CN100363496C - 一种l-乳酸脱氢酶基因及其编码的氨基酸序列 - Google Patents

Abstract

一种L—乳酸脱氢酶基因及其编码的氨基酸序列和制备过程中设计的引物，它涉及一种脱氢酶基因及其编码的氨基酸序列和制备过程中设计的引物。因为高效产氢细菌B49代谢途径中乳酸脱氢酶的基因研究对工业提高高效产氢细菌B49的产乳酸量和产氢量都有着重要的意义。所以本发明以高效产氢菌B49的DNA为模板，通过PCR扩增获得L—乳酸脱氢酶基因，序列全长1139bp，其中T、C、G、A分别为227bp、336bp、337bp、239bp。在109bp处有起始密码子ATG，在1057bp处有终止密码子TAA。该序列无内含子，具有951bp完整的开放读码框，编码316个氨基酸；而且设计了P₁～P₁₀十个引物。本发明扩大L—乳酸脱氢酶基因资源，从而为高效产氢细菌B49的代谢工程研究和构建基因工程菌株提供了物质基础。

Description

一种L-乳酸脱氢酶基因及其编码的氨基酸序列

技术领域

本发明涉及一种脱氢酶基因及其编码的氨基酸序列。

背景技术

高效产氢细菌B49(中国微生物菌种保藏中心保藏号为CGMCC1153)是从生物制氢反应器的乙醇型发酵活性污泥中分离出的一株高产氢乙醇型发酵菌株。其最大比产氢速率为25.0mmolH2/g·drycell·h，单位体积产氢速率为1813.8mL/L-culture，产氢能力居于国际前列。其菌株特征为单胞生长的规则杆菌；周生鞭毛；G+；无荚膜；无芽孢；专性厌氧；乳白色圆形菌落；代时为7.2h；在28～43℃，pH3.3～8.5条件下生长。B49酵解葡萄糖的主要发酵产物为乙醇、乙酸、H₂、CO₂和乳酸，推测B49酵解葡萄糖的代谢途径如图1所示。乳酸脱氢酶(LDH)是高效产氢细菌B49代谢的关键酶，在高效产氢细菌B49的代谢中，乳酸的生成会消耗丙酮酸，对产氢发酵有强烈的抑制作用；而氢的生成同样会消耗丙酮酸，减少乳酸的产量。因此高效产氢细菌B49代谢途径中乳酸脱氢酶(LDH)的基因研究对工业提高高效产氢细菌B49的产乳酸量和产氢量都有着重要的意义。

发明内容

鉴于乳酸脱氢酶基因的研究对工业提高高效产氢细菌B49的产乳酸量和产氢量都有着重要的意义，本发明旨在从Ethanologenbacterium hitB49基因组中分离乳酸脱氢酶基因。本发明所述的Ethanologenbacterium hit B49乳酸脱氢酶基因Bldh是以高效产氢菌Ethanologenbacterium hit B49的DNA为模板，通过PCR扩增获得的。本发明L-乳酸脱氢酶基因序列全长1139bp，其中T、C、G、A分别为227bp(20％)、336bp(29％)、337bp(30％)、239bp(21％)。在109bp处有起始密码子ATG，在1057bp处有终止密码子TAA。该序列无内含子，具有951bp完整的开放读码框，编码316个氨基酸。编码产物分子量为34.233kD，等电点pI为6.34。基因序列比对分析，与已注册的L-乳酸脱氢酶同源性为49～55％，其中与Bacillus cereus ATCC 14579乳酸脱氢酶基因的同源性最高为55％，证明是一个新的细菌乳酸脱氢酶基因。将分离的L-乳酸脱氢酶基因与原核表达载体pet-22b连接，构建成pet-22b-LDH重组表达载体，经IPTG诱导后表达出36～38Kd的目的蛋白，证实该基因具有表达功能。本发明为制备L-乳酸脱氢酶基因设计了P₁～P₁₀十个引物。

本发明从Ethanologenbacterium hit B49基因组中分离L-乳酸脱氢酶基因，扩大L-乳酸脱氢酶基因资源，从而为Ethanologenbacterium hit B49的代谢工程研究和构建基因工程菌株提供了物质基础。

附图说明

图1是推测B49酵解葡萄糖的代谢途径图；图2为pMD18-T载体结构图谱；图3为pMD18-T载体的酶切位点结构图；图4为TaKaRa LA PCR^TM invitro cloning Kit试剂盒的PCR扩增原理图；图5为特异性引物设计位置图，图中白色区域为未知区域、图中深色区域为已知区域；图6为pet-22b载体结构图谱，图7为pet-22b载体的酶切位点结构图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式中所述的Ethanologenbacterium hit B49L-乳酸脱氢酶基因Bldh是以本实验室分离到的高效产氢菌Ethanologenbacterium hit B49的DNA为模板，通过PCR扩增获得的。其具体方法如下：

