
せ、氷上に10分間放置する。
せ、氷上に10分間放置する。
【０１４０】８．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心
する。
する。
【０１４１】９．70％エタノール１mlで洗浄する。
【０１４２】10．ミクロフュージ中、高速で10分間遠心
し、乾燥する。
し、乾燥する。
【０１４３】11．それぞれをTE緩衝液10μlに再懸濁す
る。
る。
【０１４４】ラムダアームに対する試験的な連結 １．およその濃度を得るためにプレートアッセイを行な
う。臭化エチジウムを含有するアガロース上に、標準物
（既知濃度のＤＮＡサンプル）と共にサンプル0.5μlを
スポットする。紫外線中で観察し、該標準物と比較して
濃度を推定する。画分１〜４＝＞1.0μg/μl。画分５〜
７＝500ng/μl ２．以下の連結反応（５μl反応）を調製し、４℃で一
晩インキュベートする。
う。臭化エチジウムを含有するアガロース上に、標準物
（既知濃度のＤＮＡサンプル）と共にサンプル0.5μlを
スポットする。紫外線中で観察し、該標準物と比較して
濃度を推定する。画分１〜４＝＞1.0μg/μl。画分５〜
７＝500ng/μl ２．以下の連結反応（５μl反応）を調製し、４℃で一
晩インキュベートする。
【０１４５】
【表１】
【０１４６】試験パッケージおよびプレート １．製造業者のプロトコールに従い、該連結反応物をパ
ッケージングする。パッケージング抽出物当たり2.5μl
をパッケージングする（１連結当たり２抽出物）。
ッケージングする。パッケージング抽出物当たり2.5μl
をパッケージングする（１連結当たり２抽出物）。
【０１４７】２．SM緩衝液500μlでパッケージング反応
を停止し、同じ連結に由来するパッケージングをプール
する。
を停止し、同じ連結に由来するパッケージングをプール
する。
【０１４８】３．それぞれの1.0μlを適当な宿主上で力
価測定する（OD600＝1.0）［ZAPではXLI-Blue MRF、gtl
1ではY1088］。
価測定する（OD600＝1.0）［ZAPではXLI-Blue MRF、gtl
1ではY1088］。
【０１４９】200μlの宿主（mM MgSO4中）をFalcon2059
管へ加える。
管へ加える。
【０１５０】パッケージングされたファージ１μlを接
種する。
種する。
【０１５１】37℃で15分間インキュベートする。
【０１５２】約３mlの48℃の重層寒天を加える。
【０１５３】［150μlのIPTG（0.5M）および300μlのX-
GAL（350mg/ml）を含有する50mlのストック］100mmプレ
ート上にプレーティングし、37℃で一晩インキュベート
する。
GAL（350mg/ml）を含有する50mlのストック］100mmプレ
ート上にプレーティングし、37℃で一晩インキュベート
する。
【０１５４】４．効率の結果 gtl1：1.7×104個の組換え体（95％バックグラウンド） ZAP II： 4.2×104個の組換え体（66％バックグラウン
ド） ショ糖勾配および有機抽出によりＤＮＡサンプル中の混
入物は除去されたかもしれないが、該混入物が酵素反応
を阻害した可能性がある。ＤＮＡサンプルは貴重であっ
たため、クローニングのために末端を「固定（fix）」
することを試みた。
ド） ショ糖勾配および有機抽出によりＤＮＡサンプル中の混
入物は除去されたかもしれないが、該混入物が酵素反応
を阻害した可能性がある。ＤＮＡサンプルは貴重であっ
たため、クローニングのために末端を「固定（fix）」
することを試みた。
【０１５５】ＤＮＡの再平滑化 １．ラムダアームに連結しなかった残りのすべてのＤＮ
Ａ（画分１〜７）をプールし、最終容量が12μlになる
までH2Oを加える。ついで以下のものを加える： 143μl H2O 20μl 10×緩衝液２（StratageneのｃＤＮＡ S
ynthesis Kitから） 23μl 平滑化用dNTP（StratageneのｃＤＮＡ S
ynthesis Kitから） 2.0μl Pfu（StratageneのｃＤＮＡ Synthesis
Kitから） ２．72℃で30分間インキュベートする。
Ａ（画分１〜７）をプールし、最終容量が12μlになる
までH2Oを加える。ついで以下のものを加える： 143μl H2O 20μl 10×緩衝液２（StratageneのｃＤＮＡ S
ynthesis Kitから） 23μl 平滑化用dNTP（StratageneのｃＤＮＡ S
ynthesis Kitから） 2.0μl Pfu（StratageneのｃＤＮＡ Synthesis
Kitから） ２．72℃で30分間インキュベートする。
【０１５６】３．フェノール／クロロホルムで１回抽出
する。
する。
【０１５７】４．クロロホルムで１回抽出する。
【０１５８】５．３M NaOAc 20μLおよび氷冷エタノー
ル400μlを加えて沈殿させる。
ル400μlを加えて沈殿させる。
【０１５９】６．−20℃で一晩放置する。
【０１６０】７．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心
する。
する。
【０１６１】８．１mlの70％エタノールで洗浄する。
【０１６２】９．ミクロフュージ中、高速で10分間遠心
し、乾燥する。（ＤＮＡは処理の第１ラウンドで既にメ
チル化されているため、ＤＮＡのメチル化は行なわな
い） アダプター連結 １．ＤＮＡを８μlのEcoRIアダプター（Stratageneのｃ
ＤＮＡ Synthesis Kitから）に穏やかに再懸濁する。
し、乾燥する。（ＤＮＡは処理の第１ラウンドで既にメ
チル化されているため、ＤＮＡのメチル化は行なわな
い） アダプター連結 １．ＤＮＡを８μlのEcoRIアダプター（Stratageneのｃ
ＤＮＡ Synthesis Kitから）に穏やかに再懸濁する。
【０１６３】２．以下のものを加える： 1.0μl 10×連結緩衝液 1.0μl 10mM rATP 1.0μl T4 ＤＮＡリガーゼ（４Wu/μl） ３．４℃で２日間インキュベートする。（今回はアダプ
ターを使用しているため、切断はしない。その代わり
に、リン酸化が必要である） アダプターのリン酸化 １．連結反応を70℃で30分間加熱して失活させる。
ターを使用しているため、切断はしない。その代わり
に、リン酸化が必要である） アダプターのリン酸化 １．連結反応を70℃で30分間加熱して失活させる。
【０１６４】以下のものを加える： 1.0μl 10×連結緩衝液 2.0μl 10mM rATP 6.0μl H2O 1.0μl PNK（StratageneのｃＤＮＡ Synthesis
Kitから） ３．37℃で30分間インキュベートする。
Kitから） ３．37℃で30分間インキュベートする。
【０１６５】４．31μlのH2Oおよび５μlの10×STEを加
える。
える。
【０１６６】５．Sephacryl S-500スピンカラム上でサ
イズ分画する（プール画分１〜３）。
イズ分画する（プール画分１〜３）。
【０１６７】６．フェノール／クロロホルムで１回抽出
する。
する。
【０１６８】７．クロロホルムで１回抽出する。
【０１６９】８．氷冷エタノールを加えて沈殿させる。
【０１７０】９．氷上で10分間放置する。
【０１７１】10．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心
する。
する。
【０１７２】11．１mlの70％エタノールで洗浄する。
【０１７３】12．ミクロフュージ中、高速で10分間遠心
し、乾燥する。
し、乾燥する。
【０１７４】13．10.5μlのTE緩衝液に再懸濁する。プ
レートアッセイは行なわない。その代わりに、2.5μlの
ＤＮＡを使用し水を使用しないこと以外は前記のとおり
に、アームに直接連結する。
レートアッセイは行なわない。その代わりに、2.5μlの
ＤＮＡを使用し水を使用しないこと以外は前記のとおり
に、アームに直接連結する。
【０１７５】前記のとおりに、パッケージングおよび力
価測定を行なう。
価測定を行なう。
【０１７６】効率の結果： gtl1： 2.5×106個の組換え体（2.5％バックグラウン
ド） ZAP II：9.6×105個の組換え体（０％バックグラウン
ド） ライブラリーの増幅（各ライブラリーからの5.0×105個
の組換え体） １．3.0mlの宿主細胞（OD660＝1.0）を２本の50ml円錐
管へ加える。
ド） ZAP II：9.6×105個の組換え体（０％バックグラウン
ド） ライブラリーの増幅（各ライブラリーからの5.0×105個
の組換え体） １．3.0mlの宿主細胞（OD660＝1.0）を２本の50ml円錐
管へ加える。
【０１７７】２．円錐管１本当たり2.5×105 pfuを接種
する。
する。
【０１７８】３．37℃で20分間インキュベートする。
【０１７９】４．最終容量が45mlになるまで、各管へ重
層寒天を加える。
層寒天を加える。
【０１８０】５．該管を５枚の150mmプレートの全体に
プレーティングする。
プレーティングする。
【０１８１】６．プラークのサイズがピンの頭くらいの
