DE69932431T2

DE69932431T2 - Verfahren zum transformieren von pflanzen, die resultierende pflanze und deren gene

Info

Publication number: DE69932431T2
Application number: DE69932431T
Authority: DE
Inventors: Satoshi Narashino-shi Mori; Hiromi Nakanishi; Hiroyuki Oki; Hirotaka Yamaguchi
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1998-03-24
Filing date: 1999-03-24
Publication date: 2007-02-22
Anticipated expiration: 2019-03-25
Also published as: DE69932431T3; WO1999048356A1; US6849724B1; EP1080633B1; EP1080633B2; ES2268855T5; JPH11266876A; EP1080633A4; US20040268432A1; DE69932431D1; EP1080633A1; CA2329273A1; AU754079B2; CA2329273C; JP3920453B2; AU2956999A; ES2268855T3

Description

Fachgebiet
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Transformieren einer Nutzpflanze durch Einführung eines Gens einer anderen Spezies in die Nutzpflanze. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung das Verfahren zum Transformieren der Nutzpflanze, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Region eines Faktors in Bezug zur Poly-A-Addition der mRNA der zu transformierenden Nutzpflanze, die in der Basensequenz des Gens der anderen Spezies enthalten ist, zu einer anderen Basensequenz modifiziert wird, die ohne Bezug zur Poly-A-Addition der mRNA ist, ohne im Wesentlichen die Funktion des Proteins zu verändern, das von dem einzuführenden Gen codiert wird und von der Nutzpflanze hergestellt wird, sowie eine Nukleinsäure, deren hierfür verwendete Basensequenz modifiziert ist, und ein Verfahren zur Herstellung dieser Nukleinsäure.
Hintergrund
Das Wachstum von Pflanzen erfordert eine Vielzahl an Nährstoffen. Die Pflanzen absorbieren die meisten dieser für das Wachstum erforderlichen Nährstoffe über die Wurzeln. Es sind Pflanzen bekannt, die Nährstoffe im Boden aufgrund ererbter geringer Enzymaktivitäten, die für die Absorption von Nährstoffen erforderlich sind, nicht absorbieren können.
Zum Beispiel ist Eisen ein essentielles Element für fast alle Organismen und ist besonders für eine große Anzahl von Enzymen erforderlich, die an Zellfunktionen, wie der Photosynthese oder Atmung, beteiligt sind. Im Boden solubilisiertes Eisen liegt hauptsächlich in Form von Fe(III)-Chelat vor [in manchen Fällen als Fe(II)-Chelat]. Im Allgemeinen wird von den Pflanzen überwiegend Fe(II), relativ zu Fe(III), absorbiert, doch hängt die Absorption von der Pflanzenspezies ab.
Pflanzen besitzen zwei Mechanismen für die Eisenaufnahme, d.h. einen Absorptionsmechanismen (I) (siehe 1) und einen Absorptionsmechanismus (II) (siehe 2) (Mori, 1994).
Der Absorptionsmechanismus (I), der in 1 gezeigt ist, besteht aus: (1) Freisetzung eines Protons in die Rizosphäre (Olson und Brown, 1980), (2) erhöhte Fe(III)-reduzierende Aktivität in der Zellmembran der Wurzeln (Brown et al., 1961 und Chaney et al., 1972) und (3) Exkretion von reduzierten und chelatbildenden Substanzen aus den Wurzeln (Hether et al., 1984). Fe(III) wird nämlich von der freigesetzten chelatbildenden Substanz komplexiert, und Fe(III)-Chelat im freien Raum der Wurzeln wird zu Fe(II) auf der Zellmembran durch die Eisenchelat-Reduktase reduziert und über einen Fe(II)-Transporter absorbiert. Ebenfalls wird vermutet, dass das Proton in die Rizosphäre freigesetzt wird und die Aktivität der Reduktase durch die Absenkung des pH in dem freien Raum zunimmt. Allerdings ist das Problem bekannt, dass aufgrund einer Hemmung der Fe(III)-reduzierenden Aktivität durch einen höheren pH eine starke pH-Pufferwirkung wegen der hohen Konzentration des Carbonatanions zu einem Ausbruch der Kalkchlorose führt (Marchner et al., 1986).
Der Absorptionsmechanismus (II), der in 2 gezeigt ist, ist für Gräser spezifisch und besteht aus: (1) Synthese von Muginsäuren (Phytosiderophor), (2) Freisetzung von Muginsäuren in die Rizosphäre, (3) Bildung eines löslichen Komplexes aus Eisen und Muginsäuren und (4) Absorption des Muginsäuren-Eisen-Komplexes vom Pflanzenkörper (Takagi, 1976 und Takagi et al., 1984). Die Eisenaufnahme mit einem derartigen, bei Gräsern beobachteten Absorptionsmechanismus (II) hat den Vorteil, dass er nicht von höheren pH-Werten gehemmt wird.
Bei Hefe (Saccharomyces cerevisiae), einem Modellorganismus der Eukaryoten, erfolgt die Eisenaufnahme ähnlich wie mit dem obigen Absorptionsmechanismus (I). Da in Untersuchungen über den Genlevel in höheren Pflanzen der Fe(II)-Transporter mittels Komplementierung der Eisenabsorptionsmutante von Hefe kloniert wurde (Eida et al., 1996), ist nicht der genaue Mechanismus der Eisenabsorption untersucht worden.
Im Gegensatz dazu ist der Mechanismus in Hefe (Saccharomyces cerevisiae) ganz genau untersucht worden. Die Absorption von Eisen in Hefe beginnt mit der Reduktion von Fe(III) zu Fe(II) mit Hilfe der Eisenchelat-Reduktase FRE1 und FRE2 (Dancis et al., 1990, 1992, Georgatsou und Alexandraki, 1994). Bei diesem Mechanismus für die Aufnahme von reduziertem Fe(II) in die Zellen ist ein Absorptionsmechanismus mit hoher Affinität und ein Absorptionsmechanismus mit geringer Affinität bekannt.
Bei der Absorption von Eisen mit dem Absorptionsmechanismus hoher Affinität kann das Fe(III) nach Reoxidation von Fe(II) durch die Mehrfachkupfer-Oxidase FET3 (Askwith et al., 1994) in die Zellen mit Hilfe des Eisentransporters FTR1 eingebaut werden (Stearman et al., 1996). Kupfer ist bei der Reoxidation des zweiwertigen Eisens erforderlich (Dancis et al., 1994, Klomp et al., 1997), und der Kupfer liefernde Weg zu FET3 ist ebenfalls untersucht worden (Yuan et al., 1995 und Lin et al., 1997).
Die Absorption von Eisen mit dem Absorptionsmechanismus geringer Affinität kann durch die Wirkung des Fe(II)-Transporters FET4 erfolgen (Dix et al., 1994, 1997).
So kann der Eisenabsorptionsmechanismus der Hefe auf Pflanzen übertragen werden, und es können auf Eisenmangel-Böden wachsende Pflanzen erzeugt werden.
Zu diesem Zweck haben wir transgenen Tabak erzeugt, in den das FRE1-Gen von Hefe transformiert wurde, das von Dr. Dancis (NIH) zur Verfügung gestellt wurde (Yamaguchi, 1995).
Allerdings war in dem transgenen Tabak, in den das FRE1-Gen transformiert worden war, die reduzierende Aktivität im Vergleich zum Wildtyp nicht verändert. Nach der Northern-Hybridiserungsanalyse betrug das Transkriptionsprodukt des Hefegens FRE1 in Tabak lediglich 0,9 kb.
Ein Beispiel einer derartigen unvollständigen Transkription, bei der das Gen einer anderen Spezies in eine höhere Pflanze transformiert worden ist, ist die Cry-Gengruppe, die δ-Endotoxin (ein insektizides Protein) von Bacillus thuringiensis codiert. Über 42 Cry-Gene sind bekannt und sind in 4 Klassen eingeteilt (cryI–cryIV) (Whiteley und Schnepf, 1986). Das Gen, das das insektizide Protein codiert, wurde in eine höhere Pflanze eingeführt, aber es wurde keine Expression, auch nicht eine sehr geringe Expression, festgestellt.
Die Ursache ist möglicherweise (1) eine unterschiedliche Codon-Nutzung, (2) ein hoher AT-Gehalt im Cry-Gen, (3) eine instabile mRNA und (4) ein partielles Spleißen des Cry-Gens als Intron.
Von einer Präparation der höheren Pflanze mit einer hohen Proteinexpression ist berichtet worden. Um nämlich die Cry-Gengruppe in der höheren Pflanze effizient zu exprimieren, wird die Basensequenz des Cry-Gens modifiziert, um mit der Basensequenz der Pflanze zusammenzupassen, und der Primer wird synthetisiert, woraufhin die vollständige Basensequenz mit Hilfe der PCR synthetisiert wird (Perlak et al., 1991, Fujimoto et al., 1993 und Nayak et al., 1997).
Obwohl die Transformation von höheren Pflanzen durch Einführen eines Gens einer anderen Spezies bekannt ist, war die Expression des Gens nicht hinreichend. Verschiedene Gründe sind, wie oben beschrieben, angeführt worden.
Wie haben umfangreiche Untersuchungen über Faktoren zur Erzielung einer hinreichenden Expression eines Gens in einer höheren Pflanze angestellt, die durch Einführen des obigen Gens, das ein Protein mit einer von einem anderen Organismus erfüllten Funktion codiert, transformiert worden ist, um diese Funktion auf eine höhere Nutzpflanze zu übertragen, und festgestellt, dass die Basensequenz des Faktors in Bezug zur Poly-A-Addition der mRNA der transformierten Pflanze ein wichtiger Teil der Expression ist.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Expression des eingeführten Gens in der transgenen höheren Pflanze bei hoher Effizienz, diese transgene höhere Pflanze als auch ein Verfahren zur Modifizierung des Gens davon bereit.
Offenlegung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Transformieren einer Pflanze durch Einführung eines Gens einer anderen Spezies in diese Pflanze bereit, wobei dieses Gen in solcher Weise modifiziert ist, dass das Gen weder eine Sequenz von 8 benachbarten Basen oder mehr, bestehend aus lediglich G und/oder T, noch eine beliebige der folgenden Basensequenzen in Bezug zur Poly-A-Addition der mRNA der Pflanze enthält: NATAAA, ANTAAA, AANAAA, AATNAA, AATANA oder AATAAN, worin N eine beliebige Base ist und worin das von dem Gen codierte Protein funktional bleibt, nachdem das Gen modifiziert worden ist.
Ein Beispiel für die Region eines Faktors in Bezug zur Poly-A-Addition der mRNA ist vorzugsweise eine AATAAA-ähnliche Basensequenz; außerdem ist diese Region eines Faktors in Bezug zur Poly-A-Addition der mRNA die Region, die vorzugsweise stromabwärts der GT-reichen Basensequenz liegt. Darüber hinaus wird die Modifikation der Basensequenz dieser Region vorzugsweise basierend auf der Codon-Nutzung der transformierten Nutzpflanze durchgeführt.
Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die G- und T-reiche Basenregion in dem einzuführenden Gen klein ist; die Differenz in dem G- und C-Basengehalt innerhalb der gesamten Region des einzuführenden Gens klein ist; die Sequenz keine ATTTA-Sequenz aufweist; und/oder stromaufwärts des Initiationscodons des zu transferierenden Gens eine Kozak-Sequenz liegt.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die transformierte Nutzpflanze, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann. Die transformierte Nutzpflanze der vorliegenden Erfindung kann der pflanzliche Organismus und der Samen sein und ist in der Form nicht beschränkt.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure, insbesondere DNA, mit einer modifizierten Basensequenz, die für das obige Transformierungsverfahren verwendet werden kann.
Die Basensequenz der Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung ist eine modifizierte Basensequenz, die in der transformierten Nutzpflanze mit hoher Effizienz exprimiert werden kann und zum Beispiel ein Faktor in Bezug zur Poly-A-Addition von mRNA dieser Nutzpflanze ist und dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Teil eines Faktors in Bezug zu dieser Poly-A-Addition durch eine andere Basensequenz ersetzt ist und außerdem diese Basensequenz eine kleine G- und T-reiche Basenregion in dem einzuführenden Gen aufweist, eine kleine Differenz zwischen G- und C-Basengehalt in dem einzuführenden Gen aufweist, keine ATTTA-Sequenz aufweist und/oder vorzugsweise stromaufwärts des Initiationscodons des einzuführenden Gens eine Kozak-Sequenz aufweist.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der obigen Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass die obigen Nukleinsäuren in mehrere Fragmente aufgeteilt sein können und diese Fragmente ligiert werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Absorptionsmechanismus (I) von Eisen in Pflanzen.
2: Absorptionsmechanismus (II) von Eisen in Pflanzen.
3: Stelle der Poly-A-Addition in höheren Pflanzen.
4: G- und T-reiche Sequenz im Hefegen FRE1.
5: Schematische Darstellung der refre1-Synthese.
6: Sequenz der in der Synthese von refre1 eingesetzten 30 Primer.
7: Beziehung zwischen refre1-Sequenz und Primer.
8: Präparationsschema des vollständigen refre1.
9: Gesamtsequenz des konstruierten refre1.
10: Graphische Darstellung der G- und T-Gehalte in FRE1 (oberes Bild) und refre1, mit dem 8 Basenfenster berechnet.
11: Struktur des binären Vektors pRF1.
12: Foto, das das Wachstum der transgenen Pflanze der vorliegenden Erfindung zeigt.
13: Foto, das die Blüte der transgenen Pflanze der vorliegenden Erfindung zeigt.
14: Ergebnis einer Southern-Hybridisierung der Transformanten unter Verwendung von refre1 als Sonde.
Links: Verdau mit EcoRI und HindIII
Rechts: Verdau mit HindIII
Nr. 1–Nr. 12: Transformanten
W. T.: Wildtyp
15: Ergebnis einer Northern-Hybridisierung der Transformanten unter Verwendung von refre1 als Sonde.
Nr. 1–Nr. 2: Transformanten
W. T.: Wildtyp
16: Ein Foto, das die Aktivität der Eisenchelat-Reduktase in Wurzeln zeigt, die durch die Rotfärbung des BPDS-Fe(II)-Komplexes mit Fe(II) kenntlich gemacht ist.
Links: Wildtyp, der keine Rotfärbung zeigt.
Rechts: Transformant, der eine Rotfärbung im Wurzelbereich zeigt.
17: Foto, das das gleiche Experiment wie in 16 mit einem anderen Transformanten zeigt. Eine Rotfärbung wird im Transformanten beobachtet (rechts).
18: Foto, das die Aktivität der Eisenchelat-Reduktase mittels Rotfärbung des BPDS-Fe(II)-Komplexes in Wurzeln einer zweiten Generation Pflanzen zeigt, die aus Samen des Transformanten erhalten sind. Eine Rotfärbung des BPDS-Fe(II)-Komplexes wird in der zweiten Generation des Transformanten beobachtet (links).
Primäre Anwendungsform für die Durchführung der Erfindung
Die in der vorliegenden Erfindung transformierten Nutzpflanzen unterliegen keiner Beschränkung, wenn sie als Nahrungsmittel und als Pharmazeutika industriell genutzte Pflanzen sind und vorzugsweise höhere Pflanzen sind, wie Getreide, Gemüse, Früchte und Tabak.
Ein weiteres Gen, das bei der vorliegenden Erfindung eingeführt wird, unterliegt keiner Beschränkung, falls es für die Pflanzen zweckdienlich ist und es keine nachteiligen Wirkungen für Pflanzen und Menschen besitzt. Es kann ein unmittelbar zweckdienliches Gen für Pflanzen sein, das eine Resistenz gegen Chemikalien, wie Herbizide, bereitstellt und vorzugsweise ein Enzym ist, das aus Organismen, wie Bakterien und Hefen, stammt. Zum Beispiel ist Eisenchelat-Reduktase FRE1 von Hefe bevorzugt, die an der Absorption von Eisen beteiligt ist.
Wir haben festgestellt, dass in einer transformierten Pflanze Faktoren, die die Expression des eingeführten Gens beeinflussen, eine Basensequenz sein können, welche die Addition von Poly-A von mRNA bestimmt. Außerdem haben wir festgestellt, dass stromaufwärts der Basensequenz, die eine Addition von Poly-A definiert, eine GT-reiche Basensequenz erforderlich ist. Das heißt, dass bei Vorliegen einer GT-reichen Basensequenz die Addition von Poly-A in Pflanzen festgelegt ist; anschließend wird die mRNA an der Position 10–30 bp nach dem Poly-A-Signal, zum Beispiel einer AATAAA-ähnlichen Basensequenz, gespalten, woraufhin Poly-A durch die Wirkung der Poly-A-Polymerase angehängt wird. Dementsprechend kann, wenn das eingeführte Gen eine solche Basensequenz aufweist, in der transgenen Pflanze die mRNA nicht in voller Länge exprimiert werden, und die mRNA wird an der Position 10–30 bp nach dem Poly-A-Signal mit der AATAAA-ähnlichen Basensequenz gespalten.
Folglich ist die vorliegende Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass das Poly-A-Signal der Pflanze in dem eingeführten Gen, zum Beispiel die AATAAA-ähnliche Basensequenz, vorzugsweise eine GT-reiche Basensequenz, zu einer anderen Basensequenz modifiziert ist.
Ein Verfahren zur Konstruktion einer modifizierten Basensequenz besteht zunächst darin, das Codon so zu wählen, dass die von dem einzuführenden Gen codierte Aminosäuresequenz nicht verändert wird. Die Aminosäuresequenz kann verändert werden, falls die Sequenz keinen wesentlichen Effekt auf die Funktion für das Protein besitzt, vorzugsweise wird die Aminosäuresequenz aber nicht verändert.
In dem Falle, bei dem mehrere Codons, die eine Aminosäure codieren, bekannt sind, wird vorzugsweise das Codon mit einer hohen Nutzungsrate in der Pflanze ausgewählt, indem die Codon-Nutzung der zu transformierenden Pflanze betrachtet wird.
Außerdem ist nicht nur eine Modifikation der Basensequenz des Poly-A-Signals, sondern auch eine Deletion der GT-reichen Basensequenz bevorzugt. Eine Modifikation zur Verminderung des GT-Gehalts in dieser Region ist besonders in dem Fall wichtig, bei dem die GT-reiche Basensequenz in einem hohen Anteil vorliegt, da dann die Möglichkeit einer Spaltung der mRNA in der Region der Poly-A-Signal-ähnlichen Basensequenz groß ist, die stromabwärts der GT-reichen Basensequenz liegt.
Außerdem ist bei der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu der oben erwähnten Modifikation eine Modifikation bevorzugt, welche die Differenz zwischen dem G- und C-Basengehalt über die gesamte Region des einzuführenden Gens verringert. Bevorzugter sollte die Sequenz keine ATTTA-Sequenz enthalten, die bekanntlich zu einer instabilen mRNA-Sequenz führt, und/oder die Sequenz sollte eine Kozak-Sequenz aufweisen, die bekanntlich als eine Sequenz für eine effektive Translation von mRNA in Eukaryoten stromaufwärts des Initiationscodons des einzuführenden Gens gilt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst eine Modifikation einer Basensequenz, das außerdem mit einem üblichen Verfahren zur Modifikation der oben erwähnten Modifikation der Basensequenz kombiniert ist.
Das Verfahren zur Modifikation der Basensequenz kann ohne Einschränkung mit Hilfe bekannter verschiedener Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel kann jedes herkömmliche Verfahren zur Modifikation mit Hilfe von Punktmutation und Schneiden mit Restriktionsenzym angewendet werden.
Außerdem kann in dem Fall, bei dem eine große Anzahl von Basen zu modifizieren ist oder das einzuführende Gen selbst eine kurze Länge aufweist, das Gen mittels Synthese hergestellt sein. Wie später noch ausführlicher erläutert, wird das Gen, auch wenn es lang ist, in mehrere Fragmente aufgeteilt und jedes Fragment, das mit Hilfe der PCR amplifiziert ist, unter Verwendung von Restriktionsenzymen ligiert; folglich kann das Gen mit einer modifizierten Basensequenz hergestellt werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird außerdem noch konkreter erläutert, wobei aber das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht auf den Rahmen der folgenden Erläuterung beschränkt werden kann, da vielfältige Anwendungen, basierend auf dieser Erläuterung, vom Fachmann vorgenommen werden können.
Wir haben versucht, die Ursache dafür zu finden, warum die Länge der mRNA des Hefe-FRE1, das in Tabak eingeführt war, kurz war (0,9 kb). Als Gründe für die unvollständige Länge des Transkriptionsprodukts der Eisenchelat-Reduktase FRE1 der Hefe, die in Tabak eingeführt war, wurden zwei Möglichkeiten in Betracht gezogen, nämlich:

