CN1618971A - 一种2-萘酸降解菌dna片段的核苷酸序列及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了由2-萘酸降解菌(Burkholderiasp.JT1500)总DNA获得的一段8050bp的DNA片段及其制备方法,构建了原核表达质粒,转化大肠杆菌获得重组菌株,通过核苷酸序列和氨基酸序列比对,证实该DNA片段含有2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因,所表达的单加氧酶起羟化底物作用,辅酶A(CoA)连接酶基因则使底物连上辅酶A,为进一步的降解创造条件。含有该DNA片段的重组菌株具有高效降解2-奈酸和苯甲酸钠等作用,为通过基因工程技术构建多功能高效的环境污染物降解菌创造条件。
Description
所属技术领域
本发明涉及一种2-萘酸降解菌DNA片段的核苷酸序列,涉及含有该DNA片段的重组质粒和重组菌株的制备方法。具体地说,本发明涉及2-萘酸降解菌(Burkholderiasp.JT1500)的一段具有降解2-萘酸活性的DNA片段,该DNA片段含有两个关键基因:2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因,涉及含有该DNA片段的重组质粒和表达相应酶的重组菌株。
背景技术
偶氮芳香族化合物在自然界中广泛存在,而且每年以数百万吨的数量被制造出来。尤其是印染工业中偶氮染料的广泛使用产生大量的印染废水,对环境构成严重的污染和危害。微生物降解芳香族环境污染物具有投资少、占地小又不需要特殊设备等优点,逐渐成为最有前途的治理环境污染物的方法。2-萘酸是一种在化学结构上类似偶氮芳香族物质的化合物,通过研究2-萘酸的微生物代谢途径,确定其代谢过程中的酶系统以及对应的代谢基因,可以为偶氮类化合物的微生物降解提供理论依据,为通过基因工程技术构建多功能高效的环境污染物降解菌创造条件。
在微生物降解芳香族环境污染物的研究中,关于2-萘酸代谢研究的报道很少,仅有1997年Birgit Morawski等报道过2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)降解2-萘酸的代谢途径,其具体的基因和基因调控机理并未有报道。2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因未曾有过报道,他们在2-萘酸降解过程中所起的作用更未曾有报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一段2-萘酸降解菌的具有降解2-萘酸活性的DNA片段的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供含有所述DNA片段的重组表达质粒和重组菌株。
本发明的再一个目的是提供一种制备含有所述DNA片段的重组表达质粒和重组菌株的制备方法,并将其用于高效降解2-萘酸及其它偶氮类芳香族化合物。
本发明提供了一种2-萘酸降解菌的具有降解活性的DNA片段,其核苷酸序列如:SEQNo:1所示。
按照本发明的DNA片段,含有两个关键基因:2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因序列。其中2-萘酸单加氧酶基因序列为SEQ ID NO:1中所示编号为第2793-3951位的核苷酸序列,共1158bp。该基因编码的单加氧酶的氨基酸序列为SEQ ID No:2。辅酶A(CoA)连接酶的基因序列为SEQ ID No:1所示编号为第4042-5793位的核苷酸序列,共1751bp。该基因编码的辅酶A(CoA)连接酶的氨基酸序列为SEQID No:3。
本发明还提供了含有如上所述DNA序列的重组表达质粒。
本发明还涉及含有上述的重组表达质粒的重组菌株,如大肠杆菌HB101重组菌株。
本发明还提供了一种制备含有所述DNA片段的重组表达质粒和重组大肠杆菌菌株的方法,包括以下步骤:从2-萘酸降解菌Burkholderia sp.JT1500菌株中提取总DNA,经限制性内切酶部分水解,得到DNA片段,将其连接到pUC18载体上并转化大肠杆菌HB101,获得含2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因,总长8050bp的DNA片段的重组表达质粒和重组大肠杆菌菌株。
附图说明
图1为含有本发明所述的2-萘酸降解菌的DNA片段的重组质粒构建模式图。
图2为本发明所述的2-萘酸降解菌的DNA片段的核苷酸序列。
图3为本发明的2-萘酸单加氧酶基因所编码的氨基酸序列。