大きさになるまで、37℃で６〜８時間インキュベートす
る。
大きさになるまで、37℃で６〜８時間インキュベートす
る。
【０１８２】７．８〜10mlのSM緩衝液で重層し、４℃で
一晩放置する（可能ならば、穏やかに振とうしなが
ら）。
一晩放置する（可能ならば、穏やかに振とうしなが
ら）。
【０１８３】ファージの収穫 １．各プレートから50ml円錐管中へSM緩衝液を注ぐこと
によりファージ懸濁液を回収する。
によりファージ懸濁液を回収する。
【０１８４】２．３mlのクロロホルムを加え、激しく振
とうし、室温で15分間インキュベートする。
とうし、室温で15分間インキュベートする。
【０１８５】３．２K rpmで10分間遠心して、細胞デブ
リを除く。
リを除く。
【０１８６】４．上清を無菌フラスコ中へ注ぎ、500μl
のクロロホルムを加える。
のクロロホルムを加える。
【０１８７】５．４℃で保存する。
【０１８８】増幅ライブラリーの力価測定 １．系列希釈を作製する。
【０１８９】10−5＝１mlのSM緩衝液中の１μlの増幅フ
ァージ 10−6＝１mlのSM緩衝液中の１μlの10−3希釈 ２．200μlの宿主（10mM MgSO4中）を２本の管へ加え
る。
ァージ 10−6＝１mlのSM緩衝液中の１μlの10−3希釈 ２．200μlの宿主（10mM MgSO4中）を２本の管へ加え
る。
【０１９０】３．一方に10μlの10−6希釈物（10−5）
を接種する。
を接種する。
【０１９１】４．もう一方に１μlの10−6希釈物（10−
6）を接種する。
6）を接種する。
【０１９２】５．37℃で15分間インキュベートする。
【０１９３】６．約３ml、48℃の重層寒天を加える。
【０１９４】［150μlのIPTG（0.5M）および375μlのX-
GAL（350mg/ml）を含有する50mlのストック］ ７．100mmプレート上でプレーティングし、37℃で一晩
インキュベートする。
GAL（350mg/ml）を含有する50mlのストック］ ７．100mmプレート上でプレーティングし、37℃で一晩
インキュベートする。
【０１９５】８．結果： gtl１： 1.7×1011/ml ZAP II： 2.0×1010/ml実施例２ ピコプランクトンゲノムＤＮＡの安定で大きな挿入ＤＮ
Ａライブラリーの構築 細胞の採集およびＤＮＡの調製 濃縮されたピコプランクトン細胞を含有するアガロース
プラグを、オレゴン州ニューポートからハワイ州ホノル
ルまでの海洋巡航で採集されたサンプルから調製した。
海水（30リットル）をNiskinボトル内に採集し、10μm
のNitrexに通してスクリーニングし、分子量30,000カッ
トオフポリスルホンフィルターに通す中空糸濾過（Amic
on DC10）により濃縮した。濃縮された細菌プランクト
ン細胞を0.22μm、47mm Duraporeフィルター上で集め、
１mlの２×STE緩衝液（１M NaCl、0.1M EDTA、10mM Tri
s(pH8.0)）に再懸濁し、最終密度を約１×1010細胞/ml
とした。該細胞懸濁液を、40℃まで冷却した１容量の１
％溶融Seaplaque LMPアガロース（FMC）と混合し、つい
で直ちに１mlシリンジ中に取った。該シリンジをパラフ
ィルムで密封し、氷上で10分間放置した。該細胞含有ア
ガロースプラグを10mlの溶解緩衝液（10mM Tris (pH8.
0)、50mM NaCl、0.1M EDTA、１％Sarkosyl、0.2％デオ
キシコール酸ナトリウム、１mg/mlリゾチーム）中に押
出し、37℃で１時間インキュベートした。ついで該アガ
ロースプラグを40mlのESP緩衝液（１％Sarkosyl、１mg/
mlプロテイナーゼ−K（0.5M EDTA中））に移し、55℃で
16時間インキュベートした。該溶液をデカントし、新鮮
なESP緩衝液で置換し、55℃でさらに１時間インキュベ
ートした。ついで該アガロースプラグを50mM EDTA中に
入れ、海洋巡航の間、船に４℃で保存した。
Ａライブラリーの構築 細胞の採集およびＤＮＡの調製 濃縮されたピコプランクトン細胞を含有するアガロース
プラグを、オレゴン州ニューポートからハワイ州ホノル
ルまでの海洋巡航で採集されたサンプルから調製した。
海水（30リットル）をNiskinボトル内に採集し、10μm
のNitrexに通してスクリーニングし、分子量30,000カッ
トオフポリスルホンフィルターに通す中空糸濾過（Amic
on DC10）により濃縮した。濃縮された細菌プランクト
ン細胞を0.22μm、47mm Duraporeフィルター上で集め、
１mlの２×STE緩衝液（１M NaCl、0.1M EDTA、10mM Tri
s(pH8.0)）に再懸濁し、最終密度を約１×1010細胞/ml
とした。該細胞懸濁液を、40℃まで冷却した１容量の１
％溶融Seaplaque LMPアガロース（FMC）と混合し、つい
で直ちに１mlシリンジ中に取った。該シリンジをパラフ
ィルムで密封し、氷上で10分間放置した。該細胞含有ア
ガロースプラグを10mlの溶解緩衝液（10mM Tris (pH8.
0)、50mM NaCl、0.1M EDTA、１％Sarkosyl、0.2％デオ
キシコール酸ナトリウム、１mg/mlリゾチーム）中に押
出し、37℃で１時間インキュベートした。ついで該アガ
ロースプラグを40mlのESP緩衝液（１％Sarkosyl、１mg/
mlプロテイナーゼ−K（0.5M EDTA中））に移し、55℃で
16時間インキュベートした。該溶液をデカントし、新鮮
なESP緩衝液で置換し、55℃でさらに１時間インキュベ
ートした。ついで該アガロースプラグを50mM EDTA中に
入れ、海洋巡航の間、船に４℃で保存した。
【０１９６】オレゴン海岸沖合いで採集したサンプルか
ら調製したアガロースプラグ（72μl）の１個の切片
を、２mlの微量遠心管中、１mlの緩衝液Ａ（100ｍＭ Na
Cl、10mM Bis Tris Propane−HCl、100μg/mlアセチル
化BSA：25℃でpH7.0）に対して４℃で一晩透析した。該
溶液を、10ｍＭ MgCl2および１mM DTTを含有する250μl
の新鮮な緩衝液Ａで置換し、振盪するプラットホーム
上、室温で１時間インキュベートした。ついで該溶液
を、４UのSau3A1（NEB）を含有する250μlの同じ緩衝液
に変え、水浴中で37℃に平衡化し、ついで振盪するプラ
ットホーム上、37℃のインキュベーター中で45分間イン
キュベートした。該プラグを1.5ml微量遠心管へ移し、6
8℃で30分間インキュベートして、該酵素を失活させ、
アガロースを溶融した。該アガロースの消化および該Ｄ
ＮＡの脱リン酸化を、それぞれ、GelaseおよびHK−ホス
ファターゼ（Epicentre）を製造業者の推奨に従い使用
して行なった。穏やかにフェノール／クロロホルムで抽
出することによりタンパク質を除去し、該ＤＮＡをエタ
ノール沈殿させ、ペレット化し、ついで70％エタノール
で洗浄した。pFOS1ベクターに連結するために、この部
分消化されたＤＮＡを2.5ng/μlの濃度になるまで無菌
水に再懸濁した。
ら調製したアガロースプラグ（72μl）の１個の切片
を、２mlの微量遠心管中、１mlの緩衝液Ａ（100ｍＭ Na
Cl、10mM Bis Tris Propane−HCl、100μg/mlアセチル
化BSA：25℃でpH7.0）に対して４℃で一晩透析した。該
溶液を、10ｍＭ MgCl2および１mM DTTを含有する250μl
の新鮮な緩衝液Ａで置換し、振盪するプラットホーム
上、室温で１時間インキュベートした。ついで該溶液
を、４UのSau3A1（NEB）を含有する250μlの同じ緩衝液
に変え、水浴中で37℃に平衡化し、ついで振盪するプラ
ットホーム上、37℃のインキュベーター中で45分間イン
キュベートした。該プラグを1.5ml微量遠心管へ移し、6
8℃で30分間インキュベートして、該酵素を失活させ、
アガロースを溶融した。該アガロースの消化および該Ｄ
ＮＡの脱リン酸化を、それぞれ、GelaseおよびHK−ホス
ファターゼ（Epicentre）を製造業者の推奨に従い使用
して行なった。穏やかにフェノール／クロロホルムで抽
出することによりタンパク質を除去し、該ＤＮＡをエタ
ノール沈殿させ、ペレット化し、ついで70％エタノール
で洗浄した。pFOS1ベクターに連結するために、この部
分消化されたＤＮＡを2.5ng/μlの濃度になるまで無菌
水に再懸濁した。
【０１９７】アガロースプラグのいくつかから得たPCR
増幅の結果（データは示していない）は、有意量の古細
菌（archaeal）ＤＮＡの存在を示した。１つのサンプル
から抽出しオレゴン海岸沖合いの深さ200mで集めたｒＲ
ＮＡを用いる定量的ハイブリダイゼーション実験は、こ
の集合体内の浮遊古細菌が、全ピコプランクトン生物量
の約4.7％を含むことを示した（このサンプルは、DeLon
gら, 南極海洋のピコプランクトン中の古細菌の高い存
在量(high abundance of Archaea in Antarctic marine
picoplankton), Nature, 371:695-698, 1994の表１中