(1) ein Teil der mRNA wurde als Intron gespleißt und
(2) eine Transkription wurde innerhalb der codierenden Region abgebrochen.

Als Ergebnis einer weiteren Analyse mit Hilfe der RT-PCR wurde festgestellt, dass eine Poly-A-Addition innerhalb der codierenden Region in dem transgenen Tabak erfolgte, in den das FRE1-Gen transformiert war.
Ein Beispiel für eine bestätigte Expression eines in eine höhere Pflanze eingeführten Hefegens ist die Invertase (Hincha et al., 1996). In dem vorliegenden Experiment konnten neue Erkenntnisse erhalten werden, wo nach Einführen des FRE1-Gens sogar im gleichen eukaryotischen Gen eine Volllängen-mRNA nicht synthetisiert werden kann.
Der Grund, warum eine Volllängen-mRNA nicht in dem FRE1-transformierten transgenen Tabak synthetisiert werden konnte, war eine Addition von Poly-A innerhalb der codierenden Region von FRE1.
Eine Poly-A-Stelle ist nicht auf eine Position beschränkt, und stromaufwärts von jeder Poly-A-Stelle wurde eine AAUAAA-ähnliche Sequenz, eine mutmaßliche Region eines Poly-A-Signals, festgestellt. Obwohl mehrere AAUAAA-ähnliche Sequenzen an der 5'-Stelle von FRE1 festgestellt wurden, wurde allerdings eine Poly-A-Addition an diesen Stellen nicht beobachtet.
Es kann eine GU-reiche Sequenz stromaufwärts des Poly-A-Signals angeordnet werden, um eine Addition von Poly-A in der Pflanze festzulegen. Ist nämlich eine GU-reiche Sequenz vorhanden, so kann eine Addition von Poly-A in der Pflanze erfolgen, wobei an der Position von „PyA", die sich in einer Entfernung von 10–30 bp von der anschließend gelegenen AAUAAA-ähnlichen Sequenz befindet, die mRNA geschnitten wird, und dann folglich Poly-A durch die Funktion der Poly-A-Polymerase angehängt werden.
Schließlich ist eine Ursache für die ausbleibende Bildung von Volllängen-mRNA in transgenem Tabak, in den FRE1 transformiert ist, die Tatsache, dass die GU-reiche Sequenz ohne Bezug zur Poly-A-Addition in Hefe die Addition von Poly-A in Pflanzen bestimmt.
Eine Sequenz von Eisenchelat-Reduktase FRE1 mit einer GT-reichen Region ist in 4 gezeigt. In 4 sind die GT-reichen Regionen als eingerahmte Sequenzen dargestellt.
Um die Eisenchelat-Reduktase in Tabak zu exprimieren, kann folglich eine Deletion der GT-reichen Sequenz von FRE1 nützlich sein. Allerdings ist bis heute für die Sequenz, die eine Poly-A-Addition in Pflanzen festlegt, nur bekannt, dass eine Konsensus-Sequenz GU-reich sein kann und die Sequenz nicht vollständig bestimmt ist. Solange die genaue Konsensus-Sequenz nicht bekannt ist, besteht die Möglichkeit, dass die vollständige mRNA lediglich durch eine Änderung der Sequenz nicht zu erhalten ist. Wir haben deshalb versucht, eine Basensequenz zu konstruieren, die der Codon-Nutzung der zu transformierenden Pflanzen entspricht, ohne die Aminosäuresequenz von FRE1 zu verändern, um die Volllängen-mRNA in Pflanzen zu synthetisieren.
Um die Eisenchelat-Reduktase der Hefe in Tabak zu exprimieren, haben wir die Basensequenz entsprechend der Codon-Nutzung von Tabak umgestaltet, ohne die Aminosäuresequenz von FRE1 zu verändern. Bei der Gestaltung der Basensequenz werden die folgenden Punkte berücksichtigt.

(1) Die GT-reiche Region wird eliminiert;
(2) Die Basensequenz AATAAA, die ein Poly-A-Signal sein kann, und ähnliche Basensequenzen werden eliminiert;
(3) Um die Basensequenz in einfacher Weise zu bestätigen, kommen Restriktionsstellen etwa alle 400 bp (417–436 bp) vor und ist die Sequenz in 5 Segmente unterteilt;
(4) Die Basensequenz, ATTTA (Ohme-Takagi, 1993), die als instabile mRNA-Sequenz bezeichnet wird, wird eliminiert;
(5) Um den G- und C-Basengehalt in der gesamten Region zu nivellieren, werden Codonpositionen getauscht;
(6) Die Kozak-Sequenz, die eine Sequenz für eine wirksame Translation von mRNA in Eukaryoten ist (Kozak, 1989), wird vor dem Initiationscodon angeheftet.