1、乳酸脱氢酶基因的克隆

(1)PCR引物的设计：

根据GenBank中收录的细菌乳酸脱氢酶蛋白质序列(具体菌种见表1)，采用软件Genefisher(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefishe/)设计一对PCR扩增简并引物P₁和P₂，引物P₁和P₂的序列见表2：

表1设计乳酸脱氢酶基因简并引物所用乳酸脱氢酶蛋白质的菌种

乳酸脱氢酶蛋白质	菌种
		L-乳酸脱氢酶	Clostridium acetobutylicum CAC0267
L-乳酸脱氢酶	Clostridium acetobutylicum CAC3552
		L-乳酸脱氢酶	Clostridium perfringens CPE0103
L-乳酸脱氢酶	Clostridium tetani E88 CTC01998

L-乳酸脱氢酶	Clostridium thermocellum
		L-乳酸脱氢酶	Thermoanaerobaeter saccharolyticum

表2.Genefisher软件设计的扩增乳酸脱氢酶的简并引物

引物名称	引物序列	简并度
			P<sub>1</sub>：LDHJ1-forward(5’端引物)	5’-CNRANGGNGARGCNHTGGA-3’	3072
P<sub>2</sub>：LDHJ1-reverse(3’端引物)	5’-RBANACRTCNTTDATNCCRTA-3’	4608

N(A，C，T或G)R(A或G)H(非G)B(非A)D(非C)

(2)Ethanologenbacterium hit B49基因组的DNA的提取：

取Ethanologenbacterium hit B49菌液50mL，用上海华舜生物工程有限公司生产的华舜小量细菌基因组DNA抽提试剂盒(W6511)提取Ethanologenbacterium hit B49基因组的DNA，提取步骤参见小量细菌基因组DNA抽提试剂盒(W6511)使用操作手册。

(3)乳酸脱氢酶基因部分片段的PCR扩增：

以Ethanologenbacterium hit B49的DNA为模板进行PCR扩增。反应体系：5μL 1×Buffer，0.6mM dNTP，引物P₁和P₂各1.0μM，ExTaqDNA聚合酶2.5U，模板DNA0.2～1μg，加二次蒸馏水至50μL。PCR扩增程序：预变性95℃5min，94℃30s，从62℃开始每40s降低1℃降置50℃，72℃2min，循环12次；然后再按变性94℃30s，退火50℃40s，延伸72℃2min，循环23次；延伸72℃10min，最后4℃保存。

(4)PCR产物的克隆：

PCR产物用上海华舜生物工程有限公司生产的柱式华舜小量胶回收试剂盒(W5211，W5212)回收，回收步骤参见试剂盒操作手册。回收产物与pMD18-T克隆载体连接，因为pMD18-TVector是一种常用高效克隆PCR产物的专用载体，带有一段大肠杆菌lacZ的调控序列和N-端146个氨基酸的编码信息，若无外源基因插入，载体与大肠杆菌lacZ的C-端序列功能互补，即α互补，产生有完整活性的β-半乳糖苷酶；若有外源基因插入，则破坏了读码框，产生无α互补能力的肽段，所以在附加X-gal和IPTG的筛选培养基上白色菌落为带有重组质粒的细菌，蓝色菌落为带有重新环化载体的细菌。本实施方式中pMD18-T载体购自大连宝生物工程公司，pMD18-T质粒图谱及其酶切位点如图2和图3所示。回收产物与pMD18-T克隆载体连接：pMD18-T载体1μL(50ng)，PCR产物2μL(100～200ng)，Ligation Solution 5μL，加二次蒸馏水至10μL，16℃连接0.5～3h。然后连接产物用热激法转化E.ColiDH5α感受态细胞：a、取200μL感受态细胞，置于冰上，加入4μL连接产物，轻轻旋转混匀内容物；b、冰浴30min；c、42℃水浴中热激90s，勿摇动；d、冰浴2-3min；e、加入800μL无抗生素的LB培养基，混匀，在37℃200～250r/min的摇床振荡培养45-60min；f、室温离心5min，4000r/min，弃去900μL上清液，剩余菌体悬浮；g、将悬浮菌体涂布在附加50mg/L Amp、4μL IPTG和40μLX-gal的LB固体培养基上；h、平板于37℃正向放置至液体被吸收，然后倒置培养8～12h。最后在含有氨苄青霉素(Amp)、X-gal和IPTG的LB筛选平板上进行筛选，白色菌落初步认定为阳性重组子，并提取白斑菌落质粒进行菌落PCR，以鉴定阳性重组子。

