CN1245515C - L－乳酸脱氢酶基因、包括该基因的重组载体及其宿主细胞 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种L-乳酸脱氢酶基因、包括该基因的重组载体及其宿主细胞，L-乳酸脱氢酶基因具有序列表中SEQ ID No.5所述的核苷酸序列；一种包括L-乳酸脱氢酶基因的重组载体，通过PCR扩增出的L-乳酸脱氢酶的开放阅读框架，回收得到968bpDNA片段，与pGEM-T Easy加入T₄连接酶，进行连接反应，制成重组载体pLZD3084，将重组载体转化到宿主大肠杆菌的细胞中，得到重组微生物，在本发明的基础上，可进一步研究L-乳酸脱氢酶基因的缺失，缺失L-乳酸脱氢酶基因的乳杆菌将可以发酵生产高光学纯度的D-乳酸，从而可以大大降低D-乳酸的生产成本。

Description

L-乳酸脱氢酶基因、包括该基因的重组载体及其宿主细胞

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及L-型乳酸脱氢酶基因、含有该基因的重组载体，及用该载体转化的宿主细胞。

背景技术：

乳酸广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。乳酸依其旋光性不同可分为D-乳酸、L-乳酸、D，L-乳酸三种。其中，D-乳酸及其衍生物，广泛应用于食品、医药、饲料和化工等领域，特别是在医药领域，D-乳酸的聚合物可以被用作药物缓释剂型的材料，这是因为，D-乳酸的聚合物不能被人体消化吸收，但能被寄生于人体的微生物分解，从而起到缓释药物的作用；另外，D-乳酸可以用作手性药物的前体物，利用光学纯的D-乳酸的手性特征，用于开发手性药物，大大提高药物的治疗效果和用药的安全性。还有，D-乳酸可以作为农药的前体物，由此而合成的农药易分解、无残留，是一种环保型农药。因此，目前对D-乳酸的需求日益增加，其价格是L-乳酸的8～10倍，具有很大的市场潜力。

在动物或微生物体中，乳酸脱氢酶(简称“LDH”)是以NADH为辅酶，将丙酮酸经过生化反应生成乳酸，因此乳酸脱氢酶是乳酸菌发酵的关键酶。自然界中存在L和D两种依赖NADH的乳酸脱氢酶，分别催化丙酮酸生成L-乳酸和D-乳酸。在同时具有D-乳酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶的乳酸菌中，如果将L-乳酸脱氢酶缺失，就可以得到理论上光学纯度为100％的D-乳酸。L-乳酸脱氢酶广泛存在于微生物中，但目前只有少数乳杆菌属的L-乳酸脱氢酶基因被克隆和测序(Thlerry Ferain et al.1994.Lactobacillus plantarum ldhL Gene：Overexpression and Deletion.J.Bacteriol.176(3)596-601；Sungmin F.et al.1991.Cloning and Nucleotide Sequence of the Lactobacillus casei Lactate DehydrogenaseGene.Applied and Environmental Microbiology.2413-2417；Kirsi Savijoki et al.Molecular Genetic Charcterization of the L-Lactate Dehydrogenase Gene(ldhL)ofLactobacillus helveticus and Biochemical Characterization of the Enzyme.Appliedand Environmental Microbiology.1997.2850-2856)。

乳杆菌MD-1具有以下特性：①最佳生长和发酵生产乳酸的温度为48℃；②在其基因组中具有D和L两种乳酸脱氢酶基因，在生长过程中合成D和L两种乳酸脱氢酶；③乳酸类型为DL-乳酸；④可以在发酵培养基中含200g/L葡萄糖条件下快速生长和生产乳酸；⑤72小时可以产酸140g/L以上；⑥营养要求简单，可以用大米或玉米糖化液作为发酵培养基进行发酵生产乳酸。

如果缺失L-乳酸脱氢酶基因，乳杆菌MD-1可以发酵生产高光学纯度的D-乳酸，理论上光学纯度可达到100％，72小时发酵液中可积累140g/L以上的D-乳酸，从而可以大大降低D-乳酸的生产成本，具有很大的应用潜力。

明确乳酸菌L-乳酸脱氢酶基因的多核苷酸序列，是研究L-乳酸脱氢酶基因缺失的前题，它对构建生产D-乳酸的工程菌具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种L-乳酸脱氢酶基因。