の「PACl」−200mに対応する）。アガロースプラグライ
ゼート上で行なった古細菌偏向性（archaeal-biased）
ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅の結果から、このサンプル中に比
較的多量の古細菌ＤＮＡの存在が確認された。このピコ
プランクトンサンプルから調製したアガロースプラグ
を、後続のフォスミドライブラリーの調製のために選択
した。この部位からのそれぞれ１mlのアガロースプラグ
は、7.5×105個の細胞を含有していた。したがって、約
5.4×105個の細胞が、部分消化ＤＮＡの調製で用いた72
μlの切片中に存在していた。
増幅の結果（データは示していない）は、有意量の古細
菌（archaeal）ＤＮＡの存在を示した。１つのサンプル
から抽出しオレゴン海岸沖合いの深さ200mで集めたｒＲ
ＮＡを用いる定量的ハイブリダイゼーション実験は、こ
の集合体内の浮遊古細菌が、全ピコプランクトン生物量
の約4.7％を含むことを示した（このサンプルは、DeLon
gら, 南極海洋のピコプランクトン中の古細菌の高い存
在量(high abundance of Archaea in Antarctic marine
picoplankton), Nature, 371:695-698, 1994の表１中
の「PACl」−200mに対応する）。アガロースプラグライ
ゼート上で行なった古細菌偏向性（archaeal-biased）
ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅の結果から、このサンプル中に比
較的多量の古細菌ＤＮＡの存在が確認された。このピコ
プランクトンサンプルから調製したアガロースプラグ
を、後続のフォスミドライブラリーの調製のために選択
した。この部位からのそれぞれ１mlのアガロースプラグ
は、7.5×105個の細胞を含有していた。したがって、約
5.4×105個の細胞が、部分消化ＤＮＡの調製で用いた72
μlの切片中に存在していた。
【０１９８】ベクターアームは、文献記載（Kimら, Ｆ
因子に基づくベクター中のカスミドサイズのヒトＤＮＡ
挿入断片の安定な増殖(Stable propagation of casmid
sized human DNA inserts in an F factor based vecto
r), Nucl. Acids Res., 20:10832-10835, 1992）のとお
りpFOS1から調製した。簡単に言えば、該プラスミドをA
stIIで完全に消化し、HKホスファターゼで脱リン酸化
し、ついでBamHIで消化して、２つのアーム（それらは
それぞれ、35〜45kbpの連結ＤＮＡのクローニングおよ
びパッケージングのための適切な配向でcos部位を含有
していた）を得た。部分消化されたピコプランクトンＤ
ＮＡを、ベクターおよび挿入断片（それぞれ25ng）およ
び１UのT4 ＤＮＡリガーゼ（Boehringer-Mannheim）を
含有する15μl連結反応中、PFOS1アームに一晩連結し
た。４μlのこの反応液中の連結ＤＮＡを、Gigapack XL
パッケージング系（Stratagene）を用いてin vitroパッ
ケージングし、該フォスミド粒子を大腸菌（E. coli）D
H10B株（BRL）にトランスフェクトし、該細胞をLBcm15
プレート上に広げた。得られたフォスミドクローンを、
７％グリセロールが補充されたLBcm15を含有する96ウェ
ルマイクロタイター皿内に拾い入れた。ピコプランクト
ンＤＮＡ挿入断片の約40kbをそれぞれが含有する組換え
フォスミドは、クローン化ＤＮＡの約1.4×108塩基対を
含有する3,552個のフォスミドクローンのライブラリー
を与えた。調べたクローンはすべて、38〜42kbpの範囲
の挿入断片を含有していた。このライブラリーは、後の
分析のために、−80℃で凍結保存した。
因子に基づくベクター中のカスミドサイズのヒトＤＮＡ
挿入断片の安定な増殖(Stable propagation of casmid
sized human DNA inserts in an F factor based vecto
r), Nucl. Acids Res., 20:10832-10835, 1992）のとお
りpFOS1から調製した。簡単に言えば、該プラスミドをA
stIIで完全に消化し、HKホスファターゼで脱リン酸化
し、ついでBamHIで消化して、２つのアーム（それらは
それぞれ、35〜45kbpの連結ＤＮＡのクローニングおよ
びパッケージングのための適切な配向でcos部位を含有
していた）を得た。部分消化されたピコプランクトンＤ
ＮＡを、ベクターおよび挿入断片（それぞれ25ng）およ
び１UのT4 ＤＮＡリガーゼ（Boehringer-Mannheim）を
含有する15μl連結反応中、PFOS1アームに一晩連結し
た。４μlのこの反応液中の連結ＤＮＡを、Gigapack XL
パッケージング系（Stratagene）を用いてin vitroパッ
ケージングし、該フォスミド粒子を大腸菌（E. coli）D
H10B株（BRL）にトランスフェクトし、該細胞をLBcm15
プレート上に広げた。得られたフォスミドクローンを、
７％グリセロールが補充されたLBcm15を含有する96ウェ
ルマイクロタイター皿内に拾い入れた。ピコプランクト
ンＤＮＡ挿入断片の約40kbをそれぞれが含有する組換え
フォスミドは、クローン化ＤＮＡの約1.4×108塩基対を
含有する3,552個のフォスミドクローンのライブラリー
を与えた。調べたクローンはすべて、38〜42kbpの範囲
の挿入断片を含有していた。このライブラリーは、後の
分析のために、−80℃で凍結保存した。
【０１９９】実施例３ ハイブリダイゼーション選択および発現ライブラリーの
作製 実施例１に記載のとおりに調製したプラスミドライブラ
リーから出発して、本実施例に記載のプロトコールに従
いハイブリダイゼーション選択および発現ライブラリー
の調製を行なった。該ライブラリーは、単離された微生
物、富化培養物または環境サンプルからのＤＮＡを含有
し得る。
作製 実施例１に記載のとおりに調製したプラスミドライブラ
リーから出発して、本実施例に記載のプロトコールに従
いハイブリダイゼーション選択および発現ライブラリー
の調製を行なった。該ライブラリーは、単離された微生
物、富化培養物または環境サンプルからのＤＮＡを含有
し得る。
【０２００】一本鎖ＤＮＡは、以下の２つの方法のうち
の１つにより作製する。１）該プラスミドライブラリー
を増殖させ、二本鎖プラスミドＤＮＡを単離することが
できる。F1遺伝子IIタンパク質およびエキソヌクレアー
ゼIIIを用いて、該二本鎖ＤＮＡを一本鎖にする。遺伝
子IIタンパク質はF1起点で二本鎖プラスミドに切れ目を
入れ、ExoIIIは、その切れ目が入った鎖を消化除去し
て、一本鎖環を与える。この方法は、Life Technologie
sのGeneTrapperTMキットで用いられている。２）第２の
方法は、二本鎖プラスミドの鎖の１つを「レスキュー」
するためにヘルパーファージを使用することを含む。該
プラスミドライブラリーを、一晩小培養により増殖させ
る。これの小さなアリコートをVCS-M13ヘルパーファー
ジと混合し、再び一晩増殖させる。翌朝、該ファージミ
ド（一本鎖ＤＮＡを含有するウイルス粒子）を培地から
回収し、以下のプロトコールで使用する。 プロトコール １．ライブラリー#17からのレスキューされた一本鎖Ｄ
ＮＡ４μgの６個のサンプルを、３×SSC緩衝液中で調製
した。最終反応容量は30μlであった。
の１つにより作製する。１）該プラスミドライブラリー
を増殖させ、二本鎖プラスミドＤＮＡを単離することが
できる。F1遺伝子IIタンパク質およびエキソヌクレアー
ゼIIIを用いて、該二本鎖ＤＮＡを一本鎖にする。遺伝
子IIタンパク質はF1起点で二本鎖プラスミドに切れ目を
入れ、ExoIIIは、その切れ目が入った鎖を消化除去し
て、一本鎖環を与える。この方法は、Life Technologie
sのGeneTrapperTMキットで用いられている。２）第２の
方法は、二本鎖プラスミドの鎖の１つを「レスキュー」
するためにヘルパーファージを使用することを含む。該
プラスミドライブラリーを、一晩小培養により増殖させ
る。これの小さなアリコートをVCS-M13ヘルパーファー
ジと混合し、再び一晩増殖させる。翌朝、該ファージミ
ド（一本鎖ＤＮＡを含有するウイルス粒子）を培地から
回収し、以下のプロトコールで使用する。 プロトコール １．ライブラリー#17からのレスキューされた一本鎖Ｄ
ＮＡ４μgの６個のサンプルを、３×SSC緩衝液中で調製
した。最終反応容量は30μlであった。
【０２０１】２．これらの溶液へ、以下のうちの１つを
加えた。
加えた。
【０２０２】a）何も加えない b）無関係な配列からのビオチン化プローブ100ng c, d）生物#13 ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子からのビオチ
