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Abstract

本发明公开了由2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)总DNA获得的一段8050bp的DNA片段及其制备方法，构建了原核表达质粒，转化大肠杆菌获得重组菌株，通过核苷酸序列和氨基酸序列比对，证实该DNA片段含有2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因，所表达的单加氧酶起羟化底物作用，辅酶A(CoA)连接酶基因则使底物连上辅酶A，为进一步的降解创造条件。含有该DNA片段的重组菌株具有高效降解2-奈酸和苯甲酸钠等作用，为通过基因工程技术构建多功能高效的环境污染物降解菌创造条件。

Description

一种2-萘酸降解菌DNA片段的核苷酸序列及其制备方法和应用
所属技术领域
本发明涉及一种2-萘酸降解菌DNA片段的核苷酸序列，涉及含有该DNA片段的重组质粒和重组菌株的制备方法。具体地说，本发明涉及2-萘酸降解菌(Burkholderiasp.JT1500)的一段具有降解2-萘酸活性的DNA片段，该DNA片段含有两个关键基因：2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因，涉及含有该DNA片段的重组质粒和表达相应酶的重组菌株。
背景技术
偶氮芳香族化合物在自然界中广泛存在，而且每年以数百万吨的数量被制造出来。尤其是印染工业中偶氮染料的广泛使用产生大量的印染废水，对环境构成严重的污染和危害。微生物降解芳香族环境污染物具有投资少、占地小又不需要特殊设备等优点，逐渐成为最有前途的治理环境污染物的方法。2-萘酸是一种在化学结构上类似偶氮芳香族物质的化合物，通过研究2-萘酸的微生物代谢途径，确定其代谢过程中的酶系统以及对应的代谢基因，可以为偶氮类化合物的微生物降解提供理论依据，为通过基因工程技术构建多功能高效的环境污染物降解菌创造条件。
在微生物降解芳香族环境污染物的研究中，关于2-萘酸代谢研究的报道很少，仅有1997年Birgit Morawski等报道过2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)降解2-萘酸的代谢途径，其具体的基因和基因调控机理并未有报道。2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因未曾有过报道，他们在2-萘酸降解过程中所起的作用更未曾有报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一段2-萘酸降解菌的具有降解2-萘酸活性的DNA片段的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供含有所述DNA片段的重组表达质粒和重组菌株。
本发明的再一个目的是提供一种制备含有所述DNA片段的重组表达质粒和重组菌株的制备方法，并将其用于高效降解2-萘酸及其它偶氮类芳香族化合物。
本发明提供了一种2-萘酸降解菌的具有降解活性的DNA片段，其核苷酸序列如：SEQNo：1所示。
按照本发明的DNA片段，含有两个关键基因：2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因序列。其中2-萘酸单加氧酶基因序列为SEQ ID NO：1中所示编号为第2793-3951位的核苷酸序列，共1158bp。该基因编码的单加氧酶的氨基酸序列为SEQ ID No：2。辅酶A(CoA)连接酶的基因序列为SEQ ID No：1所示编号为第4042-5793位的核苷酸序列，共1751bp。该基因编码的辅酶A(CoA)连接酶的氨基酸序列为SEQ ID No：3。
本发明还提供了含有如上所述DNA序列的重组表达质粒。
本发明还涉及含有上述的重组表达质粒的重组菌株，如大肠杆菌HB101重组菌株。
本发明还提供了一种制备含有所述DNA片段的重组表达质粒和重组大肠杆菌菌株的方法，包括以下步骤：从2-萘酸降解菌Burkholderia sp.JT1500菌株中提取总DNA，经限制性内切酶部分水解，得到DNA片段，将其连接到pUC18载体上并转化大肠杆菌HB101，获得含2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因，总长8050bp的DNA片段的重组表达质粒和重组大肠杆菌菌株。
附图说明
图1为含有本发明所述的2-萘酸降解菌的DNA片段的重组质粒构建模式图。
图2为本发明所述的2-萘酸降解菌的DNA片段的核苷酸序列。
图3为本发明的2-萘酸单加氧酶基因所编码的氨基酸序列。
图4为本发明的辅酶A(CoA)连接酶基因所编码的氨基酸序列。
下面结合附图对本发明进行详细描述。
本发明首先从2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)菌株提取总DNA，然后用限制性内切酶EcoR I部分水解，经琼脂糖凝胶电泳，得到各酶切片段。将酶切片段与经过EcoR I酶解的pUC18质粒DNA，加入TaKaRa DNA Ligation Kit Ver2.0 solution I构建连接反应体系，16℃反应30min后，连接产物转化大肠杆菌HB101感受态细胞。将转化子涂布于LB固体培养基上，经过培养，转化子平板上长出了若干蓝色菌落，得到能使大肠杆菌转化子细胞积累靛蓝的重组菌株。挑取其中一个单菌落培养，用碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶水解重组质粒，根据电泳结果证实已插入了一段8kb的2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)的DNA片段。该DNA片段经测序，其核苷酸序列如图2所示(SEQ ID No：1)。对该序列作进一步研究，通过与国际已有基因库进行序列比对，发现在编号2793-3951处有一1158bp，编码386个氨基酸的序列与基因库中一些单加氧酶基因有较高同源性：与已报道的Ralstonia eutropha HF39羟化酶基因(单加氧酶基因)(bec)3’末端的780bpDNA序列有86％的同源性，与bec的氨基酸序列有64％的同源性。另有一段1751bp(在编号第4042-5793位)的核苷酸序列所编码的氨基酸序列与Amycolatopsis sp.HR167辅酶A连接酶有42％的同源性，与其他辅酶A连接酶也有一定相似性。进一步利用靓蓝生成、酶活分析等试验进一步确认该8050bp的DNA片段上含有2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A连接酶基因。在2-萘酸降解过程中，单加氧酶基因起羟化底物(2-萘酸)作用，而辅酶A连接酶基因则使底物连上辅酶A，为进一步的降解创造条件。因此本发明提供了一种可能性，即通过分子生物学手段，将本发明涉及的2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A连接酶基因克隆到大肠杆菌或其它受体菌上，为通过基因工程技术构建多功能高效的环境污染物降解菌创造条件。