本发明的第二个目的是提供一种由L-乳酸脱氢酶基因编码的多肽。

本发明的第三个目的是提供一种包括有L-乳酸脱氢酶基因的重组载体。

本发明的最后一个目的是提供一种利用L-乳酸脱氢酶基因的重组载体转化的重组微生物。

本发明的技术方案概述如下：

一种L-乳酸脱氢酶基因，它具有序列表中SEQ ID No.5所述的核苷酸序列。

一种由L-乳酸脱氢酶基因编码的多肽，它具有序列表中SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。

一种包括具有序列表中SEQ ID No.5所述的核苷酸序列基因的重组载体，它是以序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为PCR引物，以SEQ ID No.1所述的核苷酸序列为模板，扩增出的L-乳酸脱氢酶的开放阅读框架，回收得到968bpDNA片段，(包括951bp L-乳酸脱氢酶的的开放阅读框架和酶切位点及酶切位点的保护碱基)，与pGEM-T Easy加入T₄连接酶，进行连接反应，制成pLZD3084，构建策略见图6，或用BamH I和NdeI双酶切pET-28a(+)和pLZD3084，分别得到5.3kbDNA片段和962bpDNA片段，再用T₄连接酶，进行连接反应，制成pLOD3083，构建策略见图10。

一种含有L-乳酸脱氢酶基因的转化宿主细胞，它是将含有序列表中SEQ ID No.5核苷酸序列的重组载体pLZD3084导入到宿主大肠杆菌DH5α得到的转化宿主细胞DH5α/pLZD3084。

一种含有L-乳酸脱氢酶基因的转化宿主细胞，它是将含有序列表中SEQ ID No.5核苷酸序列的重组载体pLOD3083导入到宿主大肠杆菌DE3得到的转化宿主细胞DE3/pLOD3083。

本发明中乳杆菌MD-1的L-乳酸脱氢酶的特点在于和其他已经报道的乳杆菌L-乳酸脱氢酶的多核苷酸序列相似性较低，最高达到64.12％；其编码的氨基酸序列的相同性最高为68.89％。

在本发明完成的基础上，可以进一步研究L-乳酸脱氢酶基因的缺失，那么，缺失L-乳酸脱氢酶基因的乳杆菌MD-1将可以发酵生产高光学纯度的D-乳酸，从而可以大大降低D-乳酸的生产成本。

附图说明

图1显示了1260bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No.1)；

图2是根据核苷酸序列(SEQ ID No.1)推测的L-乳酸脱氢酶蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.2)；

图3显示了27bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No.3)；

图4显示了26bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No.4)；

图5显示了951bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No.5)；

图6为一种含有L-乳酸脱氢酶基因的重组(克隆)载体的构建策略图；

图7由乳杆菌MD-1基因组DNA的随机基因文库筛选到的一种含有L-乳酸脱氢酶基因的重组(克隆)载体的构建策略图；

图8为阳性克隆的乳酸脱氢酶比活力；

图9为pLZD3083的酶切分析；

图10为一种含有L-乳酸脱氢酶基因的重组表达载体的构建策略图；

图11为全细胞蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；

具体实施方式

制备本发明的一种L-乳酸脱氢酶基因、重组载体及其宿主细胞的方法包括如下步骤：

1.从乳杆菌MD-1中提取基因组DNA，经限制性内切酶部分水解，得到DNA片段，连接到pJDC9载体(南开大学生命科学学院提供)上并转化到大肠杆菌FMJ144(南开大学生命科学学院提供)，构建出乳杆菌MD-1的随机基因文库。

2.将有重组质粒的大肠杆菌FMJ144菌株在厌氧条件下培养，获得含L-乳酸脱氢酶基因的重组质粒pLZD3083及重组大肠杆菌FMJ144/pLZD3083。

在可使L-乳酸脱氢酶基因表达的条件下培养该重组菌，用丙酮酸做底物，NADH为辅酶，用紫外分光光度计测定L-乳酸脱氢酶的酶活性，证明该重组质粒具有乳酸脱氢酶活性；用SBA-40C酶膜分析仪分析以上生化反应产物—乳酸的光学特性，检测到反应产物为L-乳酸，证明含有该重组质粒的大肠杆菌FMJ144产生的乳酸脱氢酶属于L型。

乳杆菌MD-1的L-乳酸脱氢酶基因核苷酸序列SEQ ID No.1(见图1)。L-乳酸脱氢酶基因全长1260bp，这个序列的分析显示，存在951bp的开放阅读框架(ORF)；这个基因和其他乳杆菌属的相应基因比较，其相似性低于65％。

