Beeinflussung der Verteilung von Metallen in transgenen Pflanzen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Metall-bindendes Protein und ein Verfahren zur Beeinflussung der Verteilung von Metallen in transgenen Pflanzen mittels Expression des Metall-bindenden Proteins.
Mikronährstoffe, wie z.B. Eisen, Zink, Kupfer und Mangan, werden von der Pflanze aus dem Boden aufgenommen und akropetal durch das Xylem in den oberirdischen Teilen der Pflanze verteilt. Von diesen Speicherorten erfolgt über das Phloem eine gezielte Verteilung der Mikronährstoffe zu bedürftigen Organen und Geweben. Richtung und Intensität dieser Remobilisierung hängen von den Entwicklungsstadien und von Umweltfaktoren ab.
Bei der Verteilung von Metallen durch Langstreckentransport im Phloem während der Entwicklung und in Reaktion auf das Mikronährstoffangebot spielen Metallbindende Proteine eine wichtige Rolle. Durch die Auffindung solcher Metallbindenden Proteine und ihre Expression in transgenen Pflanzen sollte es möglich sein, die Verteilung von Metallen zu beeinflussen. So könnte die pflanzliche
Verteilung essentieller wie toxischer Metalle manipuliert werden. Auch die Wirkung von Umweltfaktoren wie Temperatur- und Wasserstreß könnte durch Expression eines geeigneten Metall-bindenden Proteins beeinflußt werden. Da entwicklungsspezifische Vorgänge wie Keimung, Wachstum, Reproduktion und Seneszenz mit zum Teil drastischen Mikronährstoffumlagerungen einhergehen, können diese Prozesse in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen durch Expression eines Metall-bindenden Proteins beeinflußt werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Metall-bindendes Protein aufzufinden, das sich für die Beeinflussung der Verteilung von Metallen durch Langstreckentransport im Phloem von transgenen Pflanzen eignet.
Diese und weitere Aufgaben werden durch die in den Patentansprüchen definierten Ausführungsformen gelöst.
Es wurde jetzt überraschenderweise im Phloemsaft von Ricinus communis- Keimlingen ein Protein gefunden, das Eisen und andere Metalle bindet und über längere Strecken transportiert.
Das erfindungsgemäße Protein eignet sich aufgrund seiner Eigenschaften für die Steigerung des Pflanzenwachstums, die Erhöhung der Mikronährstoffeffizienz, die Verbesserung der Spurenelementzusammensetzung von Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung und die Steigerung der pflanzlichen Toleranz gegen toxische Schwermetalle.
Das Protein wird im folgenden als Metall-bindendes Protein, abgekürzt MBP bezeichnet. Das erfindungsgemäße Protein ist in der Lage u.a. Eisen, Zink, Kupfer und Mangan zu binden. Die hohe Affinität gegenüber Eisen und Fähigkeit zum Transport von Eisen im Phloem ist für die Nutzung des Proteins bzw. seiner Expression in transgenen Pflanzen besonders vorteilhaft. Das erfindungsgemäße MBP zeigt eine besonders hohe Affinität für Eisen(III).
Die Erfindung betrifft somit ein pflanzliches Metall-bindendes Protein, das in der Lage ist, Metalle, insbesondere Eisen, zu binden und insbesondere natürlicherweise im Phloem vorkommt.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das MBP in seiner Aminosäuresequenz die folgenden Aminosäureabfolgen auf (vom N-Terminus in Richtung C-Terminu):
ΓEETLHIGGHKEEH und EGFMDK.
Hierbei können die Peptidsequenzen auch in jeweils 1-2 Aminosäureresten abweichen, sei es durch Vorliegen eines anderen Aminosäurerestes, also eines Austausches, oder durch Vorhandensein einer zusätzlichen Aminosäure innerhalb der angegebenen Peptidsequenzen, oder durch Fehlen einer Aminosäuresequenz der oben angegebenen Peptidsequenzen.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform handelt es sich um ein Protein, das in Ricinus communis und speziell in dessen Phloemsaft vorkommt.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße MBP kodiert. Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
a) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 1 angegebene Nukleinsäuresequenz oder Fragmente davon umfassen; b) DNA-Sequenzen, die eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die die in SEQ ID No. 3 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodiert; c) DNA-Sequenzen, die eine Nukleinsäuresequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleinsäuresequenz von a) oder b) hybridisiert, oder Fragmente dieser Nukleinsäuresequenz umfassen; d) DNA-Sequenzen, die zu den Nukleinsäuresequenzen von a), b) oder c) eine Sequenzidentiät von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 70%, mehr bevorzugt von mindestens 80%, 82%, 84%, besonders bevorzugt von mindestens 86%o, 88%o, äußerst bevorzugt von mindestens 90%, 92%, 94 % und am meisten bevorzugt von mindestens 96%, 98% aufweisen.
Unter einem Fragment wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Teil des erfindungsgemäßen Proteins verstanden, bei dem dessen Funktion und insbesondere die Metall-bindenden Eigenschaften erhalten sind.
Vorzugsweise stammt die erfindungsgemäße DNA-Sequenz aus Ricinus communis und kodiert ferner insbesondere ein pflanzliches MBP, das natürlicherweise im Phloem vorkommt.
Ferner betrifft die vorliegenden Erfindung rekombinante Nukleinsäuremoleküle, umfassend
a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors, b) operativ daran gebunden eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, c) operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, umfassend eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz oder ein erfindungsgemäßes rekombinantes Nukleinsäuremoleküle.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung pflanzliche Proteine, die in der Lage sind, Metalle zu binden und durch eine vorstehend beschriebene erfindungsgemäße DNA-Sequenz kodiert sind.