其中，采用CaCl₂法制备E.coliDH5α感受态细胞：a、E.coliDH5α在LB平板上划线培养12-16h，挑取单菌落接入不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡活化8～12h；b、取活化的E.coliDH5α菌液1mL置于100mL新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.3±0.05；c、将菌液分装于两个预冷的50mL灭菌离心管中，冰浴30min；d、在4℃条件下离心10min，4000r/min，并弃上清液；e、加入10mL冰冷的0.1MCaCl₂，重悬菌体，冰浴30min；f、再在4℃条件下离心10min，4000r/min，并弃上清液；g、加入2mL冰冷的0.1MCaCl₂，重悬菌体，即得到E.coliDH5α感受态细胞。阳性重组子的菌落PCR鉴定通过以下步骤进行：首先挑取白斑菌落，利用通用引物RV-M和M13-47进行菌落PCR：预变性95℃10min，变性94℃30s，变性50℃30s，延伸72℃90s，共35个循环；延伸72℃10min，4℃保存；然后再进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，若电泳显示出目的DNA条带，则表明质粒重组正确，是阳性重组子。

(5)DNA序列测定与分析：

阳性重组子选用Invitrogen上海英俊生物技术有限公司自动序列分析仪进行序列测定，序列同源性比较在http://www.ncbi.nlm.gov网站上用BLAST程序进行。

(6)克隆L-乳酸脱氢酶基因部分片段两侧序列Cassette PCR的引物设计：

采用TaKaRa LA pCR^TM in vitro cloning Kit试剂盒克隆L-乳酸脱氢酶基因片段两侧序列。以已克隆的L-乳酸脱氢酶基因片段序列为基础，设计与试剂盒中Cassette primer C1、Cassette primer C2引物分别匹配的上游引物P₃、P₄和下游引物P₅、P₆。Cassette primer C1、Cassette primer C2、P₃、P₄、P₅、P₆的序列见表3。

表3.扩增乳酸脱氢酶基因部分片段两侧序列的Cassette PCR引物

引物名称	引物序列
		Cassette primer C1	5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA-3’
Cassette primer C2	5’-CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’
		P<sub>3</sub>：LDH-S11-lower	5’-CACATACAGGTTGTCCGGCTTTGC-3’
P<sub>4</sub>：LDH-S12-lower	5’-GCGACTATTTCAAGGTGGACCCGCGCAACGTG-3’
		P<sub>5</sub>：LDH-S21-upper	5’-TTGCAAAGCCGGACAACCTGTATGTGACGTAG-3’
P<sub>6</sub>：LDH-S22-upper	5’-CCCGCGTAGATTTTCATGTTGGTGC-3’

其中，Cassette PCR的原理和引物设计要求如下：

Cassette PCR原理：原理见图4。因为在设计上，Cassette的5′末端没有磷酸基，所以Target DNA的3′末端和Cassette的5′末端的连接部位形成缺口。在第一次PCR反应的第一个循环时，从Primer C1开始的延伸反应在连接部位终止，限制了Primer C1和Primer C1同一引物之间的扩增，从而控制了非特异性PCR扩增。只有从Primer S1开始延伸合成的DNA链，才能成为PrimerC1的模板，进行DNA的特异性扩增反应。再用内侧Primer(Primer C2，PrimerS2)进一步进行第二次PCR反应，可以高效特异性地扩增目的DNA。

当蛋白质的氨基酸序列已知时，可以根据已知信息设计Mixed primer，扩增编码蛋白质的cDNA。

根据本试剂盒工作原理一般操作步骤如下：

a、用适当的限制酶将待克隆的Target DNA完全分解；

b、与具有对应的限制酶酶切位点的Cassette进行连接反应；

c、用Cassette Primer(Primer C1)和根据已知区域的DNA序列设计的Primer(Primer S1)，进行第1次PCR(1st PCR)反应；

d、取1st PCR反应液的一部分作模板，使用内侧Primer(Primer C2和Primer S2)进行第2次PCR(2nd PCR)反应，特异性地扩增目的DNA片段。

