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Fachgebiet
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Diese
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Transformieren einer Nutzpflanze
durch Einführung
eines Gens einer anderen Spezies in die Nutzpflanze. Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung das Verfahren zum Transformieren
der Nutzpflanze, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Region
eines Faktors in Bezug zur Poly-A-Addition der mRNA der zu transformierenden
Nutzpflanze, die in der Basensequenz des Gens der anderen Spezies
enthalten ist, zu einer anderen Basensequenz modifiziert wird, die
ohne Bezug zur Poly-A-Addition der mRNA ist, ohne im Wesentlichen
die Funktion des Proteins zu verändern,
das von dem einzuführenden
Gen codiert wird und von der Nutzpflanze hergestellt wird, sowie
eine Nukleinsäure,
deren hierfür verwendete
Basensequenz modifiziert ist, und ein Verfahren zur Herstellung
dieser Nukleinsäure.
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Hintergrund
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Das
Wachstum von Pflanzen erfordert eine Vielzahl an Nährstoffen.
Die Pflanzen absorbieren die meisten dieser für das Wachstum erforderlichen
Nährstoffe über die
Wurzeln. Es sind Pflanzen bekannt, die Nährstoffe im Boden aufgrund
ererbter geringer Enzymaktivitäten,
die für
die Absorption von Nährstoffen
erforderlich sind, nicht absorbieren können.
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Zum
Beispiel ist Eisen ein essentielles Element für fast alle Organismen und
ist besonders für
eine große
Anzahl von Enzymen erforderlich, die an Zellfunktionen, wie der
Photosynthese oder Atmung, beteiligt sind. Im Boden solubilisiertes
Eisen liegt hauptsächlich
in Form von Fe(III)-Chelat vor [in manchen Fällen als Fe(II)-Chelat]. Im Allgemeinen
wird von den Pflanzen überwiegend
Fe(II), relativ zu Fe(III), absorbiert, doch hängt die Absorption von der
Pflanzenspezies ab.
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Pflanzen
besitzen zwei Mechanismen für
die Eisenaufnahme, d.h. einen Absorptionsmechanismen (I) (siehe 1)
und einen Absorptionsmechanismus (II) (siehe 2) (Mori,
1994).
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Der
Absorptionsmechanismus (I), der in 1 gezeigt
ist, besteht aus: (1) Freisetzung eines Protons in die Rizosphäre (Olson
und Brown, 1980), (2) erhöhte
Fe(III)-reduzierende Aktivität
in der Zellmembran der Wurzeln (Brown et al., 1961 und Chaney et
al., 1972) und (3) Exkretion von reduzierten und chelatbildenden Substanzen
aus den Wurzeln (Hether et al., 1984). Fe(III) wird nämlich von
der freigesetzten chelatbildenden Substanz komplexiert, und Fe(III)-Chelat
im freien Raum der Wurzeln wird zu Fe(II) auf der Zellmembran durch die
Eisenchelat-Reduktase
reduziert und über
einen Fe(II)-Transporter absorbiert. Ebenfalls wird vermutet, dass
das Proton in die Rizosphäre
freigesetzt wird und die Aktivität
der Reduktase durch die Absenkung des pH in dem freien Raum zunimmt.
Allerdings ist das Problem bekannt, dass aufgrund einer Hemmung
der Fe(III)-reduzierenden Aktivität durch einen höheren pH
eine starke pH-Pufferwirkung wegen der hohen Konzentration des Carbonatanions
zu einem Ausbruch der Kalkchlorose führt (Marchner et al., 1986).
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Der
Absorptionsmechanismus (II), der in 2 gezeigt
ist, ist für
Gräser
spezifisch und besteht aus: (1) Synthese von Muginsäuren (Phytosiderophor),
(2) Freisetzung von Muginsäuren
in die Rizosphäre,
(3) Bildung eines löslichen
Komplexes aus Eisen und Muginsäuren
und (4) Absorption des Muginsäuren-Eisen-Komplexes
vom Pflanzenkörper
(Takagi, 1976 und Takagi et al., 1984). Die Eisenaufnahme mit einem
derartigen, bei Gräsern
beobachteten Absorptionsmechanismus (II) hat den Vorteil, dass er
nicht von höheren
pH-Werten gehemmt wird.
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Bei
Hefe (Saccharomyces cerevisiae), einem Modellorganismus der Eukaryoten,
erfolgt die Eisenaufnahme ähnlich
wie mit dem obigen Absorptionsmechanismus (I). Da in Untersuchungen über den
Genlevel in höheren
Pflanzen der Fe(II)-Transporter mittels Komplementierung der Eisenabsorptionsmutante
von Hefe kloniert wurde (Eida et al., 1996), ist nicht der genaue
Mechanismus der Eisenabsorption untersucht worden.
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Im
Gegensatz dazu ist der Mechanismus in Hefe (Saccharomyces cerevisiae)
ganz genau untersucht worden. Die Absorption von Eisen in Hefe beginnt
mit der Reduktion von Fe(III) zu Fe(II) mit Hilfe der Eisenchelat-Reduktase
FRE1 und FRE2 (Dancis et al., 1990, 1992, Georgatsou und Alexandraki,
1994). Bei diesem Mechanismus für
die Aufnahme von reduziertem Fe(II) in die Zellen ist ein Absorptionsmechanismus
mit hoher Affinität
und ein Absorptionsmechanismus mit geringer Affinität bekannt.
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Bei
der Absorption von Eisen mit dem Absorptionsmechanismus hoher Affinität kann das
Fe(III) nach Reoxidation von Fe(II) durch die Mehrfachkupfer-Oxidase
FET3 (Askwith et al., 1994) in die Zellen mit Hilfe des Eisentransporters
FTR1 eingebaut werden (Stearman et al., 1996). Kupfer ist bei der
Reoxidation des zweiwertigen Eisens erforderlich (Dancis et al.,
1994, Klomp et al., 1997), und der Kupfer liefernde Weg zu FET3
ist ebenfalls untersucht worden (Yuan et al., 1995 und Lin et al.,
1997).
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Die
Absorption von Eisen mit dem Absorptionsmechanismus geringer Affinität kann durch
die Wirkung des Fe(II)-Transporters FET4 erfolgen (Dix et al., 1994,
1997).
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So
kann der Eisenabsorptionsmechanismus der Hefe auf Pflanzen übertragen
werden, und es können auf
Eisenmangel-Böden
wachsende Pflanzen erzeugt werden.
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Zu
diesem Zweck haben wir transgenen Tabak erzeugt, in den das FRE1-Gen
von Hefe transformiert wurde, das von Dr. Dancis (NIH) zur Verfügung gestellt
wurde (Yamaguchi, 1995).
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Allerdings
war in dem transgenen Tabak, in den das FRE1-Gen transformiert worden
war, die reduzierende Aktivität
im Vergleich zum Wildtyp nicht verändert. Nach der Northern-Hybridiserungsanalyse
betrug das Transkriptionsprodukt des Hefegens FRE1 in Tabak lediglich
0,9 kb.
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Ein
Beispiel einer derartigen unvollständigen Transkription, bei der
das Gen einer anderen Spezies in eine höhere Pflanze transformiert
worden ist, ist die Cry-Gengruppe, die δ-Endotoxin (ein insektizides
Protein) von Bacillus thuringiensis codiert. Über 42 Cry-Gene sind bekannt
und sind in 4 Klassen eingeteilt (cryI–cryIV) (Whiteley und Schnepf,
1986). Das Gen, das das insektizide Protein codiert, wurde in eine
höhere
Pflanze eingeführt,
aber es wurde keine Expression, auch nicht eine sehr geringe Expression,
festgestellt.
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Die
Ursache ist möglicherweise
(1) eine unterschiedliche Codon-Nutzung, (2) ein hoher AT-Gehalt
im Cry-Gen, (3) eine instabile mRNA und (4) ein partielles Spleißen des
Cry-Gens als Intron.
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Von
einer Präparation
der höheren
Pflanze mit einer hohen Proteinexpression ist berichtet worden.
Um nämlich
die Cry-Gengruppe in der höheren
Pflanze effizient zu exprimieren, wird die Basensequenz des Cry-Gens
modifiziert, um mit der Basensequenz der Pflanze zusammenzupassen,
und der Primer wird synthetisiert, woraufhin die vollständige Basensequenz
mit Hilfe der PCR synthetisiert wird (Perlak et al., 1991, Fujimoto
et al., 1993 und Nayak et al., 1997).
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Obwohl
die Transformation von höheren
Pflanzen durch Einführen
eines Gens einer anderen Spezies bekannt ist, war die Expression
des Gens nicht hinreichend. Verschiedene Gründe sind, wie oben beschrieben, angeführt worden.
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Wie
haben umfangreiche Untersuchungen über Faktoren zur Erzielung
einer hinreichenden Expression eines Gens in einer höheren Pflanze
angestellt, die durch Einführen
des obigen Gens, das ein Protein mit einer von einem anderen Organismus
erfüllten
Funktion codiert, transformiert worden ist, um diese Funktion auf
eine höhere
Nutzpflanze zu übertragen,
und festgestellt, dass die Basensequenz des Faktors in Bezug zur Poly-A-Addition
der mRNA der transformierten Pflanze ein wichtiger Teil der Expression
ist.
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Folglich
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Expression des
eingeführten
Gens in der transgenen höheren
Pflanze bei hoher Effizienz, diese transgene höhere Pflanze als auch ein Verfahren
zur Modifizierung des Gens davon bereit.
