DE10047286B4

DE10047286B4 - Isomalt produzierende transgene Pflanze

Info

Publication number: DE10047286B4
Application number: DE10047286A
Authority: DE
Inventors: Markwart Prof.Dr. Kunz; Ralf Prof.Dr. Mattes; Mohammad Dr. Munir; Manfred Dr. Vogel
Original assignee: Suedzucker AG
Current assignee: Suedzucker AG
Priority date: 2000-09-20
Filing date: 2000-09-20
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2020-09-21
Also published as: EP1322772A1; ZA200302195B; US20040064851A1; IL154819A0; WO2002027003A1; AU7639801A; CA2421618A1; AU2001276398B2; DE10047286A1; JP2004522420A

Abstract

Transgene Pflanze, die in mindestens einer ihrer Zellen aus in der Pflanze gebildeter Saccharose Isomaltulose und aus der gebildeten Isomaltulose 6-O-α-D-Glucopyranosyl-D-sorbit (1,6-GPS) und/oder 1-O-α-D-Glucopyranosyl-D-mannit (1,1-GPM) erzeugen kann, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze in der mindestens einen Zelle eine stabil integrierte und in ihr exprimierbare Nucleotidsequenz, die die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codiert, und mindestens eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codierenden Nucleotidsequenz und einer die Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase codierenden Nucleotidsequenz, enthält.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine transgene Pflanze, die Isomaltulose erzeugen kann, eine transgene Pflanze, die 6-O-α-D-Glucopyranosyl-D-sorbit (im Folgenden 1,6-GPS) erzeugen kann, eine transgene Pflanze, die 1-O-α-D-Glucopyranosyl-D-mannit (im Folgenden 1,1-GPM) erzeugen kann, eine transgene Pflanze, die ein Gemisch aus 1,6-GPS und 1,1-GPM erzeugen kann, Vermehrungs- und Erntematerial dieser Pflanzen sowie Verfahren zur Erzeugung dieser transgenen Pflanzen.

Aus der DE 44 14 185 C1 sind Saccharose-Isomerasen (z.B. aus den Mikroorganismen Protaminobacter rubrum und Erwinia rhapontici) bekannt, die die glycosidische Bindung zwischen den Monosaccharideinheiten von Saccharose isomerisieren und dadurch die Umwandlung von Saccharose zu Isomaltulose und Trehalulose katalysieren können. In dieser Druckschrift werden die die Saccharose-Isomerase codierenden DNA-Sequenzen sowie damit transformierte Zellen beschrieben.

Auch Verfahren zur Herstellung von Palatinit^® (auch Isomalt oder hydrierte Isomaltulose genannt), einem nahezu äquimolarem Gemisch aus 1,6-GPS und 1,1-GPM, sowie seiner Einzelkomponenten 1,1-GPM und 1,6-GPS aus Saccharose sind bekannt, die eine enzymatische Umwandlung von Saccharose zu Isomaltulose und anschließend eine chemische Hydrierung der erhaltenen Isomaltulose zu den beiden Stereoisomeren 1,6-GPS und 1,1-GPM umfassen. So offenbart Schiweck (alimenta 19 (1980), 5-16) ein Verfahren zur Gewinnung von Palatinit^®, wobei das Verfahren die enzymatische Umsetzung von Saccharose zu Isomaltulose und die anschließende Hydrierung der isolierten Isomaltulose an Raney-Nickel-Katalysatoren umfasst. Dabei erfolgt die Umwandlung von Saccharose zu Isomaltulose mittels des Mikroorganismus Protaminobacter rubrum und die auf diesem Weg gewonnene Isomaltulose wird in Gegenwart von Raney-Nickel-Katalysatoren durch Hydrierung zu 1,6-GPS und 1,1-GPM umgewandelt und anschließend mittels Verdampfungs- und Kühlungskristallisationsverfahren angereichert.

In der EP 0 625 578 B1 werden Verfahren zur Gewinnung von 1,1-GPM und 1,6-GPS enthaltenden Zuckeralkoholgemischen beschrieben, bei denen zunächst Saccharose enzymatisch in ein Isomaltulose- und Trehalulose-haltiges Gemisch umgewandelt und das dabei erhaltene Produkt katalytisch zu einem 1,1-GPM, 1,6-GPS und 1-O-α-D-Glucopyranosyl-D-sorbit (1,1-GPS) enthaltenden Gemisch hydriert wird.

In der DE 195 23 008 A1 wird ein Verfahren zur Herstellung von Gemischen aus 1,1-GPM und 1,6-GPS offenbart, das die Hydrierung von Isomaltulose bei Drücken von unter 50 Atmosphären unter Verwendung von Ruthenium, Nickel oder deren Mischungen enthaltenden Katalysatoren umfasst.

In der DE 197 01 439 A1 werden Verfahren zur Hydrierung von Isomaltulose mittels eines trägergebundenen Nickelkatalysators offenbart, wobei Gemische aus 1,6-GPS und 1,1-GPM erhalten werden.

Die DE 197 05 664 A1 offenbart Verfahren zur Herstellung von 1,6-GPS- oder 1,1-GPM- angereicherten Gemischen aus hydrierter Isomaltulose. Ein in dieser Druckschrift beschriebenes Verfahren umfasst die Herstellung 1,6-GPS- und/oder 1,1-GPM-angereicherter Gemische aus hydrierter Isomaltulose oder aus hydrierter Isomaltulose enthaltenden Gemischen. Mittels Aufkonzentrierung einer 1,6-GPS-angereicherten Mutterlauge unter bestimmten Bedingungen und Kühlungskristallisation kann unter Verwendung dieses Verfahrens 1,6-GPS in reiner Form hergestellt werden.

Aus der deutschen Patentanmeldung DE 199 63 126.3 ist eine Sorbit-Dehydrogenase aus einem Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter bekannt, mit deren Hilfe Isomaltulose gezielt zu 1,6-GPS umgewandelt werden kann.

Schließlich ist aus einem Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas eine Mannit-Dehydrogenase isoliert worden (Brünker et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1351 (1997), 157-167), die Isomaltulose zu 1,1-GPM umwandeln kann.

Die Verfahren nach dem Stand der Technik werden hinsichtlich der Gewinnung von Palatinit^®, seiner Einzelbestandteile und Vorstufen vor allem aus den folgenden Gründen als nachteilig angesehen.

Erstens ist es bei nahezu allen Verfahren zur Herstellung der genannten Stoffe erforderlich, zunächst Saccharose als Ausgangsstoff mittels physikalisch-chemischer Verfahren aus zum Beispiel Zuckerrüben zu isolieren und für die nachfolgenden Verfahrensschritte aufzureinigen. Zweitens umfasst dann die weitere Aufarbeitung von Saccharose zu 1,6-GPS und/oder 1,1-GPM weitere komplizierte Verfahrensabfolgen, wobei verschiedene physikalische, chemische und/oder biologische Verfahren in verschiedenen Reaktoren zum Einsatz kommen müssen. Um gezielt 1,6-GPS aus Saccharose zu gewinnen, sind beispielsweise mindestens zwei separate enzymatische Umsetzungen erforderlich, in deren Verlauf im Allgemeinen aufwändige Aufreinigungsschritte durchgeführt werden müssen. Ähnliches gilt für die Herstellung von 1,1-GPM und Isomalt. So müssen unter anderem zur Gewinnung von 1,1-GPM aus Saccharose mindestens eine enzymatische Umsetzung, eine chemische Hydrierung unter Verwendung von Katalysatoren, speziellen Hydrierreaktoren und technischem Wasserstoff sowie nachfolgende Trennschritte zur Isolierung von 1,1-GPM aus dem zuvor erhaltenen Gemisch aus 1,1-GPM und 1,6-GPS durchgeführt werden.