Die so gestaltete modifizierte Basensequenz von Eisenchelat-Reduktase FRE1 von Hefe ist in der Sequenzliste als SEQ ID NR: 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenz davon ist als SEQ ID NR: 2 gezeigt.
Die gestaltete Sequenz wird als rekonstruierte FRE1 bezeichnet (nachstehend als „refre1" bezeichnet).
Die refre1 der vorliegenden Erfindung wird durch Unterteilen in 5 Segmente (A–E) synthetisiert, wie in 5 gezeigt.
Das Segment A besteht aus einer Sequenz der Basenpaare 1–434, in der die Restriktionsstellen in Base 1: EcoRI, Base 7: XbaI und Base 429: BamHI vorgesehen sind.
Das Segment B besteht aus einer Sequenz der Basenpaare 429–845, in der die Restriktionsstellen in Base 429: BamHI und Base 840: MroI vorgesehen sind.
Das Segment C besteht aus einem Segment der Basenpaare 840–1275, in dem die Restriktionsstellen in Base 840: MroI und Base 1270: SalI vorgesehen sind.
Das Segment D besteht aus einem Segment der Basenpaare 1270–1696, in dem die Restriktionsstellen in Base 1270: SalI und Base 1691: PstI vorgesehen sind.
Das Segment E besteht aus einem Segment der Basenpaare 1691–2092, in dem die Restriktionsstellen in Base 1691: PstI, Base 2081: SacI und Base 2087: HindIII vorgesehen sind.
Jedes Segment A–E besteht jeweils aus einer Sequenz mit 417–436 bp, ist unter Verwendung von 6 Primern, bestehend aus 77–83 Basenpaaren, synthetisiert. Die dreißig eingesetzten Primer, von A-1 bis E-6, sind in 6 gezeigt. Diese Basensequenzen sind in den Sequenzlisten SEQ ID NR: 5–SEQ ID NR: 34 gezeigt.
Die Primer in den Segmenten -1, -2 und -3 sind Sense-Stränge und Primer -4, -5 und -6 sind Antisense-Stränge. Die Primer sind so konstruiert, dass sie eine komplementäre Basensequenz aufweisen, die aus 12 oder 13 bp am 3'-Ende der Primer -3 und -4 besteht, und eine überlappende Sequenz aufweisen, die aus 12 oder 13 bp am 3'-Ende der Primer -1 und -2, -2 und -3, -4 und -5, und -5 und -6 besteht. Der Primer -1 und -6 ist mit einer Restriktionsstelle an der Base 1 am 5'-Ende konstruiert.
Die Beziehung zwischen diesen Primern und der konstruierten Basensequenz ist in 7 gezeigt.
Die jeweiligen Segmente A–E sind mit Hilfe der PCR unter Verwendung von Primern hergestellt, die entsprechend der oberen Basensequenz synthetisiert sind (siehe 5).
Nachdem die Reaktionsmischung des dritten PCR-Schrittes in 0,8% Agarosegel elektrophoretisch getrennt worden war, wurden die Banden mit der erwarteten Länge (417–436 bp) ausgeschnitten und gereinigt, dann in Plasmid pT7Blue(R) Vektor (von Takara Corp. erhalten) kloniert. Die Basensequenzen der erhaltenen Klone wurden bestätigt, und die Klone mit den exakten Basensequenzen wurden mit Hilfe des Fluoreszenz-DNA Sequenzierer DSQ-1000L (von Shimadzu Corp. hergestellt) ausgewählt.
Segmente mit den exakten Sequenzen wurden erhalten und refre1 voller Länge wurde mit Hilfe der Restriktionsstellen gemäß den in 8 gezeigten Verfahren erhalten.
Die Orientierung der Insertion der Segmente B und E ist für die Volllängen-Herstellung unbedingt erforderlich. Bei den anderen Segmenten waren die Segmente, welche die exakten Basensequenzen enthalten, ohne Bezug zur Orientierung der Insertion verwendet.
Die gesamte Basensequenz des erhaltenen refre1 ist in 9 gezeigt. Spezifische Merkmale der Sequenz von refre1 sind:

(1) 75,3% Homologie zum ursprünglichen FRE1 (100% Homologie der Aminosäuresequenz);
(2) Sie weist keine Sequenz auf, die aus lediglich G oder T besteht, die zu mehr als 8 Basen fortlaufend verknüpft sind;
(3) Sie enthält nicht nur keine Sequenz AATAAA, sondern auch keine Sequenzen, in denen irgendeine der Basen in der obigen Sequenz ausgetauscht ist;
(4) Sie enthält keine Sequenz ATTTA; und
(5) Es wird kein Unterschied im GC-Gehalt über die gesamte Region der Sequenz beobachtet.

