DE69736420T2

DE69736420T2 - Esterase Gen und dessen Verwendung

Info

Publication number: DE69736420T2
Application number: DE69736420T
Authority: DE
Inventors: Takeshi Takarazuka-shi Ishii; Satoshi Takarazuka-shi Mitsuda
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1996-11-28
Filing date: 1997-11-28
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2017-11-29
Also published as: US6514740B1; CA2217144A1; DK0846768T3; EP0846768A2; JPH10210974A; EP0846768B1; JP4319260B2; US6306634B1; EP0846768A3; ATE335076T1; DE69736420D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Esterasegen und dessen Verwendung.
Cyclopentenolone der Formel I:
wobei R₁ C₁-C₁₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₂-C₁₀-Alkinyl oder C₁-C₄-Haloalkyl ist, sind die wichtigsten Alkoholbestandteile in einer Gruppe von Esterverbindungen, für gewöhnlich „synthetische Pyrethroide" genannt, die eine exzellente Insektizidaktivität besitzen.
Zum Beispiel ist die Verbindung der nachstehenden Formel II, ein Ester von 4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propinyl)cyclopent-2-en-1-on mit 2,2,3,3-Tetramethylcylopropancarbonsäure, ein hervorragendes Insektizid mit einer sehr starken Betäubungsaktivität und tödlichen Aktivität (vgl. z.B. JP-B 50-15843/1975).
Die Cyclopentenolone der Formel I schließen zwei Arten von optischen Isomeren ein, weil sie an Position 4 ein asymmetrisches Kohlenstoffatom besitzen. Im Falle von synthetischen Pyrethroiden, die derartige optische Isomere als Alkoholbestandteile enthalten, ist es wohl bekannt, dass der Unterschied der optischen Isomerie zwischen diesen Alkoholbestandteilen einen großen Unterschied bei ihrer Insektizidwirkung ausmacht. Zum Beispiel fand man heraus, dass die Verbindung der Formel II, vorstehend, im Falle eines Esters von (S)-4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propinyl)cyclopent-2-en-1-on eine vielfach bessere Insektizidwirkung aufweist als im Fall eines Esters des entsprechenden (R)-4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propinyl)cyclopent-2-en-1-ons.
Aus diesen Gründen war das Verlangen nach der Entwicklung eines Verfahrens zur Trennung und zum Erhalt der optischen Isomere von Cyclopentenolonen der Formel I als Zwischenprodukt von Arzneistoffen, landwirtschaftlichen Chemikalien oder anderen aktiven Produkten in einer industriell vorteilhaften Weise groß. Weiterhin war für diesen Zweck die Suche nach einem Gen, das eine derartige Esterase codiert, zur Herstellung eines Mikroorganismus, z.B. durch ein Genmanipulationsverfahren, wobei der Mikroorganismus eine hervorragende Esterase herstellen kann, die auf einen organischen Carbonsäureester eines Cyclopentenolons der Formel I zur asymmetrischen Hydrolyse des Esters wirken kann, genauso sehr wünschenswert.
Somit ist das technische Problem, das der Erfindung zu Grunde liegt, die Bereitstellung von Verfahren und Mitteln für die Herstellung von optischen Isomeren von Cyclopentenolonen der Formel I. Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Ausführungsformen erreicht, die in den Patentansprüchen gekennzeichnet sind.
So haben die vorliegenden Erfinder ein Esterasegen gefunden, das eine Esterase codiert, die auf einen organischen Carbonsäureester eines Cyclopentenolons der Formel I zur asymmetrischen Hydrolyse des Esters zur Herstellung des Cyclopentenolons in (S)-Form mit hoher optischer Reinheit wirken kann.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Gen, das eine Esterase codiert, die eine asymmetrische Hydrolyse eines organischen Carbonsäureesters bzw. Carboxylsäureesters eines Cyclopentenolons der Formel I verursachen kann,
wobei R₁ C₁-C₁₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₂-C₁₀-Alkinyl oder C₁-C₄-Haloalkyl ist, zur Herstellung des Cyclopentenolons der Formel I in (S)-Form, und mit der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 hybridisieren kann. Das Gen ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) Genen mit der Basensequenz von SEQ ID NO: 1;
(b) Genen mit einer Basensequenz, codierend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2;
(c) Genen mit der Basensequenz, enthalten in FERM-BP 5739;
(d) Genen mit einer Basensequenz, codierend eine Esterase, die durch die Basensequenz, enthalten in FERM-BP 5739, codiert wird; und
(e) Genen mit einer Basensequenz, die mindestens 90% homolog zu der Basensequenz von einem Gen in (a) bis (d) sind.

Es ist vorstellbar, dass das Gen auch ein Gen sein kann, das mit einer Basensequenz von einem Gen von einem von (a) bis (d) hybridisiert.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Plasmid, das das erfindungsgemäße Gen enthält.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine nicht-menschliche Transformante, bzw. einen nicht-menschlichen Transformand, die bzw. der durch die Transformation mit dem Plasmid erhalten wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Transformante ein Mikroorganismus.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Esterase, umfassend:

(a) Züchten der erfindungsgemäßen Transformante, um eine Esterase, codiert durch das erfindungsgemäße Gen, herzustellen, und
(b) optional Erhalten der Esterase aus dem Kulturmedium.

Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Esterase, codiert durch das erfindungsgemäße Gen oder hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Es ist vorstellbar, dass die Esterase ebenfalls durch einen Mikroorganismus, der das erfindungsgemäße Gen besitzt, hergestellt werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die optische Auflösung eines Cyclopentenolons der Formel I
wobei R₁ C₁-C₁₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₂-C₁₀-Alkinyl oder C₁-C₄-Haloalkyl ist, das Verfahren umfassend:

(a) Erlauben der erfindungsgemäßen Esterase auf einen organischen Carbonsäureester des Cyclopentenolons der Formel I zur asymmetrischen Hydrolyse des Esters zu wirken; und
(b) Separieren des Cyclopentenolons der Formel I in (S)-Form vom Ester des korrespondierenden Enantiomers davon.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist das Cyclopentenolon der Formel I 4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propenyl)cyclopent-2-en-1-on oder 4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propinyl)cyclopent-2-en-1-on.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine DNA, umfassend ein Fragment mit einer Länge von mindestens 14 Nucleotiden der Basensequenz des erfindungsgemäßen Gens oder einer komplementären Sequenz davon.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Gens, des erfindungsgemäßen Plasmids, der erfindungsgemäßen Transformante oder der erfindungsgemäßen Esterase zur Herstellung von Arzneistoffen, landwirtschaftlichen Chemikalien, Insektiziden oder Intermediaten solcher Verbindungen.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung einen Arzneistoff, eine landwirtschaftliche Chemikalie, ein Insektizid oder ein Intermediat davon, umfassend das erfindungsgemäße Gen, das erfindungsgemäße Plasmid, die erfindungsgemäße Transformante oder die erfindungsgemäße Esterase.
1 ist ein Diagramm, das die Restriktionsendonuclease-Karten von pAL101 und pAL108 zeigt, die spezifische Beispiele des vorliegenden Plasmids sind.
Das vorliegende Gen ist ein isoliertes Esterasegen, das eine Esterase codiert, die eine asymmetrische Hydrolyse eines organischen Carbonsäureesters eines Cyclopentenolons der Formel I zur Herstellung des Cyclopentenolons der Formel I in (S)-Form verursachen kann, und an die Basensequenz von SEQ ID NO: 1 hybridisieren kann. Der Ausdruck „Esterase", wie hierin verwendet, betrifft eine Esterase, wie in einem breiteren Sinn definiert, die Lipasen enthält.
Der Satz „die eine asymmetrische Hydrolyse eines organischen Carbonsäureesters eines Cyclopentenolons der Formel I zur Herstellung des Cyclopentenolons der Formel I in (S)-Form verursachen kann", wie hierin verwendet, bedeutet, dass eine Esterase, auf die durch diesen Satz Bezug genommen wird, die asymmetrische Hydrolyse eines organischen Carbonsäureesters eines Cyclopentenolons der Formel I wie 4-Hydroxy-3-methyl-2-methylcyclopent-2-en-1-on, 4-Hydroxy-3-methyl-2-ethyl-2-cyclopent-2-en-1-on, 4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propenyl)-2-cyclopent-2-en-1-on, 4-Hydroxy-3-methyl-2-(2,4-pentadienyl)-2-cyclopent-2-en-1-on, (±)-4-Hydroxy-3-Methyl-2-(1-methyl-2-propinyl)-2-cyclopent-2-en-1-on, 4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propinyl)cyclopent-2-en-1-on, 4-Hydroxy-3-methyl-2-(1-methyl-2-propinyl)cyclopent-2-en-1-on oder 4-Hydroxy-3-methyl-2-(2,2,2-trifluorethyl)cyclopent-2-en-1-on zur Herstellung des korrespondierenden Cyclopentenolons in (S)-Form verursachen kann.
In dem Cyclopentenolon der Formel I haben die Variablen die folgende Bedeutung:
Das C₁-C₁₀-Alkyl, dargestellt durch R₁, kann zum Beispiel Methyl, Ethyl, Pentyl und Decyl einschließen.
Das C₂-C₁₀-Alkenyl, dargestellt durch R₁, kann zum Beispiel 2-Propenyl, 1-Methyl-2-propenyl, 2,4-Pentadienyl, 2-Heptenyl und 2-Decenyl einschließen.
Das C₂-C₁₀-Alkinyl, dargestellt durch R₁, kann zum Beispiel 2-Propynyl, 1-Methyl-2-Propynyl, 2-Heptynyl und 2-Decynyl einschließen.
Das C₁-C₄-Haloalkyl dargestellt durch R₁ kann zum Beispiel 2,2,2-Trifluorethyl und 4,4,4-Trifluorbutyl einschließen.
In dem vorstehenden organischen Carbonsäureester kann die organische Carbonsäure zum Beispiel gesättigte oder ungesättigte C₁-C₁₀-Fettsäuren und Pyrethroidsäuren einschließen.
Das Gen, das „an die Basensequenz von SEQ ID NO: 1 hybridisiert", bezieht sich auf ein Gen, das durch Southern-Hybridisierung, wie zum Beispiel in „Cloning and Sequence (zusammengestellt und der Aufsicht von Itaru Watanabe, herausgegeben von Masahiro Sugiura, 1989, veröffentlicht durch Noson Bunka-sha) beschrieben, unter Verwendung von DNA mit der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 als Sonde sichtbar nachgewiesen werden kann. Das Gen kann eine DNA mit der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 oder eine DNA mit einer Basensequenz mit der Addition, Deletion oder dem Austausch einer oder mehrerer Basen in der DNA mit der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 sein. Zum Beispiel wird eine doppelsträngige DNA in die komplementären, einzelsträngigen DNAs durch Hitzebehandlung bei 95°C eine Minute lang oder durch Alkalibehandlung mit 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl getrennt, die anschließend auf Eis eine Minute lang abgekühlt werden oder einer Neutralisierung mit 0,5 M Tris-HCl (pH 7,0), 3,0 M NaCl unterzogen werden, so dass sie mit einzelsträngiger DNA oder einzelsträngiger RNA assoziieren, die komplementär zu den vorstehenden einzelsträngigen DNAs sind, um wieder die Form eines Doppelstrangs (das heißt einen hybridisierten Zustand) anzunehmen. Eine derartige DNA kann für gewöhnlich ein Gen mit einer Basensequenz mit einer hohen Homologie (zum Beispiel etwa 90% oder eine höhere Homologie insgesamt, obwohl dies variieren kann abhängig davon, ob die Region mit einer aktiven Stelle oder einer Struktur eng verwandt ist) zu der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 sein.