ン化プローブ100ng e, f）生物#17 ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子からのビオチ
ン化プローブ100ng これらの生物のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の一部をコー
ドする約1300bp長の断片のPCR増幅により、ビオチン化
プローブを調製した。該増幅産物は、増幅混合物中でビ
オチン化dUTPを使用して得た。合成中に、この修飾ヌク
レオチドをＤＮＡの全体に取込ませる。QIAGEN PCR Cle
an-upキットを使用して、未取込みのヌクレオチドを除
去した。
ン化プローブ100ng e, f）生物#17 ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子からのビオチ
ン化プローブ100ng これらの生物のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の一部をコー
ドする約1300bp長の断片のPCR増幅により、ビオチン化
プローブを調製した。該増幅産物は、増幅混合物中でビ
オチン化dUTPを使用して得た。合成中に、この修飾ヌク
レオチドをＤＮＡの全体に取込ませる。QIAGEN PCR Cle
an-upキットを使用して、未取込みのヌクレオチドを除
去した。
【０２０３】３．95℃まで２分間加熱することにより、
これらの混合物を変性させた。
これらの混合物を変性させた。
【０２０４】４．サンプルa、b、dおよびfについては70
℃で90分間のハイブリダイゼーションを行なった。サン
プルcおよびeは60℃でハイブリダイズさせた。
℃で90分間のハイブリダイゼーションを行なった。サン
プルcおよびeは60℃でハイブリダイズさせた。
【０２０５】５．洗浄しブロッキングしたMPGビーズの5
0μlを加え、各サンプルと混合した。これらの混合物を
５分毎に合計30分間攪拌した。保存剤を含有する緩衝液
中でMPGビーズを１mg/mlで送って、100μlの６セットを
３×SSC中で２回洗浄し、超音波処理されたサケ精子Ｄ
ＮＡの100μgを含有する３×SSCの60μlに再懸濁した。
0μlを加え、各サンプルと混合した。これらの混合物を
５分毎に合計30分間攪拌した。保存剤を含有する緩衝液
中でMPGビーズを１mg/mlで送って、100μlの６セットを
３×SSC中で２回洗浄し、超音波処理されたサケ精子Ｄ
ＮＡの100μgを含有する３×SSCの60μlに再懸濁した。
【０２０６】６．該ＤＮＡ／ビーズ混合物を0.1×SSC／
0.1％ SDS中室温で２回、0.1×SSC／0.1％ SDS中42℃で
２回、それぞれ10分間洗浄し、さらに３×SSCで室温で
洗浄した。
0.1％ SDS中室温で２回、0.1×SSC／0.1％ SDS中42℃で
２回、それぞれ10分間洗浄し、さらに３×SSCで室温で
洗浄した。
【０２０７】７．該ビーズを50μl TE中で70℃まで15分
間加熱することにより、該結合ＤＮＡを溶出した。
間加熱することにより、該結合ＤＮＡを溶出した。
【０２０８】８．溶出したＤＮＡを希釈し、遺伝子特異
的プライマーまたはベクター特異的プライマーのいずれ
かを使用してPCR増幅を行なった。該ライブラリーＤＮ
Ａの希釈物を標準として使用した。
的プライマーまたはベクター特異的プライマーのいずれ
かを使用してPCR増幅を行なった。該ライブラリーＤＮ
Ａの希釈物を標準として使用した。
【０２０９】９．該ＤＮＡ内に含有されているＤＮＡ挿
入断片を、ベクター特異的プライマーを使用するPCRに
より増幅した。TAクローニング系（Invitrogen）を使用
して、これらの挿入断片をクローニングした。
入断片を、ベクター特異的プライマーを使用するPCRに
より増幅した。TAクローニング系（Invitrogen）を使用
して、これらの挿入断片をクローニングした。
【０２１０】10．サンプルdおよびfからの92個の白色コ
ロニーおよび４個の青色コロニーの重複体を一晩増殖さ
せ、サザンブロット用にコロニーリフト（colony lif
t）を調製した。
ロニーおよび４個の青色コロニーの重複体を一晩増殖さ
せ、サザンブロット用にコロニーリフト（colony lif
t）を調製した。
【０２１１】11．生物#17プローブを使用してコロニー
をプローブするために、BoehringerMannheimからのジゴ
キシゲニン系を使用した。
をプローブするために、BoehringerMannheimからのジゴ
キシゲニン系を使用した。
【０２１２】結果 PCR定量 図1Aおよび1B。図1Aは、遺伝子特異的プライマーとハイ
ブリダイズさせた場合に、実施例２のサンプル溶液a〜f
からのＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションアガロー
スゲル電気泳動カラムから得たオートラジオグラムの写
真である。図1Bは、ベクター特異的プライマーとハイブ
リダイズさせた場合に、実施例２のサンプル溶液a〜fか
らのＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションアガロース
ゲル電気泳動カラムから得たオートラジオグラムの写真
である。
ブリダイズさせた場合に、実施例２のサンプル溶液a〜f
からのＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションアガロー
スゲル電気泳動カラムから得たオートラジオグラムの写
真である。図1Bは、ベクター特異的プライマーとハイブ
リダイズさせた場合に、実施例２のサンプル溶液a〜fか
らのＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションアガロース
ゲル電気泳動カラムから得たオートラジオグラムの写真
である。
【０２１３】サンプルaおよびbの遺伝子特異的ＤＮＡ増
幅は、該ビーズに対する非特異的結合が最小であること
を示している。他の条件下で結合したＤＮＡの量から、
以下のとおり富化が推定される。
幅は、該ビーズに対する非特異的結合が最小であること
を示している。他の条件下で結合したＤＮＡの量から、
以下のとおり富化が推定される。
【０２１４】 遺伝子特異的当量 合計 富化 c 50ng 100pg 500× d 50ng 30pg 1667× e 20ng 50pg 400× f 20ng 20pg 1000× コロニーハイブリダイゼーション 図２は、陽性クローン（すなわち該プローブ中に含有さ
れている配列を含有し、本発明に従い調製したライブラ
リーからのＤＮＡを含有するコロニー）を示すプレート
AおよびBから得た４個のコロニーハイブリダイゼーショ
ンプレートの写真である。
れている配列を含有し、本発明に従い調製したライブラ
リーからのＤＮＡを含有するコロニー）を示すプレート
AおよびBから得た４個のコロニーハイブリダイゼーショ
ンプレートの写真である。
【０２１５】プレートCおよびDは対照であり、陽性クロ
ーンを示さなかった。
ーンを示さなかった。
【０２１６】パニングされたサンプルからの92個のコロ
ニーのうちの7個が、該プローブ中に含まれる配列に関
して陽性であった。パニングされていないサンプル中に
陽性クローンは見出されなかった。
ニーのうちの7個が、該プローブ中に含まれる配列に関
して陽性であった。パニングされていないサンプル中に
陽性クローンは見出されなかった。
【０２１７】実施例４ 酵素活性アッセイ 以下は、実施例１に従い調製した発現ライブラリーをヒ
ドロラーゼ活性に関してスクリーニングする方法の代表
的な実施例である。
ドロラーゼ活性に関してスクリーニングする方法の代表
的な実施例である。
【０２１８】実施例１に記載のとおりに調製したライブ
ラリーのプレートを使用して、各ウェル内に200μLのLB
Amp/Meth,グリセロールを含有する単一のプレートに複
数接種する。この工程は、１％漂白剤、水、イソプロパ
ノール、各接種間の風乾滅菌サイクルを含むBeckman Bi
omekのHigh Density Replicating Tool（HDRT）を用い
て行なう。該単一プレートを37℃で２時間増殖させ、つ
いで、各ウェル内に250μLのLB Amp/Meth,グリセロール
を含有する２個の白色の96ウェルDynatechマイクロタイ
ター娘プレートに接種するのに使用する。もとの単一プ
レートを37℃で18時間インキュベートし、ついで−80℃
で保存する。その２個の濃縮娘プレートも、37℃で18時
間インキュベートする。ついで該濃縮娘プレートを70℃
で45分間加熱して細胞を殺し、宿主大腸菌（E. coli）
酵素を失活させる。DMSO中５mg/ｍLのモルホウレア フ
ェニルアラニル−7−アミノ−4−トリフルオロメチルク
マリン（MuPheAFC、「基質」）のストック溶液を、界面
活性剤であるドデシルマルトシドの0.6mg/mLを含有する
50ｍM（pH7.5）Hepes緩衝液で600μMになるまで希釈す
る。
ラリーのプレートを使用して、各ウェル内に200μLのLB