Ein erheblicher Nachteil der im Stand der Technik bekannten Verfahren besteht also in der Notwendigkeit, unter einem erheblichen technischen Aufwand mehrere Verfahrensschritte durchzuführen. Da die dabei gewonnenen Produkte zur Verwendung in der Lebensmittelindustrie bestimmt sind, müssen die Verfahrensgänge darüber hinaus so ausgewählt werden, dass keine toxischen Substanzen, z.B. aus den Katalysatoren, in die Endprodukte gelangen. Dazu sind weitere Aufreinigungsschritte erforderlich, die häufig dazu führen, dass die Ausbeuten an Endprodukten nicht zufriedenstellend sind.

Die DE 44 14 185 C1 offenbart pflanzliche Zellen, die mit einer eine Saccharose-Isomerase-Aktivität codierenden DNA-Sequenz transformiert sind.

Die WO 97/26365 A2 offenbart eine transgene Maispflanze, die mit einer eine Mannit-1-Dehydrogenase codierenden DNA-Sequenz transformiert wurde.

Das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende technische Problem besteht also darin, Verfahren und Mittel zu deren Durchführung bereit zu stellen, die eine einfache, kostengünstige und selektive Gewinnung von Isomaltulose und ihren Hydrierprodukten, insbesondere von 1,6-GPS, von 1,1-GPM oder von diese umfassenden Gemischen erlauben.

Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem durch Bereitstellung transgener Pflanzen, insbesondere transgener Kartoffeln oder transgener-Zuckerrüben, die in mindestens einer ihrer Zellen aus in der Pflanze gebildeter Saccharose Isomaltulose erzeugen können gemäß dem Hauptanspruch. Insbesondere betrifft die Erfindung eine vorstehend skizzierte Pflanze, die neben ihrer Fähigkeit, aus in ihr gebildeter Saccharose Isomaltulose zu erzeugen überdies die Fähigkeit besitzt, aus dieser Isomaltulose 1,6-GPS und/oder 1,1-GPM zu erzeugen. Eine derartige Pflanze stellt in überraschender und vorteilhafter Weise ein in vivo System zur Erzeugung von Palatinit^®, seiner Einzelkomponenten, so wie des Vorläufers Isomaltulose bereit, welches am Ort der Entstehung des Eduktes, also der Saccharose, eine unmittelbare Erzeugung der gewünschten Endprodukte erlaubt. Aufwändige Isolier-, Aufreinigungs- und/oder Hydrierverfahren werden hier vermieden. Zudem kommen keinerlei toxische Substanzen zum Einsatz. Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem auch durch Bereitstellung der transgenen Pflanzen gemäß der Ansprüche 2 und 3.

Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende Problem auch durch die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung der vorgenannten Pflanzen.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft also eine transgene Pflanze, insbesondere eine transgene Zuckerrübe oder Kartoffel, die in der Lage ist, in mindestens einer ihrer Zellen aus Saccharose Isomaltulose und daneben 1,6-GPS oder 1,1-GPM zu erzeugen. Eine derartige Pflanze stellt einen wertvollen Rohstoff für die Herstellung von Palatinit^® bereit, welches zum Beispiel nach Isolierung der Isomaltulose aus der Pflanze durch chemische Hydrierung erhalten werden kann, wobei selbstverständlich auch von 1:1-Verhältnis von 1,1-GPM zu 1,6-GPS abweichende Mischungen von 1,1-GPM zu 1,6-GPS hergestellt werden können. Eine derartige Pflanze kann auch zum Ausgangspunkt weiterer gentechnischer Manipulationen gemacht werden, die letztendlich zur Herstellung eines vollständigen Stoffwechselweges von Saccharose zu Palatinit^® oder seiner Einzelkomponenten führt.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einer transgenen Pflanze, die aus in der Pflanze gebildeter Saccharose Isomaltulose erzeugen kann, eine Pflanze verstanden, die eine stabil integrierte und in ihr exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codiert. Eine Saccharose-Isomerase katalysiert die Isomerisierung von Saccharose zu Isomaltulose, wobei die α1→β2 glykosidische Bindung zwischen Glucose und Fructose in der Saccharose in eine andere glykosidische Bindung, insbesondere in eine α1→β6 Bindung überführt wird. Erfindungsgemäß geeignete Nucleotidsequenzen, die die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codieren, sind unter anderem aus Mikroorganismen der Gattung Protaminobacter, Erwinia, Serratia, Leuconostoc, Pseudomonas, Agrobacterium oder Klebsiella bekannt. Die DE 44 14 185 C1 offenbart die Isolierung und Clonierung von Saccharose-Isomerase codierenden Nucleotidsequenzen aus den Mikroorganismen Protaminobacter rubrum und Erwinia rhapontici, wobei das genannte Dokument hinsichtlich der Beschreibung und Bereitstellung der DNA-Sequenzen vollständig in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Lehre mit einbezogen wird und wobei für diese DNA-Sequenzen im erfindungsgemäßen Kontext Schutz begehrt wird.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine transgene Pflanze, insbesondere eine transgene Zuckerrübe oder Kartoffel, die in mindestens einer ihrer Zellen aus Saccharose Isomaltulose und aus der so gebildeten Isomaltulose 1,6-GPS erzeugen kann.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einer transgenen Pflanze, die aus der gebildeten Isomaltulose 1,6-GPS erzeugen kann, eine Pflanze verstanden, die eine stabil integrierte und in ihr exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codiert, und somit aus Saccharose Isomaltulose erzeugen kann, und die außerdem eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codiert. Eine Sorbit-Dehydrogenase-Aktivität reduziert Isomaltulose spezifisch zu 1,6-GPS. In der deutschen Patentanmeldung DE 199 63 126.3 ist eine erfindungsgemäß geeignete Sorbit-Dehydrogenase aus dem Mikroorganismus Gluconobacter suboxidans offenbart, wobei das genannte Dokument hinsichtlich der Beschreibung und Bereitstellung der DNA-Sequenz vollständig in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Lehre mit einbezogen wird und wobei für diese DNA-Sequenz im erfindungsgemäßen Kontext Schutz begehrt wird.

Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine transgene Pflanze, insbesondere eine transgene Zuckerrübe oder Kartoffel, die in mindestens einer ihrer Zellen aus der in der Pflanze gebildeten Saccharose Isomaltulose und aus der so gebildeten Isomaltulose 1,1-GPM erzeugen kann.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einer trangenen Pflanze, die aus der gebildeten Isomaltulose 1,1-GPM erzeugen kann, eine Pflanze verstanden, die eine stabil integrierte und in ihr exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codiert, und somit aus Saccharose Isomaltulose bilden kann, und die außerdem eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase codiert. Eine Mannit-Dehydrogenase Aktivität reduziert Isomaltulose spezifisch zu 1,1-GPM. Brünker et al. beschreiben in Biochimica et Biophysica Acta, 1351 (1997), 157-167, eine erfindungsgemäß geeignete Mannit-Dehydrogenase aus dem Mikroorganismus Pseudomonas fluorescens DSM 50106, wobei das genannte Dokument hinsichtlich der Beschreibung und Bereitstellung der DNA-Sequenz vollständig in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Lehre mit einbezogen wird und wobei für diese DNA-Sequenz im erfindungsgemäßen Kontext Schutz begehrt wird.

Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft eine transgene Pflanze, insbesondere eine transgene Zuckerrübe oder Kartoffel, die in mindestens einer ihrer Zellen aus der in der Pflanze gebildeten Saccharose Isomaltulose und aus der so gebildeten Isomaltulose ein Gemisch aus 1,6-GPS und 1,1-GPM erzeugen kann, zum Beispiel ein 1:1 Gemisch.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einer transgenen Pflanze, die aus der gebildeten Isomaltulose 1,6-GPS und 1,1-GPM erzeugen kann, eine Pflanze verstanden, die eine stabil integrierte und in ihr exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codiert, und somit aus Saccharose Isomaltulose bilden kann und die außerdem entweder eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz, die die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codiert, und eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase codiert, oder eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer unspezifisch hydrierenden Polyoldehydrogenase codiert.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine transgene Pflanze, insbeson dere eine Zuckerrübe oder Kartoffel, die in mindestens einer ihrer Zellen eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codiert.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine transgene Pflanze, insbesondere eine Zuckerrübe, bereit, die in mindestens einer ihrer Zellen eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase codiert. Die beiden vorgenannten Pflanzen sind vorteilhaft insofern, als dass sie die Bereitstellung der Enzyme Sorbit-Dehydrogenase und Mannit-Dehydrogenase erlauben. Überdies können die genannten Pflanzen als Ausgangsmaterial für die Herstellung von transgenen Pflanzen dienen, die aus Saccharose Palatinit^® erzeugen, wobei in die genannten Pflanzen Saccharose-Isomerase codierenden Nucleotidsequenzen eingeführt werden müssen.

Bei den transgenen Pflanzen kann es sich um Pflanzen der verschiedensten Arten, Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen handeln, das heißt sowohl monocotyle als auch dicotyle Pflanzen, ebenso wie Algen, Moose, Farne oder Gymnospermae. Transgene Pflanzen können auch Kalli, Pflanzenzellkulturen, sowie Teile, Organe, Gewebe, Ernte- oder Vermehrungsmaterialien davon umfassen.

Die Erfindung sieht insbesondere vor, dass die transgene Pflanze eine Nutzpflanze ist, insbesondere eine Nutzpflanze, die in ihrem Speicherorgan Saccharose produzieren kann, wie zum Beispiel Zuckerrohr oder Zuckerrübe. Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterialien und Ernteprodukte der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Blüten, Früchte, Speicherorgane, Rüben, Stengel, Samen, Knollen, Wurzeln, Blätter, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge etc.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "in mindestens einer ihrer Zellen", dass eine transgene Pflanze mindestens eine Zelle, vorzugsweise jedoch eine Vielzahl von Zellen enthält/enthalten, die eine oder mehrere stabil integrierte Nucleotidsequenzen enthalten, die die Aktivität einer Saccharose-Isomerase und/oder die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase und/oder die Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase codieren. Bei den Zellen handelt es sich vorzugsweise um Zellen, in denen Saccharose gebildet oder gespeichert wird. Im Falle einer transgenen Zuckerrübe handelt es sich also bevorzugt um Zellen des Zuckerrübenspeicherorgans, das heißt um Zellen der Rübe, während es sich im Falle einer transgenen Kartoffel bevorzugt um Zellen der Knolle handelt.

Die Nucleotidsequenz kann vorzugsweise im Zellkern aber auch im Plastidengenom oder im mitochondrialen Genom integriert sein, und zwar vorzugsweise so, dass sie stabil in die nächste Generation vererbt wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch transgene Zellen, die die vorstehend genannten Nucleotidsequenzen enthalten, sowie transgene Pflanzen, die von derartigen Zellen abstammen.

Derartige Zellen lassen sich von natürlicherweise vorkommenden Zellen dadurch unterscheiden, dass sie jeweils eine oder mehrere der vorstehend genannten codierenden Nucleotidsequenzen enthalten, die natürlicherweise in diesen Zellen nicht vorkommen, oder dass die vorstehend genannten codierenden Nucleotidsequenzen an einem Ort des Genoms integriert sind, an dem sie natürlicherweise nicht vorkommen, oder dass die vorstehend genannten codierenden Nucleotidsequenzen in einer anderen als der natürlichen Kopiezahl vorliegen. Zudem unterscheiden sich die vorstehend beschriebenen Pflanzen durch die erfindungsgemäß bewirkten Stoffwechselaktivitäten und die Expression der genannten Enzyme. Die Erfindung stellt in vorteilhafter Weise derartige Pflanzen bereit, wobei deren Wüchsigkeit, Phänotyp und/oder Kulturbedingungen denen einer Wildtyppflanze vollständig gleichen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz", dass eine Nucleotidsequenz mit Nucleinsäure-Elementen verknüpft ist, die eine stabile Integration dieser Nucleotidsequenz in das Genom einer Pflanze gestatten, so dass die integrierte Nucleotidsequenz gemeinsam mit den natürlicherweise vorhandenen Genombestandteilen der Pflanzenzelle repliziert wird, sowie mit regulatorischen DNA-Elementen verknüpft ist, die die Transkription der Nucleotidsequenz und die anschließende Expression des von der Nucleotidsequenz codierten Produktes gewährleisten.

Zur Expression der vorstehend genannten Nucleotidsequenz in pflanzlichen Zellen, insbesondere in sense-Orientierung, werden die codierenden Bereiche dieser Nucleotidsequenzen in bevorzugter Ausführungsform mit regulatorischen Elementen verknüpft. Dazu zählen insbesondere Promotoren, die die Transkription in Pflanzenzellen gewährleisten. Zur Expression der vorstehend genannten Nucleotidsequenzen kommen prinzipiell sowohl homologe als auch heterologe Promotoren in Betracht. Es kann sich dabei um Promotoren handeln, die eine konstitutive Expression bewirken oder um Promotoren, die nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt aktiv sind. Außerdem werden die vorstehend genannten Nucleotidsequenzen in bevorzugter Ausführungsform mit einer Terminationssequenz verknüpft, wodurch eine korrekte Transkriptions-Beendigung und eine Anlagerung eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript bewirkt werden. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (Gielen et al., EMBO J., 8 (1989), 23-29).

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Expression der die enzymatischen Aktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen dadurch erreicht, dass diese Nucleotidsequenzen unter der Kontrolle gewebe- oder organspezifischer, insbesondere speicherorganspezifischer Promotoren, in mindestens einer Pflanzenzelle exprimiert werden.