Homologien können mit dem Homologiesuchprogramm, das von Pearson und Lipman (vgl. zum Beispiel Pearson und Lipman, (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444) entwickelt wurde, berechnet werden. Sie können auch mit dieser Art von Programmen berechnet werden, die in dem Genetyx-Mac (erhältlich von Software Kaihatsu) enthalten sind. Zu diesem Zweck kann auch ein Homologiesuchprogramm (fasta), das im World Wide Web Service der (DNA Data Bank of Japan (DDBJ) verwendet werden.
Ein spezifischeres Beispiel des vorliegenden Gens ist ein Esterasegen mit einer Basensequenz, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 codiert. Selbstverständlich kann das vorliegende Gen auch ein Esterasegen einschließen, das die Basensequenz von SEQ ID NO: 1 besitzt.
Das vorliegende Gen kann durch PCR-Verfahren unter Verwendung genomischer DNA, die zum Beispiel von einem Mikroorganismus der Gattung Burkholderia durch ein herkömmliches Verfahren (zum Beispiel das Verfahren, das in „Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol" (herausgegeben von der Cancer Control Research Group, Medical Science Laboratory, Tokio University, veröffentlicht von Shujun-sha, 1993) hergestellt wird, als Matrize und unter Verwendung eines Fragments der DNA mit der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 (zum Beispiel eine Kombination von etwa 14 bp oder mehr Oligonucleotiden, die zu der 5'-terminalen Sequenz in der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 komplementär sind, und etwa 14 bp oder mehr Oligonucleotiden, die der 3'-terminalen Sequenz in der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 entsprechen, oder eine Kombination von etwa 14 bp oder mehr Oligonucleotiden, die der 5'-terminalen Sequenz in der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 entsprechen, und etwa 14 bp oder mehr Oligonucleotiden, die zu der 3'-terminalen Sequenz in der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 entsprechen) als Primer erhalten werden.
Das vorliegende Gen kann auch durch ein Verfahren wie Koloniehybridisierung oder Plaquehybridiserung mit einer Genbibliothek erhalten werden, die durch die Insertion von genomischer DNA, die zum Beispiel von einem Mikroorganismus der Gattung Burkholderia durch ein herkömmliches Verfahren (zum Beispiel das in „Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol" (herausgegeben von der Cancer Control Research Group, Medical Science Laboratory, Tokyo University, veröffentlicht von Shujun-sha, 1993) beschriebene Verfahren) hergestellt wurde, in λ-Phagen oder Plasmide unter Verwendung einer Basensequenz, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 codiert, bevorzugt ein DNA-Fragement mit 15 bp oder mehr, das in der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 enthalten ist, als Probe hergestellt wurde.
Als Mikroorganismus zur Verwendung bei der Herstellung des vorliegenden Gens, darunter die Mikroorganismen der vorstehenden Gattung, ist Burkholderia cepacia besonders bevorzugt, ein besonderes Beispiel davon ist Burkholderia capacia-Stamm SC-20.
Burkholderia cepacia-Stamm SC-20 ist ein Mikroorganismus, der von den hiergenannten Erfindern in der Natur gefunden wurde, und er besitzt die bakteriologischen Eigenschaften, die in Tabelle 1 gezeigt sind.
TABELLE 1
Man fand heraus, dass diese bakteriologischen Kennzeichen gleich sind wie diejenigen von Burkholderia cepacia, wenn man sie mit den Daten in Bergey's Manual of Systemaric Bacteriology, Bd. 1 (1984); Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, neunte Auflage (1994); Zhao et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 45, S. 600 (1995); und Yabuuchi et al., Microbiol. Immunol., 36, S. 1251 (1992) vergleicht.
Das vorliegende Gen kann durch das PCR-Verfahren unter Verwendung von DNA, die von den Bakterienzellen vom Escherichia coli-Stamm JM109/pAL108 hergestellt wird, als Matritze und unter Verwendung eines DNA-Fragments mit der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 (z.B. eine Kombination von etwa 14 bp oder mehr Oligonucleotiden, die zur 5'-terminalen Sequenz in der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 komplementär sind, und etwa 14 bp oder mehr Oligonucleotiden, die der 3'-terminalen Sequenz in der Basensequenz von SED ID NO: 1 entsprechen, oder eine Kombination von etwa 14 bp oder mehr Oligonucleotiden, die der 5'-terminalen Sequenz in der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 entsprechen, und etwa 14 bp oder mehr Oligonucleotiden, die zu der 3'-terminalen Sequenz in der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 komplementär sind) als Primer erhalten werden.