Amp/Meth,グリセロールを含有する単一のプレートに複
数接種する。この工程は、１％漂白剤、水、イソプロパ
ノール、各接種間の風乾滅菌サイクルを含むBeckman Bi
omekのHigh Density Replicating Tool（HDRT）を用い
て行なう。該単一プレートを37℃で２時間増殖させ、つ
いで、各ウェル内に250μLのLB Amp/Meth,グリセロール
を含有する２個の白色の96ウェルDynatechマイクロタイ
ター娘プレートに接種するのに使用する。もとの単一プ
レートを37℃で18時間インキュベートし、ついで−80℃
で保存する。その２個の濃縮娘プレートも、37℃で18時
間インキュベートする。ついで該濃縮娘プレートを70℃
で45分間加熱して細胞を殺し、宿主大腸菌（E. coli）
酵素を失活させる。DMSO中５mg/ｍLのモルホウレア フ
ェニルアラニル−7−アミノ−4−トリフルオロメチルク
マリン（MuPheAFC、「基質」）のストック溶液を、界面
活性剤であるドデシルマルトシドの0.6mg/mLを含有する
50ｍM（pH7.5）Hepes緩衝液で600μMになるまで希釈す
る。
【０２１９】MuPheAFC 600μM MuPheAFC溶液の50μLを、Biomekを用いる単一の
100μL混合サイクルで白色の濃縮プレートの各ウェルへ
加えて、基質の最終濃度を約100μMとする。基質の添加
直後に（t＝０）、プレート読み取り蛍光光度計上で蛍
光値を記録する（励起＝400nm、発光＝505nm）。該プレ
ートを70℃で100分間インキュベートし、ついでさらに1
5分間、室温度にまで冷却する。該蛍光値を再び記録す
る（t＝100）。t＝100での値からt＝０での値を引き算
して、活性クローンが存在するか否かを判定する。
100μL混合サイクルで白色の濃縮プレートの各ウェルへ
加えて、基質の最終濃度を約100μMとする。基質の添加
直後に（t＝０）、プレート読み取り蛍光光度計上で蛍
光値を記録する（励起＝400nm、発光＝505nm）。該プレ
ートを70℃で100分間インキュベートし、ついでさらに1
5分間、室温度にまで冷却する。該蛍光値を再び記録す
る（t＝100）。t＝100での値からt＝０での値を引き算
して、活性クローンが存在するか否かを判定する。
【０２２０】これらのデータは、ある特定のウェル中の
クローンの１つが該基質を加水分解しているかどうかを
示すであろう。該活性を保持する個々のクローンを確認
するために、その起源ライブラリープレートを解凍し、
個々のクローンを用いて、LBAmp/Meth,グリセロールを
含有する新たなプレートに１つずつ接種する。前記のと
おり、該細胞を増殖させるために該プレートを37℃でイ
ンキュベートし、宿主酵素を失活させるために70℃で加
熱し、600μM MuPheAFCの50μLを、Biomekを用いて加え
る。
クローンの１つが該基質を加水分解しているかどうかを
示すであろう。該活性を保持する個々のクローンを確認
するために、その起源ライブラリープレートを解凍し、
個々のクローンを用いて、LBAmp/Meth,グリセロールを
含有する新たなプレートに１つずつ接種する。前記のと
おり、該細胞を増殖させるために該プレートを37℃でイ
ンキュベートし、宿主酵素を失活させるために70℃で加
熱し、600μM MuPheAFCの50μLを、Biomekを用いて加え
る。
【０２２１】該基質を加えた後、t＝０の蛍光値を記録
し、該プレートを70℃でインキュベートし、t＝100分の
値を前記のとおり記録する。これらのデータは、該活性
クローンがどのプレート中に存在するかを示すであろ
う。
し、該プレートを70℃でインキュベートし、t＝100分の
値を前記のとおり記録する。これらのデータは、該活性
クローンがどのプレート中に存在するかを示すであろ
う。
【０２２２】該基質に関するエナンチオ選択性の値
（Ｅ）を以下の式から求める： E=ln[(1−c(1+eep)]／ln[(1−c(1−eep)] ［式中、eepは加水分解生成物のエナンチオマー過剰率
（ee）であり、cは反応の変換率（％）である］。Wong
およびWhitesides, Enzymes in Synthetic OrganicChem
istry, 1994, Elsevier, Tarrytown, New York, p. 9-1
2を参照のこと。
（Ｅ）を以下の式から求める： E=ln[(1−c(1+eep)]／ln[(1−c(1−eep)] ［式中、eepは加水分解生成物のエナンチオマー過剰率
（ee）であり、cは反応の変換率（％）である］。Wong
およびWhitesides, Enzymes in Synthetic OrganicChem
istry, 1994, Elsevier, Tarrytown, New York, p. 9-1
2を参照のこと。
【０２２３】エナンチオマー過剰率は、キラル高速液体
クロマトグラフィー（HPLC）またはキラルキャピラリー
電気泳動（CE）のいずれかにより測定する。アッセイ
は、以下のとおり行なう。200μLの適当な緩衝液、つい
で50μLの部分精製または完全精製された酵素溶液を、9
6ウェルの白色のマイクロタイタープレートの各ウェル
に加え、50μLの基質を加え、該基質の50％が消費され
るか反応が停止するかのいずれかが最初に生じるまで、
蛍光の増加を時間に対してモニターする。
クロマトグラフィー（HPLC）またはキラルキャピラリー
電気泳動（CE）のいずれかにより測定する。アッセイ
は、以下のとおり行なう。200μLの適当な緩衝液、つい
で50μLの部分精製または完全精製された酵素溶液を、9
6ウェルの白色のマイクロタイタープレートの各ウェル
に加え、50μLの基質を加え、該基質の50％が消費され
るか反応が停止するかのいずれかが最初に生じるまで、
蛍光の増加を時間に対してモニターする。
【０２２４】実施例５ 陽性酵素活性クローンの突然変異誘発 ここに記載する２つの異なる戦略を用いて２つの異なる
酵素（アルカリホスファターゼおよびβ−グリコシダー
ゼ）上で突然変異誘発を行って、野生型酵素より高い活
性度を示す新規酵素を製造した。
酵素（アルカリホスファターゼおよびβ−グリコシダー
ゼ）上で突然変異誘発を行って、野生型酵素より高い活
性度を示す新規酵素を製造した。
【０２２５】アルカリホスファターゼ 製造業者のプロトコールに従い、生物OC9aからのアルカ
リホスファターゼ遺伝子をコードするゲノムクローン27
a3a（プラスミドpBluescript中）でXL1-Red株（Stratag
ene）を形質転換した。LB＋0.1mg/mlアンピシリンの培
養液５mlに該形質転換体200μlを接種した。該培養物を
37℃で30時間増殖させた。ついで該培養上でミニプレッ
プを行ない、製造業者のプロトコールおよび以下に概要
を示す方法（「XL1 Blue細胞の形質転換」の後）に従
い、得られたＤＮＡ２μlをXL-1 Blue細胞（Stratagen
e）中に形質転換することによりスクリーニングを行な
った。スクリーニングアッセイにおいて、突然変異した
OC9aホスファターゼは発色に10分を要し、野生型酵素は
発色に30分を要した。標準的なアルカリホスファターゼスクリーニングアッセ
イ XL1 Red株の形質転換→LB/amp培養液５mlに形質転換体2
00μlを接種し、37℃で30時間インキュベートする→Ｄ
ＮＡのミニプレップ→XL1 Blue細胞の形質転換→LB/amp
プレート上でのプレーティング→Duralon UV（Stratage
ne）またはHATF（Millipore）メンブレンによるコロニ
ーのリフト→クロロホルム蒸気中での30秒間の溶菌→85
℃で30分間の加熱殺菌→BCIP緩衝液中室温でのフィルタ
ーの現像→フィルターが現像されるにつれて観察し、最
も早く現像するコロニー（「陽性体」）を同定し拾う→
BCIPプレート上に「陽性体」を再びストリークする。BCIP緩衝液： 20mm CAPS pH9.0 １mm MgCl2 0.01mm ZnCl2 0.1mg/ml BCIPβ−グリコシダーゼ このプロトコールを用いて、サーモコッカス（Thermoco
ccus）9N2 β−グリコシダーゼを突然変異誘発させた。PCR反応 ２マイクロリットルのdNTP（10mMストック） 10マイクロリットルの10×PCR緩衝液 0.5マイクロリットルのベクターＤＮＡ−31GIA−100ナ
ノグラム 20マイクロリットルの3'プライマー（100pmol） 20マイクロリットルの5'プライマー（100pmol） 16マイクロリットルのMnCl 4H2O（1.25mMストック） 24.5マイクロリットルのH2O １マイクロリットルのTaqポリメラーゼ（5.0単位） 合計100マイクロリットル反応サイクル 95℃で15秒間 58℃で30秒間 72℃で90秒間 25サイクル（72℃〜４℃で10分の延長インキュベーショ
ン） １％アガロースゲル上で５マイクロリットルを流し、反
応を調べる。
リホスファターゼ遺伝子をコードするゲノムクローン27