Die in SEQ ID No. 1 angegebene DNA-Sequenz weist eine Länge von 483 Basenpaaren auf, wobei sich der offene Leserahmen von Position 81 bis 368 erstreckt. Das durch diese Sequenz kodierte Protein mit 96 Aminosäuren (siehe SEQ ID No. 3) hat ein Gewicht von 10.913 Dalton. Dieses Gewicht weicht von dem biochemisch bestimmten, apparenten Gewicht etwas nach unten ab. Gleiches gilt für den pl-Wert, der anhand der Sequenz bei 6,7 liegen würde, in der zweidimensionalen Gelelektrophorese aber mit 7,1-7,3 bestimmt wurde. Die Unterschiede ergeben sich aus der ungewöhnlichen polaren Aminosäurezusammensetzung des
erfindungsgemäßen MBP-Proteins. Das MBP besteht nur zu 14 % aus nicht-polaren Aminosäuren, was ein Grund für sein ungewöhnliches elektrophoretisches Verhalten sein dürfte. So weist das erfindungsgemäße MBP-Protein bei einer Ausführungsform einen hohen Anteil an Glycin (13%), Glutaminsäure (15%), Lysin (19%) und Histidin (18%) auf. Diese Aminosäuren bilden ein degeneriertes tetrameres Motiv (HKGE), das sich gegebenenfalls mit Permutationen in der Aminosäuresequenz mehrfach wiederholt.
Der in SEQ ID No. 3 angegebenen Aminosäuresequenz zufolge weisen die erfindungsgemäßen Proteme eine gewisse Homologie zu LEA-Proteinen auf, wie z.B. dem SCRl-Protein aus Glycine max, dem COR11-Protein aus Citrus vulgaris und dem S-linked protein aus Nicotiana tabacum. Die als LEA (Late Embryogenesis Abundant)-Proteine bezeichneten Proteine bzw. deren cDNAs wurden zuerst durch differentielles Absuchen oder subtraktive Hybridisierung von cDNA-Banken aus reifen und unreifen Samen gefunden. Später kamen in der Primärstruktur verwandte Proteine hinzu, die bei Trockenstreß und Abscissinsäuregabe induziert werden. Ihrer Aminosäuresequenz entsprechend werden die LEA-Proteine in mindestens 6 Klassen eingeteilt. Gemeinsam ist allen ein relativ hoher Gehalt an Glycin sowie polaren Resten. Entsprechend sind die Proteine extrem hydrophil und weisen eine „random coir'-Sekundärstruktur auf. Die meisten dieser Proteinen haben ein
Molekulargewicht zwischen 8 und 16 kD, aber auch Proteine mit einem MG von 40- 60 kD und LEA-Ähnlichkeit sind bekannt.
Die molekulare Funktion der LEA-Proteine ist weitgehend unklar. Sie könnte in der Bindung von Wasser bei Trockenstreß bestehen oder in der filmartigen Anlagerung an cytosolische Proteine als Schutzmechanismus. Neben Trockenstreß werden Mitglieder der Familie auch durch Temperaturstreß induziert. Sie kommen vermutlich ubiquitär in Pflanzen vor. Funktional verwandte Proteine treten offenbar in allen Organismengruppen auf.
LEA-Proteine wurden allerdings bisher nicht im Zusammenhang mit der Bindung oder Verteilung von Metallen in Pflanzen beschrieben.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Metallbindenden Protein ein Protein verstanden, das in nativer Konformation die Metalle des Periodensystems mit unterschiedlicher Affinität bindet. Bevorzugt handelt es sich bei dem Metall-bindenden Protein um ein Protein, das in Pflanzen vorkommende essentielle wie toxische Metallionen, zumindest aber Fe(III), Fe(II), Zn, Cu und/oder Mn reversibel bindet.
Die Erfindung betrifft weiter Oligonukleotide, die zur Amplifizierung der für das erfindungsgemäße Metall-bindende Protein kodierenden DNA-Sequenz mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) eingesetzt werden können und eine erfolgreiche Isolierung der DNA-Sequenz gewährleisten.
Bei den erfindungsgemäßen PCR-Primern handelt es sich um folgende Oligonukleotide:
a)
H K E E H
5'- C CAATT//CC AAAAAA//GG G GAAGG//AA G GAAGG//AA C CAA -3'
(16-fach degeneriert)
b)
H I G G H
5'- C CAATT//CC AATTTT//CC//AA G GGGNN G GGGNN C CAA -3'
(96-fach degeneriert)
C)
E G F M D K
5'- GAG/A GGN TTT/C ATG GAT/C AA -3'
3'- CTT/C CCN AAA/G TAC CTG/A TT -5'
(in dieser Richtung; 32-fach degeneriert)
Zur Isolierung der für die erfindungsgemäßen Metall-bindenden Proteine kodierenden DNA-Sequenz können bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Oligonukleotide wie folgt verwendet werden:
Die obigen drei Oligonukleotide werden in den beiden möglichen Kombinationen (also a) und c) unten oder b) und c) unten) als PCR-Primer eingesetzt. Die PCR- Reaktion erfolgt mit cDNA von R. communis -Keimlingen als Template. Dazu wird Gesamt-RNA und daraus mRNA durch kommerzielle Isolierungsverfahren gewonnen (Qiagen, Hilden). Die Synthese von cDNA erfolgt durch das Marathon- System (Clontech, Heidelberg).
Zusammensetzung der PCR-Reaktion: Primer (je 1-100 pmol), cDNA (0,01-10 μg), hitzestabile DNA-Polymerase und Puffer nach Herstellerangaben unter Anwendung von Standard PCR-Optimierungs-Kits (z.B. Pwo, Taq, Röche Diagnostics GmbH,
Mannheim).