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Offenlegung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Transformieren einer
Pflanze durch Einführung
eines Gens einer anderen Spezies in diese Pflanze bereit, wobei
dieses Gen in solcher Weise modifiziert ist, dass das Gen weder
eine Sequenz von 8 benachbarten Basen oder mehr, bestehend aus lediglich
G und/oder T, noch eine beliebige der folgenden Basensequenzen in
Bezug zur Poly-A-Addition der mRNA der Pflanze enthält: NATAAA,
ANTAAA, AANAAA, AATNAA, AATANA oder AATAAN, worin N eine beliebige
Base ist und worin das von dem Gen codierte Protein funktional bleibt,
nachdem das Gen modifiziert worden ist.
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Ein
Beispiel für
die Region eines Faktors in Bezug zur Poly-A-Addition der mRNA ist
vorzugsweise eine AATAAA-ähnliche
Basensequenz; außerdem
ist diese Region eines Faktors in Bezug zur Poly-A-Addition der
mRNA die Region, die vorzugsweise stromabwärts der GT-reichen Basensequenz
liegt. Darüber
hinaus wird die Modifikation der Basensequenz dieser Region vorzugsweise
basierend auf der Codon-Nutzung der transformierten Nutzpflanze
durchgeführt.
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Bei
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass
die G- und T-reiche
Basenregion in dem einzuführenden
Gen klein ist; die Differenz in dem G- und C-Basengehalt innerhalb
der gesamten Region des einzuführenden
Gens klein ist; die Sequenz keine ATTTA-Sequenz aufweist; und/oder
stromaufwärts des
Initiationscodons des zu transferierenden Gens eine Kozak-Sequenz
liegt.
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Außerdem betrifft
die vorliegende Erfindung die transformierte Nutzpflanze, die mit
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann.
Die transformierte Nutzpflanze der vorliegenden Erfindung kann der
pflanzliche Organismus und der Samen sein und ist in der Form nicht
beschränkt.
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Außerdem betrifft
die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure, insbesondere DNA, mit
einer modifizierten Basensequenz, die für das obige Transformierungsverfahren
verwendet werden kann.
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Die
Basensequenz der Nukleinsäure
der vorliegenden Erfindung ist eine modifizierte Basensequenz, die
in der transformierten Nutzpflanze mit hoher Effizienz exprimiert
werden kann und zum Beispiel ein Faktor in Bezug zur Poly-A-Addition
von mRNA dieser Nutzpflanze ist und dadurch gekennzeichnet ist,
dass ein Teil eines Faktors in Bezug zu dieser Poly-A-Addition durch
eine andere Basensequenz ersetzt ist und außerdem diese Basensequenz eine
kleine G- und T-reiche Basenregion in dem einzuführenden Gen aufweist, eine
kleine Differenz zwischen G- und C-Basengehalt in dem einzuführenden
Gen aufweist, keine ATTTA-Sequenz aufweist und/oder vorzugsweise
stromaufwärts
des Initiationscodons des einzuführenden
Gens eine Kozak-Sequenz aufweist.
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Außerdem betrifft
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der obigen
Nukleinsäuren, dadurch
gekennzeichnet, dass die obigen Nukleinsäuren in mehrere Fragmente aufgeteilt
sein können
und diese Fragmente ligiert werden.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1:
Absorptionsmechanismus (I) von Eisen in Pflanzen.
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2:
Absorptionsmechanismus (II) von Eisen in Pflanzen.
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3:
Stelle der Poly-A-Addition in höheren
Pflanzen.
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4:
G- und T-reiche Sequenz im Hefegen FRE1.
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5:
Schematische Darstellung der refre1-Synthese.
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6:
Sequenz der in der Synthese von refre1 eingesetzten 30 Primer.
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7:
Beziehung zwischen refre1-Sequenz und Primer.
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8:
Präparationsschema
des vollständigen
refre1.
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9:
Gesamtsequenz des konstruierten refre1.
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10:
Graphische Darstellung der G- und T-Gehalte in FRE1 (oberes Bild)
und refre1, mit dem 8 Basenfenster berechnet.
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11:
Struktur des binären
Vektors pRF1.
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12:
Foto, das das Wachstum der transgenen Pflanze der vorliegenden Erfindung
zeigt.
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13:
Foto, das die Blüte
der transgenen Pflanze der vorliegenden Erfindung zeigt.
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14:
Ergebnis einer Southern-Hybridisierung der Transformanten unter
Verwendung von refre1 als Sonde.
Links: Verdau mit EcoRI und
HindIII
Rechts: Verdau mit HindIII
Nr. 1–Nr. 12:
Transformanten
W. T.: Wildtyp
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15:
Ergebnis einer Northern-Hybridisierung der Transformanten unter
Verwendung von refre1 als Sonde.
Nr. 1–Nr. 2: Transformanten
W.
T.: Wildtyp
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16: Ein Foto, das die Aktivität der Eisenchelat-Reduktase
in Wurzeln zeigt, die durch die Rotfärbung des BPDS-Fe(II)-Komplexes
mit Fe(II) kenntlich gemacht ist.
Links: Wildtyp, der keine
Rotfärbung
zeigt.
Rechts: Transformant, der eine Rotfärbung im Wurzelbereich zeigt.
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17: Foto, das das gleiche Experiment wie in 16 mit einem anderen Transformanten zeigt. Eine
Rotfärbung
wird im Transformanten beobachtet (rechts).
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18: Foto, das die Aktivität der Eisenchelat-Reduktase
mittels Rotfärbung
des BPDS-Fe(II)-Komplexes in Wurzeln einer zweiten Generation Pflanzen
zeigt, die aus Samen des Transformanten erhalten sind. Eine Rotfärbung des
BPDS-Fe(II)-Komplexes
wird in der zweiten Generation des Transformanten beobachtet (links).
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Primäre Anwendungsform für die Durchführung der
Erfindung
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Die
in der vorliegenden Erfindung transformierten Nutzpflanzen unterliegen
keiner Beschränkung, wenn
sie als Nahrungsmittel und als Pharmazeutika industriell genutzte
Pflanzen sind und vorzugsweise höhere
Pflanzen sind, wie Getreide, Gemüse,
Früchte
und Tabak.
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Ein
weiteres Gen, das bei der vorliegenden Erfindung eingeführt wird,
unterliegt keiner Beschränkung, falls
es für
die Pflanzen zweckdienlich ist und es keine nachteiligen Wirkungen
für Pflanzen
und Menschen besitzt. Es kann ein unmittelbar zweckdienliches Gen
für Pflanzen
sein, das eine Resistenz gegen Chemikalien, wie Herbizide, bereitstellt
und vorzugsweise ein Enzym ist, das aus Organismen, wie Bakterien
und Hefen, stammt. Zum Beispiel ist Eisenchelat-Reduktase FRE1 von
Hefe bevorzugt, die an der Absorption von Eisen beteiligt ist.
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Wir
haben festgestellt, dass in einer transformierten Pflanze Faktoren,
die die Expression des eingeführten
Gens beeinflussen, eine Basensequenz sein können, welche die Addition von
Poly-A von mRNA bestimmt. Außerdem
haben wir festgestellt, dass stromaufwärts der Basensequenz, die eine
Addition von Poly-A definiert, eine GT-reiche Basensequenz erforderlich
ist. Das heißt,
dass bei Vorliegen einer GT-reichen Basensequenz die Addition von
Poly-A in Pflanzen festgelegt ist; anschließend wird die mRNA an der Position
10–30 bp
nach dem Poly-A-Signal,
zum Beispiel einer AATAAA-ähnlichen
Basensequenz, gespalten, woraufhin Poly-A durch die Wirkung der
Poly-A-Polymerase angehängt
wird. Dementsprechend kann, wenn das eingeführte Gen eine solche Basensequenz
aufweist, in der transgenen Pflanze die mRNA nicht in voller Länge exprimiert werden,
und die mRNA wird an der Position 10–30 bp nach dem Poly-A-Signal
mit der AATAAA-ähnlichen
Basensequenz gespalten.
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Folglich
ist die vorliegende Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass das Poly-A-Signal der Pflanze
in dem eingeführten
Gen, zum Beispiel die AATAAA-ähnliche
Basensequenz, vorzugsweise eine GT-reiche Basensequenz, zu einer
anderen Basensequenz modifiziert ist.
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Ein
Verfahren zur Konstruktion einer modifizierten Basensequenz besteht
zunächst
darin, das Codon so zu wählen,
dass die von dem einzuführenden
Gen codierte Aminosäuresequenz
nicht verändert
wird. Die Aminosäuresequenz
kann verändert
werden, falls die Sequenz keinen wesentlichen Effekt auf die Funktion
für das
Protein besitzt, vorzugsweise wird die Aminosäuresequenz aber nicht verändert.
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In
dem Falle, bei dem mehrere Codons, die eine Aminosäure codieren,
bekannt sind, wird vorzugsweise das Codon mit einer hohen Nutzungsrate
in der Pflanze ausgewählt,
indem die Codon-Nutzung der zu transformierenden Pflanze betrachtet
wird.
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Außerdem ist
nicht nur eine Modifikation der Basensequenz des Poly-A-Signals,
sondern auch eine Deletion der GT-reichen Basensequenz bevorzugt.
Eine Modifikation zur Verminderung des GT-Gehalts in dieser Region
ist besonders in dem Fall wichtig, bei dem die GT-reiche Basensequenz
in einem hohen Anteil vorliegt, da dann die Möglichkeit einer Spaltung der
mRNA in der Region der Poly-A-Signal-ähnlichen
Basensequenz groß ist,
die stromabwärts
der GT-reichen Basensequenz liegt.