Der E. coli-Stamm JM109/pAL108 ist eine Mikroorganismus-Transformante, die durch den Einbau von Plasmid pAL108, das das vorliegende Gen (das vorliegende Plasmid) enthält, in den E. coli-Stamm JM109 (die vorliegende Transformante) erhalten wurde, und er wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology als „FERM-BP 5739" (Hinterlegungsdatum: 7. November 1996) hinterlegt.
Das vorliegende Plasmid kann einfach durch Einbau des erhaltenen vorliegenden Gens zum Beispiel in einen Vektor, der normalerweise in zu transformierenden Wirtszellen verwendet wird, mittels herkömmlicher Genmanipulationstechnik hergestellt werden. Genauer gesagt kann zum Beispiel, wenn E. coli als Mikroorganismus als Wirtszelle verwendet wird, der zu verwendende Vektor pUC119 (erhältlich von Takara Shuzo) und pBluescriptII (erhältlich von Stratagene Cloning System) einschließen.
Das Verfahren zum Transformieren einer Wirtszelle mit dem vorliegenden, hergestellten Plasmid kann abhängig von der zu transformierenden Wirtszelle ein normalerweise verwendetes Verfahren sein, und zum Beispiel, wenn E. coli als Mikroorganismus als Wirtszelle verwendet wird, kann es ein herkömmliches Verfahren wie in „Molecular Cloning" (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor, 1989) einschließen.
Die Auswahl von Transformanten wird wie folgt ausgeführt: Zum Beispiel wird die mit dem vorliegenden Plasmid transformierte Wirtszelle zuerst auf einer LB-Platte gezüchtet, die Tributyrin enthält, und diejenigen, die eine deutliche Zone ausbilden, werden ausgewählt. Die ausgewählten Transformanten werden gezüchtet und die entstandenen Kulturen werden wie ein organischer Carbonsäureester eines Cyclopentenolons der Formel I behandelt. Die Reaktionsprodukte werden analysiert, so dass die Transformanten, die das Cyclopentenolon der Formel I in (S)-Form mit hoher optischer Reinheit herstellen, ausgewählt werden können.
Genauer gesagt werden zum Beispiel 0,5 g des Essigsäureesters von (RS)-4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-porpenyl)cyclopent-2-en-1-on und 8,0 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) in eine 100 ml-Probenflasche gegeben und das Gemisch wird auf 40°C unter Rühren mit einem Rührstab 10 Minuten lang vorerhitzt. Diesem Gemisch werden 1,0 ml der vorstehenden Kultur zugegeben und die Umsetzung erfolgt bei 40°C unter Rühren mit einem Rührstab. Nach 30 Minuten wird das Reaktionsgemisch in einem Volumen von 50 μl entnommen und die Umsetzung wird durch Zugabe von 1 ml Ethanol gestoppt. Für die Blindwerte wird gereinigtes Wasser an Stelle der Kultur verwendet, und der Test wird auf die gleiche Art und Weise durchgeführt. Die Zersetzungsgeschwindigkeit wird mittels Gaschromatographie bestimmt. Als Säule für die Analyse werden 10% Silikon-DC-QF-1, Länge 2,6 m verwendet, und die Analyse erfolgt mit GC-14A (erhältlich von Shimazu Seisakusho) unter folgenden Bedingungen: Temperatur der Säule: 150°C, Temperatur der Injektion: 170°C; Nachweistemperatur: 170°C, und Nachweismittel: FID. Für den Enzymtiter wird die Menge des Enzyms, das 1 μMol (S)-4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-porpenyl)-cyclopent-2-en-1-on eine Minute lang freisetzt, als 1 Einheit definiert. Das Reaktionsgemisch wird weiterhin mit Methylisobutylketon extrahiert und der Extrakt wird auf die optische Reinheit von (S)-4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propenyl)-cyclopent-2-en-1-on mittels HPLC-Analyse untersucht. Bei der Analyse werden Säulen zur optischen Isomeranalyse OA-4100 (4,0 mm I.D. × 25 cm), erhältlich vom Sumika Bunseki Center, verwendet. Als Eluent kann ein Gemisch von Hexan, 1,2-Dichlorethan und Ethanol in einem Verhältnis von 100:20:1 verwendet werden. Das optische Isomer kann bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min mit einer Extinktion bei 230 nm als Index bestimmt werden.
Genauer gesagt werden Plasmide, die in den Transformanten enthalten sind, aus den ausgewählten Transformanten hergestellt, und die Restriktionsendonuclease-Karten der so hergestellten Plasmide werden mittels eines herkömmlichen Verfahrens hergestellt, wie zum Beispiel in „Molecular Cloning" (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor, 1989) beschrieben. Es kann auch durch ein Verfahren, wie Basensequenzanalyse, Southern-Hybridisierung oder Western-Hybridisierung bestimmt werden, ob das gewünschte vorliegende Gen enthalten ist oder nicht.
Auf diese Weise können die vorliegenden Transformanten erhalten und gezüchtet werden, um die vorliegende Esterase herzustellen (das vorliegende Herstellungsverfahren).