PCR-Programm: 1 min bei 94 °C; 0,5-3 min bei 30-60 °C; 1 min bei 72 °C. Die optimale Annealing-Temperatur wird durch Gradienten-PCR im angegebenen
Temperaturbereich bestimmt.
PCR-Produkte werden nach Standardverfahren gereinigt und kloniert (z.B. in pCAP- Vektor, Röche Diagnostics GmbH). Verifizierung der klonierten PCR-Produkte erfolgt durch DNA-Sequenzierung nach Standardverfahren und Vergleich der translatierten Aminosäuresequenz mit den vorliegenden internen Peptidsequenzen.
Die Isolierung der füll length-cDNA mit der in SEQ ID No. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz kann beispielsweise durch eines der folgenden Verfahren erfolgen:
1. PCR-Reaktion mit den 5 '- bzw. 3 '-Adapter-Primern des Marathon (Clontech)- cDNA-Pools in entsprechender Kombination mit internen, auswärts gerichteten Primern des klonierten und verifizierten PCR-Produkts. Klonierung der PCR- Produkte wie oben beschrieben und anschließendes Zusammenfügen der DNA- Fragmente zur vollständigen cDNA durch Klonierung an geeigneten Restriktionsschnittstellen.
2. RACE-Protokoll 5' und 3' mit internen Primern wie unter 1. angegeben (RACE- Kit von Röche Diagnostics GmbH). Erstellen der vollständigen cDNA wie unter 1.
3. Absuchen einer cDNA-Phagenbank, erstellt von Keimlingen von R. communis, mit dem radioaktiv markierten PCR-Produkt nach Standardverfahren. Die Herstellung kann z.B. im Phagen λgtl 1 nach Herstellerangaben (Promega, Mannheim) erfolgen.
Diese Verfahren können selbstverständlich auf jede gewünschte Pflanze, aus der für das MBP kodierende Nukleinsäuresequenzen isoliert werden sollen, übertragen werden.
Die vollständige cDNA wird in geeignete binäre Vektoren kloniert, z.B. pBHOl (Clontech), der für konstitutive Expression durch den CMV 35S Promotor geeignet ist.
Es ist für den Fachmann klar, dass z.B. die Position „N" (= G, A, T oder C) im Oligonukleotid durch Inosin ersetzt werden kann. Grundsätzlich besteht aber auch
immer die Möglichkeit mehrere Oligonukleotide einzusetzen, um alle Möglichkeiten abzudecken.
Die DNA-Sequenz, die ein erfindungsgemäßes Metall-bindendes Protein kodiert, kann aus natürlichen Quellen isoliert oder nach herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden. Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ist es möglich, gewünschte Konstrukte für die Transformation von Pflanzenzellen vorzubereiten bzw. herzustellen. Die für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen üblicherweise eingesetzten Klonierungs-, Mutagenisie- rungs-, Sequenzanalyse-, Restriktionsanalyse- und weitere biochemisch- molekularbiologischen Methoden sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt. So können nicht nur geeignete chimäre Genkonstrukte mit der gewünschten Fusion von Promotor und MBP -DNA-Sequenz und ggf. weiteren Regulations- und/oder Signalsequenzen hergestellt werden, vielmehr kann der Fachmann, falls erwünscht, zusätzlich mittels Routinetechniken, verschiedenartige Mutationen in die das Metallbindende Protein kodierende DNA-Sequenz einführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletion vom 5'- oder vom 3 '-Ende der kodierenden DNA-Sequenz die Synthese entsprechend verkürzter Proteine erreicht werden kann. Femer ist es möglich, gezielt Proteine herzustellen, die durch Addition entsprechender Signalsequenzen in bestimmten Kompartimenten der Pflanzenzelle lokalisiert sind. Derartige Sequenzen sind in der Literatur beschrieben und dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt (siehe z.B. Braun et al. (1992) EMBO J. 11 :3219- 3227; Wolter F. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:846-850; Sonnewald U. et al. (1991) Plant J. 1:95-106). Weiterhin ist auch die Einführung von Punktmutationen an Positionen denkbar, bei denen eine Veränderung der Aminosäuresequenz einen Einfluss beispielsweise auf die Bindungsaffinität oder -
spezifität oder die Regulierung des Proteins hat. Auf diese Weise können z.B. Mutanten hergestellt werden, die nicht mehr den normalerweise in der Zelle herrschenden Regulationsmechanismen über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen. Weiterhin können Mutanten hergestellt werden, die ein verändertes Aktivitäts-, Temperatur- und/oder pH-Profil aufweisen.
Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Teile davon in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von Standardverfahren (siehe z.B.
Sambrook et al. (1989), vide supra) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können an die Fragmente, wo erforderlich, Adapter oder Linker angefügt werden. Ferner können mittels enzymatischer und anderer Manipulationen passende Restriktionsschnittstellen zur Verfügung gestellt oder überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, „primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethoden werden im allgemeinen Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammt die beschriebene, für ein Metall-bindendes Protein kodierende DNA-Sequenz aus Ricinus communis.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Metall-bindende Protein kodiert, mindestens eine Nukleotidsequenz auf, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) C A T/C A A A/G G A G/A G A G/A C A T/C b) C A T/C A T T/C/A G G N G G N C A T/C c) G A G/A G G N T T T/C A T G G A T/C A A A/G
Besonders bevorzugt ist eine DNA-Sequenz, die mindestens zwei, am meisten bevorzugt alle drei dieser Nukleotidsequenzen (a), b) und c)) aufweist und für ein MBP kodiert.