下面通过实施例对本发明作进一步详细的说明，下述实施例仅用于说明而不是限制本发明。
实施例1：2-萘酸降解菌总DNA的提取过程
将2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)接种于5ml LB培养基，30℃，140rpm摇床培养过夜，6000g离心10min，收集菌体。加入2.7ml DNA抽提缓冲液，充分悬浮；加入20μl 20mg/ml蛋白酶K，37℃水浴摇床200rpm摇30min后加入0.3ml 20％ SDS，轻轻颠倒几次混匀，置恒温水浴箱静置，65℃温浴2h，期间每隔15-20min上下颠倒几次混匀，直至澄清，6000rpm室温离心10min，上清液转至新的离心管中。加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1v/v)抽提两次，将上清转至新的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温静置1h或更长一点；14000rpm室温离心20min收集粗DNA。DNA用70％的乙醇轻轻溜洗，弃上清后置干净工作台上晾干，最后加入适量含RNA酶的无菌水溶解，转至1.5ml离心管，即得到该菌DNA。
实施例2：克隆过程和测序
取前面所述的总DNA溶液10μl，用限制性内切酶EcoR I部分水解，经琼脂糖凝胶电泳，得到各酶切片段。取6μl(5μg)酶解DNA片段与3μl(2μg)经EcoRI酶解的pUC18质粒DNA，加入9ml TaKaRa DNA Ligation Kit Ver2.0 solution I构建连接反应体系，16℃反应30min；连接产物转化已用氯化钙法制备的大肠杆菌HB101感受态细胞。将转化子涂布于含75μg/ml Amp(氨苄青霉素)的LB固体培养基上。经过培养，转化子平板上长出了若干蓝色菌落，得到能使大肠杆菌转化子细胞积累靛蓝的重组菌株。挑取其中一个单菌落培养，用碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶水解重组质粒，根据电泳结果证实已插入了一段8kb的2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)的DNA片段。
经过测序，并应用相关软件对该DNA序列进行分析，结果显示，此序列上有一段1158bp(编号第2793-3951位核苷酸)阅读框(ORF)编码386个氨基酸，与已报道的Ralstonia eutropha HF39羟化酶基因(单加氧酶基因)(bec)3’末端的780bpDNA序列有86％的同源性，与bec的氨基酸序列有64％的同源性。另一段1751bp(编号第4042-5793位核苷酸)编码的氨基酸序列与Amycolatopsis sp.HR167辅酶A连接酶有42％的同源性，与其他辅酶A连接酶也有一定相似性。
实施例3：验证试验
(1)应用靛蓝生成实验验证基因产物的加氧活性：靛蓝溶解在二甲替甲酰胺(DMF)中，在OD610处有特异的吸收峰。观察OD610处光吸收值的升高，可计算出靛蓝的生成量。紫外分光光度计的靛蓝摩尔吸光系数为17200 liters/mol.cm。在含0.2％葡萄糖的M9液体培养基中(Amp 100mg/L)，添加吲哚60umol/L为底物，用重组大肠杆菌做靛蓝生成实验。每30min取一定量培养液，将被加氧酶羟化吲哚生成的靛蓝溶解在DMF中，测定在OD610处的光吸收值，即可测定重组细胞中加氧酶的活性。实验证明，含有以上基因的重组菌株在反应8h后，就将大部分的底物转化完全，而阴性对照HB101却无转化活性。
(2)利用氧吸收实验，也可验证加氧酶的活性：在加氧酶的酶活测定反应中，NADH浓度的降低表示有加氧反应进行，紫外分光光度计的NADH摩尔吸光系数为3300liters·mol-1·cm-1。酶活以每毫克蛋白每分钟催化1umol NADH的氧化反应表示。该实验结果也证实含目的基因的重组菌株构建的反应体系中，NADH浓度的降低速度明显快于阴性对照HB101大肠杆菌。这一实验结果也验证了加氧酶基因的存在。
(3)利用高效液相色谱仪HPLC检测细胞提取液中的代谢中间产物，检测出辅酶A(CoA)硫酯的形成，从而验证了辅酶A(CoA)连接酶功能。
实施例4：大肠杆菌重组菌株降解试验
底物转化实验：先用液体LB氨苄(100ug/ml)抗性培养基培养重组菌株，离心收集菌株，超声波破碎细胞，超速离心，获取细胞提取液。取反应混合物做适当稀释，在kpi缓冲体系中，用紫外-可见分光光度扫描分析重组大肠杆菌对底物的利用。结果显示，由重组菌株获取的细胞提取液在60min内可使2-萘酸吸收峰值显著降低(约降低50％)；用同样的方法检测该细胞提取液对苯甲酸钠的降解作用，发现该细胞抽提液对苯甲酸钠同样有降解作用(60min后吸收峰值降低1/3)。

Claims (6)

1、一种2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.)JT1500的DNA片段，其特征在于该DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No：1。
2、含有权利要求1所述的DNA片段的重组表达质粒。
3、含有权利要求2所述的重组表达质粒的重组菌株。
4、如权利要求3所述的重组菌株，其为大肠杆菌HB101重组菌株。
5、如权利要求3所述的重组菌株在降解偶氮芳香族化合物中的应用。
6、如权利要求3所述的重组菌株在降解2-萘酸中的应用。
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