Wenn die Transformanten Mikroorganismen sind, werden die Transformanten mit verschiedenen Arten von Medien, die geeigneterweise Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, organische Salze und/oder inorganische Salze und andere Zusatzstoffe enthalten, gezüchtet, die zur Herstellung der herkömmlichen Kulturen von Mikroorganismen verwendet wurden. Die Kohlenstoffquellen können Glucose, Glycerin, Dextrin, Saccharose, organische Säuren, tierische und pflanzliche Öle und Melassen einschließen. Die Stickstoffquellen können organische und inorganische Stickstoffquellen wie Kulturlösung, Pepton, Hefeextrakt, Malzektrakt, Sojabohnenpulver, Maisquellwasser, Baumwollsamenpulver, Trockenhefe, Casaminsäure, Natriumnitrat und Harnstoff einschließen. Die organischen und inorganischen Salze können Chloride, Sulfate, Acetate, Carbonate und Phosphate von Elementen wie Kalium, Natrium, Magnesium, Eisen, Mangan, Kobalt und Zink einschließen, wobei spezifische Beispiele davon Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Mangansulfat, Kobaltchlorid, Zinksulfat, Kupfersulfat, Natriumacetat, Calciumcarbonat, Natriumcarbonat, Kaliummonohydrogenphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat sind.
Kulturen werden mittels eines herkömmlichen Verfahrens für Mikroorganismen hergestellt und sie können in Form von entweder festen Kulturen oder flüssigen Kulturen (z.B. Schüttelkulturen unter Verwendung von Teströhrchen oder Reziprokschüttelapparaten und andere Kulturen unter Verwendung von Gefäßbioreaktoren oder Fermentertanks) vorliegen. Insbesondere ist es, wenn Gefäßbioreaktoren verwendet werden, notwendig, keimfreie Luft einzuführen, normalerweise mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,1- bis etwa zweimal des Kulturvolumens pro Minute. Die Inkubationstemperatur kann geeigneterweise innerhalb eines Bereichs verändert werden, um das Wachstum der Mikkoorganismen zu garantieren. Zum Beispiel werden Kulturen bevorzugt bei einer Temperatur von etwa 15°C bis etwa 40°C unter der Kontrolle eines mittleren pH-Werts innerhalb des Bereichs von etwa 6,0 bis etwa 8,0 inkubiert. Der Inkubationszeitraum kann bei verschiedenen Inkubationsbedingungen variieren, und das bevorzugte Inkubationsverfahren liegt normalerweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 5 Tagen. Die vorliegende Esterase besitzt die folgenden Kennzeichen:

(1) Das Molekulargewicht (bestimmt mittels SDS-PAGE) beträgt etwa 40 kD;
(2) Die Reaktion kann im Bereich von mindestens etwa 15°C bis etwa 60°C, bevorzugt etwa 25°C bis etwa 40°C durchgeführt werden;
(3) Die Reaktion kann im pH-Wert des Bereichs von etwa 4 bis etwa 9, bevorzugt etwa 6 bis etwa 8 durchgeführt werden;
(4) Sie kann eine asymmetrische Hydrolyse eines organischen Carboxylsäureesters eines Cyclopentenolons der Formel I zur Herstellung des Cyclopentenolons der Formel I in (S)-Form verursachen;
(5) Sie kann ebenfalls durch Züchten von Nicht-Tranformanten, zum Beispiel eines Mikroorganismus der Gattung Burkholderia (besonders bevorzugt ist Burkholderia cepacia, ein spezifisches Beispiel ist Burkholderia cepacia-Stamm SC-20) erhalten werden. Natürlich kann sie, wie vorstehend beschrieben, auch durch Züchten der Transformanten erhalten werden, die durch Transformation mit einem das vorliegende Gen enthaltenden Plasmid hergestellt wurden.

Die vorliegende Esterase kann für die Enzymreaktion in Form einer Kultur verwendet werden, die diese enthält, aber sie kann auch für die Enzymreaktion in Form eines rohen Enzyms, das von der Kultur abgetrennt wurde, oder in Form eines gereinigten Enzyms verwendet werden. Das rohe Enzym kann mittels eines herkömmlichen Verfahrens, zum Beispiel eines Verfahren, bei dem Baketrienzellen durch Ultraschallzersetzung, Trituration mit Glasperlen oder Aluminiumoxid, Homogenisierung oder Aufschluss mit einer French-Presse, Enzymbehandlung mit Lysozym aufgeschlossen werden, abgetrennt werden, und die gewünschte Fraktion wird von den aufgeschlossenen Bakterienzellen durch Salzablagerug mit Ammoniumsulfat oder einem anderen Salz erhalten; Ausfällung mit einem organischen Lösungsmittel oder einem organischen Polymer wie Polyethylenglycol; Chromatographie wie Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie oder jegliche andere Chromatographie; oder Elektroporese. Wenn notwendig können diese Techniken in Kombination verwendet werden.
Weiterhin kann die vorliegende Esterase auch für die Enzymreaktion in Form eines immobilisierten Produkts verwendet werden, das durch Unlöslichmachen der Esterase durch ein Verfahren der Immobilisierung wie eine Trägerbindungstechnik, bei der die Esterase durch kovalente Kopplung an einen Träger gebunden wird, Ionenbindung oder Adsorption; oder eine Einschlusstechnik, bei der die Esterase in eine Netzwerkstruktur eines Polymers eingeschlossen wird; und anschließend die Weiterverarbeitung der unlöslich gemachten Esterase zu einem leicht trennbaren Zustand erhalten wird.
Die vorliegende Esterase kann zum Beispiel bei der optischen Auflösung eines Cyclopentenolons der Formel I verwendet werden. Das heißt, dass die vorliegende Esterase auf einen organischen Carbonsäureester eines Cyclopentenolons der Formel I zur asymmetrischen Hydrolyse des Esters wirken kann, so dass das Cyclopentenolon der Formel I in (S)-Form von dem Ester des entsprechenden Enatiomers davon getrennt werden kann. In solch einer Auflösung werden für gewöhnlich Ester in racemischer Form als Startmaterial verwendet.