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Außerdem ist
bei der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu der oben erwähnten Modifikation
eine Modifikation bevorzugt, welche die Differenz zwischen dem G-
und C-Basengehalt über
die gesamte Region des einzuführenden
Gens verringert. Bevorzugter sollte die Sequenz keine ATTTA-Sequenz
enthalten, die bekanntlich zu einer instabilen mRNA-Sequenz führt, und/oder
die Sequenz sollte eine Kozak-Sequenz
aufweisen, die bekanntlich als eine Sequenz für eine effektive Translation
von mRNA in Eukaryoten stromaufwärts des
Initiationscodons des einzuführenden
Gens gilt.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst eine Modifikation einer
Basensequenz, das außerdem
mit einem üblichen
Verfahren zur Modifikation der oben erwähnten Modifikation der Basensequenz
kombiniert ist.
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Das
Verfahren zur Modifikation der Basensequenz kann ohne Einschränkung mit
Hilfe bekannter verschiedener Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel kann
jedes herkömmliche
Verfahren zur Modifikation mit Hilfe von Punktmutation und Schneiden
mit Restriktionsenzym angewendet werden.
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Außerdem kann
in dem Fall, bei dem eine große
Anzahl von Basen zu modifizieren ist oder das einzuführende Gen
selbst eine kurze Länge
aufweist, das Gen mittels Synthese hergestellt sein. Wie später noch ausführlicher
erläutert,
wird das Gen, auch wenn es lang ist, in mehrere Fragmente aufgeteilt
und jedes Fragment, das mit Hilfe der PCR amplifiziert ist, unter
Verwendung von Restriktionsenzymen ligiert; folglich kann das Gen
mit einer modifizierten Basensequenz hergestellt werden.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung wird außerdem noch konkreter erläutert, wobei
aber das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht auf den Rahmen
der folgenden Erläuterung
beschränkt
werden kann, da vielfältige
Anwendungen, basierend auf dieser Erläuterung, vom Fachmann vorgenommen
werden können.
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Wir
haben versucht, die Ursache dafür
zu finden, warum die Länge
der mRNA des Hefe-FRE1, das in Tabak eingeführt war, kurz war (0,9 kb).
Als Gründe
für die
unvollständige
Länge des
Transkriptionsprodukts der Eisenchelat-Reduktase FRE1 der Hefe,
die in Tabak eingeführt
war, wurden zwei Möglichkeiten
in Betracht gezogen, nämlich:
- (1) ein Teil der mRNA wurde als Intron gespleißt und
- (2) eine Transkription wurde innerhalb der codierenden Region
abgebrochen.
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Als
Ergebnis einer weiteren Analyse mit Hilfe der RT-PCR wurde festgestellt,
dass eine Poly-A-Addition innerhalb der codierenden Region in dem
transgenen Tabak erfolgte, in den das FRE1-Gen transformiert war.
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Ein
Beispiel für
eine bestätigte
Expression eines in eine höhere
Pflanze eingeführten
Hefegens ist die Invertase (Hincha et al., 1996). In dem vorliegenden
Experiment konnten neue Erkenntnisse erhalten werden, wo nach Einführen des
FRE1-Gens sogar im gleichen eukaryotischen Gen eine Volllängen-mRNA
nicht synthetisiert werden kann.
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Der
Grund, warum eine Volllängen-mRNA
nicht in dem FRE1-transformierten transgenen Tabak synthetisiert
werden konnte, war eine Addition von Poly-A innerhalb der codierenden
Region von FRE1.
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Eine
Poly-A-Stelle ist nicht auf eine Position beschränkt, und stromaufwärts von
jeder Poly-A-Stelle wurde eine AAUAAA-ähnliche Sequenz, eine mutmaßliche Region
eines Poly-A-Signals, festgestellt. Obwohl mehrere AAUAAA-ähnliche
Sequenzen an der 5'-Stelle
von FRE1 festgestellt wurden, wurde allerdings eine Poly-A-Addition
an diesen Stellen nicht beobachtet.
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Es
kann eine GU-reiche Sequenz stromaufwärts des Poly-A-Signals angeordnet
werden, um eine Addition von Poly-A in der Pflanze festzulegen.
Ist nämlich
eine GU-reiche Sequenz vorhanden, so kann eine Addition von Poly-A
in der Pflanze erfolgen, wobei an der Position von „PyA", die sich in einer
Entfernung von 10–30
bp von der anschließend
gelegenen AAUAAA-ähnlichen
Sequenz befindet, die mRNA geschnitten wird, und dann folglich Poly-A
durch die Funktion der Poly-A-Polymerase angehängt werden.
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Schließlich ist
eine Ursache für
die ausbleibende Bildung von Volllängen-mRNA in transgenem Tabak, in
den FRE1 transformiert ist, die Tatsache, dass die GU-reiche Sequenz
ohne Bezug zur Poly-A-Addition in Hefe die Addition von Poly-A in
Pflanzen bestimmt.
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Eine
Sequenz von Eisenchelat-Reduktase FRE1 mit einer GT-reichen Region
ist in 4 gezeigt. In 4 sind die
GT-reichen Regionen als eingerahmte Sequenzen dargestellt.
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Um
die Eisenchelat-Reduktase in Tabak zu exprimieren, kann folglich
eine Deletion der GT-reichen Sequenz von FRE1 nützlich sein. Allerdings ist
bis heute für
die Sequenz, die eine Poly-A-Addition in Pflanzen festlegt, nur
bekannt, dass eine Konsensus-Sequenz GU-reich sein kann und die
Sequenz nicht vollständig bestimmt
ist. Solange die genaue Konsensus-Sequenz nicht bekannt ist, besteht
die Möglichkeit,
dass die vollständige
mRNA lediglich durch eine Änderung
der Sequenz nicht zu erhalten ist. Wir haben deshalb versucht, eine
Basensequenz zu konstruieren, die der Codon-Nutzung der zu transformierenden
Pflanzen entspricht, ohne die Aminosäuresequenz von FRE1 zu verändern, um
die Volllängen-mRNA
in Pflanzen zu synthetisieren.
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Um
die Eisenchelat-Reduktase der Hefe in Tabak zu exprimieren, haben
wir die Basensequenz entsprechend der Codon-Nutzung von Tabak umgestaltet,
ohne die Aminosäuresequenz
von FRE1 zu verändern. Bei
der Gestaltung der Basensequenz werden die folgenden Punkte berücksichtigt.
- (1) Die GT-reiche Region wird eliminiert;
- (2) Die Basensequenz AATAAA, die ein Poly-A-Signal sein kann,
und ähnliche
Basensequenzen werden eliminiert;
- (3) Um die Basensequenz in einfacher Weise zu bestätigen, kommen
Restriktionsstellen etwa alle 400 bp (417–436 bp) vor und ist die Sequenz
in 5 Segmente unterteilt;
- (4) Die Basensequenz, ATTTA (Ohme-Takagi, 1993), die als instabile
mRNA-Sequenz bezeichnet
wird, wird eliminiert;
- (5) Um den G- und C-Basengehalt in der gesamten Region zu nivellieren,
werden Codonpositionen getauscht;
- (6) Die Kozak-Sequenz, die eine Sequenz für eine wirksame Translation
von mRNA in Eukaryoten ist (Kozak, 1989), wird vor dem Initiationscodon
angeheftet.
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Die
so gestaltete modifizierte Basensequenz von Eisenchelat-Reduktase
FRE1 von Hefe ist in der Sequenzliste als SEQ ID NR: 1 gezeigt.
Die Aminosäuresequenz
davon ist als SEQ ID NR: 2 gezeigt.
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Die
gestaltete Sequenz wird als rekonstruierte FRE1 bezeichnet (nachstehend
als „refre1" bezeichnet).
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Die
refre1 der vorliegenden Erfindung wird durch Unterteilen in 5 Segmente
(A–E)
synthetisiert, wie in 5 gezeigt.
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Das
Segment A besteht aus einer Sequenz der Basenpaare 1–434, in
der die Restriktionsstellen in Base 1: EcoRI, Base 7: XbaI und Base
429: BamHI vorgesehen sind.
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Das
Segment B besteht aus einer Sequenz der Basenpaare 429–845, in
der die Restriktionsstellen in Base 429: BamHI und Base 840: MroI
vorgesehen sind.
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Das
Segment C besteht aus einem Segment der Basenpaare 840–1275, in
dem die Restriktionsstellen in Base 840: MroI und Base 1270: SalI
vorgesehen sind.
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Das
Segment D besteht aus einem Segment der Basenpaare 1270–1696, in
dem die Restriktionsstellen in Base 1270: SalI und Base 1691: PstI
vorgesehen sind.
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Das
Segment E besteht aus einem Segment der Basenpaare 1691–2092, in
dem die Restriktionsstellen in Base 1691: PstI, Base 2081: SacI
und Base 2087: HindIII vorgesehen sind.
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Jedes
Segment A–E
besteht jeweils aus einer Sequenz mit 417–436 bp, ist unter Verwendung
von 6 Primern, bestehend aus 77–83
Basenpaaren, synthetisiert. Die dreißig eingesetzten Primer, von
A-1 bis E-6, sind in 6 gezeigt. Diese Basensequenzen
sind in den Sequenzlisten SEQ ID NR: 5–SEQ ID NR: 34 gezeigt.