a3a（プラスミドpBluescript中）でXL1-Red株（Stratag
ene）を形質転換した。LB＋0.1mg/mlアンピシリンの培
養液５mlに該形質転換体200μlを接種した。該培養物を
37℃で30時間増殖させた。ついで該培養上でミニプレッ
プを行ない、製造業者のプロトコールおよび以下に概要
を示す方法（「XL1 Blue細胞の形質転換」の後）に従
い、得られたＤＮＡ２μlをXL-1 Blue細胞（Stratagen
e）中に形質転換することによりスクリーニングを行な
った。スクリーニングアッセイにおいて、突然変異した
OC9aホスファターゼは発色に10分を要し、野生型酵素は
発色に30分を要した。標準的なアルカリホスファターゼスクリーニングアッセ
イ XL1 Red株の形質転換→LB/amp培養液５mlに形質転換体2
00μlを接種し、37℃で30時間インキュベートする→Ｄ
ＮＡのミニプレップ→XL1 Blue細胞の形質転換→LB/amp
プレート上でのプレーティング→Duralon UV（Stratage
ne）またはHATF（Millipore）メンブレンによるコロニ
ーのリフト→クロロホルム蒸気中での30秒間の溶菌→85
℃で30分間の加熱殺菌→BCIP緩衝液中室温でのフィルタ
ーの現像→フィルターが現像されるにつれて観察し、最
も早く現像するコロニー（「陽性体」）を同定し拾う→
BCIPプレート上に「陽性体」を再びストリークする。BCIP緩衝液： 20mm CAPS pH9.0 １mm MgCl2 0.01mm ZnCl2 0.1mg/ml BCIPβ−グリコシダーゼ このプロトコールを用いて、サーモコッカス（Thermoco
ccus）9N2 β−グリコシダーゼを突然変異誘発させた。PCR反応 ２マイクロリットルのdNTP（10mMストック） 10マイクロリットルの10×PCR緩衝液 0.5マイクロリットルのベクターＤＮＡ−31GIA−100ナ
ノグラム 20マイクロリットルの3'プライマー（100pmol） 20マイクロリットルの5'プライマー（100pmol） 16マイクロリットルのMnCl 4H2O（1.25mMストック） 24.5マイクロリットルのH2O １マイクロリットルのTaqポリメラーゼ（5.0単位） 合計100マイクロリットル反応サイクル 95℃で15秒間 58℃で30秒間 72℃で90秒間 25サイクル（72℃〜４℃で10分の延長インキュベーショ
ン） １％アガロースゲル上で５マイクロリットルを流し、反
応を調べる。
【０２２６】Qiaquickカラム（Qiagen）上で精製する。
【０２２７】50マイクロリットルのH2Oに再懸濁する。制限消化 25マイクロリットルの精製されたPCR産物 10マイクロリットルのNEB緩衝液#2 ３マイクロリットルのKpnI（10U/マイクロリットル） ３マイクロリットルEcoRI（20U/マイクロリットル） 59マイクロリットルのH2O 37℃で２時間切断する。
【０２２８】Qiaquickカラム（Qiagen）上で精製する。
【０２２９】35マイクロリットルのH2Oで溶出する。連結反応 10マイクロリットルの消化されたPCR産物 ５マイクロリットルのベクター（EcoRI/KpnIで切断し、
シュリンプアルカリホスファターゼでホスファターゼ処
理したもの） ４マイクロリットルの５×連結緩衝液 １マイクロリットルのT4 ＤＮＡリガーゼ（BRL） 一晩連結させる。
シュリンプアルカリホスファターゼでホスファターゼ処
理したもの） ４マイクロリットルの５×連結緩衝液 １マイクロリットルのT4 ＤＮＡリガーゼ（BRL） 一晩連結させる。
【０２３０】エレクトロポレーションによりM15pREP4細
胞中に形質転換する。
胞中に形質転換する。
【０２３１】100または200マイクロリットルをLB amp m
eth kanプレート上にプレーティングし、摂氏37℃で一
晩増殖させる。β−グリコシダーゼアッセイ 以下のとおりに突然変異体に関してスクリーニングする
ためにグリコシダーゼアッセイを行なう。該フィルター
アッセイには、基質5−ブロモ−4−クロロ−3−インド
リル−β−o−グルコピラノシド（XGLU）（Diagnostic
Chemicals LimitedまたはSigma）の１mg/mlを含有する
緩衝液Z（後記の調製法を参照されたい）を使用する。Z−緩衝液： （Miller, J.H. (1992) A Short Course in
Bacterial Genetics, p.445を参照のこと） １リットル当たり： Na2HPO4−7H2O 16.1g NaH2PO4−H2O 5.5g KCl 0.75g MgSO4−7H2O 0.246g β−メルカプトエタノール 2.7ml pHを7.0に調整する （１）Millipore HATFメンブレンフィルターを使用して
コロニーリフトを行なう。
eth kanプレート上にプレーティングし、摂氏37℃で一
晩増殖させる。β−グリコシダーゼアッセイ 以下のとおりに突然変異体に関してスクリーニングする
ためにグリコシダーゼアッセイを行なう。該フィルター
アッセイには、基質5−ブロモ−4−クロロ−3−インド
リル−β−o−グルコピラノシド（XGLU）（Diagnostic
Chemicals LimitedまたはSigma）の１mg/mlを含有する
緩衝液Z（後記の調製法を参照されたい）を使用する。Z−緩衝液： （Miller, J.H. (1992) A Short Course in
Bacterial Genetics, p.445を参照のこと） １リットル当たり： Na2HPO4−7H2O 16.1g NaH2PO4−H2O 5.5g KCl 0.75g MgSO4−7H2O 0.246g β−メルカプトエタノール 2.7ml pHを7.0に調整する （１）Millipore HATFメンブレンフィルターを使用して
コロニーリフトを行なう。
【０２３２】（２）150mmガラスペトリ皿中でクロロホ
ルム蒸気でコロニーを溶菌する。
ルム蒸気でコロニーを溶菌する。
【０２３３】（３）１mg/ml XGLUを含有するZ緩衝液で
飽和したWhatman 3MM濾紙１枚を含有する100mmガラスペ
トリ皿へフィルターをトランスファーする。溶菌コロニ
ーを担持するフィルターを該ガラスペトリ皿へトランス
ファーした後、皿を室温で維持する。
飽和したWhatman 3MM濾紙１枚を含有する100mmガラスペ
トリ皿へフィルターをトランスファーする。溶菌コロニ
ーを担持するフィルターを該ガラスペトリ皿へトランス
ファーした後、皿を室温で維持する。
【０２３４】（４）フィルターメンブレン上で「陽性
体」が青色の斑点として観察された（「陽性体」は、早
期に出現する斑点である）。以下のフィルターレスキュ
ー法により、溶菌された陽性コロニーからプラスミドを
回収する。パスツールピペット（またはガラス毛細管）
を使用して、該フィルターメンブレン上の青色斑点の中
心部を抜き取る。小さなフィルターディスクを、20μl
の水を含有するEpp管に入れる。該Epp管を75℃で５分間
インキュベートし、ついでボルテックスしてプラスミド
ＤＮＡをフィルターから溶出させる。このＤＮＡをエレ
クトロコンピテント（electrocompetent）大腸菌（E. c
oli）細胞中に形質転換する。形質転換プレート上でフ
ィルター−リフトアッセイを繰り返して、「陽性体」を
同定する。フィルターリフトの後、形質転換プレートを
37℃のインキュベーターへ戻して、コロニーを再生させ
る。再精製した陽性体を３mlのLBamp液に接種し、37℃
で一晩インキュベートする。これらの培養物からプラス
ミドＤＮＡを単離し、プラスミド挿入断片を配列決定す
る。
体」が青色の斑点として観察された（「陽性体」は、早
期に出現する斑点である）。以下のフィルターレスキュ
ー法により、溶菌された陽性コロニーからプラスミドを
回収する。パスツールピペット（またはガラス毛細管）
を使用して、該フィルターメンブレン上の青色斑点の中
心部を抜き取る。小さなフィルターディスクを、20μl
の水を含有するEpp管に入れる。該Epp管を75℃で５分間
インキュベートし、ついでボルテックスしてプラスミド
ＤＮＡをフィルターから溶出させる。このＤＮＡをエレ
クトロコンピテント（electrocompetent）大腸菌（E. c
oli）細胞中に形質転換する。形質転換プレート上でフ
ィルター−リフトアッセイを繰り返して、「陽性体」を
同定する。フィルターリフトの後、形質転換プレートを
37℃のインキュベーターへ戻して、コロニーを再生させ
る。再精製した陽性体を３mlのLBamp液に接種し、37℃
で一晩インキュベートする。これらの培養物からプラス
ミドＤＮＡを単離し、プラスミド挿入断片を配列決定す
る。
【０２３５】実施例７ 陽性酵素活性クローンの定方向突然変異誘発 ここに記載する２つの異なる戦略を用いて２つの異なる
酵素（アルカリホスファターゼおよびβ−グリコシダー
ゼ）上で定方向突然変異誘発を行って、野生型酵素より
高い活性度をより低温で示す新規酵素を製造した。
酵素（アルカリホスファターゼおよびβ−グリコシダー
ゼ）上で定方向突然変異誘発を行って、野生型酵素より