Spezifische Beispiele des Cyclopentenolons der Formel I sind 4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propenyl)cyclopent-2-en-1-on und 4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propinyl)cyclopent-2-en-1-on.
Die Reaktionstemperatur liegt zum Beispiel im Bereich von etwa 15°C bis etwa 60°C, bevorzugt etwa 25°C bis etwa 40°C. Der pH-Wert der Reaktion liegt zum Beispiel im Bereich von etwa 4 bis etwa 9, bevorzugt etwa 6 bis etwa 8. Die Reaktionszeit liegt zum Beispiel im Bereich von etwa 5 Minuten bis etwa 96 Stunden.
Das Cyclopentenolon der Formel I in (S)-Form und der Ester des entsprechenden Enantiomers davon können von dem Reaktionsgemisch durch jegliche im Allgemeinen im Stand der Technik bekannte Verfahren gewonnen werden. Zum Beispiel können Verfahren wie die Extraktion mit einem Lösungsmittel, Blasendestillation und Säulenchromatographie geeigneterweise verwendet werden. Genau gesagt wird das Reaktionsgemisch mit einem organischen Lösungsmittel wie Ether, Ethylacetat oder Benzol extrahiert, und der Extrakt wird einer Blasendestillation oder einer Silicagelchromatographie gefolgt von Extraktion unterzogen, so dass das Cyclopentenolon der Formel I in (S)-Form von dem Ester des entsprechenden Enantiomers davon getrennt wird.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht; jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht in irgendeiner Weise auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1: (Herstellung genomischer DNA)
Eine Kultur des Burkholderia cepacia-Stamms SC-20 wurde auf einem Medium (Bacto-Trypton (erhältlich von Difco Laboratories Incorporated), 10 g; Bacto-Hefeextrakt (erhältlich von Difco Laboratories Incorporated), 5 g; NaCl, 5 g/l; nachstehend einfach als LB-Medium bezeichnet) bei 30°C 12 Stunden lang gezüchtet und dann durch Zentrifugation bei 6000 UpM 10 Minuten lang zum Sammeln der Bakterienzellen geerntet.
Die gesammelten Bakterienzellen wurden in einer Lösung (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA-NaOH (pH 8,0), 10 mM NaCl; nachstehend einfach als TEN-Lösung bezeichnet), die 1 mg/ml Lysozymchlorid (erhältlich von Seikagaku Kogyo) und 25 μl/ml RNaseA (erhältlich von Sigma Aldrich Japan) enthielt, suspendiert, und anschließend bei 37°C 20 Minuten lang inkubiert. Danach wurde Natriumdodecylsulfat bis zu einer Endkonzentration von 1% (Gew./Vol.) zugegeben, und die Inkubation wurde bei 55°C 10 Minuten lang weitergeführt. Anschließend wurde mit TE [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] gesättigtes Phenol im gleichen Volumen zugegeben. Das Gemisch wurde langsam gerührt und anschließend bei 10.000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert, um die obere Schicht zu sammeln, der eine TE-gesättigte Phenolchloroformlösung im gleichen Volumen zugegeben wurde. Das Gemisch wurde langsam gerührt und anschließend bei 10.000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert, um die obere Schicht zu sammeln, zu der eine 3 M Ammoniumacetatlösung in einem 1/10-fachen Volumen und anschließend Ethanol in einem zweifachen Volumen zugegeben wurden. Die DNA, die hinterlegt wird, wurde durch Aufrollen um einen runden Glasstab entnommen. Diese DNA wurde mit 70% (Vol./Vol.) Ethanol gespült, und anschließend wieder nacheinander mit 80% (Vol./Vol.) Ethanol und 100% Ethanol gespült, gefolgt von Lufttrocknung. Die so erhaltene DNA wurde in einer TEN-Lösung suspendiert, die 25 μg/ml RNase (erhältlich von Sigma Aldrich Japan) und 20 μg/ml Proteinase K (erhältlich von Boehringer Mannheim) enthielt, und anschließend bei 37°C 12 Stunden lang inkubiert; dazu wurde eine TE-gesättigte Phenolchloroformlösung im gleichen Volumen zugegeben. Das Gemisch wurde langsam gerührt und anschließend bei 10.000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert, um die obere Schicht zu sammeln, zu der eine 3 M Ammoniumacetatlösung in einem 1/10-fachen Volumen und anschließend Ethanol in einem zweifachen Volumen zugegeben wurden. Die DNA, die hinterlegt wird, wurde durch Aufrollen um einen runden Glasstab entnommen. Diese DNA wurde mit 70% (Vol./Vol.) Ethanol gespült, und anschließend wieder nacheinander mit 80% (Vol./Vol.) Ethanol und 100% Ethanol gespült, gefolgt von Luftrocknung. Die so erhaltene DNA wurde in 10 ml der TE-Lösung aufgelöst, die 25 μg/ml RNaseA enthielt, und die Lösung wurde zweimal gegen 2 l der TE-Lösung dialysiert. Somit wurden 1,6 mg genomischer DNA von 100 ml der Kultur erhalten.