Specific Primer(S1，S2)的设计标准：

根据已知区域设计Primer(见图5)。设计方向为需要扩增的未知区域的方向。S2的位置应设计在S1的内侧，两个引物间的距离没有严格的规定。

设计引物时还需要注意以下几点：

①引物长度为20～35mer(扩增长链DNA时最好为30～35mer)。

②GC含量在50％左右，避免局部GC或AT集中。特别是引物的3′端不要AT集中。

③引物自身不要形成发夹等明显的二级结构。

④两个Specific Primer(S1、S2)要与Cassette Primer(C1、C2)组合使用，所以设计时还要考虑不要与配对的引物形成引物二聚体，特别是3′端的3、4个碱基不要与配对的引物序列互补。

(7)克隆乳酸脱氢酶基因部分片段两侧序列的Cassette PCR扩增：

根据已克隆的L-乳酸脱氢酶基因片段序列，分析该序列的限制性内切酶位点情况，找出该序列没有的限制性内切酶，而TaKaRa LA PCR^TM in vitrocloning Kit试剂盒中有该酶接头的限制性内切酶，最后选定HindIII酶切基因组DNA，酶切后的基因组DNA和HindIII于16℃连接3h。Cassette PCR反应体系和反应条件如下：

a、DNA的限制酶酶切反应：反应体系见表4

表4DNA的限制酶酶切反应体系

DNA	5μg
		HindIII限制酶	50U*
10×限制酶Buffer	5μL
		灭菌蒸馏水	up to 50μL

*表示使DNA完全分解的必要酶量，根据制备的DNA纯度而定，一般10U分解1μg DNA。

b、连接反应

①按表5中组份配制连接反应液。按下列组份配制连接反应液。

表5

DNA    片段	5μL
		HindIII Cassette接头	2.5μL
Ligation Solution I	15μL
		Ligation Solution II	7.5μL

②16℃反应30min

③反应结束后，进行乙醇沉淀回收DNA。

④溶解于5μL的灭菌蒸馏水中。

c、PCR扩增

①将b-④DNA溶液1μL加入到33.5μL灭菌蒸馏水中，94℃加热10min。

②按表6中组份配制第一次PCR(1st PCR)反应液。

表6

c-①的DNA溶液	34.5μL
		10×LA PCR Buffer II(Mg<sup>2+</sup>plus)	5μL
TaKaRa LA Taq	0.5μL
		dNTP Mixture	8μL
Primer C1	1μL
		Primer CS-1	1μL

③进行1st PCR反应：变性94℃30s，退火55℃2min，延伸72℃1min，循环30次。

④用灭菌水将b-③的PCR反应液稀释(1～10000倍稀释)，再取1μL进行2nd PCR反应，2nd PCR反应液组份如表7。

表72nd PCR反应液组份

b-④的1st PCR反应液(或稀释液)	1μL
		10×LA PCR Buffer II(Mg<sup>2+</sup>plus)	5μL
TaKaRa LA Taq	0.5μL
		dNTP Mixture	8μL
Primer C2	1μL
		Primer CS-2	1μL
灭菌蒸馏水	up to 50μL

⑤进行2nd PCR反应：变性94℃30s，退火55℃2min，延伸72℃1min，循环30次。

⑥反应结束后，取2nd PCR反应液(5～10μL)进行琼脂糖凝胶电泳，得到扩增目的PCR片段。

(8)乳酸脱氢酶全长基因的PCR扩增、克隆和测序：

根据已拼接的序列设计了全长验证引物P₇和P₈(P₇和P₈的序列见表8)，以Ethanologenbacterium hit B49基因组的DNA为模板扩增全长L-乳酸脱氢酶基因。PCR反应体系为预变性94℃5min；变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃80s，循环35次；最后72℃延伸10min。

表8乳酸脱氢酶基因全长验证引物P₇和P₈

引物名称	引物序列
		P<sub>7</sub>：LDH-upper	5’-GGATAATCTCCCCTGCCCGTGCGGATACTA-3’
P<sub>8</sub>：LDH-lower	5’-CATCAACACCTCACAGACAAAGATCGGCCATT-3’