Gewebespezifische Promotoren zur Expression der die enzymatischen Aktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen in Samengewebe sind zum Beispiel der Vicilin-Promotor aus Pisum sativum (Newbigin et al., Planta, 180 (1990), 461-470). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sieht die Erfindung vor, zur Expression der vorstehend genannten Nucleotidsequenzen in der Epidermis und dem Parenchym von sogenannten Sink-Organen beispielsweise den Arabidopsis-Promotor AtAAP1 (Expression in Endosperm und während früher Embrionalentwicklung) oder AtAAP2 (Expression in Phloem des Funiculus) (Hirner et al., Plant J., 14 (1998), 535-544) zu verwenden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, die die enzymatischen Aktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen in den Pflanzenorganen zu exprimieren, die große Mengen an Saccharose speichern. Dazu zählen beispielsweise die Rübe der Zuckerrübe, der Stamm vom Zuckerrohr oder die Knolle der AGPase-antisense-Linie 93 der Kartoffel, der sogenannten „Saccharosekartoffel" (Müller-Röber et al., Mol. Gen. Genet., 224 (1990), 136-146). Die Expression der die enzymatischen Aktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen in solchen Organen kann beispielsweise erreicht werden, indem der B33-Promotor des B33-Gens aus Kartoffeln verwendet wird (Rocha-Sosa et al., EMBO J., 8 (1988), 23-29).

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung kann vorgesehen sein, konstitutiv exprimierende Promotoren wie den CaMV 35S-Promotor, den geleitzellenspezifischen rolC-Promotor aus Agrobacterium oder den Enhanced PMA4-Promotor (Morian et al., Plant J., 19 (1999), 31-41) einzusetzen.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, in denen die die enzymatischen Aktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen im Leseraster an eine Signalsequenz fusioniert sind, welche ein Signalpeptid zur Aufnahme der die enzymatischen Aktivitäten aufweisenden Genprodukte in das endoplasmatische Reticulum einer eukaryontischen Zelle codiert. Die Erfindung sieht also vor, dass die Nucleotidsequenzen mit Signalsequenzen versehen werden können, die eine Lokalisation der Genprodukte in bestimmten Kompartimenten der Zelle erlauben. So kommen insbesondere Signalsequenzen in Betracht, die Signalpeptide codieren, welche zur Aufnahme von Proteinen in das endoplasmatische Reticulum führen und die sich dadurch nachweisen lassen, dass sie zwar in den Vorläuferproteinen, nicht jedoch in prozessierten, reifen Proteinen nachweisbar sind. Bekanntermaßen werden nämlich die Signalpeptide während der Aufnahme in das endoplasmatische Reticulum proteolytisch entfernt. So kann in einer Ausführungsform der Erfindung vorgesehen sein, ein Signalpeptid wie zum Beispiel die verkürzte N-terminale Sequenz des Proteinase-inhibitors PI II aus Kartoffel (Keil et al., Nucl. Acids Res., 14 (1986), 5641-5650; Schaewen et al., EMBO Journal, 9 (1990), 3033-3044) zu verwenden, wodurch eine Aufnahme des Genprodukts in das endoplasmatische Retikulum mit anschließender Sekretion in den apoplastischen Raum erreicht wird. Selbstverständlich können erfindungsgemäß auch andere Signalsequenzen verwendet werden.

In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung vor, dass die die enzymatischen Aktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen an eine Signalsequenz fusioniert sind, welche ein Signalpeptid zur Aufnahme ins endoplasmatische Reticulum einer eukaryontischen Zelle, insbesondere einer Pflanzenzelle, und zur Weiterleitung in die Vakuole codiert. Eine vakuoläre Lokalisation der Genprodukte ist besonders vorteilhaft. Erfindungsgemäß können beispielsweise Signalpeptide zur vakuolären Lokalisation von Lektin aus Gerste verwendet werden (Raikhel und Lerner, Dev. Genet., 12 (1991), 255-260), 43 Aminosäuren im aminoterminalen Bereich des reifen Phytohämaglutinins der Bohne codierende Signalsequenzen (Tague et al., Plant Cell, 2 (1990), 533-546) und Signalsequenzen aus einem Patatingen aus Kartoffel.

Erfindungsgemäß ist besonders bevorzugt, zur Lokalisation der Genprodukte in der Vakuole eine Signalsequenz des Patatin-B33-Gens zu verwenden, insbesondere eine Signalsequenz, die die 23 aminoterminalen Aminosäuren des Propeptids codiert (Rosahl et al., Mol. Gen. Genet., 203 (1986), 214-220), das heißt also die Nucleotide 736 bis 804. Diese Sequenz lässt sich sowohl als Fragment aus genomischer DNA der Kartoffel als auch aus der cDNA des B33-Gens gewinnen. Die Fusion der erweiterten B33-Signalsequenz mit den codierenden Nucleotidsequenzen führt zur Aufnahme von deren Genprodukten in die Vakuole.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die die enzymati schen Aktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen nicht mit einer Signalsequenz fusioniert sind, so dass die exprimierten Genprodukte im Cytosol verbleiben.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung der vorgenannten transgenen Pflanzen, umfassend die Transformation einer oder mehrerer Pflanzenzellen mit einem Vektor, insbesondere einem Plasmid, der/das eine oder mehrere Nucleotidsequenzen) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codierenden Nucleotidsequenz, einer die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codierenden Nucleotidsequenz und einer die Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase codierenden Nucleotidsequenz enthält, die Integration der in diesem Vektor oder Plasmid enthaltenen codierenden Nucleotidsequenz(en) in das Genom der transformierten Zelle(n), gegebenenfalls unter Einschluss von dessen/deren Signalsequenzen und/oder regulatorischen Elementen und die Regeneration der Pflanzenzelle(n) zu intakten, fruchtbaren transformierten Pflanzen, die Sorbit-Dehydrogenase, Mannit-Dehydrogenase und/oder Saccharose-Isomerase erzeugen.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Verfahren zur Verfügung. Bei vielen Verfahren ist es erforderlich, dass die einzuführenden Nucleotidsequenzen in Clonierungs- und oder Expressionsvektoren vorliegen. Bei Vektoren handelt es sich prinzipiell um Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen, Shuttle-Vektoren und andere in der Gentechnik üblichen Vek toren. Vektoren können noch andere Funktionseinheiten besitzen, die den Vektor in einem Wirtsorganismus stabilisieren und/oder dessen Replikation ermöglichen. Vektoren können auch regulatorische Elemente enthalten, mit denen die enthaltene Nucleotidsequenz funktionell verbunden ist und die die Expression der Nucleotidsequenz in einem Wirtsorganismus gestatten. Derartige regulatorische Einheiten können Promotoren, Enhancer, Operatoren und/oder Transkriptionsterminationssignale sein. Vektoren enthalten darüber hinaus häufig Marker-Gene, die eine Selektion der sie enthaltenden Wirtsorganismen erlauben, wie zum Beispiel Antibiotika-Resistenzgene.

Verfahren zur Einführung von DNA in Pflanzenzellen umfassen Transformationen pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Protoplastenfusion, die Mikroinjektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Bei den Verfahren der Mikroinjektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide, wie zum Beispiel pUC-Derivate verwendet werden. Wenn aus derartig transformierten Zellen jedoch ganze Pflanzen regeneriert werden sollen, sollte ein selektierbarer Marker vorhanden sein.