图4为本发明的辅酶A(CoA)连接酶基因所编码的氨基酸序列。
下面结合附图对本发明进行详细描述。
本发明首先从2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)菌株提取总DNA,然后用限制性内切酶EcoR I部分水解,经琼脂糖凝胶电泳,得到各酶切片段。将酶切片段与经过EcoR I酶解的pUC18质粒DNA,加入TaKaRa DNA Ligation Kit Ver2.0 solution I构建连接反应体系,16℃反应30min后,连接产物转化大肠杆菌HB101感受态细胞。将转化子涂布于LB固体培养基上,经过培养,转化子平板上长出了若干蓝色菌落,得到能使大肠杆菌转化子细胞积累靛蓝的重组菌株。挑取其中一个单菌落培养,用碱裂解法提取质粒,用限制性内切酶水解重组质粒,根据电泳结果证实已插入了一段8kb的2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)的DNA片段。该DNA片段经测序,其核苷酸序列如图2所示(SEQ ID No:1)。对该序列作进一步研究,通过与国际已有基因库进行序列比对,发现在编号2793-3951处有一1158bp,编码386个氨基酸的序列与基因库中一些单加氧酶基因有较高同源性:与已报道的Ralstonia eutropha HF39羟化酶基因(单加氧酶基因)(bec)3’末端的780bpDNA序列有86%的同源性,与bec的氨基酸序列有64%的同源性。另有一段1751bp(在编号第4042-5793位)的核苷酸序列所编码的氨基酸序列与Amycolatopsis sp.HR167辅酶A连接酶有42%的同源性,与其他辅酶A连接酶也有一定相似性。进一步利用靓蓝生成、酶活分析等试验进一步确认该8050bp的DNA片段上含有2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A连接酶基因。在2-萘酸降解过程中,单加氧酶基因起羟化底物(2-萘酸)作用,而辅酶A连接酶基因则使底物连上辅酶A,为进一步的降解创造条件。因此本发明提供了一种可能性,即通过分子生物学手段,将本发明涉及的2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A连接酶基因克隆到大肠杆菌或其它受体菌上,为通过基因工程技术构建多功能高效的环境污染物降解菌创造条件。
下面通过实施例对本发明作进一步详细的说明,下述实施例仅用于说明而不是限制本发明。
实施例1:2-萘酸降解菌总DNA的提取过程
将2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)接种于5ml LB培养基,30℃,140rpm摇床培养过夜,6000g离心10min,收集菌体。加入2.7ml DNA抽提缓冲液,充分悬浮;加入20μl 20mg/ml蛋白酶K,37℃水浴摇床200rpm摇30min后加入0.3ml 20%SDS,轻轻颠倒几次混匀,置恒温水浴箱静置,65℃温浴2h,期间每隔15-20min上下颠倒几次混匀,直至澄清,6000rpm室温离心10min,上清液转至新的离心管中。加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1 v/v)抽提两次,将上清转至新的离心管中,加入0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温静置1h或更长一点;14000rpm室温离心20min收集粗DNA。DNA用70%的乙醇轻轻溜洗,弃上清后置干净工作台上晾干,最后加入适量含RNA酶的无菌水溶解,转至1.5ml离心管,即得到该菌DNA。
实施例2:克隆过程和测序
取前面所述的总DNA溶液10μl,用限制性内切酶EcoR I部分水解,经琼脂糖凝胶电泳,得到各酶切片段。取6μl(5μg)酶解DNA片段与3μl(2μg)经EcoRI酶解的pUC18质粒DNA,加入9ml TaKaRa DNA Ligation Kit Ver2.0 solution I构建连接反应体系,16℃反应30min;连接产物转化已用氯化钙法制备的大肠杆菌HB101感受态细胞。将转化子涂布于含75μg/ml Amp(氨苄青霉素)的LB固体培养基上。经过培养,转化子平板上长出了若干蓝色菌落,得到能使大肠杆菌转化子细胞积累靛蓝的重组菌株。挑取其中一个单菌落培养,用碱裂解法提取质粒,用限制性内切酶水解重组质粒,根据电泳结果证实已插入了一段8kb的2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)的DNA片段。