(9)乳酸脱氢酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)plys中表达及检测

乳酸脱氢酶基因Bldh与原核表达载体pet-22b重组，构建成重组表达质粒pet-22b-Bldh，热激法转化到原核表达宿主菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，1.0mM IPTG诱导3.5h后，经12％的SDS-PAGE凝胶电泳、考马斯亮蓝染色检测基因的表达情况。pet-22b载体购于Novagen公司，其质粒图谱及酶切位点见图6和图7。根据pet-22b表达载体的多克隆位点序列，在乳酸脱氢酶基因的109bp(起始密码子ATG)处引入NdeI酶切位点，在1057bp(终止密码子TAA)处引入XhoI酶切位点，引物P₉、P₁₀的序列见表9。PCR反应条件：预变性95℃5min；变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃80s，循环35次；最后延伸72℃10min。胶回收PCR产物，经NdeI和XhoI酶切，在胶回收，与同样用NdeI和XhoI酶切且胶回收的pet-22b原核表达载体于16℃连接3h。将该连接产物转化E.ColiDH5α感受态细胞。在含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB筛选平板上进行蓝白斑筛选，并提取白斑菌落质粒进行菌落PCR以鉴定阳性重组子。提取阳性克隆质粒，将该质粒转化BL21(DE3)plys感受态细胞。在含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB筛选平板上进行蓝白斑筛选，并提取白斑菌落质粒进行菌落PCR以鉴定阳性重组子。

表9乳酶脱氢酶基因表达用引物P₉、P₁₀

引物名称	引物序列	引入酶切位点
			P<sub>9</sub>：LDH-22b-forward	5’-AAAAGGAGCGATCCATATGTGCACCGACAACCGC-3’	Nde I
P<sub>10</sub>：LDH-22b-reverse	5’-GTTAATCTAGAAAATGTCAACCCGGAGACGGCCTGCTCCAG-3’	xho I

2、Ethanologenbacterium hit B49乳酸脱氢酶活力测定

a、试剂

①分离缓冲液：0.05mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液；

②反应缓冲液：0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液；12mmol/L NADH，Sigma公司产品；0.16mol/L丙酮酸钠，国产分析纯。

b、测定方法

在25℃、紫外光波长340nm的条件下，向测定比色皿中依次加入反应缓冲液1.06mL，稀释酶液0.015mL，NADH0.03mL；另取一比色皿为对照管，其中加入反应缓冲液和酶液，抽打混匀。记录测定管中初始NADH的吸光度值为A1，然后向测定管中准确加入丙酮酸钠0.03mL启动反应，设定时间扫描程序为每0.5min记录1次A值，连续测定3min并记做A₂。以A的OD₃₄₀值对时间作图，计算ΔA减少值(A₁-A₂)，并计算酶的活力。

c、蛋白质含量测定

采用上海华舜生物工程有限公司BCA蛋白质含量测定试剂盒，步骤参见BCA蛋白质含量测定试剂盒操作手册。

d、酶活单位的定义(U)：在25℃、pH7.0条件下，1min氧化1μmol NADH的酶量为1U。

本实施方式测定L-乳酸脱氢酶比活为7.8。

本实施方式中的Ethanologenbacterium hit B49乳酸脱氢酶基因Bldh是L型乳酸脱氢酶，序列的Blast同源性比对结果显示该基因与GenBank中已注册的序列存在较大差异，是一个新的基因。该基因全长1139bp，其中T、C、G、A分别为227bp(20％)、336bp(29％)、337bp(30％)、239bp(21％)。在109bp处有起始密码子ATG，在1057bp处有终止密码子TAA。该序列无内含子，具有951bp完整的开放读码框，编码316个氨基酸。编码产物分子量为34.233kD，等电点pI为6.34。

                    序列表

<110>哈尔滨工业大学

<120>一种L-乳酸脱氢酶基因及其编码的氨基酸序列和制备过程中设计的引物

<160>12

<210>1

<211>1139

<212>DNA

<213>产乙醇杆菌属(Ethanologenbacterium ssp.)

<220>

<221>CDS

<222>(109)...(1059)

<400>1

ggataatctc ccctgcccgt gcggatacta aggcgtgtgc acagccgggc gggaggcaca 60

cgcgattcgt attgatttga caacaaccaa acaaaaggag cgatcttt atg tgc acc gac 120

                                                     Met Cys Thr Asp

                                                      1

aac cgc aaa gtc gtg ctg gta ggc acc gga ctg gtg ggc atg agt ttt 168

Asn Arg Lys Val Val Leu Val Gly Thr Gly Leu Val Gly Met Ser Phe

5                   10                  15                  20

gcc tac gcc ctg ctc aac cag cac gca tgt gac gaa ctg gtc ctc att 216

Ala Tyr Ala Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Asp Glu Leu Val Leu Ile