In Abhängigkeit von dem verwendeten Verfahren zur Einführung codierender Nucleotidsequenzen in die Pflanzenzellen kann es erforderlich sein, dass der Vektor weitere DNA-Sequenzen enthält. Werden beispielsweise das Ti- oder Ri-Plasmid zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet, ist es erforderlich, dass zumindest die rechte Bordersequenz, häufig jedoch die rechte und die linke Bordersequenz der Ti- und Ri-Plasmid-T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden ist. Bei Verwendung von Agrobacterium zur Transformation muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide cloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Auf Grund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, können intermediäre Vektoren durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid von Agrobacterien integriert werden. Diese enthalten außerdem die für den Transfer der T-DNA erforderliche vir-Region. Intermediäre Vektoren können sich nicht in Agrobacterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden. Im Gegensatz dazu können sich binäre Vektoren sowohl in E. coli als auch in Agrobacterien replizieren. Sie enthalten ein Gen für einen Selektionsmarker und einen Linker oder Polylinker, der von der rechten und linken T-DNA-Borderregion eingerahmt wird. Binäre Vektoren lassen sich direkt in Agrobacterien transformieren (Holsters et al., Mol. Gen. Genet., 163 (1978), 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobacterium soll ein Plasmid, welches eine vir-Region trägt, enthalten. Dieser vir-Bereich ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Das auf diese Weise transformierte Agrobacterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist unter anderem beschrieben in EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerej Kanters. B. V., Alblasserdam (1985), Kapitel V; Fralej et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4,1-46, und An et al., EMBO J., 4 (1985), 277-287). Um DNA in die Pflanzenzelle zu transferieren, können Pflanzenexplantate mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes cokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial, wie zum Beispiel Blattstücken, Stengelabschnitten, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder in Suspension kultivierten Pflanzenzellen, können dann in einem geeigneten Medium, das Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthält, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Transformation von Rübenzellen mittels Agrobacterium tumefaciens ist in EP 0 517 833 B1 offenbart.