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Die
Primer in den Segmenten -1, -2 und -3 sind Sense-Stränge und
Primer -4, -5 und -6 sind Antisense-Stränge. Die Primer sind so konstruiert,
dass sie eine komplementäre
Basensequenz aufweisen, die aus 12 oder 13 bp am 3'-Ende der Primer
-3 und -4 besteht, und eine überlappende
Sequenz aufweisen, die aus 12 oder 13 bp am 3'-Ende der Primer -1 und -2, -2 und -3,
-4 und -5, und -5 und -6 besteht. Der Primer -1 und -6 ist mit einer
Restriktionsstelle an der Base 1 am 5'-Ende konstruiert.
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Die
Beziehung zwischen diesen Primern und der konstruierten Basensequenz
ist in 7 gezeigt.
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Die
jeweiligen Segmente A–E
sind mit Hilfe der PCR unter Verwendung von Primern hergestellt,
die entsprechend der oberen Basensequenz synthetisiert sind (siehe 5).
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Nachdem
die Reaktionsmischung des dritten PCR-Schrittes in 0,8% Agarosegel
elektrophoretisch getrennt worden war, wurden die Banden mit der
erwarteten Länge
(417–436
bp) ausgeschnitten und gereinigt, dann in Plasmid pT7Blue(R) Vektor
(von Takara Corp. erhalten) kloniert. Die Basensequenzen der erhaltenen Klone wurden
bestätigt,
und die Klone mit den exakten Basensequenzen wurden mit Hilfe des
Fluoreszenz-DNA Sequenzierer DSQ-1000L (von Shimadzu Corp. hergestellt)
ausgewählt.
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Segmente
mit den exakten Sequenzen wurden erhalten und refre1 voller Länge wurde
mit Hilfe der Restriktionsstellen gemäß den in 8 gezeigten
Verfahren erhalten.
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Die
Orientierung der Insertion der Segmente B und E ist für die Volllängen-Herstellung
unbedingt erforderlich. Bei den anderen Segmenten waren die Segmente,
welche die exakten Basensequenzen enthalten, ohne Bezug zur Orientierung
der Insertion verwendet.
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Die
gesamte Basensequenz des erhaltenen refre1 ist in 9 gezeigt.
Spezifische Merkmale der Sequenz von refre1 sind:
- (1)
75,3% Homologie zum ursprünglichen
FRE1 (100% Homologie der Aminosäuresequenz);
- (2) Sie weist keine Sequenz auf, die aus lediglich G oder T
besteht, die zu mehr als 8 Basen fortlaufend verknüpft sind;
- (3) Sie enthält
nicht nur keine Sequenz AATAAA, sondern auch keine Sequenzen, in
denen irgendeine der Basen in der obigen Sequenz ausgetauscht ist;
- (4) Sie enthält
keine Sequenz ATTTA; und
- (5) Es wird kein Unterschied im GC-Gehalt über die gesamte Region der
Sequenz beobachtet.
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10 zeigt
eine verringerte Anzahl an Sequenzen, die aus sequentiellem G und
T in refre1 bestehen, verglichen mit der ursprünglichen FRE1. Dies veranschaulicht
der GT-Gehalt von 8 sequentiellen Basen in der FRE1 und refre1-Sequenz. 10 zeigt
die gleichförmige
Verteilung des GT-Gehalts in refre1, im Vergleich zur ursprünglichen
FRE1.
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Das
so synthetisierte Gen refre1 wird in Tabak (Nicotiana tabacum L.
var. SRI) eingeführt.
Als Folge der Transformation wurden 68 Kanamycin-resistente Pflanzen reproduziert.
Um die Transformation des Zielgens in der reproduzierten Pflanze
und seine Kopienzahl zu bestätigen,
wurde eine genomische Southern-Hybridisierung vorgenommen. Als Ergebnis
wurden ein bis mehrere Kopien des transformierten refre1-Gens in den
Pflanzen bestätigt.
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Ein
Verfahren zur Einführung
eines Gens in Pflanzenzellen für
eine Reproduktion der Pflanze kann ein herkömmliches Verfahren sein, wie
es zum Beispiel in „Laboratory
Manual on functional analysis of plant gene" (Maruzen) [Ref. (4)], beschrieben ist.
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Spezifisch
wurde ein Fragment der Restriktionsenzyme, XbaI und SacI, in refre1,
das mit dem pT7Blue(R) Vektor mit dem obigen Verfahren kloniert
war, gegen den ORF von β-Glucuronidase
in dem binären
Vektor pBI121 (TOYOBO Co. Ltd.) ausgetauscht, um den binären Vektor
pRF1 herzustellen. Die Struktur des binären Vektors pRF1 ist in 11 gezeigt.
-
Der
so erhaltene binäre
Vektor pRF1 wurde in E. coli transformiert, und E. coli, das das
Helferplasmid pRK2013 trägt,
wurde bei 37°C über Nacht
in Schüttelkultur
gehalten. Andererseits wurde Agrobacterium tumefaciens C58 in 1
ml LB-Flüssigkulturmedium,
das ein geeignetes Antibiotikum enthielt, bei 26°C 2 Nächte in Schüttelkultur gehalten. Je 100 μl davon wurde
auf eine LB-Platte, die kein Antibiotikum enthielt, ausgebracht,
bei 26°C
2 Nächte
kultiviert, woraufhin die Plattenoberfläche mit einem Platinspatel
abgeschabt wurde und auf der Selektionsplatte [LB-Platte, die 100 μl/μg Rifampicin
(Rf) und 25 μg/μl Kanamycin
(Km) enthielt] bei 26°C
2 Nächte
kultiviert wurde, um eine Einzelkolonie zu bilden.
-
Die
Einzelkolonie wurde in 4 ml LB (Km und Rf) Flüssigmedium bei 26°C 2 Nächte in
Schüttelkultur gehalten.
Das Plasmid wurde extrahiert und mit Restriktionsenzym behandelt.
Das Restriktionsstellenmuster des Plasmids zeigte, dass pRF1 vorlag.
-
Die
zu transformierende Pflanze wurde folgendermaßen präpariert.
-
Zwei
oder drei junge Blätter,
etwa 8 cm groß,
des Wildtyp-Tabaks wurden zerteilt und in einer Petri-Schale, die
mit sterilisierter Lösung
(10% Hypochlorige Säure
und 0,1% Tween 20) gefüllt
war, unter Rühren 15
Minuten sterilisiert. Nach dreimaligem Waschen mit sterilem Wasser
wurden die Blätter
in 8 mm Quadrate zerschnitten. Zu den Blättern in einer Petri-Schale
wurde 3 ml Kulturflüssigkeit
des den binären
Vektor tragenden Agrobacterium tumefaciens C58 gegeben, das bei
26°C 2 Nächte kultiviert
war. Nach 1 Minute wurde die Flüssigkeit
mit einer Pasteurpipette rasch entfernt und die zurückbleibende
Flüssigkeit
mit einem autoklavierten Filterpapier abgezogen.
-
Die
Fragmente der Blätter
wurden auf ein Kulturmedium verbracht, dem Benzyladenin und Naphthalenessigsäure zum
MS-Medium gegeben war, und im Licht bei 25°C 3 Tage kultiviert. Danach
wurden die Fragmente der Blätter
in Medium transferiert, dem CLAFORAN zugefügt war, und 1 Woche kultiviert
und weiter in ein Medium überführt, dem
CLAFORAN und Kanamycin zugefügt
war, dann alle 2 Wochen überimpft.
Wenn die Kalli induziert und die Schößlinge gebildet waren, wurden
die Schößlinge mit
dem Skalpell abgeschnitten und in das MS-Medium überführt, dem Kanamycin zugefügt war.
-
Die
Schößlinge mit
Wurzeln wurden in Vermikulit verpflanzt, und die Pflanzen wurden
unter Versorgung mit Hyponex (Hyponex Japan Co. Ltd.) angezogen,
um transgene Pflanzen zu erhalten.
-
68
transgene Pflanzen mit einer Kanamycin-Resistenz konnten als Folge
der Transformation erhalten werden. Ein beispielhaftes Foto der
gewachsenen Pflanze ist in 12 gezeigt
und ein Foto der blütentragenden
Pflanze ist in 13 gezeigt.
-
Von
diesen wurden 5 individuelle Pflanzen einer genomischen Southern-Hybridisierung
unterzogen. Das Ergebnis ist in 14 gezeigt.
-
Bei
der genomischen Southern-Hybridisierung erfolgte die Extraktion
der genomischen DNA des transgenen Tabaks gemäß der Beschreibung in „Plant
Cell Technology Series 2, Protocol for PCR Experiments of Plants" (Shujun-Sha) [Ref.
(2)]. Die erhaltene genomische DNA wurde mit Restriktionsenzymen
EcoRI und HindIII verdaut, und die Hybridisierung wurde mit einer
Sonde durchgeführt,
die mit dem Voll längen-Fragment von
refre1 als Template hergestellt war ([α-32P]-dATP wurde verwendet).
-
In
der in 14 gezeigten Southern-Hybridisierung
wurden Mengen an DNA nach der Restriktionsenzymbehandlung aufgetrennt,
allerdings wurde eine Abweichung aufgrund der Behandlung mit Ethanol
nach der Restriktionsenzymbehandlung beobachtet. Folglich spiegelt
die Intensität
der detektierten Banden nicht immer die Anzahl an Kopien des eingeführten Gens
wider.