10 zeigt eine verringerte Anzahl an Sequenzen, die aus sequentiellem G und T in refre1 bestehen, verglichen mit der ursprünglichen FRE1. Dies veranschaulicht der GT-Gehalt von 8 sequentiellen Basen in der FRE1 und refre1-Sequenz. 10 zeigt die gleichförmige Verteilung des GT-Gehalts in refre1, im Vergleich zur ursprünglichen FRE1.
Das so synthetisierte Gen refre1 wird in Tabak (Nicotiana tabacum L. var. SRI) eingeführt. Als Folge der Transformation wurden 68 Kanamycin-resistente Pflanzen reproduziert. Um die Transformation des Zielgens in der reproduzierten Pflanze und seine Kopienzahl zu bestätigen, wurde eine genomische Southern-Hybridisierung vorgenommen. Als Ergebnis wurden ein bis mehrere Kopien des transformierten refre1-Gens in den Pflanzen bestätigt.
Ein Verfahren zur Einführung eines Gens in Pflanzenzellen für eine Reproduktion der Pflanze kann ein herkömmliches Verfahren sein, wie es zum Beispiel in „Laboratory Manual on functional analysis of plant gene" (Maruzen) [Ref. (4)], beschrieben ist.
Spezifisch wurde ein Fragment der Restriktionsenzyme, XbaI und SacI, in refre1, das mit dem pT7Blue(R) Vektor mit dem obigen Verfahren kloniert war, gegen den ORF von β-Glucuronidase in dem binären Vektor pBI121 (TOYOBO Co. Ltd.) ausgetauscht, um den binären Vektor pRF1 herzustellen. Die Struktur des binären Vektors pRF1 ist in 11 gezeigt.
Der so erhaltene binäre Vektor pRF1 wurde in E. coli transformiert, und E. coli, das das Helferplasmid pRK2013 trägt, wurde bei 37°C über Nacht in Schüttelkultur gehalten. Andererseits wurde Agrobacterium tumefaciens C58 in 1 ml LB-Flüssigkulturmedium, das ein geeignetes Antibiotikum enthielt, bei 26°C 2 Nächte in Schüttelkultur gehalten. Je 100 μl davon wurde auf eine LB-Platte, die kein Antibiotikum enthielt, ausgebracht, bei 26°C 2 Nächte kultiviert, woraufhin die Plattenoberfläche mit einem Platinspatel abgeschabt wurde und auf der Selektionsplatte [LB-Platte, die 100 μl/μg Rifampicin (Rf) und 25 μg/μl Kanamycin (Km) enthielt] bei 26°C 2 Nächte kultiviert wurde, um eine Einzelkolonie zu bilden.
Die Einzelkolonie wurde in 4 ml LB (Km und Rf) Flüssigmedium bei 26°C 2 Nächte in Schüttelkultur gehalten. Das Plasmid wurde extrahiert und mit Restriktionsenzym behandelt. Das Restriktionsstellenmuster des Plasmids zeigte, dass pRF1 vorlag.
Die zu transformierende Pflanze wurde folgendermaßen präpariert.
Zwei oder drei junge Blätter, etwa 8 cm groß, des Wildtyp-Tabaks wurden zerteilt und in einer Petri-Schale, die mit sterilisierter Lösung (10% Hypochlorige Säure und 0,1% Tween 20) gefüllt war, unter Rühren 15 Minuten sterilisiert. Nach dreimaligem Waschen mit sterilem Wasser wurden die Blätter in 8 mm Quadrate zerschnitten. Zu den Blättern in einer Petri-Schale wurde 3 ml Kulturflüssigkeit des den binären Vektor tragenden Agrobacterium tumefaciens C58 gegeben, das bei 26°C 2 Nächte kultiviert war. Nach 1 Minute wurde die Flüssigkeit mit einer Pasteurpipette rasch entfernt und die zurückbleibende Flüssigkeit mit einem autoklavierten Filterpapier abgezogen.
Die Fragmente der Blätter wurden auf ein Kulturmedium verbracht, dem Benzyladenin und Naphthalenessigsäure zum MS-Medium gegeben war, und im Licht bei 25°C 3 Tage kultiviert. Danach wurden die Fragmente der Blätter in Medium transferiert, dem CLAFORAN zugefügt war, und 1 Woche kultiviert und weiter in ein Medium überführt, dem CLAFORAN und Kanamycin zugefügt war, dann alle 2 Wochen überimpft. Wenn die Kalli induziert und die Schößlinge gebildet waren, wurden die Schößlinge mit dem Skalpell abgeschnitten und in das MS-Medium überführt, dem Kanamycin zugefügt war.
Die Schößlinge mit Wurzeln wurden in Vermikulit verpflanzt, und die Pflanzen wurden unter Versorgung mit Hyponex (Hyponex Japan Co. Ltd.) angezogen, um transgene Pflanzen zu erhalten.
68 transgene Pflanzen mit einer Kanamycin-Resistenz konnten als Folge der Transformation erhalten werden. Ein beispielhaftes Foto der gewachsenen Pflanze ist in 12 gezeigt und ein Foto der blütentragenden Pflanze ist in 13 gezeigt.
Von diesen wurden 5 individuelle Pflanzen einer genomischen Southern-Hybridisierung unterzogen. Das Ergebnis ist in 14 gezeigt.
Bei der genomischen Southern-Hybridisierung erfolgte die Extraktion der genomischen DNA des transgenen Tabaks gemäß der Beschreibung in „Plant Cell Technology Series 2, Protocol for PCR Experiments of Plants" (Shujun-Sha) [Ref. (2)]. Die erhaltene genomische DNA wurde mit Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII verdaut, und die Hybridisierung wurde mit einer Sonde durchgeführt, die mit dem Voll längen-Fragment von refre1 als Template hergestellt war ([α-32P]-dATP wurde verwendet).
In der in 14 gezeigten Southern-Hybridisierung wurden Mengen an DNA nach der Restriktionsenzymbehandlung aufgetrennt, allerdings wurde eine Abweichung aufgrund der Behandlung mit Ethanol nach der Restriktionsenzymbehandlung beobachtet. Folglich spiegelt die Intensität der detektierten Banden nicht immer die Anzahl an Kopien des eingeführten Gens wider.
Beim Verdau mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII wurde eine Bande mit einer Größe von 3,2 kb beobachtet, die in allen Individuen erwartet wurde. Allerdings wurde in dem Individuum Nr. 12 eine Bande geringfügig kleiner als 3,2 kb detektiert. Nach diesem Ergebnis wurde vermutet, dass 1 Kopie von refre1 in Nr. 1 und Nr. 11, 3 oder 4 Kopien in Nr. 2 und 4 Kopien in Nr. 9 vorlagen.
Beim Verdau mit HindIII bei Nr. 12 konnte die Bande aufgrund des fehlerhaften Ladens des Gels nicht detektiert werden.
Als Ergebnis der Analyse der obigen Southern-Hybridisierung wurde festgestellt, dass refre1 in die ausgewählten fünf Individuen eingeführt wurde.
Wird die Sequenz mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII geschnitten, so wird eine Sequenz vom Promotor bis zum Terminator geschnitten und das eingeführte refre1-Gen wird unter der Regulation des CaMV35S-Promotors in mRNA transkribiert. Beim EcoRI und HindIII-Verdau von Nr. 12 könnte ein Grund für die Detektion einer geringfügig kleineren Bande als 3,2 kb der Tatsache zugeschrieben werden, dass eines der eingeführten Konstrukte vor Integration in das pflanzliche Genom geschnitten wurde und in eine Position nahe der EcoRI oder HindIII-Stelle im pflanzlichen Genom inseriert wurde.
Als nächstes wurde die Bildung von Volllängen-mRNA im transformierten Tabak Nr. 1 und Nr. 2 mittels Northern-Analyse bestätigt, wo das eingeführte refre1-Gen oben mittels genomischer Southern-Analyse bestätigt worden war.
Bei der Northern-Analyse wurde ein Blot-Verfahren zum Beispiel nach dem herkömmlichen Verfahren angewandt, das in „Cloning and Sequencing" (Noson-Bunka-Sha) [Ref. (1)] beschrieben ist, und das Hybridisierungsverfahren erfolgte nach dem wie in obiger Southern-Analyse beschriebenen Verfahren.
Ein Ergebnis der Northern-Hybridisierung ist in 15 gezeigt. In 15 wird keine Bande in der Wildtyp-Spur (W. T.) beobachtet. In den Spuren von Nr. 1 und Nr. 2 werden Hauptbanden mit einer Größe von 2,5 kb und mehrere Banden detektiert, die kleiner als die Hauptbanden sind.
Bei der Northern-Analyse konnte die Bildung von Volllängen-mRNA als Ergebnis der Einführung von refre1 der vorliegenden Erfindung bestätigt werden. Bei der vorliegenden Analyse wird, obwohl grundsätzlich die Gesamt-mRNA aus der Wurzel extrahiert werden sollte, in der die mRNA erwartungsgemäß überexprimiert wird, in diesem Experiment die Extraktion aus Blättern durchgeführt, da dann, wenn die Wurzel abgeschnitten wird, keine Pflanze der nachfolgenden Generation erhalten werden kann. Da CaMV35S als Promotor verwendet wird und das refre1-Gen in allen Teilen der Pflanze exprimiert wird, wird selbst bei der Analyse, die mittels Extraktion von Gesamt-mRNA aus Blättern durchgeführt wird, die Bestätigung erhalten, dass die Transkription in Blättern und Wurzeln der Pflanzen erfolgt und die Stelle der Poly-A-Addition nicht verändert ist.
Als Ergebnis der Northern-Hybridisierung könnte, das das Transkriptionsprodukt mit 2,5 kb im Tabak, in den refre1 eingeführt war, bestätigt wurde, eine Poly-A-Addition durch den NOS-Terminator vorkommen. Volllängen-mRNA wurde ebenfalls in dem Tabak festgestellt, in den refre1 eingeführt war.
Eine Bande, die kleiner als 2,5 kb war, wie in 15 zu erkennen, wird an der rRNA entsprechenden Position detektiert, wie es ein Vergleich des Fotos nach der Elektrophorese zeigt. Obwohl eine unspezifische Adsorption der Sonde an rRNA vermutet wurde, da sie nicht mit Wildtyp-RNA hybridisierte, hybridisiert sie selbstverständlich mit dem Transkriptionsprodukt von refre1. Es kann möglicherweise die kürzere mRNA anstatt der Volllängen-mRNA von refre1 gebildet werden. Da sie als gleich lang wie rRNA detektiert wird, kann allerdings vermutet werden, dass bei der RNA-Elektrophorese mRNA von refre1 von rRNA mitgeschleppt sein kann, die in großen Mengen vorliegt. Diese Ursache kann mit einer Northern-Hybridisierung mit gereinigter Poly-A + RNA überprüft werden, wobei allerdings, wie aus 15 eindeutig zu erkennen, der Großteil der mRNA eine Volllängen-mRNA ist und deshalb kein Anlass besteht, dies weiter zu verfolgen und abzuklären.
Um die Northern-Hybridisierung durchzuführen, wurde RNA des Transformanten Nr. 1, in dem 1 Kopie festgestellt wurde, und RNA des Transformanten Nr. 2, in dem 3 oder 4 Kopien festgestellt wurden, elektrophoretisch behandelt und daraufhin festgestellt, dass die Banden von Nr. 2 in Abhängigkeit der Kopienzahl vom refre1-Gen dunkel gefärbt waren.
Außerdem wurde bei den erhaltenen 68 transformierten Tabakpflanzen (Kanamycin-Selektion) eine konstante Eisenchelat-Reduktase in der Wurzel in 6 Pflanzen bestätigt.
Für die Detektion der Reduktase-Aktivität wurde die Eigenschaft der Rotfärbung des Komplexes aus Bathophenanthrolindisulfonsäure (BPDS), die ein starker Chelator für Fe(II) ist, mit Fe(II) genutzt. Nach Entfernung von Vermikulit vom Transformanten und Wildtyp-Tabak wurden die Wurzeln, die mit Aluminiumfolie vor Licht geschützt waren, auf ein BPDS-haltiges Gel gelegt und bei 27°C 24 Stunden ruhen gelassen. Eine Reduktion von Fe(III) wurde durch die Färbung der Rizosphäre des Transformanten bestätigt.
Fotos, die eine Reduktase-Aktivität bestätigen, sind in 16 und 17 gezeigt. In den Fotos von 16 und 17 wird eine Rotfärbung des Transformanten rechts auf den Fotos beobachtet, wie es mit der schwarzen Farbe angezeigt ist.
Wie gezeigt, wurde Eisenchelat-Reduktase in allen 6 Pflanzen detektiert (mit Kanamycin selektiert), die für eine Bestätigung der Aktivität der Eisenchelat-Reduktase in Pflanzen verwendet wurden. Um den Unterschied zwischen dem transformierten Tabak und Wildtyp-Tabak zu zeigen, wurde eine Reaktionszeit für die Reduktase von 24 Stunden gewählt, wobei aber ein Unterschied nach einer Reaktionszeit von etwa 1 Stunde beobachtet wurde. In allen 6 in den Transformationsexperimenten verwendeten Pflanzen neigten die Blätter, die auf das Gel zwecks Detektion der Aktivität gelegt wurden, zum Schrumpeln, verglichen zu dem Zustand der Wildtyp-Blätter. Dies kann der Expression des eingeführten refre1-Gens in den Blättern zugeschrieben werden. Obwohl wegen dieses Phänomens Aktivitätstests nicht so häufig durchgeführt wurden, ist es eindeutig, dass das refre1-Gen als Ergebnis der Transkription und Translation in der Wurzel unter Regulation des CaMV35S-Promotors exprimiert wird.
Wie oben erklärt, haben wir einen neuen Tabak erzeugt, der die Eisenchelat-Reduktase FRE1 der Hefe in der höheren Pflanze Tabak exprimieren konnte.
Die Gründe, dass nicht das Volllängen-Transkriptionsprodukt eines Gens eines anderen Organismus erhalten wird, können auf zwei Möglichkeiten zurückgeführt werden, nämlich Spleißen eines Teils der mRNA als ein Intron und Addition von Poly-A innerhalb der codierenden Region.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Konstruktion einer Basensequenz bereit, um ein Volllängen-Transkriptionsprodukt durch Transferieren eines Gens einer anderen Spezies in eine höhere Pflanze zu erhalten. Um eine Poly-A-Addition in der codierenden Region zu vermeiden, wurde in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass es erforderlich ist, die Sequenz aus einer fortlaufenden Sequenz von 8 Basen oder mehr zu konstruieren, ohne eine aus lediglich G oder T bestehende Sequenz zu enthalten, und die Sequenz so zu konstruieren, dass sie nicht nur keine Sequenz AATAAA, sondern auch keine Sequenz enthält, in der eine der Basen davon durch eine andere Base ersetzt ist (d.h. NATAAA, ANTAAA, AANAAA, AATNAA, AATANA oder AATAAN).
Es wurde ebenfalls festgestellt, dass es wichtig ist, die Sequenz so zu konstruieren, dass die G- und C-Gehalte über die gesamte Region konstant verteilt sind.
Außerdem wurde in der konkreten Anwendung der vorliegenden Erfindung Eisenchelat-Reduktase im transformierten Tabak in der gesamten Pflanze exprimiert, da CaMV35S als Promotor eingesetzt war. Wie gezeigt, kann ein lokal exprimiertes Gen in der gesamten Pflanze als Folge der Kombination mit dem Promotor exprimiert werden. Andererseits kann das exprimierte Gen in der gesamten Pflanze mittels Kombination mit einem bevorzugten Promotor lokal exprimiert werden.
Ein Absorptionsmechanismus mittels Reduktion von Fe(III) ist für einen Eisenaufnahme-Mechanismus bei den Monocotyledonen und Dicotyledonen, außer Gräser, spezifisch, und auch Gräser können Eisen durch Reduktion von Fe(III) zu Fe(II) unter der Bedingung absorbieren, dass Eisen hinreichend vorhanden ist. Als Folge der Ligation des Eisenchelat-Reduktase-Gens refre1 der vorliegenden Erfindung mit einem Promotor, der in der Wurzel unter Eisenmangelbedingungen spezifisch aktiv ist, kann ein neuartiges Gras geschaffen werden, in dem ein Eisenabsorptionsmechanismus (I) und Eisenabsorptionsmechanismus (II) unter Eisenmangelbedingungen funktionsfähig sein kann.
Referenzen in der vorliegenden Erfindung sind hier nachstehend angeführt.