Für die Expression der DNA-Sequenz in pflanzlichen Zellen ist diese mit regulatorischen Sequenzen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hier kommt jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage. Dabei können die für das erfindungsgemäße Metall-bindende Protein kodierenden DNA-Sequenzen mittels herkömmlicher molekularbiologischen Methoden (siehe z.B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) mit regulatorischen Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors verknüpft werden.
Der Promotor kann so gewählt sein, dass die Expression konsumtiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe oder Organ, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung und/oder zu einem durch äußere Einflüsse, biotische oder abiotische Stimuli bestimmten Zeitpunkt (induzierte Genexpression). In Bezug auf die zu transformierende Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein.
Geeignete Promotoren sind z.B. der 35S RNA-Promotor des Cauliflower Mosaic Virus und der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression, ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben garantiert, z.B. der ST-LSl -Promotor (Stockhaus et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7943-7947; Stockhaus et al. (1989) EMBO J. 8:2445-2451) oder ein Promotor, der während der Pflanzentransformation, der Pflanzenregeneration oder bestimmten Stadien dieser Prozesse aktiv ist, wie z.B. zellteilungsspezifische Promotoren wie der Histon H3-Promotor (Kapros et al. (1993) InVitro Cell Cev. Biol. Plant 29:27-32) oder das chemisch induzierbare Tet-Repressor-System (Gatz et
al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237). Weitere geeignete Promotoren können der Literatur, z.B. Ward (1993, Plant Mol. Biol. 22:361-366), entnomen werden. Gleiches gilt für induzierbare und zell- bzw. gewebespezifische Promotoren, wie Meristem-spezifische Promotoren, die ebenfalls in der Literatur beschrieben worden sind und im Rahmen der Erfindung ebenfalls geeignet sind.
Besonders bevorzugt sind Phloem-spezifische Promotoren, am meisten bevorzugt Geleitzellen-spezifische Promotoren. Hier sind als Beispiele zu nennen der rolC- Promotor von Agrobacterium rhizogenes (Schmülling et al. (1989) Plant Cell 1:665- 670) und der AtSUC2 Saccharose-Symporter-Promotor von Arabidopsis thaliana (Imlau et al. (1999) Plant Cell 11 :309-322).
Ferner sind Transkriptions- bzw. Terminationssequenz vorhanden, die der korrekten Beendigung der Transkription dient, sowie der Addition eines polyA-Schwanzes an das Transkript dienen kann, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (z.B. Gielen (1989) EMBO J. 8:23-29) und beliebig austauschbar, z.B. der Terminator des Octopinsynthasegens aus Agrobacterium tumefaciens.
Die für das MBP kodierende Sequenz kann in sense- oder antisense-Orientierung vorliegen. Soll die endogene MBP- Aktivität in der transgenen Pflanze unterdrückt werden, wird die Expression endogener MBP-Sequenzen durch Antisense- oder Co- Suppression verringert bzw. ausgeschaltet. Im Falle der Antisense- oder Co- Suppression sind natürlich auch solche Fragmente der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen einsetzbar, und vom Schutzumfang umfasst, die zwar nicht die gesamte kodierende Region umfassen, aber dennoch eine Downregulierung der endogenen MBP-Expression bzw. -Aktivität bewirken. Solche Fragmente könnte man als „antisense-aktive" DNA-Fragmente bezeichnen.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC- Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. co/z'-Zellen verwendet. Transformierte E. co/z'-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysenmethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA- Sequenzen verknüpft werden.
Die erfindungsgemäßen Vektoren und Nukleinsäuremoleküle können weitere regulatorische Sequenzen und/oder Funktionseinheiten besitzen, die z.B. als Enhancer wirken oder eine Stabilisierung des Vektors in der Wirtszelle bewirken. Wie oben erwähnt, können die kodierenden Sequenzen auch durch Signalsequenzen ergänzt sein, die für den Transport des Genprodukts zu einem bestimmten Kompartiment sorgen.
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die erfindungsgemäße rekombinante Nukleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten, wobei die Moleküle oder Vektoren transient oder stabil vorliegen können. Wirtszelle kann dabei jede Zelle und jeder
Organismus sein, die bzw. der in der Lage ist, rekombinante DNA aufzunehmen und ggf. aufgenommene DNA-Sequenz zu exprimieren. Hier kommen prokaryontische und eukaryontische Zellen bzw. Organismen in Frage, insbesondere Mikroorganismen wie Bakterien, Viren, Pilze, Hefen und Algen, aber auch
Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Vektoren oder Teile oder Derivate davon enthalten.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle und Vektoren ist es möglich, Pflanzen zu erzeugen, die eine im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen veränderte Verteilung von Metallen aufweisen.
Weiter kann die Akkumulation von toxischen und nicht-toxischen Metallen in Pflanzenorganen beeinflußt werden. Hierdurch können eine erhöhte Mikronährstoffeffizienz und/oder eine erhöhte Metalltoleranz in Kulturpflanzen erzielt werden.
Die Verbesserung der Nährstoffausnutzung unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen kann insbesondere in geographischen Gebieten mit nährstoffarmen Böden, d.h. vor allem in Entwicklungsländern, genutzt werden. Die Entgiftung von Schwermetallen ist vor allem in industrialisierten Ländern wie Europa, den USA und Japan von Interesse.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Erzeugung von transgenen Pflanzen mit veränderter Verteilung von Metallen, umfassend die Schritte:
i) Herstellung eines rekombinanten Nuklemsäuremoleküls, umfassend a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors; b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Metall-bindendes
Protein kodiert, operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können, oder eines Vektors, enthaltend ein solches rekombinantes Nukleinsäuremolekül; und
ii) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus i) auf Pflanzenzellen.