-
Beim
Verdau mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII wurde eine
Bande mit einer Größe von 3,2
kb beobachtet, die in allen Individuen erwartet wurde. Allerdings
wurde in dem Individuum Nr. 12 eine Bande geringfügig kleiner
als 3,2 kb detektiert. Nach diesem Ergebnis wurde vermutet, dass
1 Kopie von refre1 in Nr. 1 und Nr. 11, 3 oder 4 Kopien in Nr. 2
und 4 Kopien in Nr. 9 vorlagen.
-
Beim
Verdau mit HindIII bei Nr. 12 konnte die Bande aufgrund des fehlerhaften
Ladens des Gels nicht detektiert werden.
-
Als
Ergebnis der Analyse der obigen Southern-Hybridisierung wurde festgestellt,
dass refre1 in die ausgewählten
fünf Individuen
eingeführt
wurde.
-
Wird
die Sequenz mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII geschnitten,
so wird eine Sequenz vom Promotor bis zum Terminator geschnitten
und das eingeführte
refre1-Gen wird unter der Regulation des CaMV35S-Promotors in mRNA
transkribiert. Beim EcoRI und HindIII-Verdau von Nr. 12 könnte ein
Grund für die
Detektion einer geringfügig
kleineren Bande als 3,2 kb der Tatsache zugeschrieben werden, dass
eines der eingeführten
Konstrukte vor Integration in das pflanzliche Genom geschnitten
wurde und in eine Position nahe der EcoRI oder HindIII-Stelle im
pflanzlichen Genom inseriert wurde.
-
Als
nächstes
wurde die Bildung von Volllängen-mRNA
im transformierten Tabak Nr. 1 und Nr. 2 mittels Northern-Analyse
bestätigt,
wo das eingeführte
refre1-Gen oben mittels genomischer Southern-Analyse bestätigt worden
war.
-
Bei
der Northern-Analyse wurde ein Blot-Verfahren zum Beispiel nach
dem herkömmlichen
Verfahren angewandt, das in „Cloning
and Sequencing" (Noson-Bunka-Sha) [Ref. (1)] beschrieben
ist, und das Hybridisierungsverfahren erfolgte nach dem wie in obiger
Southern-Analyse beschriebenen Verfahren.
-
Ein
Ergebnis der Northern-Hybridisierung ist in 15 gezeigt.
In 15 wird keine Bande in der Wildtyp-Spur (W. T.)
beobachtet. In den Spuren von Nr. 1 und Nr. 2 werden Hauptbanden
mit einer Größe von 2,5
kb und mehrere Banden detektiert, die kleiner als die Hauptbanden
sind.
-
Bei
der Northern-Analyse konnte die Bildung von Volllängen-mRNA
als Ergebnis der Einführung
von refre1 der vorliegenden Erfindung bestätigt werden. Bei der vorliegenden
Analyse wird, obwohl grundsätzlich die
Gesamt-mRNA aus der Wurzel extrahiert werden sollte, in der die
mRNA erwartungsgemäß überexprimiert wird,
in diesem Experiment die Extraktion aus Blättern durchgeführt, da
dann, wenn die Wurzel abgeschnitten wird, keine Pflanze der nachfolgenden
Generation erhalten werden kann. Da CaMV35S als Promotor verwendet
wird und das refre1-Gen in allen Teilen der Pflanze exprimiert wird,
wird selbst bei der Analyse, die mittels Extraktion von Gesamt-mRNA
aus Blättern
durchgeführt
wird, die Bestätigung
erhalten, dass die Transkription in Blättern und Wurzeln der Pflanzen
erfolgt und die Stelle der Poly-A-Addition
nicht verändert
ist.
-
Als
Ergebnis der Northern-Hybridisierung könnte, das das Transkriptionsprodukt
mit 2,5 kb im Tabak, in den refre1 eingeführt war, bestätigt wurde,
eine Poly-A-Addition durch den NOS-Terminator vorkommen. Volllängen-mRNA
wurde ebenfalls in dem Tabak festgestellt, in den refre1 eingeführt war.
-
Eine
Bande, die kleiner als 2,5 kb war, wie in 15 zu
erkennen, wird an der rRNA entsprechenden Position detektiert, wie
es ein Vergleich des Fotos nach der Elektrophorese zeigt. Obwohl
eine unspezifische Adsorption der Sonde an rRNA vermutet wurde,
da sie nicht mit Wildtyp-RNA hybridisierte, hybridisiert sie selbstverständlich mit
dem Transkriptionsprodukt von refre1. Es kann möglicherweise die kürzere mRNA
anstatt der Volllängen-mRNA
von refre1 gebildet werden. Da sie als gleich lang wie rRNA detektiert
wird, kann allerdings vermutet werden, dass bei der RNA-Elektrophorese
mRNA von refre1 von rRNA mitgeschleppt sein kann, die in großen Mengen
vorliegt. Diese Ursache kann mit einer Northern-Hybridisierung mit
gereinigter Poly-A + RNA überprüft werden,
wobei allerdings, wie aus 15 eindeutig
zu erkennen, der Großteil
der mRNA eine Volllängen-mRNA
ist und deshalb kein Anlass besteht, dies weiter zu verfolgen und
abzuklären.
-
Um
die Northern-Hybridisierung durchzuführen, wurde RNA des Transformanten
Nr. 1, in dem 1 Kopie festgestellt wurde, und RNA des Transformanten
Nr. 2, in dem 3 oder 4 Kopien festgestellt wurden, elektrophoretisch
behandelt und daraufhin festgestellt, dass die Banden von Nr. 2
in Abhängigkeit
der Kopienzahl vom refre1-Gen dunkel gefärbt waren.
-
Außerdem wurde
bei den erhaltenen 68 transformierten Tabakpflanzen (Kanamycin-Selektion) eine konstante
Eisenchelat-Reduktase in der Wurzel in 6 Pflanzen bestätigt.
-
Für die Detektion
der Reduktase-Aktivität
wurde die Eigenschaft der Rotfärbung
des Komplexes aus Bathophenanthrolindisulfonsäure (BPDS), die ein starker
Chelator für
Fe(II) ist, mit Fe(II) genutzt. Nach Entfernung von Vermikulit vom
Transformanten und Wildtyp-Tabak wurden die Wurzeln, die mit Aluminiumfolie
vor Licht geschützt
waren, auf ein BPDS-haltiges Gel gelegt und bei 27°C 24 Stunden
ruhen gelassen. Eine Reduktion von Fe(III) wurde durch die Färbung der
Rizosphäre
des Transformanten bestätigt.
-
Fotos,
die eine Reduktase-Aktivität
bestätigen,
sind in 16 und 17 gezeigt.
In den Fotos von 16 und 17 wird
eine Rotfärbung
des Transformanten rechts auf den Fotos beobachtet, wie es mit der schwarzen
Farbe angezeigt ist.
-
Wie
gezeigt, wurde Eisenchelat-Reduktase in allen 6 Pflanzen detektiert
(mit Kanamycin selektiert), die für eine Bestätigung der Aktivität der Eisenchelat-Reduktase in Pflanzen
verwendet wurden. Um den Unterschied zwischen dem transformierten
Tabak und Wildtyp-Tabak zu zeigen, wurde eine Reaktionszeit für die Reduktase
von 24 Stunden gewählt,
wobei aber ein Unterschied nach einer Reaktionszeit von etwa 1 Stunde beobachtet
wurde. In allen 6 in den Transformationsexperimenten verwendeten
Pflanzen neigten die Blätter, die
auf das Gel zwecks Detektion der Aktivität gelegt wurden, zum Schrumpeln,
verglichen zu dem Zustand der Wildtyp-Blätter. Dies kann der Expression
des eingeführten
refre1-Gens in den
Blättern
zugeschrieben werden. Obwohl wegen dieses Phänomens Aktivitätstests
nicht so häufig
durchgeführt
wurden, ist es eindeutig, dass das refre1-Gen als Ergebnis der Transkription und
Translation in der Wurzel unter Regulation des CaMV35S-Promotors
exprimiert wird.
-
Wie
oben erklärt,
haben wir einen neuen Tabak erzeugt, der die Eisenchelat-Reduktase FRE1 der Hefe
in der höheren
Pflanze Tabak exprimieren konnte.
-
Die
Gründe,
dass nicht das Volllängen-Transkriptionsprodukt
eines Gens eines anderen Organismus erhalten wird, können auf
zwei Möglichkeiten
zurückgeführt werden,
nämlich
Spleißen
eines Teils der mRNA als ein Intron und Addition von Poly-A innerhalb
der codierenden Region.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Konstruktion einer
Basensequenz bereit, um ein Volllängen-Transkriptionsprodukt
durch Transferieren eines Gens einer anderen Spezies in eine höhere Pflanze
zu erhalten. Um eine Poly-A-Addition in der codierenden Region zu
vermeiden, wurde in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung festgestellt,
dass es erforderlich ist, die Sequenz aus einer fortlaufenden Sequenz
von 8 Basen oder mehr zu konstruieren, ohne eine aus lediglich G
oder T bestehende Sequenz zu enthalten, und die Sequenz so zu konstruieren,
dass sie nicht nur keine Sequenz AATAAA, sondern auch keine Sequenz
enthält,
in der eine der Basen davon durch eine andere Base ersetzt ist (d.h.
NATAAA, ANTAAA, AANAAA, AATNAA, AATANA oder AATAAN).
-
Es
wurde ebenfalls festgestellt, dass es wichtig ist, die Sequenz so
zu konstruieren, dass die G- und C-Gehalte über die gesamte Region konstant
verteilt sind.