Beispiel 2: (Herstellung einer genomischen DNA-Bibliothek)
50 mg der vorstehend erhaltenen genomischen DNA wurden mit der Restriktionsendonuclease EcoRI bei 37°C eine Stunde lang verdaut. Getrennt davon wurde der Expressionsvektor pUC19 (erhältlich von Takara Shuzo) mit der Restriktionsnuclease EcoRI bei 37°C eine Stunde lang verdaut, gefolgt von einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase. Diese Verdauungsprodukte wurden mit einem Ligierungskit (erhältlich von Takara Shuzo) bei 16°C über Nacht zusammen ligiert. Nach Beendigung der Ligierung wurde die Ligierungslösung für die Transformation von kompetenten E. coli Stamm JM109-Zellen (erhältlich bon Toyo Boseki) verwendet. Die transformierten E. coli-Zellen wurden auf einem Medium (Bacto-Trypton (erhältlich von Difco Laboratories Incorporated), 20 g; Bacto-Hefeextrakt (erhältlich von Difco Laboratories Incorporated), 10 g; 1 M NaCl, 10 ml; 1 M KCl, 2,5 ml; 1 M MgSo₄, 10 ml; 1 M MgCl₂, 10 ml; 2 M Glucose, 10 ml pro Liter (pH = 7,4); nachstehend einfach als SOC-Medium bezeichnet) bei 37°C 2 Stunden lang gezüchtet, anschließend wurden sie auf LB-Medium, enthaltend 20 ml 50 mg/l Ampicillin, bei 37°C über Nacht gezüchtet. Die resultierende Kultur wurde auf ein LB-Medium, enthaltend 1 mM Isopropyl-thio-β-D-galactosid (nachstehend einfach als ITPG bezeichnet), 1,0% Tributyrin und 50 mg/l Ampicillin, ausplattiert, gefolgt von der Züchtung bei 37°C. Nach der Züchtung über wenige Tage wurden 29 Stämme, die eine klare Zone ausbildeten, ausgewählt. Von den ausgewählten Transformanten wurde ein Plasmid hergestellt und auf das eingefügte Fragment mit Restriktionsendonucleasen untersucht, was zu einer Transformante führt, die das 3,5 kb-EcoRI-Fragment als Insertion besitzt. Das so erhaltene Plasmid wurde als pAL101 bezeichnet.
Beispiel 3: (Restriktionsendonuclease-Analyse und Basensequenzanalyse)
Das in Beispiel 2 erhaltene Plasmid pAL101 wurde mit Restriktionsendonucleasen analysiert, um eine in 2 gezeigte Restriktionsendonuclease-Karte herzustellen. Für das vorliegende Gen, das in pAL101 enthalten ist, wurde die Basensequenz mit PRISM-Kit und einem automatischen Basensequenzanalysegerät 373A (beides erhältlich von Perkin Elmer, Japan) bestimmt. Die resultierende Basensequenz wurde mit Genetyx-Mac/ATSQ und Genetyx-Mac (beides erhältlich von Software Kaihatsu) analysiert. Die durch die Analyse erhaltene Basensequenz des Esterasegens ist in SEQ ID NO: 1 im Sequenzprotokoll gezeigt.
Bespiel 4: (Subclonierung)
Verschiedene Plasmide wurden durch Verkleinerung des 3,5 kb-EcoRI-Fragments, das in dem in Beispiel 2 erhaltenen Plasmid pAL101 vorhanden ist, hergestellt. Diese Plasmide wurden in kompetente E. coli Stamm JM109-Zellen (erhältlich von Toyo Boseki) gemäß einem Verfahren, wie in Beispiel 2 beschrieben, eingeführt und transformiert. Die transformierten E. coli-Zellen wurden auf einem LB-Medium gezüchtet, das Tributyrin enthielt. Das Plasmid pAL108, dem die für die Herstellung der vorliegenden Esterase irrelevanten genetischen Regionen fehlen, wurden durch Nachweis der Ausbildung einer klaren Zone hergestellt. Das Plasmid pAL108 besaß das 1,7 kbSphI-Fragment als Insertion.
Beispiel 5: (Optische Selektivität I von Esterase)
Eine Kultur der in Beispiel 3 und 4 erhaltenen Transformante wurde auf 100 ml LB-Medium, enthaltend 50 mg/l Ampicillin und 50 mg/l 1 mM Isopropyl-thio-ß-D-galactosid (nachstehend einfach als IPTG bezeichnet) bei 37°C 16 Stunden lang gezüchtet und anschließend durch Zentrifugation bei 6000 UpM 10 Minuten lang geerntet, um die Bakterienzellen zu sammeln.
Die erhaltenen Bakterienzellen wurden in 20 ml 200 mM Phosphatpuffer suspendiert. Die Suspension konnte auf 1 g Essigsäureester von (RS)-4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propenyl)cyclopent-2-en-1-on wirken, und das resultierende (S)-4-hydroxy-3-methyl-2-(2-propenyl)cyclopent-2-en-1-on wurde analysiert. Die Analyse von (5)-4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propenyl)cyclopent-2-en-1-on wurde wie folgt durchgeführt:
Zuerst wurden 0,5 g Methylester von (RS)-4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propenyl)cyclopent-2-en-1-on und 8,0 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) in eine 100 ml-Probenflasche gegeben und unter Rühren mit einem Rührstab bei 40°C 10 Minuten lang vorerhitzt. Diesem Gemisch wurde 1,0 ml der vorstehenden Kultur zugegeben, und die Reaktion erfolgte bei 40°C unter Rühren mit einem Rührstab. Nach 30 Minuten wurden das Reaktionsgemisch in einem Volumen von 50 μl entnommen, und die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 ml Ethanol gestoppt. Für Blindwerte wurde gereinigtes Wasser an Stelle der Kultur verwendet und der Test wurde auf die gleiche Art und Weise durchgeführt. Die Zersetzungsgeschwindigkeit wurde mittels Gaschromatographie bestimmt. Als Säule für die Analyse wurden 10% Silikon-DC-QF-1, Länge 2,6 m, verwendet, und die Analyse erfolgte mit GC-14A (erhältlich von Shimazu Seisakusho) unter folgenden Bedingungen: Temperatur der Säule: 150°C, Temperatur der Injektion: 170°C; Nachweistemperatur: 170°C und Nachweismittel: FID. Für den Enzymtiter wird die Menge des Enzyms, das 1 μMol (RS)-4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propenyl)cyclopent-2-en-1-on eine Minute lang freisetzt, als 1 Einheit definiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit Methylisobutylketon weiter extrahiert, und der Extrakt wurde auf optische Reinheit mittels HPLC-Analyse untersucht. Bei der Analyse wurde eine Säule für die optische Isomeranalyse OA-4100 (4,0 mm I.D. × 25 cm), erhältlich von Sumika Bunseki Center, verwendet. Als Eluent wurde ein Gemisch aus Hexan, 1,2-Dichlorethan und Ethanol in einem Verhältnis von 100:20:1 verwendet. Das optische Isomerverhältnis wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min mit einer Extinktion bei 230 nm als Index bestimmt.