In der Regel werden im Anschluß an die Übertragung des Nukleinsäuremoleküls auf Pflanzenzellen aus den transformierten Pflanzenzellen transgene Pflanzen regeneriert.
Voraussetzung für die Einführung der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle und Vektoren in Pflanzenzellen ist die Verfügbarkeit geeigneter Transformationssysteme. Hier wurde während der letzten zwei Jahrzehnte ein breites Spektrum an Transformationsmethoden entwickelt und etabliert. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, Diffusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Injektion und Elektroporation von DNA in
Pflanzenzellen, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methoden sowie weitere Möglichkeiten, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode problemlos ermitteln kann. Sämtliche Transformationsverfahren sind seit vielen Jahren gut etabliert und gehören zweifelsohne zum Standardrepertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekularbiologie, Pflanzenbiotechnologie und Zell- und Gewebekultur.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z.B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen.
Je nach Einfuhrungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri- Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentransformation beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengel- segmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzen-
zellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin u.a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker, Screeningmarker (wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selek- tionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screening- bedarf einhergeht. Falls der eingesetzte Selektionsmarker nach erfolgter Transformation und Identifizierung erfolgreich transformierter Zellen bzw. Pflanzen wieder entfernt werden soll, stehen dem Fachmann hierfür verschiedene Strategien zur Verfügung. So können z.B. sequenzspezifische Rekombinasen verwendet werden, z.B. in Form der Retransformation einer Rekombinase-exprimierenden Ausgangslinie und Auskreuzung der Rekombinase nach erfolgter Entfernung des Selektionsmarkers (siehe z.B. Reiss et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:3094-3098; Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:353-361; Lloyd et al. (1994) Mol. Gen. Genet. 242:653-657; Maser et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 230:170-176; Onouchi et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19:6373-6378). Der Selektionsmarker kann auch durch Cotransformation mit anschließender Auskreuzung entfernt werden.
Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung üblicher Nährmedium und Phytohormone. Die so erhaltenen Pflanzen können dann, falls erwünscht, mittels
üblicher Verfahren, einschließlich molekularbiologischer Methoden, wie PCR, Blot- Analysen, oder biochemischer Verfahren auf Anwesenheit der eingeführten DNA, die ein erfindungsgemäßes Metall-bindendes Protein kodiert, untersucht werden.
Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Regeneration von transformierten Pflanzenzellen erhältlichen transgenen Pflanzen. Bei der transgenen Pflanze bzw. den transgenen Pflanzenzellen kann es sich um jede beliebige monokotyle oder dikotyle Pflanze bzw. Pflanzenzelle handeln, vorzugsweise handelt es sich um Nutzpflanzen bzw. Zellen von Nutzpflanzen. Besonders bevorzugt handelt es sich um Weizen, Gerste, Reis, Kartoffel, Citrusfrüchte, Raps, Rübe und Futterpflanzen und -gräser.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial transgener Pflanzen, deren Zellen oder Geweben ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül enthalten und eine veränderte Verteilung von Metallen aufweisen. Bei den
Ernteprodukten und dem Vermehrungsmaterial handelt es sich insbesondere um Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, etc.
Unabhängig von den verwendeten regulatorischen Sequenzen, unter deren Kontrolle die Expression der für das Metall-bindende Protein kodierenden DNA-Sequenz steht, steht dem Fachmann ein breites Spektrum an molekularbiologischen und/oder biochemischen Verfahren für die Analyse der transformierten Pflanzenzellen, transgenen Pflanzen, Pflanzenteile, Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial zur Verfügung, z.B. PCR, Northern Blot- Analyse zum Nachweis von MBP-spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumulation von MBP-spezifischer RNA, Southern Blot-Analyse zur Identifizierung von MBP-kodierenden DNA- Sequenzen oder Western Blot-Analyse zum Nachweis des durch die erfmdungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodierten Metall-bindenden Proteins. Selbstverständlich kann der Nachweis des Proteins auch durch Bindungsstudien mit Metallen erfolgen. Weiter kann man z.B. den durch Selbstung oder Kreuzungen
erhaltenen Samen auf Medium auslegen, das das zu dem zusammen mit der MBP- DNA-Sequenz übertragenen Selektionsmarker passende Selektionsmittel enthält, und anhand der Keimfähigkeit und des Wachstums der Tochtergeneration(en) und des Segregationsmusters Rückschlüsse auf den Genotyp der jeweiligen Pflanze schließen.
Weiter betrifft die Erfindung die Verwendung von DNA-Sequenzen, die ein erfindungsgemäßes Metall-bindendes Protein kodieren, für die Erzeugung von Pflanzen, die eine erhöhte Mikronährstoffeffizienz aufweisen, besonders bevorzugt durch Expression der MBP-kodierenden Sequenz unter Kontrolle eines Phloem- spezifischen Promotors. Hierdurch kann das Pflanzenwachstum verbessert werden.
Weiter können die MBP-kodierenden Sequenzen genutzt werden, um den Mikronährstoffgehalt in Pflanzenteilen zu steigern, die zur menschlichen und tierischen Ernährung dienen. Hier sind besonders solche Promotoren als regulatorische Sequenzen geeignet, die eine gewebe- bzw. organspezifische Expression des MBP vermitteln, also vor allem Samen-, Frucht-, Blatt-, Knollenoder Wurzel-spezifische Promotoren.
Eine weitere sinnvolle Anwendung besteht in der Verbesserung der Toleranz gegenüber Mikronährstoffkonzentrationen im Boden, die im Pflanzenanbau für Nahrungs- und Futtermittelzwecke zu hoch sind. Hier kann die endogene MBP- Expression durch konstitutive Co- oder Antisense-Suppression des MBP in allen Organen gehemmt werden.