(1) Cloning and Sequence (1989), Noson-Bunka-Sha
(2) Protocol of PCR Experiments for Plants (1995) Shujun-Sha
(3) Biological Experiments, Illustrated Fundamentals of Genetic Analysis (1995), Shujun-Sha
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Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen detailliert erläutert, ist aber nicht auf diese Beispiele beschränkt zu verstehen.
In den nachstehenden Beispielen wird eine grundlegende Genmanipulation gemäß der Beschreibung „Cloning and Sequencing" (Noson-Bunka-Sha) durchgeführt, und die Analyse der Basensequenz des Gens erfolgt unter Anwendung von DNASIS (hergestellt von Hitachi Corp.).
Beispiel 1 (Extraktion von Gesamt-RNA von FRE1, das in transgenen Tabak eingeführt ist)
Extraktion von Gesamt-RNA von FRE1, das in transgenen Tabak eingeführt ist, wurde nach dem in der Referenz beschriebenen Verfahren (Naito et al., 1988) durchgeführt.
2 g Blätter von FRE1-eingeführtem transgenen Tabak wurden in eine Reibschale verbracht und dem Flüssigstickstoff hinzugegeben, woraufhin die Blätter vollständig zerquetscht wurden. Die dreifache Menge an Extraktionspuffer und die gleiche Menge an Phenol/Chloroform (1:1) wurden zu dem Brei gegeben und suspendiert, dann mit 8000 rpm 15 Minuten zentrifugiert und einmal mit Chloroform extrahiert. Eine Ethanolfällung wurde bei –80°C 30 Minuten durchgeführt und bei 4°C 30 Minuten zentrifugiert. Das Präzipitat wurde mit 70% Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Präzipitat wurde in 1 ml DEPC-behandeltem Wasser gelöst, mit 13500 rpm 3 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde in ein neues Röhrchen überführt; außerdem wurde ¼ Volumen 10 M LiCl zugegeben und 2 Stunden auf Eis gehalten. Das Gemisch wurde mit 12000 rpm bei 4°C 10 Minuten zentrifugiert, dann wurde das Präzipitat mit 70% Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde in 50 μl DEPC-behandeltem Wasser gelöst.

Reagenzien: Extraktionspuffer

1 M Tris HCl pH 9,0

1% SDS

(120 μl β-Mercaptoethanol wurden zu 6 ml Puffer vor Gebrauch gegeben)
Beispiel 2: (Reinigung von Poly-A + RNA und cDNA-Synthese)
Poly-A + RNA wurde aus 100 μg Gesamt-RNA, die in Beispiel 1 erhalten wurde, mittels Verwendung von Dynabeads Oligo (dT) 25 (DYNAL Inc.) gereinigt. Diese Poly-A + RNA wurde einer reverse Transkriptase-Reaktion mit der M-MLV reversen Transkriptase (TOYOBO Co. Ltd.) bei 37°C 1 Stunde unter Verwendung des folgenden hybriden Primers unterzogen, um cDNA zu erhalten.
Hybrider Primer (dT¹⁷ Adapterprimer):
5'-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3'
Beispiel 3 (RT-PCR und Bestätigung der Basensequenz)
Die PCR wurde mit dem für den hybriden Primer spezifischen Primer und dem 5'-Primer von FRE1 unter Verwendung der in Beispiel 2 erhaltenen cDNA als Template durchgeführt.
Das Reaktionsprodukt der PCR wurde elektrophoretisch auf 0,8% Agarosegel aufgetrennt, und die erhaltene Bande wurde in den pT7Blue(R)-Vektor (Takara Corp.) kloniert. Die Kolonie wurde in LB-Medium über Nacht in Schüttelkultur gehalten, das Plasmid mit dem alkalischen SDS-Verfahren extrahiert, und die Basensequenz der 7 Klone, in denen die Insertion mit Restriktionsenzym-Behandlung bestätigt worden war, wurde mit Hilfe der Bca BEST DNA Polymerase („Biotechnology Experiments Illustrated, Fundamentals of Gene Analysis") (Shujun-Sha) bestimmt.
Primer, spezifisch für hybriden Primer:
5'-GACTCGAGTCGACATCG-3'
5'-Primer von FRE1:
5'-ACACTTATTAGCACTTCATGTATT-3'
PCR-Reaktionsbedingungen

(1) 95°C 5 Minuten;
(2) 95°C 40 Sekunden;
(3) 55°C 30 Sekunden;
(4) 72°C 1 Minute;
(5) 72°C 10 Minuten; und
(6) 4°C

Die oberen Prozeduren (2), (3) und (4) wurden 40-mal wiederholt.
Folglich wurde in dem mit FRE1 transformierten transgenen Tabak Poly-A an die in 3 gezeigte Stelle in der transkribierten mRNA vom FRE1-Gen geheftet.
Die Anheftungsstellen von Poly-A waren nicht einheitlich, und mRNA unterschiedlicher Länge wurde beobachtet. Eine Sequenz, die als Poly-A-Signal stromaufwärts der Poly-A-Stelle erkannt werden konnte, wurde als ein mutmaßliches Poly-A-Signal gedeutet.
Beispiel 4 (Herstellung des jeweiligen Segments mittels PCR)
Jedes Segment wurde mittels PCR hergestellt, wie in 5 veranschaulicht. Die Super Taq (Sawaday Inc.) wurde als Taq-Polymerase verwendet.
Die Zusammensetzung der PCR-Reaktion ist folgendermaßen. PCR-Reaktionslösung im ersten Schritt:

10 × Puffer 10 μl

2 mM dNTP Gemisch 10 μl

20 μM Primer (-3) 5 μl

20 μM Primer (-4) 5 μl

Destilliertes Wasser ad. 99,5 μl Gesamtvolumen PCR-Reaktionslösung im zweiten Schritt:

PCR-Reaktionslösung des ersten Schritts 1 μl

10 × Puffer 10 μl

2 mM dNTP Gemisch 10 μl

20 μM Primer (-2) 5 μl

20 μM Primer (-5) 5 μl

Destilliertes Wasser ad. 99,5 μl Gesamtvolumen PCR-Reaktionslösung im dritten Schritt:

PCR-Reaktionslösung des zweiten Schritts 1 μl

10 × Puffer 10 μl

2 mM dNTP Gemisch 10 μl

20 μM Primer (-1) 5 μl

20 μM Primer (-6) 5 μl

Destilliertes Wasser ad. 99,5 μl Gesamtvolumen
PCR-Reaktionsbedingungen:

(1) 95°C 5 Minuten;
(2) Zugabe von 0,5 μl Taq
(3) 95°C 40 Sekunden;
(4) 45°C 1 Minute;
(5) 72°C 1 Minute;
(6) 94°C 40 Sekunden;
(7) 60°C 30 Sekunden;
(8) 72°C 1 Minute;
(9) 72°C 10 Minuten;
(10) 4°C