Andere Möglichkeiten zur Einführung von Fremd-DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder mittels Protoplastentransformation sind unter anderem in Willmitzer, L., Transgenic plants, In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (Hersg. H. J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler) Band 2 (1993), 627-659, VCH Weinheim New York Basel Cambridge, offenbart. Alternative Systeme zur Transformation von monocotylen Pflanzen sind die elektrisch oder chemisch induzierte DNA-Aufnahme in Protoplasten, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Makroinjektion von DNA in Blütenstände, die Mikroinjektion von DNA in Mikrosporen und Pro-Embryonen, die DNA-Aufnahme durch keimende Pollen und die DNA-Aufnahme in Embryonen durch Quellung (Potrykos, Physiol. Plant (1990), 269-273). Neuere Untersuchungen weisen darauf hin, dass auch monocotyle Pflanzen mit Hilfe von Vektoren auf der Basis von Agrobacterium transformiert werden können (Chan et al., Plant Mol. Biol., 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J., 6 (1994), 271-282; Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 (1987), 5345-5349; Raineri et al., Bio/Technology, 8 (1990), 33-38; Gould et al., Plant. Physiol., 95 (1991), 426-434; Mooney et al., Plant, Cell Tiss. & Org. Cult., 25 (1991), 209-218; Li et al., Plant Mol. Biol., 20 (1992), 1037-1048). Für verschiedene Getreidearten sind einige der vorstehend genannten Transformationssysteme etabliert worden, wie zum Beispiel die Elektroporation von Geweben, die Transformation von Protoplasten und der DNA-Transfer durch Partikelbeschuss in regenerierbare Gewebe und Zellen (Jähne et al., Euphytica, 85 (1995), 35-44). Die Transformation von Weizen ist von Maheshwari et al., Critical Reviews in Plant Science, 14(2) (1995), 149-178, und die Transformation von Mais ist von Brettschneider et al., Theor. Appl. Genet., 94 (1997), 737-748, und Ishida et al., Nature Biotechnology, 14 (1996), 745-750, beschrieben worden.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispiele erläutert. Die Figuren zeigen:
1 eine Restriktionskarte des Plasmids pHWG279.1, das ein etwa 1,7 kb großes HindIII-Fragment mit der Saccharose- Isomerase codierenden Sequenz (smuA*) im Vektor pBR322 enthält,
2 eine Restriktionskarte des Plasmids pHWG469, das das native Gen der Sorbit-Dehydrogenase (sdh) aus Gluconobacter suboxidans im Vektor pBR322 enthält
Konzentrationsangaben "μM" und "mM" beziehen sich auf μMol/l bzw. mMol/l.
Beispiel 1:(Vergleichsbeispiel)
Herstellung von Vektoren. die eine Saccharose-Isomerase codierende Nucleotidsequenz enthalten
Es wurde eine Reihe von Konstrukten hergestellt, die in einem binären Vektor jeweils einen in Pflanzen exprimierbaren Promotor, jeweils die Saccharose-Isomerase codierende Nucleotidsequenz aus Protaminobacter rubrum und jeweils das Polyadenylierungssignal der T-DNA-Octopin-Synthase (Gielen et al., 1984) enthielten. Die codierende Nucleotidsequenz wurde entweder mit der Signalsequenz des Patatin-Gens der Kartoffel (Rosahl et al., Mol. Gen. Genet., 203 (1986), 214-220) fusioniert, die eine vakuoläre Lokalisation des Genprodukts bewirkt, oder ohne eine vakuoläre Target-Sequenz verwendet, um eine Expression im Cytosol der jeweiligen Pflanzenzelle zu erreichen. Als Promotor wurden sowohl der CaMV 35 S-Promotor als auch der Promotor des Patatin-Gens B33 der Kartoffel (Rocha-Sosa et al., EMBO J., 8 (1989), 23-29) verwendet, mit dem sich eine organspezifische Expression in der Knolle der Kartoffel und in der Speicherrübe der Zuckerrübe erreichen lässt. Im Fall der Kartoffel wurde der binäre Vektor pBinB33-Hyg (Becker, Nucl. Acids Res., 18 (1990), 203) verwendet, der bereits den B33-Promotor und das Polyadenylierungssignal enthält und außerdem das Hyg-Resistenzgen als Marker enthält. Im Fall der Zuckerrübe wurde der binäre Vektor pGA492 (An, Plant Physiol., 81 (1986), 86-91) verwendet, der ein Kanamycin-Resistenzgen besitzt. Mit den erhaltenen Plasmiden wurden Agrobakterien transformiert. Die transformierten Agrobakterien wurden entweder zur Transformation der Kartoffel oder der Zuckerrübe verwendet. Im Folgenden wird die Konstruktion des Plasmids UL8-19 beschrieben, bei dem die Saccharose-Isomerase codierende Sequenz am 5'-Ende „in frame" mit dem Signalpeptid des Patatin-Gens und am 3'-Ende mit dem Polyadenylierungssignal der Octopin-Synthase der T-DNA fusioniert ist und unter der Kontrolle des B33-Promotors steht.
Ein ca. 1,7 kb HindIII-Fragment (enthaltend die Saccharose-Isomerase codierende Sequenz) des in 1 dargestellten Plasmids pHWG279,1 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Mattes, Universität Stuttgart), das das native Gen der Saccharose-Isomerase aus Protaminobacter rubrum im Vektor pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2 (2) (1977), 95-113; Peden, Gene 22 (2-3) (1983), 277-280) enthält, wurde in den Vektor pBluescriptSK (Stratagene, Heidelberg) cloniert, wobei ein als pSK279,1 bezeichnetes Plasmid erhalten wurde. Zur „in frame"-Clonierung eines vakuolären Transitpeptides des Patatin-Gens (297 bp, Rosahl et al., 1986) wurde die Signalsequenz des Patatingens mit Hilfe des PCR-Verfahrens amplifiziert und nach Spaltung der Enden mit den Restriktionsenzymen ApaI und SalI in pBluescriptSK cloniert, wobei das Plasmid pSK297 erhalten wurde. Das Plasmid pSK297 wurde mit dem Restriktionsenzym SalI gespalten, die überstehenden Enden wurden in glatte Enden überführt und anschließend mit dem 1,7 kb-Fragment des Plasmids pSK279,1 ligiert, dessen Enden vorher ebenfalls in glatte Enden überführt worden waren. Das erhaltene Plasmid wurde als ULS-19 bezeichnet. Zur Kontrolle wurde der Übergangsbereich zwischen der Signalsequenz und der Saccharose-Isomerase codierenden Nucleotidsequenz sequenziert, um sicherzustellen, dass der Übergang korrekt war. Dabei stellte sich heraus, dass zwar der Übergang korrekt war, die Saccharose-Isomerase codierende Nucleotidsequenz des Plasmids pHWG279,1 jedoch mehrere Sequenzfehler, unter anderem ein Stop-Codon, enthielt. Deshalb wurde das HindIII-Fragment gegen ein eine fehlerfreie Saccharose-Isomerase codierendes HindIII-Fragment ausgetauscht. Das erhaltene Plasmid pHWG432,3 wurde nach Transformation in Escherichia coli DH5alpha auf enzymatische Aktivität überprüft. Die mit der Signalsequenz fusionierte cDNA wurde isoliert, indem das Plasmid pHWG432,3 mit XbaI gespalten wurde, die überstehenden Enden geglättet wurden und danach eine Spaltung mit Asp718 erfolgte. Das dabei erhaltene 2,0 kB-Fragment wurde in den binären Vektor pBinB33-Hyg cloniert, der mit SalI, wobei die überstehenden Enden anschließend geglättet wurden, und Asp718 gespalten worden war, so dass eine gerichtete Clonierung möglich war. Mit dem dabei erhaltenen, als UL8-19 bezeichneten Vektor wurde der Agrobacterium tumefaciens-Stamm pGV2260 (Deblaere et al., Nucl. Acids Res., 13 (1985), 4777-4788) mittels Elektroporation transformiert. Die transformierten Agrobakterien wurden zur Transformation der AGPase-antisense-Linie 93 der Kartoffel (sogen. „Saccharose-Kartoffel"; Müller-Röber et al., 1990) und der Kartoffel-Wildtyp-Varietät Desiree verwendet. Dabei wurden die transgenen Pflanzen 086BK beziehungsweise 096BK erhalten.
Beispiel 2:
Herstellung von Vektoren, die eine Sorbit-Dehydrogenase codierende Nucleotidsequenz enthalten
Es wurde eine Reihe von Konstrukten hergestellt, die in einem binären Vektor jeweils einen in Pflanzen exprimierbaren Promotor, jeweils die Sorbitdehydrogenase codierende Nucleotidsequenz aus Gluconobacter suboxidans und jeweils das Polyadenylierungssignal der T-DNA-Octopin-Synthase enthielten. Auch in diesem Beispiel wurde die codierende Nucleotidsequenz entweder mit der Signalsequenz des Patatin-Gens fusioniert, um eine vakuoläre Lokalisation des Genprodukts zu erreichen, oder zur Expression des Genprodukts im Cytosol der Zelle ohne die vakuoläre Target-Sequenz verwendet. Als Promotoren wurden der CaMV 35 S-Promotor oder der B33-Promotor des B33-Gens der Kartoffel verwendet. Im Fall der Kartoffel wurde der binäre Vektor pBinB33-Hyg verwendet, der bereits den B33-Promotor und das Polyadenylierungssignal enthält, und im Fall der Zuckerrübe der binäre Vektor pGA492. Mit den erhaltenen Plasmiden wurden Agrobakterien transformiert. Die transformierten Agrobakterien wurden entweder zur Transformation der Kartoffel oder der Zuckerrübe verwendet. Im Folgenden wird die Konstruktion des Plasmids U120/19 beschrieben, bei dem die Sorbit-Dehydrogenase codierende Sequenz am 5'-Ende „in frame" mit dem Signalpeptid des Patatin-Gens und am 3'-Ende mit dem Polyadenylierungssignal der Octopin-Synthase der T-DNA fusioniert ist und unter der Kontrolle des B33-Promotors steht.