Basierend auf den Ergebnissen der vorstehenden Analyse wurden die Hydrolysegeschwindigkeit und die optische Selektivität berechnet und sie sind in Tabelle 2 gezeigt.
TABELLE 2
Wie aus Tabelle 3 ersichtlich ist, produziert E. coli-Stamm JM109/pAL108, der eine Transformante ist, die das eingefügte 1,7 kbp-SphI-Fragment enthält, eine Esterase, die die asymmetrische Hydrolyse des Essigsäureesters von (RS)-4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propenyl)cyclopent-2-en-1-on für die Herstellung von (S)-4-hydroxy-3-methyl-2-(2-propenyl)cyclopent-2-en-1-on verursachen kann.
Beispiel 6: (Optische Selektivität II von Esterase)
Der Essigsäureester von (RS)-4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propenyl)cyclopent-2-en-1-on wurde als Substrat verwendet und die gleichen Experimente wurden, wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
TABELLE 3
Wie vorstehend beschrieben, machte es die vorliegende Erfindung möglich, ein Gen bereitzustellen, das eine Esterase codiert, die auf einen organischen Carbonsäureester eines Cyclopentenolons der Formel I zur asymmetrischen Hydroylse des Esters zur Herstellung des Cyclopentenolons der Formel I in (S)-Form mit hoher optischer Reinheit wirken kann.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gen kodierend eine Esterase, die in der Lage ist, einen organischen Carboxylsäureester selektiv zu hydrolysieren zum Erhalt der (S)-Form eines Cyclopentenolons der Formel I herzustellen:
wobei R₁ C₁-C₁₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₂-C₁₀-Alkynyl oder C₁-C₄-Haloalkyl ist, wobei das Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) Gene mit der Basensequenz von SEQ ID NO: 1; (b) Gene mit einer Basensequenz kodierend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2; (c) Gene mit der Basensequenz enthalten in FERM-BP 5739; (d) Gene mit einer Basensequenz kodierend eine Esterase, die durch die Basensequenz enthalten in FERM-BP 5739 kodiert wird; und (e) Gene mit einer Basensequenz, die mindestens 90% homolog zu der Basensequenz von einem der Gene in (a) bis (d) sind.
Plasmid enthaltend das Gen von Anspruch 1.
Nicht-menschlicher Transformand erhalten durch Transformation mit dem Plasmid von Anspruch 2.
Transformand nach Anspruch 3, welcher ein Mikroorganismus ist.
Verfahren zur Herstellung einer Esterase, umfassend (a) Züchten des Transformanden von Anspruch 3 oder 4 um eine Esterase kodiert durch das Gen herzustellen, und (b) optional Erhalten der Esterase aus dem Kulturmedium.
Esterase kodiert durch das Gen von Anspruch 1 oder erhältlich nach dem Verfahren von Anspruch 5.
Verfahren zur optischen Auflösung eines Cyclopentenolons der Formel I:
wobei R₁ C₁-C₁₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₂-C₁₀-Alkynyl oder C₁-C₄-Haloalkyl ist, das Verfahren umfassend: (a) Erlauben der Esterase von Anspruch 6, auf einen organischen Carboxylsäureester des Cyclopentenolons der Formel I zur asymetrischen Hydrolyse des Esters zu wirken; und (b) Separieren des Cyclopentenolons der Formel I in (S)-From vom Ester des korrespondierenden Enantiomers.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Cyclopentenolon der Formel I 4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propenyl)cyclopent-2-en-1-on oder 4-Hydroxy-3-methyl-2-(2-propynyl)cyclopent-2-en-1-on ist.
DNA umfassend ein Fragment mit einer Länge von mindestens 14 Nukleotiden der Basensequenz des Gens von Anspruch 1 oder einer komplementären Sequenz davon.
Verwendung des Gens von Anspruch 1, des Plasmids von Anspruch 2, des Transformanden von Anspruch 3 oder 4, oder der Esterase von Anspruch 6 zur Herstellung von Arzneimitteln, landwirtschaftlichen Chemikalien, Insektiziden oder Intermediaten solcher Verbindungen.
Arzneimittel, landwirtschaftliche Chemikalie, Insektizid oder Intermediat davon umfassend das Gen von Anspruch 1, das Plasmid von Anspruch 2, den Transformanden von Anspruch 3 oder 4, oder die Esterase von Anspruch 6.