Die oberen Prozeduren (3), (4) und (5) wurden 5-mal wiederholt, beziehungsweise die Prozeduren (6), (7) und (8) wurden 20-mal wiederholt.
Beispiel 5 (Klonierung und Bestätigung der Basensequenz)
Nach der Elektrophorese der PCR-Reaktionslösung im dritten Schritt in Beispiel 4 auf 0,8% Agarosegel wurde eine Bande, die die erwartete Länge besaß (417–436 bp), herausgeschnitten und gereinigt, dann in das Plasmid pT7Blue(R) Vektor (Takara Inc.) kloniert. Die Basensequenz des so erhaltenen Klons wurde bestätigt, und die exakte Basensequenz wurde mit Hilfe des SHIMADZU Lumineszenz DNA-Sequenzierers DSQ-1000L bestimmt.
Nachdem das Segment von jeder exakten Basensequenz erhalten worden war, wurde ein Volllängen-refre, 1 wie in 8 gezeigt, mit Hilfe der Restriktionsenzymstellen hergestellt. Eine Orientierung der Insertion der Segmente B und E war für die Herstellung voller Längen wesentlich. Bei den anderen Segmenten wurde die Sequenz, welche die exakte Basensequenz enthielt, ohne Berücksichtigung der Orientierung der Insertion verwendet.
Die Volllängen-Basensequenz des synthetisierten refre1 ist in der Sequenzliste als SEQ ID NR: 1 und in 9 gezeigt.
Beispiel 6 (Einführung von refre1 in Tabak)
Ein Gen, das in Beispiel 5 synthetisierte refre1, wurde in Tabak (Nicotiana tabacum L. var. SRI) eingeführt. Als Ergebnis der Transformation wurden 68 individuelle Pflanzen erzeugt, die gegen Kanamycin resistent waren. Eine genomische Southern-Hybridisierung wurde durchgeführt, um die Einführung eines Zielgens, refre1, in der erzeugten Pflanze und die Kopienzahl davon zu bestätigen. Als Ergebnis wurde das Vorhandensein von einer bis zu mehreren Kopien des refre1-Gens bestätigt.
Ein Verfahren zur Einführung eines Gens in Pflanzenzellen zur Erzeugung einer Pflanze wurde gemäß der Beschreibung in „Laboratory Manual for Functional Analysis of Plant Genes" (Maruzan) durchgeführt.
(1) Herstellung des binären Vektors pRF1 zur Transformation
XbaI und SacI Fragmente von refre1, die in pT7Blue(R) Vektor geklont waren, wurden gegen den ORF von β-Glucuronidase des binären Vektors pBI121 ausgetauscht, um den binären Vektor pRF1 herzustellen. Die Struktur des binären Vektors pRF1 ist in 11 gezeigt.
(2) Transfer des binären Vektors pRF1 in Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens C58 wurde bei 26°C 2 Nächte in 1 ml LB-Flüssigmedium, das ein geeignetes Antibiotikum enthielt, in Schüttelkultur gehalten, und E. coli mit pRF1 und E. coli mit Helferplasmid pRK2013 bei 37°C eine Nacht in 1 ml LB-Flüssigmedium, das ein geeignetes Antibiotikum enthielt, in Schüttelkultur gehalten. Jeweils 100 μl wurden auf der LB-Platte gemischt, die keine Antibiotika enthielt. Nachdem das Gemisch bei 26°C 2 Nächte kultiviert worden war, wurde die Plattenoberfläche mit Hilfe einer Platinimpföse abgeschabt und zur Bildung von Einzelkolonien auf der Selektionsplatte [LB-Platte, die 100 μg/μl Rifampicin (Rf) und 25 μg/μl Kanamycin (Km) enthielt] inkubiert (bei 26°C, 2 Nächte).
Die so erhaltene Einzelkolonie wurde in 4 ml LB-Flüssigmedium (Km und Rf) bei 26°C 2 Nächte lang in Schüttelkultur gehalten, und das Plasmid wurde mit dem alkalischen SDS-Verfahren extrahiert, woraufhin das Vorliegen von pRF1 durch Beobachten der Spaltmuster von den Restriktionsenzymen bestätigt wurde.
(3) Infektion von Tabak mit Agrobakterium und Regeneration der Pflanze
Zwei oder drei junge Blätter von Tabak (Nicotiana tabacum L. var. SRI) mit einer Größe von etwa 8 cm wurden zerschnitten, in eine Petri-Schale verbracht, die mit sterilisiertem Wasser (10% Hypochlorige Säure, 0,1% Tween 20) gefüllt war und unter Rühren 15 Minuten sterilisiert. Die Blätter wurden mit sterilisiertem Wasser dreimal gespült und in 8-mm-Quadrate mit einem Skalpell geschnitten. 3 ml Flüssigkultur von Agrobakterium mit binärem Vektor pRF1, die bei 26°C 2 Nächte kultiviert worden waren, wurden zu den Blattfragmenten in der Petri-Schale gegeben.
Nach einer Minute wurde die Flüssigkeit mit Hilfe einer Pasteurpipette entfernt und die zurückbleibende Flüssigkeit mit einem autoklavierten sterilisierten Filterpapier abgezogen. Die Blätter wurden auf MS-Medium (II), siehe unten, verbracht und bei 25°C 3 Tage bei Licht kultiviert. Danach wurden die Blattfragmente auf MS-Medium (III) transferiert und 1 Woche kultiviert, dann auf MS-Medium (IV) transferiert und alle 2 Wochen überimpft. Waren die Kalli induziert und die Schößlinge gebildet, so wurden die Schößlinge mit einem Skalpell abgeschnitten und auf MS-Medium (V) transferiert. Die Schößlinge mit Wurzeln wurden auf Vermikulit geimpft und unter Versorgung mit Hyponex (Hyponex Japan Co., Ltd.) angezogen, um die regenerierte Pflanze zu erhalten.

Die Zusammensetzungen der MS-Medien für Tabak in den vorerwähnten Experimenten sind folgendermaßen. Hauptbestandteile (g/l)

NH₄NO₃	1,65
KNO₃	1,9
CaCl₂ × 2H₂O	0,44
MgSO₄ × 7H₂O	0,44
KH₂PO₄	0,17

Nebenbestandteile (mg/l)

H₃BO₄	6,2
MnSO₄ × 4H₂O	22,3
ZnSO₄ × 7H₂O	8,6
KI	0,83
Na₂MoO₄ × 2H₂O	0,25
CuSO₄ × 5H₂O	0,025
CoCl₂ × 6H₂O	0,025
Fe(III)Na-EDTA	0,042 mg/l
myo-Inositol	100 mg/l
Thiamin	5 mg/l
Sucrose	30 g/l
Geranyliertes G	2 g/l

MS-Medium (I) wurde mit der vorerwähnten Zusammensetzung zubereitet. Die weiteren MS-Medien wurden durch Zugabe der folgenden Phytohormone und/oder Antibiotika zum MS-Medium (I) zubereitet.

MS-Medium (II)	MS-Medium (I) + BA + NAA
MS-Medium (III)	MS-Medium (I) + BA + NAA + Claforan
MS-Medium (IV)	MS-Medium (I) + BA + NAA + Claforan + Kanamycin
MS-Medium (V)	MS-Medium (I) + Kanamycin

Beispiel 7 (Southern-Analyse)
(1) Extraktion genomischer DNA aus Tabak
Die Extraktion genomischer DNA aus Tabak wurde nach dem Verfahren durchgeführt, das in „Plant Cell Engineering Series: Protocol for PCR Experiments in Plants" (Shujun-Sha) beschrieben ist.
0,1–0,2 g Blätter wurden in eine Reibschale verbracht und dem Flüssigstickstoff hinzugegeben, woraufhin die Blätter vollständig zerrieben wurden. Die zerriebenen Blätter wurden in ein Eppendorf-Röhrchen verbracht, und 300 μl 2% CTAB-Lösung wurden zugegeben und gemischt, dann bei 65°C 30 Minuten behandelt. Eine gleiche Menge Chloroform und Isoamylalkohol (24:1) wurde zugegeben und 5 Minuten gemischt.
Das Gemisch wurde mit 12000 rpm 15 Minuten zentrifugiert und die obere Schicht in ein neues Röhrchen überführt; dann wurde die Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion einmal wiederholt und die obere Schicht in ein neues Röhrchen überführt. 1–1,5 Volumenteile 1% CTAB-Lösung wurden zugegeben, gemischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur ruhen gelassen, dann mit 8000 rpm 10 Minuten zentrifugiert. Die obere Schicht wurde verworfen und 400 μl 1 M CsCl wurden zum Rückstand gegeben und auf 65°C erwärmt, bis sich das Präzipitat vollständig löste. 800 μl 100% Ethanol wurden dazu gegeben, gemischt und bei –20°C 20 Minuten ruhen gelassen, dann mit 12000 rpm 5 Minuten zentrifugiert. Die obere Schicht wurde verworfen und der Rückstand wurde mit 70% Ethanol gewaschen, im Vakuum getrocknet und in 30 μl TE-Puffer gelöst.
(2) Schneiden genomischer DNA mit Restriktionsenzymen und Elektrophorese
Die Restriktionsenzym-Behandlung erfolgte durch Verdau mit EcoRI und HindIII, wobei mit diesem Verdau die Sequenz von pCaMV35S bis tNOS geschnitten wurde, und durch Verdau mit ausschließlich HindIII, wobei mit diesem Verdau die Sequenz stromaufwärts von pCaMV35S geschnitten wurde.
10 μg genomische DNA in 100 μl Reaktionsvolumen wurden über Nacht mit dem Restriktionsenzym behandelt, durch Zugabe von Ethanol gefällt und das Präzipitat in 20 μl TE-Puffer gelöst. Der Lösung wurden 2 μl Ladepuffer hinzugegeben, und die Lösung wurde auf 0,8% Agarosegel bei 60 V 5 Stunden elektrophoretisch behandelt. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt und auf dem UV-Transluminator mit Skala photographiert.
(3) Blotting und Hybridisierung
Nach dem Photographieren wurde das Gel mit destilliertem Wasser gewaschen und 10 Minuten in 0,2 N HCl geschüttelt. Ein Blot-Verfahren wurde gemäß der Beschreibung in „Cloning and Sequencing" (Noson-Bunka-Sha) durchgeführt. Das Gel wurde auf eine Nylonmembran (New Hybond-N+ Amersham) mit 0,4 N NaOH transferiert und die Membran mit 2 × SSPE 5 Minuten gewaschen und bei Raumtemperatur 3 Stunden getrocknet. Das Hybridisierungsverfahren wurde „Biotechnology Experiments Illustrated, Fundamentals of Gene Analysis" (Shujun-Sha) entnommen. Die Membran wurde für eine Vorhybridisierung mit 30 ml Vorhybridisierungspuffer, der zuvor auf 65°C erwärmt worden war, 1 Stunde bei 65°C behandelt und der Hybridisierungspuffer wurde ausgetauscht (25 ml). Die Sonde wurde zugegeben und die Hybridisierung bei 65°C 12 Stunden durchgeführt. Die Membran wurde zweimal bei 65°C 10 Minuten mit Waschlösung gewaschen, die zuvor auf 65°C erwärmt worden war, und einmal mit einer hoch stringenten Waschlösung bei 65°C 10 Minuten gewaschen. Die Membran wurde mit Saran Wrap eingepackt, einem Film 24 Stunden exponiert und das Ergebnis wurde mit einem Image Analyzer (Fuji Photo Film Co. Ltd.). bestätigt. Reagenzien 20 × SSPE