-
Außerdem wurde
in der konkreten Anwendung der vorliegenden Erfindung Eisenchelat-Reduktase
im transformierten Tabak in der gesamten Pflanze exprimiert, da
CaMV35S als Promotor eingesetzt war. Wie gezeigt, kann ein lokal
exprimiertes Gen in der gesamten Pflanze als Folge der Kombination
mit dem Promotor exprimiert werden. Andererseits kann das exprimierte
Gen in der gesamten Pflanze mittels Kombination mit einem bevorzugten
Promotor lokal exprimiert werden.
-
Ein
Absorptionsmechanismus mittels Reduktion von Fe(III) ist für einen
Eisenaufnahme-Mechanismus bei den Monocotyledonen und Dicotyledonen,
außer
Gräser,
spezifisch, und auch Gräser
können
Eisen durch Reduktion von Fe(III) zu Fe(II) unter der Bedingung
absorbieren, dass Eisen hinreichend vorhanden ist. Als Folge der
Ligation des Eisenchelat-Reduktase-Gens refre1 der vorliegenden
Erfindung mit einem Promotor, der in der Wurzel unter Eisenmangelbedingungen
spezifisch aktiv ist, kann ein neuartiges Gras geschaffen werden,
in dem ein Eisenabsorptionsmechanismus (I) und Eisenabsorptionsmechanismus
(II) unter Eisenmangelbedingungen funktionsfähig sein kann.
-
Referenzen
in der vorliegenden Erfindung sind hier nachstehend angeführt.
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-
Beispiele
-
Die
vorliegende Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen detailliert
erläutert,
ist aber nicht auf diese Beispiele beschränkt zu verstehen.
-
In
den nachstehenden Beispielen wird eine grundlegende Genmanipulation
gemäß der Beschreibung „Cloning
and Sequencing" (Noson-Bunka-Sha)
durchgeführt,
und die Analyse der Basensequenz des Gens erfolgt unter Anwendung
von DNASIS (hergestellt von Hitachi Corp.).
-
Beispiel 1 (Extraktion
von Gesamt-RNA von FRE1, das in transgenen Tabak eingeführt ist)
-
Extraktion
von Gesamt-RNA von FRE1, das in transgenen Tabak eingeführt ist,
wurde nach dem in der Referenz beschriebenen Verfahren (Naito et
al., 1988) durchgeführt.
-
2
g Blätter
von FRE1-eingeführtem
transgenen Tabak wurden in eine Reibschale verbracht und dem Flüssigstickstoff
hinzugegeben, woraufhin die Blätter
vollständig
zerquetscht wurden. Die dreifache Menge an Extraktionspuffer und
die gleiche Menge an Phenol/Chloroform (1:1) wurden zu dem Brei
gegeben und suspendiert, dann mit 8000 rpm 15 Minuten zentrifugiert
und einmal mit Chloroform extrahiert. Eine Ethanolfällung wurde
bei –80°C 30 Minuten
durchgeführt
und bei 4°C
30 Minuten zentrifugiert. Das Präzipitat
wurde mit 70% Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Präzipitat
wurde in 1 ml DEPC-behandeltem Wasser gelöst, mit 13500 rpm 3 Minuten
zentrifugiert, und der Überstand
wurde in ein neues Röhrchen überführt; außerdem wurde ¼ Volumen
10 M LiCl zugegeben und 2 Stunden auf Eis gehalten. Das Gemisch
wurde mit 12000 rpm bei 4°C
10 Minuten zentrifugiert, dann wurde das Präzipitat mit 70% Ethanol gewaschen
und im Vakuum getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde in 50 μl DEPC-behandeltem
Wasser gelöst.
Reagenzien: | Extraktionspuffer |
| 1
M Tris HCl pH 9,0 |
| 1%
SDS |
(120 μl β-Mercaptoethanol
wurden zu 6 ml Puffer vor Gebrauch gegeben)
-
Beispiel 2: (Reinigung
von Poly-A + RNA und cDNA-Synthese)
-
Poly-A
+ RNA wurde aus 100 μg
Gesamt-RNA, die in Beispiel 1 erhalten wurde, mittels Verwendung von
Dynabeads Oligo (dT) 25 (DYNAL Inc.) gereinigt. Diese Poly-A + RNA
wurde einer reverse Transkriptase-Reaktion mit der M-MLV reversen Transkriptase
(TOYOBO Co. Ltd.) bei 37°C
1 Stunde unter Verwendung des folgenden hybriden Primers unterzogen,
um cDNA zu erhalten.
Hybrider Primer (dT17 Adapterprimer):
5'-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3'
-
Beispiel 3 (RT-PCR und
Bestätigung
der Basensequenz)
-
Die
PCR wurde mit dem für
den hybriden Primer spezifischen Primer und dem 5'-Primer von FRE1 unter Verwendung der
in Beispiel 2 erhaltenen cDNA als Template durchgeführt.
-
Das
Reaktionsprodukt der PCR wurde elektrophoretisch auf 0,8% Agarosegel
aufgetrennt, und die erhaltene Bande wurde in den pT7Blue(R)-Vektor
(Takara Corp.) kloniert. Die Kolonie wurde in LB-Medium über Nacht
in Schüttelkultur
gehalten, das Plasmid mit dem alkalischen SDS-Verfahren extrahiert,
und die Basensequenz der 7 Klone, in denen die Insertion mit Restriktionsenzym-Behandlung
bestätigt
worden war, wurde mit Hilfe der Bca BEST DNA Polymerase („Biotechnology
Experiments Illustrated, Fundamentals of Gene Analysis") (Shujun-Sha) bestimmt.
Primer,
spezifisch für
hybriden Primer:
5'-GACTCGAGTCGACATCG-3'
5'-Primer von FRE1:
5'-ACACTTATTAGCACTTCATGTATT-3'
-
PCR-Reaktionsbedingungen
-
- (1) 95°C
5 Minuten;
- (2) 95°C
40 Sekunden;
- (3) 55°C
30 Sekunden;
- (4) 72°C
1 Minute;
- (5) 72°C
10 Minuten; und
- (6) 4°C
-
Die
oberen Prozeduren (2), (3) und (4) wurden 40-mal wiederholt.
-
Folglich
wurde in dem mit FRE1 transformierten transgenen Tabak Poly-A an
die in 3 gezeigte Stelle in der transkribierten mRNA
vom FRE1-Gen geheftet.
-
Die
Anheftungsstellen von Poly-A waren nicht einheitlich, und mRNA unterschiedlicher
Länge wurde beobachtet.
Eine Sequenz, die als Poly-A-Signal stromaufwärts der Poly-A-Stelle erkannt
werden konnte, wurde als ein mutmaßliches Poly-A-Signal gedeutet.
-
Beispiel 4 (Herstellung
des jeweiligen Segments mittels PCR)
-
Jedes
Segment wurde mittels PCR hergestellt, wie in 5 veranschaulicht.
Die Super Taq (Sawaday Inc.) wurde als Taq-Polymerase verwendet.
-
Die
Zusammensetzung der PCR-Reaktion ist folgendermaßen. PCR-Reaktionslösung im
ersten Schritt:
10 × Puffer | 10 μl |
2 mM
dNTP Gemisch | 10 μl |
20 μM Primer
(-3) | 5 μl |
20 μM Primer
(-4) | 5 μl |
Destilliertes Wasser ad. 99,5 μl Gesamtvolumen PCR-Reaktionslösung im
zweiten Schritt:
PCR-Reaktionslösung des
ersten Schritts | 1 μl |
10 × Puffer | 10 μl |
2 mM
dNTP Gemisch | 10 μl |
20 μM Primer
(-2) | 5 μl |
20 μM Primer
(-5) | 5 μl |
Destilliertes Wasser ad. 99,5 μl Gesamtvolumen PCR-Reaktionslösung im
dritten Schritt:
PCR-Reaktionslösung des
zweiten Schritts | 1 μl |
10 × Puffer | 10 μl |
2 mM
dNTP Gemisch | 10 μl |
20 μM Primer
(-1) | 5 μl |
20 μM Primer
(-6) | 5 μl |
Destilliertes Wasser ad. 99,5 μl Gesamtvolumen
-
PCR-Reaktionsbedingungen:
-
- (1) 95°C
5 Minuten;
- (2) Zugabe von 0,5 μl
Taq
- (3) 95°C
40 Sekunden;
- (4) 45°C
1 Minute;
- (5) 72°C
1 Minute;
- (6) 94°C
40 Sekunden;
- (7) 60°C
30 Sekunden;
- (8) 72°C
1 Minute;
- (9) 72°C
10 Minuten;
- (10) 4°C
-
Die
oberen Prozeduren (3), (4) und (5) wurden 5-mal wiederholt, beziehungsweise
die Prozeduren (6), (7) und (8) wurden 20-mal wiederholt.
-
Beispiel 5 (Klonierung
und Bestätigung
der Basensequenz)
-
Nach
der Elektrophorese der PCR-Reaktionslösung im dritten Schritt in
Beispiel 4 auf 0,8% Agarosegel wurde eine Bande, die die erwartete
Länge besaß (417–436 bp),
herausgeschnitten und gereinigt, dann in das Plasmid pT7Blue(R)
Vektor (Takara Inc.) kloniert. Die Basensequenz des so erhaltenen
Klons wurde bestätigt,
und die exakte Basensequenz wurde mit Hilfe des SHIMADZU Lumineszenz
DNA-Sequenzierers DSQ-1000L
bestimmt.