Der Vektor pSK297 (pBluescript mit 297 bp der vakuolären Targetsequenz des Patatin-Gens) wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRV gespalten. Aus dem Plasmid pHWG469 (siehe 2) (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Mattes, Universität Stuttgart), das das native Gen der Sorbit-Dehydrogenase aus Gluconobacter suboxidans im Vektor pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2 (2) (1977), 95-113; Peden, Gene 22 (2-3) (1983), 277-280) enthält, wurde ein eine Sorbit-Dehydrogenase aus Gluconobacter suboxidans codierendes Fragment durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen EcoRV und HindIII ausgeschnitten und nach Überführung überhängender Enden in glatte Enden gerichtet hinter die vakuoläre Targetsequenz cloniert, so dass ein durchgängiges Leseraster entstand. Das Leseraster wurde an der Fusionsstelle mittels Sequenzierung überprüft. Aus dem so erhaltenen Plasmid UL19/19 wurde mittels Spaltung mit den Restriktionsenzymen Asp718 und BamHI ein 1145 bp-Fragment ausgeschnitten, das das fusionierte Protein codiert. Dieses Fragment wurde in den binären Vektor pBinB33 (Becker, NAR, 18 (1990), 203) cloniert. Mit dem resultierenden Plasmid UL20/19 wurde der Agrobacterium tumefaciens- Stamm pGV2260 transformiert. Die transformierten Agrobakterien wurden zur Transformation der Linien 21 und 33 der Kartoffellinie 096BK verwendet. Dabei wurden die transgenen Pflanzen 158BK beziehungsweise 159BK erhalten.
Beispiel 3:
Herstellung eines binären Vektors der eine Mannit-Dehydrogenase codierende Nucleotidsequenz enthält
Es wurde eine Reihe von Konstrukten hergestellt, die in einem binären Vektor die Mannit-Dehydrogenase codierende Nucleotidsequenz aus Pseudomonas fluorescens DSM 50106 (Brünker et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1 351 (1 997), 157-167) zusammen mit jeweils einem pflanzenspezifischen Promotor und dem Polyadenylierungssignal der T-DNA-Octopin-Synthase enthielten. Auch in diesem Beispiel wurde die codierende Nucleotidsequenz entweder mit der Signalsequenz des Patatin-Gens fusioniert, um eine vakuoläre Lokalisation des Genprodukts zu erreichen, oder ohne die vakuoläre Target-Sequenz verwendet, um das Genprodukt im Cytosol der Zelle zu exprimieren. Als Promotoren wurden der CaMV 35 S-Promotor oder der B33-Promotor des B33-Gens der Kartoffel verwendet. Im Fall der Kartoffel wurde der binäre Vektor pBinB33-Hyg verwendet, der bereits den B33-Promotor und das Polyadenylierungssignal enthält, und im Fall der Zuckerrübe der binäre Vektor pGA492. Mit den erhaltenen Plasmiden wurden Agrobakterien transformiert. Die transformierten Agro bakterien wurden entweder zur Transformation der Kartoffel oder der Zuckerrübe verwendet.
Beispiel 4:
Transformation von Agrobacterium tumefaciens
Der DNA-Transfer in die Agrobakterien erfolgte mittels direkter Transformation nach dem Verfahren von Höfgen und Willmitzer(Nucl. Acids Res., 16 (1988), 9877). Die Plasmid-DNA transformierten Agrobakterien wurde nach dem Verfahren von Birnboim und Doly (Nucl. Acids Res., 7 (1979), 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.
Beispiel 5:
Transformation der Kartoffel
Die Pflanzentransformation erfolgte durch Agrobakterium tumefaciens (Stamm pGV2260 in C58C1; Deblaere et al., Nucl. Acids Res., 13 (1985) , 4777-4788) vermittelten Gentransfer nach dem in Dietze et al., Gentransfer to Plants, (1995), 24-29, beschriebenen Verfahren. Die transgenen Pflanzen wurden entweder auf Kanamycin oder Hygromycin enthaltenden Medien selektiert.
Beispiel 6:
Induktion regenerierbarer Kalli aus Blättern der Zuckerrübe
Etwa einen Monat nach der Keimung von Zuckerrübensamen im Gewächshaus wurden Versuche zur Induktion von Kalli gemäß dem von Saunders et al. (Saunders, J. W. und Doley, W. P., J. Plant. Physiol., 124 (1986), 473-479) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Dabei wurden einer jeden Pflanze junge, drei bis fünf Zentimeter lange Blätter abgenommen, desinfiziert, mit sterilem Wasser dreimal gespült und auf sterilem Filterpapier getrocknet. Jedes Blatt wurde anschließend in Stücke von etwa 0,25 cm² geschnitten und die so erhaltenen Explantate wurden in Petrischalen auf MSB1-Medium kultiviert. Nachdem die Schalen mit einer Kunststofffolie luftdicht abgeschlossen worden waren, wurden sie dreißig Tage bei 30°C im Dunklen inkubiert und anschließend in Kulturkammern überführt . Vier bis zehn Wochen nach Kulturbeginn erschienen auf oder unter den Blattexplantaten weiße brüchige Kalli.
Beispiel 7:
Gewinnung von Zellsuspensionen aus induzierten Kalli der Zuckerrübe
Vier bis sechs Wochen nach ihrem Erscheinen wurden die Kalli entnommen und in 250 ml-Erlenmeyerkolben, die mit Folie verschlossen worden waren, in 100 ml flüssigem MSB1-Medium kultiviert. Die Erlenmeyerkolben wurden auf einem Rotationsschüttler bei etwa 200 U/min geschüttelt. Nach etwa zwei bis drei Wochen wurde eine Zellsuspension erhalten.
Beispiel 8:
Transformation von Zellsuspensionen und jungen Kalli der Zuckerrübe
Zellsuspension
Die Transformation wurde mit Zellsuspensionen nach etwa dreiwöchigem Kultivieren durchgeführt. Zu 10 ml Suspensionsmedium wurden 10 ml frisches MSB1-Medium zugegeben. Die so verdünnte Suspension wurde auf vier Petrischalen verteilt.
Aus Stammkulturen von Agrobacterium tumefaciens-Stämmen, die mit den erstellten Binärvektoren transformiert worden waren, wurden 50 μl entnommen und in 2 ml LB-Medium, das Rifampicin und Tetracyclin enthielt, kultiviert. Die Kulturen wurden zwei Tage mit 200 U/min bei 30° C gerührt. Dieser Stamm wurde in frisches Medium umgesetzt und unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen die Nacht über kultiviert.
Die Infektion der Pflanzenzellen erfolgte, indem 50 μl eines jeden Agrobacterium tumefaciens-Stammes einer der die entsprechenden Rübenzellen enthaltenden Petrischalen zugesetzt wurden. Die Rübenzellen und die Bakterien wurden drei Tage lang in einer Kulturkammer in der Dunkelheit kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien von den Pflanzenzellen entfernt, indem zunächst mit MSB1 und 600 mg/l Cefotaxim und dann mit MSB1 plus 300 mg/l Cefotaxim gewaschen wurde. Die so gewaschenen Rübenzellen wurden in Petrischalen auf einem Blatt sterilen Whatman-Papier kultiviert, das auf Kanamycinhaltigem MSB1-Medium plus 300mg/l Cefotaxim lag. Die Schalen wurden mit Kunststofffolie luftdicht verschlossen und fünfzehn Tage in der Kulturkammer inkubiert. Drei bis acht Wochen danach erschienen weiße Kalli auf einer Schicht abgestorbener Zellen.
Dispersion neu induzierter Kalli
Es wurden junge, aus Blattexplantaten frisch induzierte Kalli transformiert. Dabei wurden Kalli verwendet, die nach zwei bis sechs Wochen auf Blättern gerade erschienen waren. Diese Kalli wurden in sterilen Kunststoffröhrchen in flüssigem MSB1-Medium dispergiert und dem gleichen Transformationsverfahren wie die Zellsuspensionen unterworfen.
Beispiel 9:
Regeneration von Zuckerrüben-Pflanzen aus transformierten Kalli
Nachdem die transformierten Kalli zunächst einen Monat auf MSB1 und Cefotaxim oder MSB1 und Cefotaxim und Kanamycin kultiviert worden waren, erfolgte die weitere Kultivierung der transformierten Kalli auf MSB1-Medium.
Nach einer bestimmten Zeit entwickelten sich aus bestimmten Kalli Sprossen und/oder Embryonen. Sobald die Sprossen mit der Entwicklung von Blättern begonnen hatten, wurden diese auf MS-Medium, das 1 mg/l Naphtalinessigsäure enthielt, eingewurzelt. Nach zwei bis sechs Wochen erschienen Wurzeln. Nach der Entwicklung von Wurzeln wurden die Pflanzen im Gewächshaus in Humuserde aklimatisiert. Nach weiteren drei Monaten hatten sich vollständige Pflanzen entwickelt.
Beispiel 10:
Nachweis des gebildeten Mannit-Dehydrogenase-, Sorbit-Dehydrogenase- und Saccharose-Isomerase-Gens in transformiertem Gewebe
Die Vorselektion von transformierten Pflanzen erfolgte auf Kanamycin beziehungsweise Hygromycin enthaltenden Medien. Zum Nachweis der Transgene wurde zunächst genomische DNA aus den entsprechenden Geweben (Kartoffelknollen oder Zuckerrüben-Speicherwurzel) isoliert. Jeweils 30 ng genomische DNA wurde als Template für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR; Saki et al., Science, 239 (1988), 487-491) verwendet. Als Primer dienten genspezifische Sonden aus dem 5'- und 3'-Bereich der Saccharose-Isomerase aus Protaminobacter rubrum, der Sorbit-Dehydrogenase aus Gluconobacter suboxidans und der Mannit-Dehydrogenase aus Pseudomonas fluorescens. Die Reaktionen wurden jeweils in einer Lösung mit einem Gesamtvolumen von 50 μl, enthaltend 1 μM der 3'- und 5'-Primer, 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl und 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,4, mit 1 E Tag-Polymerase (Gibco-BRL) durchgeführt. Die PCR-Ansätze wurden jeweils 40 Zyklen mit 1-minütiger Denaturierung bei 95°C, 1-minütiger Primeranlagerung bei 65°C und 2,5-minütiger Synthese bei 72°C unterworfen, wobei eine 10-minütige abschließende Synthese zur Ketten-Vervollständigung die gesamte Reaktion beendete. Die Analyse der Reaktionsprodukte erfolgte mittels Gelelektrophorese, wobei das dem jeweiligen Transgen entsprechende PCR-Produkt über die Fragmentgröße bestimmt wurde. Nach Subclonierung und partieller Sequenzierung der PCR-Produkte konnten die Transgene eindeutig identifiziert werden.
Beispiel 11:
Nachweis der Saccharose-Isomerase-Aktivität in transformiertem Gewebe
Der Nachweis der Saccharose-Isomerase-Aktivität in transformierten Kartoffelknollen wurde wie folgt durchgeführt. Kartoffelknollen transgener Kartoffelpflanzen und der als Kontrolle verwendeten Wildtyp-Varietät Desiree wurden zerkleinert und jeweils 2 bis 5 g des zerkleinerten Materials wurden nach Zugabe von 50 ml kochendem Wasser in einem Omni-Mixer 2 min homogenisiert und anschließend 15 min in einem Wasserbad bei 95°C erhitzt. Der Nachweis von Isomaltulose erfolgt nach Zentrifugation und Verdünnung des Überstandes mit Hilfe des HPAEC-Verfahrens. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Nachweis von Isomaltulose in transgenen Kartoffelpflanzen