高い活性度をより低温で示す新規酵素を製造した。
【０２３６】アルカリホスファターゼ 製造業者のプロトコールに従い、生物OC9aからのアルカ
リホスファターゼをコードするＤＮＡ（プラスミドpBlu
escript中）でXL1-Red株（Stratagene）を形質転換し
た。LB＋0.1mg/mlアンピシリンの培養液５mlに該形質転
換体200μlを接種した。該培養物を37℃で30時間増殖さ
せた。ついで該培養上でミニプレップを行ない、製造業
者のプロトコールに従い、得られたＤＮＡ２μlをXL-1
Blue細胞（Stratagene）中に形質転換することによりス
クリーニングを行なった。標準的なアルカリホスファターゼスクリーニングアッセ
イ →LB/ampプレート上でのプレーティング→Duralon UV
（Stratagene）またはHATF（Millipore）メンブレンに
よるコロニーのリフト→クロロホルム蒸気中での30秒間
の溶菌→85℃で30分間の加熱殺菌→BCIP緩衝液中室温で
のフィルターの現像→フィルターが現像されるにつれて
観察し、最も早く現像されるコロニー（陽性体）を同定
し拾う→BCIPプレート上に「陽性体」を再びストリーク
する。BCIP緩衝液： 20mm CAPS pH9.0 １mm MgCl2 0.01mm ZnCl2 0.1mg/ml BCIP スクリーニングアッセイにおいて、突然変異したOC9aホ
スファターゼは発色に10分を要し、野生型酵素は発色に
30分を要した。
リホスファターゼをコードするＤＮＡ（プラスミドpBlu
escript中）でXL1-Red株（Stratagene）を形質転換し
た。LB＋0.1mg/mlアンピシリンの培養液５mlに該形質転
換体200μlを接種した。該培養物を37℃で30時間増殖さ
せた。ついで該培養上でミニプレップを行ない、製造業
者のプロトコールに従い、得られたＤＮＡ２μlをXL-1
Blue細胞（Stratagene）中に形質転換することによりス
クリーニングを行なった。標準的なアルカリホスファターゼスクリーニングアッセ
イ →LB/ampプレート上でのプレーティング→Duralon UV
（Stratagene）またはHATF（Millipore）メンブレンに
よるコロニーのリフト→クロロホルム蒸気中での30秒間
の溶菌→85℃で30分間の加熱殺菌→BCIP緩衝液中室温で
のフィルターの現像→フィルターが現像されるにつれて
観察し、最も早く現像されるコロニー（陽性体）を同定
し拾う→BCIPプレート上に「陽性体」を再びストリーク
する。BCIP緩衝液： 20mm CAPS pH9.0 １mm MgCl2 0.01mm ZnCl2 0.1mg/ml BCIP スクリーニングアッセイにおいて、突然変異したOC9aホ
スファターゼは発色に10分を要し、野生型酵素は発色に
30分を要した。
【０２３７】β−グリコシダーゼ このプロトコールを用いて、サーモコッカス（Thermoco
ccus）9N2 β−グリコシダーゼをコードするＤＮＡを突
然変異誘発させた。このＤＮＡ配列は図１に記載されて
いる。PCR ２マイクロリットルのdNTP（10mMストック） 10マイクロリットルの10×PCR緩衝液 β−グリコシダーゼＤＮＡ（100ナノグラム）を含有す
る0.5マイクロリットルのpBluescriptベクターＤＮＡ 20マイクロリットルの3'プライマー（100pmol） 20マイクロリットルの5'プライマー（100pmol） 16マイクロリットルのMnCl 4H2O（1.25mMストック） 24.5マイクロリットルのH2O １マイクロリットルのTaqポリメラーゼ（5.0単位） 合計100マイクロリットル反応サイクル 95℃で15秒間 58℃で30秒間 72℃で90秒間 25サイクル（72℃〜４℃で10分の延長インキュベーショ
ン） １％アガロースゲル上で５マイクロリットルを流し、反
応を調べる。
ccus）9N2 β−グリコシダーゼをコードするＤＮＡを突
然変異誘発させた。このＤＮＡ配列は図１に記載されて
いる。PCR ２マイクロリットルのdNTP（10mMストック） 10マイクロリットルの10×PCR緩衝液 β−グリコシダーゼＤＮＡ（100ナノグラム）を含有す
る0.5マイクロリットルのpBluescriptベクターＤＮＡ 20マイクロリットルの3'プライマー（100pmol） 20マイクロリットルの5'プライマー（100pmol） 16マイクロリットルのMnCl 4H2O（1.25mMストック） 24.5マイクロリットルのH2O １マイクロリットルのTaqポリメラーゼ（5.0単位） 合計100マイクロリットル反応サイクル 95℃で15秒間 58℃で30秒間 72℃で90秒間 25サイクル（72℃〜４℃で10分の延長インキュベーショ
ン） １％アガロースゲル上で５マイクロリットルを流し、反
応を調べる。
【０２３８】Qiaquickカラム（Qiagen）上で精製する。
【０２３９】50マイクロリットルのH2Oに再懸濁する。制限酵素消化 25マイクロリットルの精製されたPCR産物 10マイクロリットルのNEB緩衝液#2 ３マイクロリットルのKpnI（10U/マイクロリットル） ３マイクロリットルのEcoRI（20U/マイクロリットル） 59マイクロリットルのH2O 37℃で２時間切断する。
【０２４０】Qiaquickカラム（Qiagen）上で精製する。
【０２４１】35マイクロリットルのH2Oで溶出する。連結反応 10マイクロリットルの消化されたPCR産物 ５マイクロリットルのpBluescriptベクター（EcoRI/Kpn
Iで切断し、シュリンプアルカリホスファターゼでホス
ファターゼ処理したもの） ４マイクロリットルの５×連結緩衝液 １マイクロリットルのT4 ＤＮＡリガーゼ（BRL） 一晩連結させる。
Iで切断し、シュリンプアルカリホスファターゼでホス
ファターゼ処理したもの） ４マイクロリットルの５×連結緩衝液 １マイクロリットルのT4 ＤＮＡリガーゼ（BRL） 一晩連結させる。
【０２４２】エレクトロポレーションによりM15pREP4細
胞中に形質転換する。
胞中に形質転換する。
【０２４３】100または200マイクロリットルをLB amp m
eth kanプレート上にプレーティングし、摂氏37℃で一
晩増殖させる。β−グリコシダーゼアッセイ 以下のとおりに突然変異体に関してスクリーニングする
ためにグリコシダーゼアッセイを行なう。フィルターア
ッセイには、基質5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリ
ル−β−o−グルコピラノシド（XGLU）（Diagnostic Ch
emicals LimitedまたはSigma）の１mg/mlを含有する緩
衝液Z（後記の調製法を参照されたい）を使用する。Z−緩衝液： （Miller, J.H. (1992) A Short Course in
Bacterial Genetics, p.445を参照のこと） １リットル当たり： Na2HPO4−7H2O 16.1g NaH2PO4−H2O 5.5g KCl 0.75g MgSO4−7H2O 0.246g β−メルカプトエタノール 2.7ml pHを7.0に調整する （１）Millipore HATFメンブレンフィルターを使用して
コロニーリフトを行なう。
eth kanプレート上にプレーティングし、摂氏37℃で一
晩増殖させる。β−グリコシダーゼアッセイ 以下のとおりに突然変異体に関してスクリーニングする
ためにグリコシダーゼアッセイを行なう。フィルターア
ッセイには、基質5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリ
ル−β−o−グルコピラノシド（XGLU）（Diagnostic Ch
emicals LimitedまたはSigma）の１mg/mlを含有する緩
衝液Z（後記の調製法を参照されたい）を使用する。Z−緩衝液： （Miller, J.H. (1992) A Short Course in
Bacterial Genetics, p.445を参照のこと） １リットル当たり： Na2HPO4−7H2O 16.1g NaH2PO4−H2O 5.5g KCl 0.75g MgSO4−7H2O 0.246g β−メルカプトエタノール 2.7ml pHを7.0に調整する （１）Millipore HATFメンブレンフィルターを使用して
コロニーリフトを行なう。
【０２４４】（２）150mmガラスペトリ皿中でクロロホ
ルム蒸気でコロニーを溶菌する。
ルム蒸気でコロニーを溶菌する。
【０２４５】（３）１mg/ml XGLUを含有するZ緩衝液で
飽和したWhatman 3MM濾紙１枚を含有する100mmガラスペ
トリ皿へフィルターをトランスファーする。溶菌コロニ
ーを担持するフィルターを該ガラスペトリ皿へトランス
ファーした後、皿を室温で維持する。
飽和したWhatman 3MM濾紙１枚を含有する100mmガラスペ
トリ皿へフィルターをトランスファーする。溶菌コロニ
ーを担持するフィルターを該ガラスペトリ皿へトランス
ファーした後、皿を室温で維持する。