Dagegen kann die Toleranz gegenüber toxischen Metallen durch konstitutive Expression des MBP in allen Organen erhöht werden. In diesem Zusammenhang ist der Einsatz zur Phytoremediation zu nennen.
Aufgrund der sehr hohen Affinitäten zu Metallen wie Eisen, Zink, Mangan und Kupfer, insbesondere auch unter denaturierenden Bedingungen, ist das erfindungsgemäße Protein ferner dazu prädestiniert, durch translationale Fusion mit einem weiteren rekombinanten Protein zur Reinigung dieses weiteren rekombinanten Proteins mittels Affinitäts-chromatographie eingesetzt zu werden. Diese Eigenschaften bleiben auch bei Bildung eines Fusionsproteins aus einem zu reinigenden rekombinanten Protein und einem Fragment der in SEQ ID No. 3 angegebenen Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Proteins erhalten, mit der Maßgabe, daß die Metall-bindende Domäne des erfindungsgemäßen Proteins von dem Fragment umfaßt wird. Fusionsproteine aus einem zu reinigenden rekombinanten Protein und dem erfindungsgemäßen Protein können somit schnell, effizient und automatisierbar mit hoher Ausbeute mittels Affinitätschromatograpliie gereinigt werden.
Damit wird durch die vorliegende Erfindung ein neuartiger Affinitätsanker zur Reinigung von rekombinanten Proteinen beispielsweise als Alternative zum Poly- Histidin-System, das in kommerziellen Plasmiden vieler Anbieter vorkommt, bereitgestellt. Es ist klar, dass das MBP dank seines hohen Histidin-Gehalts eine nützliche Alternative zu dem bereits für Proteinfusion und anschließende Nickelaffinitätsreinigung eingesetzten Poly-His-Tag darstellt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Fusionsprotein, umfassend das zu reinigende rekombinante Protein und das erfindungsgemäße MBP, bzw. ein aktives Fragment davon, eine Endoprotease-Schnittstelle, so daß das erfindungsgemäße Protein von dem zu reinigenden Protein entfernt werden kann. Derartige Endoprotease-Schnittstellen werden aus dem Fachmann geläufigen Schnittstellen für Serin-, Cystein, Aspartat- und Metall-Proteasen, wie beispielsweise Elastase, Trypsin, Chymotrypsin, Calpaine und dergleichen, ausgewählt. Als Affinitätsmatrix können Metallchelatsäulen wie beispielsweise HiTrap Chelating HP Columns und Chelating Sepharose Fast Flow (Amersham-Pharmacia) eingesetzt
werden, die auch für die Reinigung des erfindungsgemäßen MBP-Proteins alleine geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Reinigung eines rekombinanten Proteins mittels Affinitätschromatographie, umfassend die folgenden Schritte:
a) Insertion der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor, der ein für das zu reinigende rekombinante Protein kodierendes Gen umfaßt; b) Transformation und Kultivierung der transformierten Zellen; c) Zellaufschluß der geernteten Zellen; d) Aufgeben der löslichen Proteinfraktion auf eine Chromatographiesäule; e) ggf. Entfernen unspezifisch gebundener Proteine durch Waschschritte; f) ggf. Abspalten des zu reinigenden rekombinanten Proteins von dem erfindungsgemäßen Protein.
Das vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Reinigungsverfahren ist aufgrund der sehr hohen Bindungsstärke, d.h. der sehr hohen Affinität des erfindungsgemäßen MBP-Proteins und dem neuen Spektrum an Metallen, das für die Affinitätschromatographie zur Verfügung steht, äußerst vorteilhaft gegenüber den bisher beschriebenen Reinigungsverfahren.
Weitere Anwendungsbereiche des MBP können im technischen oder Umwelt- Bereich liegen. So kann die Expression des Wildtyp-Proteins oder eines durch Mutation veränderten Derivats des MBP mit geeigneten Bindungsaffinitäten für Metalle für den Entzug der Metalle aus Lösungen oder Abwässern eingesetzt werden.
Schließlich kann die im Phloemtransport begründete reversible Natur der Metallbindung genutzt werden, um katalytische Metalle wie Zn, Mn, Cu, Fe in in
vitro isolierte oder rekombinant hergestellte technische Enzyme oder Proteine einzufügen, die solche Metalle benötigen (z.B. Lipoxygenasen).
Die Erfindung stellt somit erstmals ein Verfahren zur Beeinflussung der Verteilung von Metallen, insbesondere von Eisen, in transgenen Pflanzen bereit, umfassend die Schritte i) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, enthaltend eine erfindungsgemäße, für ein MBP kodierende DNA-Sequenz, ii) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls auf Pflanzenzellen; und iii) ggf. Regenerieren vollständig transformierter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne diese in irgendeiner Weise einzuschränken.
Beispiele
1. Reinigung des Metall-bindenden Proteins mittels Metallaffinitätschromatographie
Das MBP kann durch folgendes Reinigungsverfahren rein dargestellt werden:
Eine NAP-10-Säule (Amersham-Pharmacia, Freiburg) oder eine PD-10-Säule (Pharmacia Biotech, Uppsala/Schweden) wird mit drei Volumen Elutionspuffer (20 mM HEPES, pH 7,2, und 1 M NaCl) äquilibriert. 1 ml unbehandelter Phloemsaft von Ricinus communis (180 μg Protein, Proteinmengenbestimmung nach Bradford (1976, Anal. Biochem. 84:248-254)) wird auf die Säule aufgetragen und mit Elutionspuffer eluliert. Eine Proteinfraktion von 2 ml Eluat wurde gesammelt, die lediglich Spuren von niedermolekularen Verbindungen enthielt. Diese vorgereinigte Proteinlösung wurde einer Metallaffinitätschromatographie unterzogen.