-
Nachdem
das Segment von jeder exakten Basensequenz erhalten worden war,
wurde ein Volllängen-refre,
1 wie in 8 gezeigt, mit Hilfe der Restriktionsenzymstellen
hergestellt. Eine Orientierung der Insertion der Segmente B und
E war für
die Herstellung voller Längen
wesentlich. Bei den anderen Segmenten wurde die Sequenz, welche
die exakte Basensequenz enthielt, ohne Berücksichtigung der Orientierung
der Insertion verwendet.
-
Die
Volllängen-Basensequenz
des synthetisierten refre1 ist in der Sequenzliste als SEQ ID NR:
1 und in 9 gezeigt.
-
Beispiel 6 (Einführung von
refre1 in Tabak)
-
Ein
Gen, das in Beispiel 5 synthetisierte refre1, wurde in Tabak (Nicotiana
tabacum L. var. SRI) eingeführt.
Als Ergebnis der Transformation wurden 68 individuelle Pflanzen
erzeugt, die gegen Kanamycin resistent waren. Eine genomische Southern-Hybridisierung wurde
durchgeführt,
um die Einführung
eines Zielgens, refre1, in der erzeugten Pflanze und die Kopienzahl
davon zu bestätigen.
Als Ergebnis wurde das Vorhandensein von einer bis zu mehreren Kopien
des refre1-Gens bestätigt.
-
Ein
Verfahren zur Einführung
eines Gens in Pflanzenzellen zur Erzeugung einer Pflanze wurde gemäß der Beschreibung
in „Laboratory
Manual for Functional Analysis of Plant Genes" (Maruzan) durchgeführt.
-
(1) Herstellung des binären Vektors
pRF1 zur Transformation
-
XbaI
und SacI Fragmente von refre1, die in pT7Blue(R) Vektor geklont
waren, wurden gegen den ORF von β-Glucuronidase
des binären
Vektors pBI121 ausgetauscht, um den binären Vektor pRF1 herzustellen.
Die Struktur des binären
Vektors pRF1 ist in 11 gezeigt.
-
(2) Transfer des binären Vektors
pRF1 in Agrobacterium
-
Agrobacterium
tumefaciens C58 wurde bei 26°C
2 Nächte
in 1 ml LB-Flüssigmedium,
das ein geeignetes Antibiotikum enthielt, in Schüttelkultur gehalten, und E.
coli mit pRF1 und E. coli mit Helferplasmid pRK2013 bei 37°C eine Nacht
in 1 ml LB-Flüssigmedium,
das ein geeignetes Antibiotikum enthielt, in Schüttelkultur gehalten. Jeweils
100 μl wurden
auf der LB-Platte gemischt, die keine Antibiotika enthielt. Nachdem das
Gemisch bei 26°C
2 Nächte
kultiviert worden war, wurde die Plattenoberfläche mit Hilfe einer Platinimpföse abgeschabt
und zur Bildung von Einzelkolonien auf der Selektionsplatte [LB-Platte,
die 100 μg/μl Rifampicin (Rf)
und 25 μg/μl Kanamycin
(Km) enthielt] inkubiert (bei 26°C,
2 Nächte).
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Die
so erhaltene Einzelkolonie wurde in 4 ml LB-Flüssigmedium (Km und Rf) bei
26°C 2 Nächte lang in
Schüttelkultur
gehalten, und das Plasmid wurde mit dem alkalischen SDS-Verfahren
extrahiert, woraufhin das Vorliegen von pRF1 durch Beobachten der
Spaltmuster von den Restriktionsenzymen bestätigt wurde.
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(3) Infektion von Tabak
mit Agrobakterium und Regeneration der Pflanze
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Zwei
oder drei junge Blätter
von Tabak (Nicotiana tabacum L. var. SRI) mit einer Größe von etwa
8 cm wurden zerschnitten, in eine Petri-Schale verbracht, die mit
sterilisiertem Wasser (10% Hypochlorige Säure, 0,1% Tween 20) gefüllt war
und unter Rühren
15 Minuten sterilisiert. Die Blätter
wurden mit sterilisiertem Wasser dreimal gespült und in 8-mm-Quadrate mit
einem Skalpell geschnitten. 3 ml Flüssigkultur von Agrobakterium
mit binärem
Vektor pRF1, die bei 26°C
2 Nächte
kultiviert worden waren, wurden zu den Blattfragmenten in der Petri-Schale
gegeben.
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Nach
einer Minute wurde die Flüssigkeit
mit Hilfe einer Pasteurpipette entfernt und die zurückbleibende
Flüssigkeit
mit einem autoklavierten sterilisierten Filterpapier abgezogen.
Die Blätter
wurden auf MS-Medium (II), siehe unten, verbracht und bei 25°C 3 Tage
bei Licht kultiviert. Danach wurden die Blattfragmente auf MS-Medium
(III) transferiert und 1 Woche kultiviert, dann auf MS-Medium (IV)
transferiert und alle 2 Wochen überimpft.
Waren die Kalli induziert und die Schößlinge gebildet, so wurden
die Schößlinge mit
einem Skalpell abgeschnitten und auf MS-Medium (V) transferiert.
Die Schößlinge mit
Wurzeln wurden auf Vermikulit geimpft und unter Versorgung mit Hyponex
(Hyponex Japan Co., Ltd.) angezogen, um die regenerierte Pflanze
zu erhalten.
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Die
Zusammensetzungen der MS-Medien für Tabak in den vorerwähnten Experimenten
sind folgendermaßen. Hauptbestandteile
(g/l)
NH4NO3 | 1,65 |
KNO3 | 1,9 |
CaCl2 × 2H2O | 0,44 |
MgSO4 × 7H2O | 0,44 |
KH2PO4 | 0,17 |
Nebenbestandteile
(mg/l)
H3BO4 | 6,2 |
MnSO4 × 4H2O | 22,3 |
ZnSO4 × 7H2O | 8,6 |
KI | 0,83 |
Na2MoO4 × 2H2O | 0,25 |
CuSO4 × 5H2O | 0,025 |
CoCl2 × 6H2O | 0,025 |
Fe(III)Na-EDTA | 0,042
mg/l |
myo-Inositol | 100
mg/l |
Thiamin | 5
mg/l |
Sucrose | 30
g/l |
Geranyliertes
G | 2
g/l |
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MS-Medium
(I) wurde mit der vorerwähnten
Zusammensetzung zubereitet. Die weiteren MS-Medien wurden durch
Zugabe der folgenden Phytohormone und/oder Antibiotika zum MS-Medium
(I) zubereitet.
MS-Medium
(II) | MS-Medium
(I) + BA + NAA |
MS-Medium
(III) | MS-Medium
(I) + BA + NAA + Claforan |
MS-Medium
(IV) | MS-Medium
(I) + BA + NAA + Claforan + Kanamycin |
MS-Medium
(V) | MS-Medium
(I) + Kanamycin |
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Beispiel 7 (Southern-Analyse)
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(1) Extraktion genomischer
DNA aus Tabak
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Die
Extraktion genomischer DNA aus Tabak wurde nach dem Verfahren durchgeführt, das
in „Plant Cell
Engineering Series: Protocol for PCR Experiments in Plants" (Shujun-Sha) beschrieben
ist.
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0,1–0,2 g Blätter wurden
in eine Reibschale verbracht und dem Flüssigstickstoff hinzugegeben,
woraufhin die Blätter
vollständig
zerrieben wurden. Die zerriebenen Blätter wurden in ein Eppendorf-Röhrchen verbracht,
und 300 μl
2% CTAB-Lösung
wurden zugegeben und gemischt, dann bei 65°C 30 Minuten behandelt. Eine
gleiche Menge Chloroform und Isoamylalkohol (24:1) wurde zugegeben
und 5 Minuten gemischt.
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Das
Gemisch wurde mit 12000 rpm 15 Minuten zentrifugiert und die obere
Schicht in ein neues Röhrchen überführt; dann
wurde die Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion einmal wiederholt
und die obere Schicht in ein neues Röhrchen überführt. 1–1,5 Volumenteile 1% CTAB-Lösung wurden
zugegeben, gemischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur ruhen gelassen,
dann mit 8000 rpm 10 Minuten zentrifugiert. Die obere Schicht wurde
verworfen und 400 μl
1 M CsCl wurden zum Rückstand
gegeben und auf 65°C
erwärmt,
bis sich das Präzipitat
vollständig
löste.
800 μl 100%
Ethanol wurden dazu gegeben, gemischt und bei –20°C 20 Minuten ruhen gelassen,
dann mit 12000 rpm 5 Minuten zentrifugiert. Die obere Schicht wurde
verworfen und der Rückstand
wurde mit 70% Ethanol gewaschen, im Vakuum getrocknet und in 30 μl TE-Puffer
gelöst.
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(2) Schneiden genomischer
DNA mit Restriktionsenzymen und Elektrophorese
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Die
Restriktionsenzym-Behandlung erfolgte durch Verdau mit EcoRI und
HindIII, wobei mit diesem Verdau die Sequenz von pCaMV35S bis tNOS
geschnitten wurde, und durch Verdau mit ausschließlich HindIII, wobei
mit diesem Verdau die Sequenz stromaufwärts von pCaMV35S geschnitten
wurde.
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10 μg genomische
DNA in 100 μl
Reaktionsvolumen wurden über
Nacht mit dem Restriktionsenzym behandelt, durch Zugabe von Ethanol
gefällt
und das Präzipitat
in 20 μl
TE-Puffer gelöst.