                25                  30                  35

gat atc aac aaa cag cgt gct gag ggt gag gcg atg gac ctc aac cat 264

Asp Ile Asn Lys Gln Arg Ala Glu Gly Glu Ala Met Asp Leu Asn His

            40                  45                  50

ggt ctg gcg ttt tcc ggc acc aac atg aaa atc tac gcg ggc gat tac 312

Gly Leu Ala Phe Ser Gly Thr Asn Met Lys Ile Tyr Ala Gly Asp Tyr

        55                  60                  65

aag gac tgc gcc gac gcc gac atc gtg gcc atc tgc gcg ggc gtg gcg 360

Lys Asp Cys Ala Asp Ala Asp Ile Val Ala Ile Cys Ala Gly Val Ala

    70                  75                  80

cag aaa ccg ggc gag agc cgg atg gat ctg ctg cag cgc aac acc gcc 408

Gln Lys Pro Gly Glu Ser Arg Met Asp Leu Leu Gln Arg Asn Thr Ala

85                  90                  95                  100

gtg ttc aaa tcc atc gtg gag ccg gtg gtg gct tcg gga ttt tcc ggc 456

Val Phe Lys Ser Ile Val Glu Pro Val Val Ala Ser Gly Phe Ser Gly

                105                 110                 115

gtg ttt ctt gtg gcc acc aat ccg gtg gac atc atg tcc tac gtc aca 504

Val Phe Leu Val Ala Thr Asn Pro Val Asp Ile Met Ser Tyr Val Thr

            120                 125                 130

tac agg ttg tcc ggc ttt gca aaa ggc cgc atc gtg ggc acc ggc acc 552

Tyr Arg Leu Ser Gly Phe Ala Lys Gly Ary Ile Val Gly Thr Gly Thr

        135                 140                 145

acg ctg gac acc gcc cgc ctg cgc tac ctg ctg ggc gac tat ttc aag 600

Thr Leu Asp Thr Ala Arg Leu Arg Tyr Leu Leu Gly Asp Tyr Phe Lys

    150                 155                 160

gtg gac ccg cgc aac gtg cat gct tat gtg atg ggc gag cac ggc gac 648

Val Asp Pro Arg Asn Val His Ala Tyr Val Met Gly Glu His Gly Asp

165                 170                 175                 180

agt gag ttt gtg ccg tgg tcg cag gcg ctt ata gcc acc cgc ccg gtg 696

Ser Glu Phe Val Pro Trp Ser Gln Ala Leu Ile Ala Thr Arg Pro Val

                185                 190                 195

atg ggg ctt tgc gtg gaa aac cac ggc ccg gac tat aaa gcc ggc atg 744

Met Gly Leu Cys Val Glu Asn His Gly Pro Asp Tyr Lys Ala Gly Met

            200                 205                 210

ctc cac atc ggt gag gaa gtc cgc acc gct gcc tac cgc atc atc gaa 792

Leu His Ile Gly Glu Glu Val Arg Thr Ala Ala Tyr Arg Ile Ile Glu

        215                 220                 225

gcc aaa aaa gcc acc tat tac ggg atc ggc atg gcc atg gtg cgc gtg 840

Ala Lys Lys Ala Thr Tyr Tyr Gly Ile Gly Met Ala Met Val Arg Val

    230                 235                 240

gcc cgc gcc att ctc ggc ggc gaa aac agc gtg ctc acc gtt tcc tcg 888

Ala Arg Ala Ile Leu Gly Gly Glu Asn Ser Val Leu Thr Val Ser Ser

245                 250                 255                 260

ctg ctc gac gac gac tac ggc acc ccc aag gtc tat gcc ggc gtg ccg 936

Leu Leu Asp Asp Asp Tyr Gly Thr Pro Lys Val Tyr Ala Gly Val Pro

                265                 270                     275

tcc atc gtc agc cgg cgg ggc gtc agc cgt atc att cgg ctt tcg ctc 984

Ser Ile Val Ser Arg Arg Gly Val Ser Arg Ile Ile Arg Leu Ser Leu

            280                 285                     290

aca ccg gaa gaa aat cag ctg atg caa gat tcc tgt gcc aaa ctg gag 1032

Thr Pro Glu Glu Asn Gln Leu Met Gln Asp Ser Cys Ala Lys Leu Glu

        295                 300                     305

cag gcc gtc tcc ggg ttg aca ttt taa caatggccga tctttgtctg 1079

Gln Ala Val Ser Gly Leu Thr Phe

    310                 315

tgaggtgttg atgatgaaac tgttcgaacc gttcaacatc cgggagctca cggagctcac 1139

<210>2

<211>316

<212>PRT

<213>产乙醇杆菌属(Ethanologenbacterium ssp.)