【０２４６】（４）フィルターメンブレン上で「陽性
体」が青色の斑点として観察された（「陽性体」は、早
期に出現する斑点である）。以下のフィルターレスキュ
ー法により、溶菌された陽性コロニーからプラスミドを
回収する。パスツールピペット（またはガラス毛細管）
を使用して、該フィルターメンブレン上の青色斑点の中
心部を抜き取る。小さなフィルターディスクを、20μl
の水を含有するEpp管に入れる。該Epp管を75℃で５分間
インキュベートし、ついでボルテックスしてプラスミド
ＤＮＡをフィルターから溶出させる。このＤＮＡをエレ
クトロコンピテント（electrocompetent）大腸菌（E. c
oli）細胞中に形質転換する。形質転換プレート上でフ
ィルター−リフトアッセイを繰り返して、「陽性体」を
同定する。フィルターリフトの後、形質転換プレートを
37℃のインキュベーターへ戻して、コロニーを再生させ
る。再精製した陽性体を３mlのLBamp液に接種し、37℃
で一晩インキュベートする。これらの培養物からプラス
ミドＤＮＡを単離し、プラスミド挿入断片を配列決定す
る。
体」が青色の斑点として観察された（「陽性体」は、早
期に出現する斑点である）。以下のフィルターレスキュ
ー法により、溶菌された陽性コロニーからプラスミドを
回収する。パスツールピペット（またはガラス毛細管）
を使用して、該フィルターメンブレン上の青色斑点の中
心部を抜き取る。小さなフィルターディスクを、20μl
の水を含有するEpp管に入れる。該Epp管を75℃で５分間
インキュベートし、ついでボルテックスしてプラスミド
ＤＮＡをフィルターから溶出させる。このＤＮＡをエレ
クトロコンピテント（electrocompetent）大腸菌（E. c
oli）細胞中に形質転換する。形質転換プレート上でフ
ィルター−リフトアッセイを繰り返して、「陽性体」を
同定する。フィルターリフトの後、形質転換プレートを
37℃のインキュベーターへ戻して、コロニーを再生させ
る。再精製した陽性体を３mlのLBamp液に接種し、37℃
で一晩インキュベートする。これらの培養物からプラス
ミドＤＮＡを単離し、プラスミド挿入断片を配列決定す
る。
【０２４７】突然変異誘発に供したβ−グリコシダーゼ
は、野生型β−グリコシダーゼより2.5倍効率的にXGLU
に作用した。
は、野生型β−グリコシダーゼより2.5倍効率的にXGLU
に作用した。
【０２４８】前記の教示を考慮して、本発明の多数の修
飾および変形が可能である。したがって、本発明は、請
求の範囲の範囲内において、特に記載されていないもの
であっても実施され得る。
飾および変形が可能である。したがって、本発明は、請
求の範囲の範囲内において、特に記載されていないもの
であっても実施され得る。
【図１】図1A及び1B。図1Aは、実施例2に記載した標準
及びサンプルa〜fを含むアガロースゲルの写真である。
サンプルc〜fは、実施例2に記載したように、2種の特異
的なＤＮＡプローブを使用してゲノムＤＮＡライブラリ
ーから回収し、遺伝子特異的なプライマーを使用して増
幅したＤＮＡを示す。図1Bも、実施例2に記載した標準
及びサンプルa〜fを含むアガロースゲルの写真である。
サンプルc〜fは、実施例2に記載したように、2種の特異
的なＤＮＡプローブを使用してゲノムＤＮＡライブラリ
ーから回収し、ベクター特異的なプライマーを使用して
増幅したＤＮＡを示す。
及びサンプルa〜fを含むアガロースゲルの写真である。
サンプルc〜fは、実施例2に記載したように、2種の特異
的なＤＮＡプローブを使用してゲノムＤＮＡライブラリ
ーから回収し、遺伝子特異的なプライマーを使用して増
幅したＤＮＡを示す。図1Bも、実施例2に記載した標準
及びサンプルa〜fを含むアガロースゲルの写真である。
サンプルc〜fは、実施例2に記載したように、2種の特異
的なＤＮＡプローブを使用してゲノムＤＮＡライブラリ
ーから回収し、ベクター特異的なプライマーを使用して
増幅したＤＮＡを示す。
【図２】図2は、4つのコロニーハイブリダイゼーション
プレートの写真である。プレートA及びBは、陽性クロー
ン、すなわち本発明に従って調整したＤＮＡを含み、プ
ローブ配列も含むコロニーを示す。プレートC及びDは対
照であり、陽性クローンを示していない。
プレートの写真である。プレートA及びBは、陽性クロー
ン、すなわち本発明に従って調整したＤＮＡを含み、プ
ローブ配列も含むコロニーを示す。プレートC及びDは対
照であり、陽性クローンを示していない。
【図３】図3は、サーモコッカス(Thermococcus)9N2β-
グリコシダーゼの完全長ＤＮＡ配列及び対応する推定ア
ミノ酸配列を示す。
グリコシダーゼの完全長ＤＮＡ配列及び対応する推定ア
ミノ酸配列を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｑ 1/26 1/34 1/34 1/48 1/48 1/527 1/527 1/68 ＺＣＣ 1/68 ＺＣＣＡ (31)優先権主張番号 ０８／６５１，５６８ (32)優先日 平成８年５月22日(1996．5．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／６９２，００２ (32)優先日 平成８年８月２日(1996．8．2) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
Claims (15)
- 【請求項１】 熱安定性酵素が得られたもとの酵素に比
べ、低温において改良された酵素活性を有する熱安定性
酵素を得る方法であって、 (a) 少なくとも60℃の温度で安定な第一の酵素をコード
する、少なくとも一種のポリヌクレオチドを突然変異誘
発にかけて、一種または二種以上の変異ポリヌクレオチ
ドを得、そして(b) 前記変異ポリヌクレオチドまたは該
変異ポリヌクレオチドから得られた変異酵素をスクリー
ニングして、少なくとも60℃の温度で安定で、その至適
温度範囲の少なくとも10℃低い温度で酵素活性を有し、
該変異酵素が得られたもとの前記第一の酵素よりも高い
活性を有する突然変異酵素を取得することを含む前記方
法。 - 【請求項２】 前記第一の酵素が野生型酵素である請求
項1に記載の方法。 - 【請求項３】 前記第一の酵素がリパーゼ、エステラー
ゼ、プロテアーゼ、グリコシダ―ゼ、グリコシルトラン
スフェラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、モノオキシ
ゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ハロペロキシダーゼ、リ
グニンペルオキシダーゼ、ジアリールプロパンペルオキ
シダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ニトリルヒドラタ
ーゼ、ニトリルニトリラーゼ、トランスアミナーゼ、ア
ミダーゼおよびアシラーゼからなる群から選ばれる請求
項1に記載の方法。 - 【請求項４】 前記突然変異誘発がランダム指向である
請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記突然変異誘発が指数的集合突然変異
誘発を含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記突然変異誘発がエラーを起こしやす
いPCRを含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 前記突然変異誘発が複合化学手法を含む
請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 前記突然変異誘発が性的PCRを含む請求
項１に記載の方法。 - 【請求項９】 前記突然変異誘発がカセット劣性突然変
異誘発を含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記突然変異誘発が機能的集合突然変
異誘発を含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記突然変異誘発が生体内突然変異誘
発である請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記突然変異誘発がオリゴヌクレオチ
ド指向性突然変異誘発を含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記突然変異誘発が指向性である請求
項１に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記第一の酵素が２以上のポリヌクレ
オチドによりコードされている請求項1に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記変異ポリヌクレオチドを配列決定
して、改良された酵素活性を有する変異酵素をコードす
るDNA配列を得ることをさらに含む請求項１に記載の方
法。
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