Der Lösung
wurden 2 μl
Ladepuffer hinzugegeben, und die Lösung wurde auf 0,8% Agarosegel
bei 60 V 5 Stunden elektrophoretisch behandelt. Nach Beendigung
der Elektrophorese wurde das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt und
auf dem UV-Transluminator mit Skala photographiert.
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(3) Blotting und Hybridisierung
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Nach
dem Photographieren wurde das Gel mit destilliertem Wasser gewaschen
und 10 Minuten in 0,2 N HCl geschüttelt. Ein Blot-Verfahren wurde
gemäß der Beschreibung
in „Cloning
and Sequencing" (Noson-Bunka-Sha)
durchgeführt.
Das Gel wurde auf eine Nylonmembran (New Hybond-N+ Amersham) mit
0,4 N NaOH transferiert und die Membran mit 2 × SSPE 5 Minuten gewaschen
und bei Raumtemperatur 3 Stunden getrocknet. Das Hybridisierungsverfahren
wurde „Biotechnology
Experiments Illustrated, Fundamentals of Gene Analysis" (Shujun-Sha) entnommen.
Die Membran wurde für
eine Vorhybridisierung mit 30 ml Vorhybridisierungspuffer, der zuvor
auf 65°C
erwärmt
worden war, 1 Stunde bei 65°C
behandelt und der Hybridisierungspuffer wurde ausgetauscht (25 ml).
Die Sonde wurde zugegeben und die Hybridisierung bei 65°C 12 Stunden
durchgeführt.
Die Membran wurde zweimal bei 65°C
10 Minuten mit Waschlösung
gewaschen, die zuvor auf 65°C
erwärmt
worden war, und einmal mit einer hoch stringenten Waschlösung bei
65°C 10
Minuten gewaschen. Die Membran wurde mit Saran Wrap eingepackt,
einem Film 24 Stunden exponiert und das Ergebnis wurde mit einem
Image Analyzer (Fuji Photo Film Co. Ltd.). bestätigt. Reagenzien 20 × SSPE
NaCl | 3
M |
NaH2PO4 | 0,2
M |
EDTA | 1
mM |
-
1 M Church Phosphatpuffer
-
0,5
Mol NaH
2PO
4 wurden
zu etwa 800 ml destilliertem Wasser gegeben, mit H
3PO
4 auf pH 7,2 eingestellt, dann auf einen
Liter mit destilliertem Wasser aufgefüllt und autoklaviert. Hybridisierungspuffer
Church
Phosphatpuffer | 0,5
M |
EDTA | 1
mM |
SDS
(v/v) | 7% |
Denaturiertes Lachssperma (1 mg/ml) 1/100 vol
wurde vor Gebrauch zugegeben. Waschlösung
Church
Phosphatpuffer | 40
mM |
SDS
(v/v) | 1% |
Hoch
stringente Waschlösung 0,2 × SSPE
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(4) Präparation der Sonde
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Die
Sonde wurde mit dem random primer DNA labeling kit ver. 2.0 (Takara
Corp.) unter Verwendung von vollangem refre1 als Template (vorausgesetzt
dass [α-32P]-dATP
verwendet wurde) präpariert
und nicht umgesetztes [α-32P]-dATP wurde mit Probe Quant TM G-50 Mikrosäulen (Pharmacia,
Biotech Inc.) entfernt.
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Das
Ergebnis ist in 14 gezeigt. Die linke Seite
in 14 zeigt den Verdau mit den Restriktionsenzymen
EcoRI und HindIII und die rechte Seite in 14 zeigt
den Verdau mit ausschließlich
HindIII. In 14 bedeutet W. T. Wildtyp.
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Beispiel 8 (Northern-Analyse)
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(1) Extraktion von Gesamt-RNA
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Gesamt-RNA
wurde aus Blättern
des transgenen Tabaks, in den refre1 eingeführt war, und aus Blättern des
Wildtyp-Tabaks nach demselben wie in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren
extrahiert.
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(2) Elektrophorese der
RNA
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Elektrophoresegefäß, Gelkammer,
Kamm und Erlenmeyerkolben wurden vorher mit abSolve (RNase-Inhibitor,
Du Pont Inc.) behandelt. 10 ml 20 × MOPS, 2,4 g Agarose und 100
ml sterilisiertes destilliertes Wasser wurden in einen Erlenmeyerkolben
gegeben, und die Agarose wurde in der Mikrowelle gelöst. 10 ml Formaldehyd
wurde zu dem Gel gegeben, das auf etwa 50°C gekühlt wurde, und mit sterilisiertem
destilliertem Wasser wurde auf 200 ml aufgefüllt und nach erfolgter Gelbildung
verwendet. Etwa 800 ml 1 × MOPS
wurden in das Elektrophoresegefäß gegeben,
und für
eine Verwendung als Elektrophoresepuffer wurden 5 μl 10 mg/ml Ethidiumbromid
dazu gegeben. 16 μl
RNA-Probenpuffer wurden zu 10 μg
Gesamt-RNA gegeben, mit sterilisiertem destillierten Wasser auf
20 μl aufgefüllt, und
die Mischung wurde 10 Minuten auf 65°C erwärmt, dann 5 Minuten auf Eis
ruhen gelassen und dann einer Elektrophorese unterzogen. Nach einstündiger Elektrophorese
mit 60 V erfolgte eine weitere zweistündige Elektrophorese mit 120
V. Reagenzien 20 × MOPS
MOPS | 0,4
M |
NaOAc | 0,1
M |
EDTA | 0,02
M |
RNA-Probenpufter
Formaldehyd | 1,6
ml |
Formamid | 5,0
ml |
20 × MOPS | 0,5
ml |
Glycerin-Pigmentlösung | 1,6
ml |
Gesamt | 8,7 ml |
Glycerin-Pigmentlösung
Glycerin | 5
ml |
Bromphenol
Blau | 1
mg |
Xylolanilin | 1
mg |
0,5
M EDTA (pH 8,0) | 0,02
ml |
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(3) Blotting und Hybridisierung
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Nach
der Elektrophorese wurde das Gel auf einen UV-Illuminator gelegt
und mit Skala photographiert. Das Blotverfahren entsprach der Beschreibung
in „Cloning
and Sequencing" (Noson-Bunka-Sha).
Die RNA wurde nämlich
vom Gel auf die Nylonmembran (New Hybond-N, Amersham Inc.) mit 20 × SSPE transferiert. Nach
12 Stunden wurde die Membran mit 2 × SSPE 5 Minuten gewaschen
und bei Raumtemperatur 3 Stunden getrocknet, dann wurde die RNA
auf der Membran mit Hilfe von 5 Minuten UV-Bestrahlung fixiert.
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Das
Hybridisierungsverfahren wurde wie bei der Southern-Hybridisierung
durchgeführt.
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Das
Ergebnis ist in 15 gezeigt. In 15 steht
W. T. für
Wildtyp. Keine Bande wurde in der Spur von Wildtyp (W. T.) detektiert.
In Spur Nr. 1 und Nr. 2 wurden Hauptbanden mit einer Größe von 2,5
kb detektiert, und mehrere Banden wurden in Positionen weiter unten
detektiert.
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Beispiel 9 (Bestätigung der
Eisenchelat-Reduktase)
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Der
transgene Tabak, in den das refre1-Gen eingeführt war, und Wildtyp-Tabak
wurden in Vermikulit verpflanzt und unter Versorgung mit Hyponax
angezogen. Die Aktivität
der Eisenchelat-Reduktase wurde mit Hilfe etwa 5 cm–6 cm großer Pflanzen
bestätigt.
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Zur
Bestätigung
der Aktivität
der Eisenchelat-Reduktase wurde eine Rotfärbung mit Fe(II) verwendet, die
durch die Bildung eines Komplexes mit Bathophenanthrolindisulfonsäure (BPDS),
einem starken Komplexbildner mit Fe(II), hervorgerufen wird. 0,4%
Agarose, die in der Mikrowelle gelöst wurde, wurde zu dem Testpuffer
gegeben und gekühlt.
500 μM Fe(III)-EDTA,
1/100 vol., und 500 μM
BPDS, 1/100 vol., wurden zu dem leicht gekühlten Gel gegeben, gerührt und
in das Gefäß gegeben,
woraufhin auf das Festwerden gewartet wurde. Nachdem der transformierte
Tabak und der Wildtyp-Tabak von Vermikulit befreit waren, wurden
die Wurzeln auf das Gel gelegt, vor Licht geschützt und bei 27°C 24 Stunden
darauf liegen gelassen.
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Das ähnliche
Experiment wurde unter Verwendung einer zweiten Generation der transgenen
Pflanze durchgeführt,
die aus Samen der regenerierten Pflanze gekeimt war. Die Reaktionszeit
in diesem Experiment war auf 1 Stunde festgelegt. Testpuffer
CaSO4 | 0,2
mM |
MES-Puffer
pH 5,5 | 5,0
mM |
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Fotos,
die eine Bestätigung
der Aktivität
der Eisenchelat-Reduktase zeigen, sind in 16 und 17 gezeigt. Ein Foto, das eine Bestätigung der
Aktivität
der Eisenchelat-Reduktase der zweiten Pflanzengeneration zeigt,
ist in 18 gezeigt. Die Reduktion von
Fe(III) wurde als ein Ergebnis der Färbung des Transformanten in
der Rizosphäre
bestätigt.
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