经过测序,并应用相关软件对该DNA序列进行分析,结果显示,此序列上有一段1158bp(编号第2793-3951位核苷酸)阅读框(ORF)编码386个氨基酸,与已报道的Ralstonia eutropha HF39羟化酶基因(单加氧酶基因)(bec)3’末端的780bpDNA序列有86%的同源性,与bec的氨基酸序列有64%的同源性。另一段1751bp(编号第4042-5793位核苷酸)编码的氨基酸序列与Amycolatopsis sp.HR167辅酶A连接酶有42%的同源性,与其他辅酶A连接酶也有一定相似性。
实施例3:验证试验
(1)应用靛蓝生成实验验证基因产物的加氧活性:靛蓝溶解在二甲替甲酰胺(DMF)中,在OD610处有特异的吸收峰。观察OD610处光吸收值的升高,可计算出靛蓝的生成量。紫外分光光度计的靛蓝摩尔吸光系数为17200liters/mol.cm。在含0.2%葡萄糖的M9液体培养基中(Amp 100mg/L),添加吲哚60umol/L为底物,用重组大肠杆菌做靛蓝生成实验。每30min取一定量培养液,将被加氧酶羟化吲哚生成的靛蓝溶解在DMF中,测定在OD610处的光吸收值,即可测定重组细胞中加氧酶的活性。实验证明,含有以上基因的重组菌株在反应8h后,就将大部分的底物转化完全,而阴性对照HB101却无转化活性。
(2)利用氧吸收实验,也可验证加氧酶的活性:在加氧酶的酶活测定反应中,NADH浓度的降低表示有加氧反应进行,紫外分光光度计的NADH摩尔吸光系数为3300liters·mol-1·cm-1。酶活以每毫克蛋白每分钟催化1umol NADH的氧化反应表示。该实验结果也证实含目的基因的重组菌株构建的反应体系中,NADH浓度的降低速度明显快于阴性对照HB101大肠杆菌。这一实验结果也验证了加氧酶基因的存在。
(3)利用高效液相色谱仪HPLC检测细胞提取液中的代谢中间产物,检测出辅酶A(CoA)硫酯的形成,从而验证了辅酶A(CoA)连接酶功能。
实施例4:大肠杆菌重组菌株降解试验
底物转化实验:先用液体LB氨苄(100ug/ml)抗性培养基培养重组菌株,离心收集菌株,超声波破碎细胞,超速离心,获取细胞提取液。取反应混合物做适当稀释,在kpi缓冲体系中,用紫外-可见分光光度扫描分析重组大肠杆菌对底物的利用。结果显示,由重组菌株获取的细胞提取液在60min内可使2-萘酸吸收峰值显著降低(约降低50%);用同样的方法检测该细胞提取液对苯甲酸钠的降解作用,发现该细胞抽提液对苯甲酸钠同样有降解作用(60min后吸收峰值降低1/3)。
Claims (12)
1、一种2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)的DNA片段,该DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No:1。
2、权利要求1所述的2-萘酸降解菌的DNA片段含有2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因。
3、权利要求2所述的2-萘酸单加氧酶基因序列为SEQ ID No:1中所示编号为第2793-3951位的核苷酸序列,共1158bp。
4、权利要求2所述的2-萘酸单加氧酶基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No:2。
5、权利要求2所述的辅酶A(CoA)连接酶基因序列为SEQ ID No:1中所示编号为第4042-5793位的核苷酸序列,共1751bp。
6、权利要求2所述的辅酶A(CoA)连接酶基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No:3。
7、含有权利要求1所述的DNA片段的重组表达质粒。
8、含有权利要求7所述的重组表达质粒的重组菌株。
9、含有如权利要求8所述的重组菌株为大肠杆菌HB101重组菌株。
10、一种制备具有降解2-萘酸活性的DNA片段的方法,包括以下步骤:从2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)菌株中提取总DNA,经限制性内切酶部分水解,得到DNA片段,将其连接到pUC18载体上并转化大肠杆菌HB101,获得含有一段8050bp,上有2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因的DNA片段的重组表达质粒和重组大肠杆菌菌株。
11、权利要求8所述的重组菌株用于降解偶氮芳香族化合物。
12、权利要求8所述的重组菌株用于2-萘酸的降解。
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