<400>2

Met Cys Thr Asp Asn Arg Lys Val Val Leu Val Gly Thr Gly Leu Val

                15                  10                  15

Gly Met Ser Phe Ala Tyr Ala Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Asp Glu

            20                  25                  30

Leu Val Leu Ile Asp Ile Asn Lys Gln Arg Ala Glu Gly Glu Ala Met

        35                  40                  45

Asp Leu Asn His Gly Leu Ala Phe Ser Gly Thr Asn Met Lys Ile Tyr

    50                  55                  60

Ala Gly Asp Tyr Lys Asp Cys Ala Asp Ala Asp Ile Val Ala Ile Cys

65                  70                  75                  80

Ala Gly Val Ala Gln Lys Pro Gly Glu Ser Arg Met Asp Leu Leu Gln

                85                  90                  95

Arg Asn Thr Ala Val Phe Lys Ser Ile Val Glu Pro Val Val Ala Ser

            100                 105                 110

Gly Phe Ser Gly Val Phe Leu Val Ala Thr Asn Pro Val Asp Ile Met

        115                 120                 125

Ser Tyr Val Thr Tyr Arg Leu Ser Gly Phe Ala Lys Gly Arg Ile Val

    130                 135                 140

Gly Thr Gly Thr Thr Leu Asp Thr Ala Arg Leu Arg Tyr Leu Leu Gly

145                 150                 155                 160

Asp Tyr Phe Lys Val Asp Pro Arg Asn Val His Ala Tyr Val Met Gly

                165                  170                175

Glu His Gly Asp Ser Glu Phe Val Pro Trp Ser Gln Ala Leu Ile Ala

            180                 185                 190

Thr Arg Pro Val Met Gly Leu Cys Val Glu Asn His Gly Pro Asp Tyr

        195                 200                 205

Lys Ala Gly Met Leu His Ile Gly Glu Glu Val Arg Thr Ala Ala Tyr

    210                 215                 220

Arg Ile Ile Glu Ala Lys Lys Ala Thr Tyr Tyr Gly Ile Gly Met Ala

225                 230                 235                 240

Met Val Arg Val Ala Arg Ala Ile Leu Gly Gly Glu Asn Ser Val Leu

                245                 250                 255

Thr Val Ser Ser Leu Leu Asp Asp Asp Tyr Gly Thr Pro Lys Val Tyr

            260                 265                 270

Ala Gly Val Pro Ser Ile Val Ser Arg Arg Gly Val Ser Arg Ile Ile

        275                 280                 285

Arg Leu Ser Leu Thr Pro Glu Glu Asn Gln Leu Met Gln Asp Ser Cys

    290                  295                300

Ala Lys Leu Glu Gln Ala Val Ser Gly Leu Thr Phe

305                 310                  315

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(3，4，6，9，12，15，16)

<223>n＝a或g或c或t；r＝a或g；h＝a或c或t

<400>3

gcnranggng argcnhtgga 20

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1，2，4，7，10，13，16，19)

<223>n＝a或g或c或t；r＝a或g；b＝g或c或t；d＝a或g或t

<400>4

rbanacrtcn ttdatnccrt a 21

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据Cassette primer C1引物而设计，以用作与Cassette primer C1引物匹配的

上游引物

<400>5

cacatacagg ttgtccggct ttgc 24

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据Cassette primer C1引物而设计，以用作与Cassette primer C1引物匹配的

上游引物

<400>6

gcgactattt caaggtggac ccgcgcaacg tg 32

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据Cassette primer C2引物而设计，以用作与Cassette primer C2引物匹配的

下游引物

<400>7

ttgcaaagcc ggacaacctg tatgtgacgt ag 32

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据Cassette primer C2引物而设计，以用作与Cassette primer C2引物匹配的

下游引物

<400>8

cccgcgtaga ttttcatgtt ggtgc 25

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据已拼接的序列而设计，以用作全长验证引物

<400>9

ggataatctc ccctgcccgt gcggatacta 30

<210>10

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据已拼接的序列而设计，以用作全长验证引物

<400>10

catcaacacc tcacagacaa agatcggcca tt 32

<210>11

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据pet-22b表达载体的多克隆位点序列而设计，以用作基因表达引物

<400>11

aaaaggagcg atccatatgt gcaccgacaa ccgc 34

<210>12

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据pet-22b表达载体的多克隆位点序列而设计，以用作基因表达引物

<400>12

gttaatctag aaaatgtcaa cccggagacg gcctgctcca g 41

Claims (2)