Eine HiTrap- Affinitätssäule (von Pharmacia Biotech, Uppsala/Schweden; Volumen 1 ml) wird mit 5 ml Wasser äquilibriert, bevor die Matrix mit Eisen(IIi)-Ionen durch Aufbringung von 0,5 ml 0,1 M FeCl beladen wird. Überschüssiges Eisen wird durch Waschen mit 5 ml Wasser, gefolgt durch Äquilibrierung der Säule mit Elutionspuffer entfernt. Dann wird die vorgereinigte Proteinlösung (Phloemsaft-Protein) auf die Säule aufgetragen, bevorzugt durch Zirkularisierung für 30 min. unter Einsatz einer Peristaltikpumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min. Proteine werden mit steigenden Konzentrationen von Imidazol in Elutionspuffer eluiert und in 1 ml Fraktionen gesammelt. Die Imidazol-Konzentrationen waren wie folgt: 50, 100, 150, 200 und 250 mM und schließlich 5 ml von 400 mM Imidazol. Die Säule wurde mit 5 ml von 50 ml EDTA in HEPES-Puffer gestrippt.
10 μl einer jeden Fraktion wurden mit 5 μl Probenpuffer (Schägger and Van Jagow (1987) Anal. Biochem. 166:368-379) gemischt und die Proteinzusammensetzung wurde in einer SDS-PAGE und Silbernitratfärbung (Jungblut and Seifert (1990) J. Biochem. Biophys. Meth. 21:47-58) untersucht. Diese Analyse zeigte ein einzelnes Protein von 17-18 kD.
Die Untersuchung zeigte, dass 16 μg des MBP isoliert wurden.
Die Proteinreinigung wurde in gleicher Weise durchgeführt mit Säulen, die mit Kupfer (CuSO4 oder CuCl2), Mangan (MnCl2) oder Zink (ZnSO4 oder ZnCl2) beladen wurden. Des weiteren wurden Säulen eingesetzt, die anstelle von FeCl mit Fe(II) beladen wurden, in Form von FeCl2 oder (NH4)2Fe(SO )2.
Als Negativkontrolle wurde die Chromatographie mit einer HiTrap-Säule ohne Metallbeladung durchgeführt.
Die Durchführung der Chromatographie mit einem ϊmidazolgradienten von geringeren Konzentrationsschritten ergab, dass das Protein von Fe - und Zn - beladenen Matrices bei einer Konzentration von 100 mM Imidazol eluiert wurde.
Es versteht sich, dass das oben dargestellte Aufreinigungsverfahren nicht auf das MBP im Phloemsaft von R. communis beschränkt ist, sondern auf jede beliebige Pflanze übertragen werden kann. Auf diese Weise lässt sich anhand der oben beschriebenen Metallaffinitätschromatographie das erfindungsgemäße Protein aus jeder beliebigen Pflanze aufreinigen.
Mittels dieses Verfahrens kann das MBP auch aus Gesamtproteinextrakten von Endosperm, Cotyledonen und Hypokotyl sowie aus Phloemsaft von Sprossen adulter Pflanzen gereinigt und nachgewiesen werden.
Für die Gewinnung von Phloemsaft wurde das Hypokotyl von 7 Tage alten
Keimlingen am Haken (engl. hook) mit einer Rasierklinge geschnitten. Der obere Teil des Keimlings wurde mit dem Endosperm nach unten in befeuchtetes Vermiculite in einem 10 ml Becherglas gegeben. Die Bechergläser wurden in eine Kammer bei 27 °C und 95% rel. Luftfeuchte gestellt. Das Exsudat, also Phloemsaft, der an der Schnittfläche austrat, wurde mit Mikropipetten gesammelt und entweder auf Eis, wenn es unmittelbar anschließend untersucht wurde, oder bei -20°C bis zu seiner endgültigen Verwendung gelagert. Neben Phloemexsudat von 7 Tage alten Keimlingen von Ricinus communis wurde auch Phloemexsudat von 12 Wochen alten R. communis-Ϋflanzen geerntet (Jeschke and Pate (1991) J. Exp. Bot. 42:1091-1103). Die weitere Handhabung war analog zu der aus Keimlingen.
2. Charakterisierung des MBP
Das Protein enthält Eisen, wenn es aus nativem Phloemsaft isoliert wird. Nach Fütterung von Rtctrais-Cotyledonen mit radioaktivem Eisen ist das Protein nach Isolierung aus Phloemsaft im gelelektrophoretischen Test mit Eisen markiert (in vtvo-Nachweis).
Nach gelelektrophoretischer Auftrennung von Phloemsaft kann dieses auf einer Membran immobilisierte Protein radioaktives Eisen binden (in vz'tro-Nachweis).
Das Protein kann durch eine Eisen- Affinitätschromatographie zur gelelektrophoretischen Homogenität gereinigt werden. In diesem Nachweisverfahren bindet das Protein an Fe , Zn , Cu , Mn und in geringerem Ausmaß Fe . An diesen Metallen gereinigtes und wieder befreites Protein bindet in freier Lösung an die genannten Metalle.
Das Protein hat ein apparentes Molekulargewicht von 16-17 kD und einen isoelektrischen Punkt von pH 7,1-7,3.
3. Sequenzierung des MBP
Das MBP wurde mittels Edman- Abbau partiell sequenziert und davon die folgenden Peptidsequenzen erhalten:
1) IEETLHIGGHKEEH
2) EGFMDK
4. Klonierung der MBP-cDNA aus Ricinus communis
Unter Verwendung folgender Oligonukleotide als PCR-Primer:
5 '-CAT/C AAA/G GAG/A GAG/A CA-3 ' (oben erwähnter Primer a))
5'-TT A/GTC CAT G/AAA NCC C/TTC-3' (oben erwähnter Primer c))
wird die PCR-Reaktion nach dem oben beschriebenen Protokoll durchgeführt. Amplifiziert wurde ein ca. 140 bp langes Fragment, das in ein geeignetes Plasmid kloniert und nach Standardverfahren sequenziert wurde.