根据核苷酸序列SEQ ID No.1，推测乳杆菌MD-1的L-乳酸脱氢酶蛋白的氨基酸序列见SEQ ID No.2。该L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列由316个氨基酸组成，分子量为33839.7Da，pI值为5.37。通过对本发明涉及的L-乳酸脱氢酶基因推导的氨基酸序列与其他乳杆菌的L-乳酸脱氢酶氨基酸序列进行比对分析，结果表明菌株MD-1的L-乳酸脱氢酶属于依赖NADH的脱氢酶家族的一员，与其他已报道的L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列相比，其相同性小于70％。(参见Thlerry Ferain et al.1994.Lactobacillus plantarum ldhL Gene：Overexpressionand Deletion.J.Bacteriol.176(3)596-601；Sungmin F.et al.1991.Cloning andNucleotide Sequence of the Lactobacillus casei Lactate Dehydrogenase Gene.Appliedand Environmental Microbiology.2413-2417；Kirsi Savi joki et al.Molecular GeneticCharcterization of the L-Lactate Dehydrogenase Gene(ldhL)of Lactobacillushelveticus and Biochemical Characterization of the Enzyme.Applied andEnvironmental Microbiology.1997.2850-2856)

下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明。应该理解的是，所述的实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。

实施例1乳杆菌MD-1基因组DNA的提取

采用高温高产乳酸的乳杆菌MD-1(南开大学生命科学学院提供)，接种乳杆菌MD-1在200mLMRS培养基中，48℃培养24小时。离心收集菌体，用TE缓冲液(Tris-HCl 10mmol/L，EDTA 1mmol/L，pH8.0)洗涤2次，然后悬浮在24mLTE缓冲液中加入溶菌酶，使其工作浓度为5mg/mL，混匀后于37℃放置2小时；之后加入2.5mL溶液A(Tris-HCl 50mmol/L，EDTA 0.25mmol/L，pH8.0)，同时加入1.5mL溶液B(十二烷基磺酸钠(SDS)10％，Tris-HCl50mmol/L，EDTA 20mmol/L)以及150μL浓度为10mg/mL的蛋白酶K，混匀后于55℃保温1小时；该溶液分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次，然后再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，取上清液用0.6倍的异丙醇沉淀，收DNA，用70％乙醇洗涤2次，沉淀溶于3mLTE缓冲液中；加入10mg/mL Rnase18μL，37℃保温1小时，分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次，上清液加入2倍体积无水乙醇，回收DNA，分别用70％的乙醇和无水乙醇洗涤，干燥，用去离子水溶解。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A_260/280＝1.98，A_260/A230＝2.18。

实施例2基因文库的构建

取实施例1所提取的基因组DNA10μL(约50μgDNA)，用限制性内切酶BamHI不完全消化，经琼脂糖凝胶电泳，用大连宝生物的胶回收试剂盒回收，得到约2-6kb的部分消化片段。用限制性内切酶BamHI酶切pJDC9，经琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒(大连宝生物)回收pJDC9；取2μL pJDC9回收产物，与5μL回收的基因组DNA片段，在10μL连接体系进行连接反应，总共做20支10μL连接体系的连接反应，其中含1μL的10倍连接缓冲液，1μLT4DNA连接酶，1μL水。连接体系在16℃条件下过夜反应，取10μL连接产物电转化到E.coli(大肠杆菌)FMJ144中，涂布在M9培养基平板上，得到乳杆菌MD-1基因组DNA的随机基因文库(见图7)。

实施例3在厌氧条件下进行互补筛选

将电转化的大肠杆菌FMJ144细胞涂布在含有工作浓度为250μg/mL红霉素的M9培养基平板上，厌氧条件下37℃培养144h筛选获得有乳酸脱氢酶活性的含有重组质粒的菌株，即阳性克隆；对阳性克隆菌落用碱法提取重组质粒，采用实施例2中相同的电转化手段，将重组质粒电转化到E.coli(大肠杆菌)FMJ144中进一步进行筛选；在厌氧条件下37℃培养144h筛选验证含有乳酸脱氢酶活性的含有重组质粒的菌株。

实施例4乳酸脱氢酶酶活性分析

将阳性克隆接种到10mLM9液体培养基中，37℃静置培养48小时，离心收集菌体，用0.5M的磷酸缓冲液悬浮菌体，超声波破碎细胞，14,000r/min离心30分钟，取其上清液，即蛋白粗提物；用福林酚法测定蛋白质浓度。用紫外分光光度计测定乳酸脱氢酶活性，具体方法为：在2790μL 0.5M的磷酸缓冲液中加入100μL2.5mg/mL丙酮酸、100μL3.5mg/mL的NADH和10μL酶液，在25℃条件下用紫外分光光度计用340nm波长测定3分钟反应液的吸光值变化量，即ΔA_3-10nm。分析结果表明筛选出的8株含有重组质粒的阳性克隆均存在很高的酶活(见图8)，选取酶活性最高的H菌株进行进一步分析。该阳性克隆的重组质粒称为pLZD3083(见图7中的质粒)，含有此重组质粒pLZD3083的重组大肠杆菌称为大肠杆菌FMJ144/pLZD3083。