1.一种L-乳酸脱氢酶基因，其特征是L-乳酸脱氢酶的基因序列如下所示：

GGATAATCTCCCCTGCCCGTGCGGATACTAAGGCGTGTGCACAGCCGGGCGGGAGGCACACGCGAT

TCGTATTGATTTGACAACAACCAAACAAAAGGAGCGATCTTTATGTGCACCGACAACCGCAAAGTC

GTGCTGGTAGGCACCGGACTGGTGGGCATGAGTTTTGCCTACGCCCTGCTCAACCAGCACGCATGT

GACGAACTGGTCCTCATTGATATCAACAAACAGCGTGCTGAGGGTGAGGCGATGGACCTCAACCAT

GGTCTGGCGTTTTCCGGCACCAACATGAAAATCTACGCGGGCGATTACAAGGACTGCGCCGACGCC

GACATCGTGGCCATCTGCGCGGGCGTGGCGCAGAAACCGGGCGAGAGCCGGATGGATCTGCTGCAG

CGCAACACCGCCGTGTTCAAATCCATCGTGGAGCCGGTGGTGGCTTCGGGATTTTCCGGCGTGTTT

CTTGTGGCCACCAATCCGGTGGACATCATGTCCTACGTCACATACAGGTTGTCCGGCTTTGCAAAA

GGCCGCATCGTGGGCACCGGCACCACGCTGGACACCGCCCGCCTGCGCTACCTGCTGGGCGACTAT

TTCAAGGTGGACCCGCGCAACGTGCATGCTTATGTGATGGGCGAGCACGGCGACAGTGAGTTTGTG

CCGTGGTCGCAGGCGCTTATAGCCACCCGCCCGGTGATGGGGCTTTGCGTGGAAAACCACGGCCCG

GACTATAAAGCCGGCATGCTCCACATCGGTGAGGAAGTCCGCACCGCTGCCTACCGCATCATCGAA

GCCAAAAAAGCCACCTATTACGGGATCGGCATGGCCATGGTGCGCGTGGCCCGCGCCATTCTCGGC

GGCGAAAACAGCGTGCTCACCGTTTCCTCGCTGCTCGACGACGACTACGGCACCCCCAAGGTCTAT

GCCGGCGTGCCGTCCATCGTCAGCCGGCGGGGCGTCAGCCGTATCATTCGGCTTTCGCTCACACCG

GAAGAAAATCAGCTGATGCAAGATTCCTGTGCCAAACTGGAGCAGGCCGTCTCCGGGTTGACATTT

TAACAATGGCCGATCTTTGTCTGTGAGGTGTTGATGATGAAACTGTTCGAACCGTTCAACATCCGG

GAGCTCACGGAGCTCAC。

2.一种L-乳酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列，其特征是L-乳酸脱氢酶基因所编码的氨基酸序列如下所示：

MetCysThrAspAsnArgLysValValLeuValGlyThrGlyLeuValGlyMetSerPheAlaTyr

AlaLeuLeuAsnGlnHisAlaCysAspGluLeuValLeuIleAspIleAsnLysGlnArgAlaGlu

GlyGluAlaMetAspLeuAsnHisGlyLeuAlaPheSerGlyThrAsnMetLysIleTyrAlaGly

AspTyrLysAspCysAlaAspAlaAspIleValAlaIleCysAlaGlyValAlaGlnLysProGly

GluSerArgMetAspLeuLeuGlnArgAsnThrAlaValPheLysSerIleValGluProValVal

AlaSerGlyPheSerGlyValPheLeuValAlaThrAsnProValAspIleMetSerTyrValThr

TyrArgLeuSerGlyPheAlaLysGlyArgIleValGlyThrGlyThrThrLeuAspThrAlaArg

LeuArgTyrLeuLeuGlyAspTyrPheLysValAspProArgAsnValHisAlaTyrValMetGly

GluHisGlyAspSerGluPheValProTrpSerGlnAlaLeuIleAlaThrArgProValMetGly

LeuCysValGluAsnHisGlyProAspTyrLysAlaGlyMetLeuHisIleGlyGluGluValArg

ThrAlaAlaTyrArgIleIleGluAlaLysLysAlaThrTyrTyrGlyIleGlyMetAlaMetVal

ArgValAlaArgAlaIleLeuGlyGlyGluAsnSerValLeuThrValSerSerLeuLeuAspAsp

AspTyrGlyThrProLysValTyrAlaGlyValProSerIleValSerArgArgGlyValSerArg

IleIleArgLeuSerLeuThrProGluGluAsnGlnLeuMetGlnAspSerCysAlaLysLeuGlu

GlnAlaValSerGlyLeuThrPhe。

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