NaCl 3 M

NaH₂PO₄ 0,2 M

EDTA 1 mM
1 M Church Phosphatpuffer
0,5 Mol NaH₂PO₄ wurden zu etwa 800 ml destilliertem Wasser gegeben, mit H₃PO₄ auf pH 7,2 eingestellt, dann auf einen Liter mit destilliertem Wasser aufgefüllt und autoklaviert. Hybridisierungspuffer

Church Phosphatpuffer 0,5 M

EDTA 1 mM

SDS (v/v) 7%

Denaturiertes Lachssperma (1 mg/ml) 1/100 vol wurde vor Gebrauch zugegeben. Waschlösung

Church Phosphatpuffer 40 mM

SDS (v/v) 1%

Hoch stringente Waschlösung 0,2 × SSPE

SDS (v/v) 0,1%
(4) Präparation der Sonde
Die Sonde wurde mit dem random primer DNA labeling kit ver. 2.0 (Takara Corp.) unter Verwendung von vollangem refre1 als Template (vorausgesetzt dass [α-³²P]-dATP verwendet wurde) präpariert und nicht umgesetztes [α-³²P]-dATP wurde mit Probe Quant TM G-50 Mikrosäulen (Pharmacia, Biotech Inc.) entfernt.
Das Ergebnis ist in 14 gezeigt. Die linke Seite in 14 zeigt den Verdau mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII und die rechte Seite in 14 zeigt den Verdau mit ausschließlich HindIII. In 14 bedeutet W. T. Wildtyp.
Beispiel 8 (Northern-Analyse)
(1) Extraktion von Gesamt-RNA
Gesamt-RNA wurde aus Blättern des transgenen Tabaks, in den refre1 eingeführt war, und aus Blättern des Wildtyp-Tabaks nach demselben wie in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren extrahiert.
(2) Elektrophorese der RNA
Elektrophoresegefäß, Gelkammer, Kamm und Erlenmeyerkolben wurden vorher mit abSolve (RNase-Inhibitor, Du Pont Inc.) behandelt. 10 ml 20 × MOPS, 2,4 g Agarose und 100 ml sterilisiertes destilliertes Wasser wurden in einen Erlenmeyerkolben gegeben, und die Agarose wurde in der Mikrowelle gelöst. 10 ml Formaldehyd wurde zu dem Gel gegeben, das auf etwa 50°C gekühlt wurde, und mit sterilisiertem destilliertem Wasser wurde auf 200 ml aufgefüllt und nach erfolgter Gelbildung verwendet. Etwa 800 ml 1 × MOPS wurden in das Elektrophoresegefäß gegeben, und für eine Verwendung als Elektrophoresepuffer wurden 5 μl 10 mg/ml Ethidiumbromid dazu gegeben. 16 μl RNA-Probenpuffer wurden zu 10 μg Gesamt-RNA gegeben, mit sterilisiertem destillierten Wasser auf 20 μl aufgefüllt, und die Mischung wurde 10 Minuten auf 65°C erwärmt, dann 5 Minuten auf Eis ruhen gelassen und dann einer Elektrophorese unterzogen. Nach einstündiger Elektrophorese mit 60 V erfolgte eine weitere zweistündige Elektrophorese mit 120 V. Reagenzien 20 × MOPS

MOPS 0,4 M

NaOAc 0,1 M

EDTA 0,02 M

RNA-Probenpufter

Formaldehyd 1,6 ml

Formamid 5,0 ml

20 × MOPS 0,5 ml

Glycerin-Pigmentlösung 1,6 ml

Gesamt 8,7 ml

Glycerin-Pigmentlösung

Glycerin 5 ml

Bromphenol Blau 1 mg

Xylolanilin 1 mg

0,5 M EDTA (pH 8,0) 0,02 ml
(3) Blotting und Hybridisierung
Nach der Elektrophorese wurde das Gel auf einen UV-Illuminator gelegt und mit Skala photographiert. Das Blotverfahren entsprach der Beschreibung in „Cloning and Sequencing" (Noson-Bunka-Sha). Die RNA wurde nämlich vom Gel auf die Nylonmembran (New Hybond-N, Amersham Inc.) mit 20 × SSPE transferiert. Nach 12 Stunden wurde die Membran mit 2 × SSPE 5 Minuten gewaschen und bei Raumtemperatur 3 Stunden getrocknet, dann wurde die RNA auf der Membran mit Hilfe von 5 Minuten UV-Bestrahlung fixiert.
Das Hybridisierungsverfahren wurde wie bei der Southern-Hybridisierung durchgeführt.
Das Ergebnis ist in 15 gezeigt. In 15 steht W. T. für Wildtyp. Keine Bande wurde in der Spur von Wildtyp (W. T.) detektiert. In Spur Nr. 1 und Nr. 2 wurden Hauptbanden mit einer Größe von 2,5 kb detektiert, und mehrere Banden wurden in Positionen weiter unten detektiert.
Beispiel 9 (Bestätigung der Eisenchelat-Reduktase)
Der transgene Tabak, in den das refre1-Gen eingeführt war, und Wildtyp-Tabak wurden in Vermikulit verpflanzt und unter Versorgung mit Hyponax angezogen. Die Aktivität der Eisenchelat-Reduktase wurde mit Hilfe etwa 5 cm–6 cm großer Pflanzen bestätigt.
Zur Bestätigung der Aktivität der Eisenchelat-Reduktase wurde eine Rotfärbung mit Fe(II) verwendet, die durch die Bildung eines Komplexes mit Bathophenanthrolindisulfonsäure (BPDS), einem starken Komplexbildner mit Fe(II), hervorgerufen wird. 0,4% Agarose, die in der Mikrowelle gelöst wurde, wurde zu dem Testpuffer gegeben und gekühlt. 500 μM Fe(III)-EDTA, 1/100 vol., und 500 μM BPDS, 1/100 vol., wurden zu dem leicht gekühlten Gel gegeben, gerührt und in das Gefäß gegeben, woraufhin auf das Festwerden gewartet wurde. Nachdem der transformierte Tabak und der Wildtyp-Tabak von Vermikulit befreit waren, wurden die Wurzeln auf das Gel gelegt, vor Licht geschützt und bei 27°C 24 Stunden darauf liegen gelassen.
Das ähnliche Experiment wurde unter Verwendung einer zweiten Generation der transgenen Pflanze durchgeführt, die aus Samen der regenerierten Pflanze gekeimt war. Die Reaktionszeit in diesem Experiment war auf 1 Stunde festgelegt. Testpuffer

CaSO₄ 0,2 mM

MES-Puffer pH 5,5 5,0 mM
Fotos, die eine Bestätigung der Aktivität der Eisenchelat-Reduktase zeigen, sind in 16 und 17 gezeigt. Ein Foto, das eine Bestätigung der Aktivität der Eisenchelat-Reduktase der zweiten Pflanzengeneration zeigt, ist in 18 gezeigt. Die Reduktion von Fe(III) wurde als ein Ergebnis der Färbung des Transformanten in der Rizosphäre bestätigt.
SEQUENZLISTE
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zum Transformieren einer Pflanze durch Einführen eines Gens einer anderen Spezies in diese Pflanze, wobei das Gen in solcher Weise modifiziert ist, dass das Gen weder eine Sequenz von 8 benachbarten Basen oder mehr, bestehend aus lediglich G und/oder T, noch eine der folgenden Basensequenzen in Bezug zur Poly-A-Addition der mRNA der Pflanze enthält: NATAAA, ANTAAA, AANAAA, AATNAA, AATANA oder AATAAN, worin N eine beliebige Base ist, und wobei das durch das Gen codierte Protein funktional bleibt, nachdem das Gen modifiziert worden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gen von Hefe abstammt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Modifikation basierend auf der Codon-Nutzung der zu transformierenden höheren Pflanze vorgenommen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Modifikation der Basensequenz den GT-Gehalt vermindert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Sequenz eine Kozak-Sequenz aufweist, die stromaufwärts des Initiationscodons jenes Gens lokalisiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Gen ein Protein codiert, das an der Absorption von Nährstoffen beteiligt ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Gen die Eisenchelat-Reduktase FRE1 codiert.
Transgene Pflanze, erhältlich mittels eines Verfahrens nach einem der vorangehenden Ansprüche.