Claims

Transgene Pflanze, die in mindestens einer ihrer Zellen aus in der Pflanze gebildeter Saccharose Isomaltulose und aus der gebildeten Isomaltulose 6-O-α-D-Glucopyranosyl-D-sorbit (1,6-GPS) und/oder 1-O-α-D-Glucopyranosyl-D-mannit (1,1-GPM) erzeugen kann, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze in der mindestens einen Zelle eine stabil integrierte und in ihr exprimierbare Nucleotidsequenz, die die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codiert, und mindestens eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codierenden Nucleotidsequenz und einer die Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase codierenden Nucleotidsequenz, enthält.
Transgene Pflanze, die in mindestens einer ihrer Zellen eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codiert.
Transgene Pflanze, die in mindestens einer ihrer Zellen eine stabil integrierte und exprimierbare Nucleotidsequenz enthält, die die Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase codiert, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dicotylen Pflanzen, Algen, Moosen, Farnen und Gymnospermae.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Kartoffel ist.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Zuckerrübe ist.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleotidsequenz in einem Pflanzen-Vektor enthalten ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 6, wobei die codierende Nucleotidsequenz eine cDNA oder eine genomische DNA-Sequenz ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 7, wobei die Saccharose-Isomerase codierende Nucleotidsequenz aus einem Mikroorganismus, insbesondere aus einem Mikroorganismus der Gattung Protaminobacter, Erwinia, Serratia, Leuconostoc, Pseudomonas, Agrobacterium oder Klebsiella, die Sorbit-Dehydrogenasen codierende Nucleotidsequenz aus einem Mikroorganismus, insbesondere aus einem Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter, und die Mannit-Dehydrogenase aus einem Mikroorganismus, insbesondere aus einem Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas, erhältlich ist.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die codierende Nucleotidsequenz unter der funktionellen Kontrolle mindestens eines regulatorischen Elementes steht, das die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleistet.
Transgene Pflanze nach Anspruch 9, wobei das mindestens eine regulatorische Element ein Promotor, insbesondere ein pflanzenspezifischer Promotor ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 10, wobei der Promotor ein gewebe- oder organspezifischer, vorzugsweise ein speicherorganspezifischer Promotor ist.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die codierende Nucleotidsequenz im Leseraster entweder an eine Signalsequenz fusioniert ist, welche ein Signalpeptid codiert, das den Transport des Proteins mit der Aktivität einer Saccharose-Isomerase, des Proteins mit der Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase oder des Proteins mit der Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase zu einem bestimmten Zellkompartiment oder einer bestimmten Zellorganelle gewährleistet, oder nicht an eine Signalsequenz fusioniert ist, so daß das Protein mit der Aktivität einer Saccharose-Isomerase, das Protein mit der Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase oder das Protein mit der Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase im Cytosol lokalisiert ist.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die codierende Nucleotidsequenz funktionell mit Terminations- und/oder Polyadenylierungssignalen verbunden ist.
Vermehrungs- und/oder Erntematerial einer Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend a) die Transformation einer oder mehrerer Pflanzenzellen mit i) einer die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codierenden Nucleotidsequenz und einer die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codierenden Nucleotidsequenz oder ii) einer die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codierenden Nucleotidsequenz und einer die Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase codierenden Nucleotidsequenz oder iii) einer die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codierenden Nucleotidsequenz oder iv) einer die Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase codierenden Nucleotidsequenz, b) die Integration der Nucleotidsequenz(en) in das Genom der transformierten Zelle(n) und c) die Regeneration von Pflanzen, die Sorbit-Dehydrogenase, Mannit-Dehydrogenase- und/oder Saccharose-Isomerase erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Transformation eine Cotransformation der jeweils eingesetzten Nucleotidsequenzen ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die zu transformierenden Zellen transgene Zellen sind, die mindestens eine stabil integrierte Nucleotidsequenz enthalten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer die Aktivität einer Saccharose-Isomerase codierenden Nucleotidsequenz, einer die Aktivität einer Sorbit-Dehydrogenase codierenden Nucleotidsequenz und einer die Aktivität einer Mannit-Dehydrogenase codierenden Nucleotidsequenz.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die transformierte(n) Nucleotidsequenz(en) in einem Pflanzenvektor enthalten sind.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die codierende(n) Nucleotidsequenz(en) eine cDNA oder eine genomische DNA Sequenz ist (sind).
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Saccharose-Isomerase codierende Nucleotidsequenz aus einem Mikroorganismus, insbesondere aus einem Mikroorganismus der Gattung Protaminobacter, Erwinia, Serratia, Leuconostoc, Pseudomonas, Agrobacterium oder Klebsiella, die Sorbit-Dehydrogenase codierende Nucleotidsequenz aus einem Mikroorganismus, insbesondere aus einem Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter, und die Mannit-Dehydrogenase codierende Nucleotidsequenz aus einem Mikroorganismus, insbesondere einem Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas, erhältlich ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20 wobei die codierende(n) Nucleotidsequenz(en) jeweils unter der funktionellen Kontrolle mindestens eines regulatorischen Elementes steht/stehen, das die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleistet.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das mindestens eine regulatorische Element ein Promotor, insbesondere ein pflanzenspezifischer Promotor ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Promotor ein gewebe- oder organspezifischer, vorzugsweise ein speicherorganspezifischer Promotor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 23, wobei die codierende(n) Nucleotidsequenz(en) entweder im Leseraster an eine Signalsequenz fusioniert ist (sind), welche ein Signalpeptid codiert, das den Transport des codierten Proteins zu einem bestimmten Zellkompartiment oder einer bestimmten Zellorganelle gewährleistet, oder nicht an eine Signalsequenz fusioniert ist, so daß das codierte Protein im Cytosol lokalisiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, wobei die codierende(n) Nucleotidsequenz(en) funktionell mit Terminations- und/oder Polyadenylierungssignalen verbunden ist (sind).