酶活单位(U)：在25℃，pH7.0的条件下，1分钟氧化1μmolNADH的酶量为1单位。

实施例5鉴定乳酸脱氢酶类型

在700μL0.5M的磷酸缓冲液中加入100μL10mg/mL丙酮酸、100μL42mg/mL的NADH和100μL上述酶液，在25℃条件下反应2小时；用SBA-40C酶膜分析仪分析酶反应液中乳酸类型，分析结果表明反应液中存在产物L-乳酸，证明了酶液中乳酸脱氢酶属于L-乳酸脱氢酶。

实施例6pLZD3083酶切分析

挑出阳性克隆接入含有250μg/mL红霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下振荡培养16小时；用碱法提取质粒，用BamH I酶切分析，琼脂糖凝胶电泳中呈约3kb的带(见图9)。

实施例7序列测定与分析

DNA序列测定由TaKaRa公司完成。DNA序列分析采用Artemis v5，蛋白质序列分析采用Dnaman4.0和ClustalX1.8以及NCBI相关数据库和软件。分析得到DNA序列：SEQ ID No.1(图1)和SEQ ID No.5。(图5)

实施例8L-乳酸脱氢酶ORF的PCR扩增和测序

以SEQ ID No.1的核苷酸序列作参照，设计并合成PCR引物：

上游引物为5’-GCGCG CATATGTTGACTCTAAAACGTC-3’(SEQ ID No.3)。

                           NdeI

下游引物为5’-GCG GGATCCTTAAAGTTGATCCATGC-3’(SEQ ID No.4)。

                       BamHI

反应体系：

Taq premix version     25μL

模板DNA                1μL

引物1(20pmol/μL)      1μL

引物2(20pmol/μL)      1μL

水                     22μL

                       50μL

扩增条件：

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用回收试剂盒回收约1kb的DNA片段，对该DNA片段用Sanger链终止法测定其核苷酸序列，以检测PCR片段是否和L-乳酸脱氢酶的ORF一致，测序结果见SEQ ID No.5。结果表明PCR片段与L-乳酸脱氢酶的ORF一致。

实施例9构建L-乳酸脱氢酶克隆载体

取5μL回收的L-乳酸脱氢酶基因ORF的PCR片段与0.5μL pGEM-T Easy载体(Promega公司出售)在10μL连接体系进行连接反应，其中含1μL的10×连接缓冲液，1μLT₄DNA连接酶，2.5μL水。连接体系在16℃条件下过夜反应，连接产物用于转化大肠杆菌。

实施例10克隆载体转化到大肠杆菌DH5α

加入100μL解冻的用CaCl₂法制备的感受态细胞大肠杆菌DH5α(市售)和10μL连接液至Eppendorf管中，冰上30分钟，42℃热激90s，冰上2分钟，加入LB培养基900μL37℃100r/min振荡培养1小时。取100μL涂布在LB培养基平板(100μg/mL氨苄青霉素、1mmol5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)(大连宝生物)、1mmol异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(大连宝生物)上，37℃条件下培养16小时；挑出白色菌落接入含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下振荡培养16小时；用碱法提取质粒，用PCR检测，琼脂糖凝胶电泳中呈约1kb的带。含有该DNA片段的重组质粒称为pLZD3084(见图6)，含有此重组质粒pLZD3084的重组大肠杆菌称为大肠杆菌DH5α/pLZD3084。

实施例11L-乳酸脱氢酶与表达载体pET-28a(+)(Novagen公司出售)的重组

L-乳酸脱氢酶和表达载体pET-28a(+)分别用BamHI和NdeI双酶切。酶切条件如下：

Eppendorf A                 Eppendorf B

BamH I       1μL           BamH I           1μL

NdeI         1μL           NdeI             1μL

10×K缓冲液  5μL           10×K缓冲液      5μL

pLZD3084     30μL          pET-28a(+)       30μL

H₂O         13μL          H₂O             13μL

             50μL                           50μL

37℃酶切2小时，电泳后分别回收两个目的片段，用T4 DNA连接酶连接，连接条件如下：

Eppendorf C

T4 DNA连接酶          1μL

10×连接缓冲液        1μL

pET-28a(+)            2μL

酶切片段              3μL

H₂O                  3μL

                      10μL

连接体系在16℃条件下过夜反应，连接产物用于转化大肠杆菌。

实施例12表达载体转化到大肠杆菌DE3(Novagen公司出售)