Dieses PCR-Produkt wurde anschließend zur Isolierung der vollständigen cDNA eingesetzt. Hierbei wurde zum einen eine PCR-Reaktion mit den 5'- bzw. 3'- Adapter-Primern des Marathon (Clontech)-cDNA-Pools in entsprechender Kombination mit internen, auswärts gerichteten Primern des klonierten und verifizierten PCR-Produkts. Klonierung der PCR-Produkte wie oben beschrieben und anschließendes Zusammenfügen der DNA-Fragmente zur vollständigen cDNA durch Klonierung an geeigneten Restriktionsschnittstellen.
Alternativ wurde eine cDNA-Phagenbank aus Cotyledonen von R. communis mit dem PCR-Produkt als radioaktiv markierte Sonde nach Standardverfahren gecreent. Die Herstellung im Phagen λgtl 1 erfolgte nach Herstellerangaben (Promega, Mannheim).
5. Alternative Klonierungsstrategie
In einer alternativen Klonierungsstrategie wird die oben erwähnte cDNA-Bank mit einem endmarkierten Oligonukleotid als Sonde durchmustert.
Folgendes Oligonukleotid wird aus dem Peptid HIGGHKEEH abgeleitet:
H I G G H K E E H 5'-CAT/C ATT/C/A GGN GGN CAT/C AAA/G GAG/A GAG/A CA-3'
Dabei werden die Positionen mit N (= G, A, T oder C) bei der Synthese durch Inosin ersetzt. Die Endmarkierung erfolgt mit γ( P)dATP und T4 Polynukleotid-Kinase (Sambrook et al, 1989). Das Absuchen der cDNA-Bank folgt Standardprotokollen unter Anwendung nicht-stringenter DNA-DNA-Hybridisierungsbedingungen (z.B. bei 42°C). Die Präparation von λgtl 1-Phagen und Subklonierung des cDNA- iserts in geeignete Plasmide (pBluescript, Stratagene, La Jolla, USA) für die anschließende Sequenzanalyse erfolgt nach Standardprotokollen.
6. Allgemeine Klonierungsstrategie
Allgemeine DNA-Klomerungstechniken, PCR-Reaktionen und DNA-Sequenzierung werden wie bei Sambrook et al. (1989) vide supra, beschrieben, durchgeführt. Die Isolierung von Gesamt-RNA aus Kotyledonen und Hypokotylen von 7 Tage alten Ricinus-Keimlingen wurde nach Fritsche et al. (1999, FEBS Lett. 462:249-253) durchgeführt. Aus dieser Fraktion wurde mRNA mit dem Poly-Attract-Kit (Promega, Mannheim) isoliert und ein doppelsträngiger cDNA-Pool wurde mit Adapter- Primern unter Einsatz des Marathon cDNA Synthesis-Kits (Clontech, Heidelberg) nach dem Protokoll des Herstellers erzeugt. Degenerierte Oligonukleotidprimer wurden von dem Peptid IEETLHIGGHKEEH (Sense-Primer; 5'- CAT/CAAA/GGAG/AGAG/ACA-3Λ) und dem Peptid EGFMDK (Antisense-Primer; 5'-TTA/GTCCATG/AAAICCC/TTC-3Λ) des MBP abgeleitet und das resultierende PCR-Produkt (etwa 100 Basenpaare) wurde in den pGEM T- Vektor (Promega) kloniert. Unter Verwendung Sequenz-spezifischer Auswärts-Primer und dem
Marathon cDNA Adapterprimer für Rapid Amplification von cDNA-Enden wurde die gesamte cDNA-Information erhalten. Spezifische 5"- und 3Λ-Endprimer wurden abgeleitet und verwendet, um schließlich die gesamte für das MBP kodierende cDNA aus dem Marathon cDNA-Pool zu isolieren.
Es ist klar, dass sich diese allgemeine Methode auf die Isolierung der für das MBP kodierenden DNA-Sequenz aus jedem beliebigem Organismus problemlos anwenden lässt. Da im vorliegenden Fall Peptidsequenzen und Primersequenzen angegeben sind, die allgemein für das erfindungsgemäße MBP gelten, lassen sich die oben angegebenen Klonierungsverfahren auf j ede beliebige Pflanze übertragen. Darüber hinaus können natürlich die im beigefügten Sequenzprotokoll angegebenen vollständigen DNA-Sequenzen als Hybridisierungssonde in herkömmlichen Hybridisierungs- und Screeningverfahren eingesetzt werden, um für das MBP kodierende DNA-Sequenzen aus einer gewünschten Pflanze zu isolieren. Die Tatsache, daß eine isolierte DNA-Sequenz auch wirklich für das erfindungsgemäße MBP kodiert, läßt sich nach Expression und Gewinnung des Proteins auf einfache Weise anhand seiner Fähigkeit zur Metallbindung durch Metallaffinitätschromatographie, wie oben angegeben, überprüfen. Dem Fachmann werden somit durch die obige Beschreibung nicht nur Mittel zur Verfügung gestellt zur Isolierung von Nukleinsäuren, die für das MBP kodieren, sondern auch zur Überprüfung, ob die isolierte Nukleinsäure für ein funktionstüchtiges MBP mit der Fähigkeit zur Metallbindung, insbesondere Bindung von Eisenionen, kodiert.