加入60μL解冻的用CaCl法制备的感受态细胞大肠杆菌DE3和10μL连接液至Eppendorf管中，冰上30分钟，42℃热激90s，冰上2分钟，加入LB培养基930μL37℃100r/min振荡培养1小时。取100μL涂布在LB培养基平板(60μg/mL卡拉霉素)上，37℃条件下培养16小时；挑出菌落接入含有60μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下振荡培养16小时；用碱法提取质粒，用PCR检测，琼脂糖凝胶电泳中呈约1kb的带。含有该DNA片段的重组质粒称为pLOD3083(见图10)，含有此重组质粒pLOD3083的重组大肠杆菌称为大肠杆菌DE3/pLOD3083。

实施例13L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌DE3中的表达

将带有L-乳酸脱氢酶的pET-28a(+)重组载体pLOD3083的大肠杆菌DE3接入含有60μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下振荡培养16小时，取培养物50μL接入5mL含有60μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下振荡培养，直到OD值为0.3-0.4，加入1mmol/LIPTG诱导L-乳酸脱氢酶表达，25℃诱导2小时后，离心收集细胞，用0.5mol/L pH7.0的磷酸缓冲液洗涤两次，然后悬浮在1mL相同的磷酸缓冲液中；用超声波细胞破碎仪破碎细胞，12000r/min离心30分钟，得到上清液，即粗酶液。按照实施例4、实施例5测定L-乳酸脱氢酶活性及乳酸脱氢酶类型(见表1)。

                    表1重细D-乳酸脱氢酶活性

菌株	E.coli DE3(pET-28a(+))	E.coli(pLOD3083)	Lactobacillus sp.MD-1
				比活力(U.mg-1.)L-乳酸(mg/mL)	0.0060	0.1242	0.09735

实施例14含有重组表达载体pLOD3083的大肠杆菌DE3全蛋白变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳

将带有L-乳酸脱氢酶的pET-28a(+)重组载体pLOD3083的大肠杆菌DE3接入含有60μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下振荡培养16小时，取培养物50μL接入5mL含有60μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下振荡培养，直到OD值为0.3-0.4，加入1mMIPTG诱导L-乳酸脱氢酶表达，25℃诱导2小时后，取1mL菌液离心收集细胞，加入100μL水和100μL2×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水煮5分钟，用浓度为15％的凝胶进行SDS-PAGE凝胶电泳2小时，用考马斯亮蓝染液染色1小时，再用脱色液脱色4小时，得到电泳图谱(见图11)全细胞蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱：图中，A，含有重组质粒pLOD3083的大肠杆菌DE3的全细胞蛋白；B，含有载体质粒pET-28(+)的大肠杆菌DE3的全细胞蛋白C，蛋白质标准)。电泳结果证实有蛋白质大量表达，分子量约为34000道尔顿(除去组氨酸标签，其分子量约为3000道尔顿)。

Claims (5)

1.一种L-乳酸脱氢酶基因，其特征是它具有序列表中SEQ ID No.5所述的核苷酸序列。

2.一种L-乳酸脱氢酶基因编码的多肽，其特征是它具有序列表中SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。

3.一种包括权利要求1基因的重组载体，其特征是将以序列表SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4为PCR引物，以SEQ ID No.1所述的核苷酸序列为模板，扩增出的L-乳酸脱氢酶的开放阅读框架，回收得到968bpDNA片段，与pGEM-T Easy加入T₄连接酶，进行连接反应，制成pLZD3084，构建策略见图6，或用BamHI和NdeI双酶切pET-28a(+)和pLZD3084，分别得到5.3kbDNA片段和962bpDNA片段，再用T₄连接酶，进行连接反应，制成pLOD3083，构建策略见图10。

4.一种含有L-乳酸脱氢酶基因的转化宿主细胞，其特征是将含有序列表中SEQ IDNo.5核苷酸序列的重组载体pLZD3084导入到宿主大肠杆菌DH5α得到的转化宿主细胞。

5.一种含有L-乳酸脱氢酶基因的转化宿主细胞，其特征是将含有序列表中SEQ IDNo.5核苷酸序列的重组载体pLOD3083导入到宿主大肠杆菌DE3得到的转化宿主细胞。

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