CN102146123A - 氧化葡糖杆菌吡咯喹啉醌合成蛋白系统及其编码的基因簇 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种吡咯喹啉醌合成基因簇及其编码蛋白系统，其由1)由SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11所示的蛋白质组成；或由2)在EQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质组成。本发明同时提供编码上述蛋白系统的基因簇，其序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的吡咯喹啉醌合成基因簇及其编码蛋白系统将在PQQ生物合成、改良和构建PQQ生产菌株、提高小菌糖酸转化效率以及构建醇糖酸一步转化工程菌中起到重要作用。

Description

氧化葡糖杆菌吡咯喹啉醌合成蛋白系统及其编码的基因簇

技术领域

本发明涉及一种新的吡咯喹啉醌合成基因簇及其编码蛋白系统。

背景技术

维生素C(vatamin C，Vc)是一种水溶性维生素，又称L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)，能参与体内多种羟化反应和氧化还原反应，是一种重要的细胞代谢氧化还原化合物，在人体中起着必不可少的生理作用，在医药、化妆品、食品和饲料等诸多领域应用广泛。随着人们生活水平的提高和对维生素C用途的不断开发，维生素C的市场需求日益增大。

早期维生素C的生产主要采用“莱氏法”化学合成(Helvetica chimica Acta，第17卷，311页，1934年)。该法产品质量好，转化效率高，但工艺复杂，环境污染严重，已逐渐被微生物转化法取代。其中我国尹光琳等上世纪八十年代开发的“二步发酵法”是目前维生素C工业化大规模生产的主要生产路线(美国专利4935359，1990年)。该法第一步利用生黑醋杆菌将D-山梨醇转化为L-山梨糖，第二步是在混合菌系的作用下将山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸。混合菌系包括两种微生物，直接负责山梨糖生物氧化的微生物俗称小菌，原来命名为氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)，2000年经系统分类学鉴定重新命名为普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)(Urbance JW et al.，2001)；另一种微生物俗称大菌，生产中多采用芽孢杆菌，其自身不能转化山梨糖，作为伴生菌起辅助小菌生长和产生的作用。

小菌中山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸由山梨糖脱氢酶(sorbose dehydrogenase，SDH)负责，迄今为止已在小菌基因组中发现四种山梨糖脱氢酶基因，其编码的山梨糖脱氢酶均为定位于细菌周质的脱氢酶，也都是依赖吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)作为辅酶的醌酶。小菌中将山梨酮糖转化为酮古龙酸的一种山梨酮脱氢酶(sorbsone dehydrogenase，SNDH)以及将山梨醇转化为山梨糖的山梨醇脱氢酶(sobitol dehydrogenase，SLDH)也都是以PQQ为辅酶。这些醌酶在小菌体内催化底物，发挥正常生理功能需要结合辅酶PQQ。

PQQ的生物合成涉及4-7个基因(pqqA，B，C，D，E，F，G)，这些基因在染色体上一般成簇排列。有的pqq基因连续排列成1个基因簇，如肺炎克雷伯氏菌为pqqABCDEF；而有的则分布在2个基因簇中，如在扭脱甲基杆菌中有2个簇，一个为pqqABCDE，另一个为pqqFG。有的pqq基因与依赖PQQ的脱氢酶基因相邻。不同细菌的PQQ合成基因序列具有一定的保守性。除了已经确证pqqA编码多肽为PQQ合成前体以及pqqC是催化PQQ合成反应中最后一步反应的酶以外，其他基因的功能目前还不是很清楚。

发明内容

本发明的目的是提供一种吡咯喹啉醌合成的蛋白系统及其所编码的基因簇和其应用。

本发明所提供的吡咯喹啉醌合成基因，来源于氧化葡糖杆菌1.110(购自中国普通微生物菌种保存管理中心)，具有下述核苷酸序列：

SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，由3248个碱基组成。该序列包含5个PQQ合成基因pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE，组成一个pqqABCDE基因簇。其中第1-93位碱基为pqqA基因序列NO.2，编码蛋白序列为NO.3。第253-1014位碱基为pqqB基因序列NO.4，编码蛋白序列为NO.5。第1011-1775位碱基为pqqC基因序列NO.6，编码蛋白序列为NO.7。第1775-2080位碱基为pqqD基因序列NO.8，编码蛋白序列为NO.9。第2073-3248位碱基为pqqE基因序列NO.10，编码蛋白序列为NO.11。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明吡咯喹啉醌合成的蛋白系统还包括由SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有同等活性的由SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11所示的蛋白质衍生的蛋白质组成。本发明提供的基因簇还包括编码上述蛋白的核酸序列。

此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

在pqqABCDE基因簇中，pqqA基因由单独的启动子控制，pqqBCDE组成一个操纵子。pqqB和pqqC基因编码区有4个碱基的重叠，pqqC和pqqD基因编码区有1个碱基的重叠，pqqD和pqqE基因编码区有8个碱基的重叠。

所述的氧化葡糖杆菌1.110PQQ合成基因簇与氧化葡糖杆菌621H的PQQ合成基因簇排列方式相同，两者的pqqABCDE基因序列核苷酸相同性为61.0％。其编码蛋白氨基酸相同性分别为pqqA60.7％，pqqB 49.0％，pqqC 64.2％，pqqD 35.8％，pqqE 51.0％。

大肠杆菌DH5α自身不能合成PQQ，也没有PQQ合成基因。通过PCR扩增得到氧化葡糖杆菌1.110的pqqABCDE基因簇，将该基因簇连入载体，优选的载体为本领域公知的用于表达外源基因的低拷贝载体，最为优选的是低拷贝载体pOK12(GenBank登录号：AF223639)，导入大肠杆菌DH5α中，表达得到吡咯喹啉醌合成相关蛋白，通过醌酶SDH活性DCIP法检测，能够检测到宿主菌PQQ的合成。

本发明还提供含有的PQQ合成基因的载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明的吡咯喹啉醌合成相关基因及其编码蛋白将在研究PQQ生物合成、改良和构建PQQ生产菌株、提高小菌糖酸转化效率以及构建醇糖酸一步转化工程菌中起到重要作用。

附图说明

图1为氧化葡糖杆菌1.110基因组DNA琼脂糖凝胶电泳。M：λ-HindIII分子量标准；1：氧化葡糖杆菌1.110基因组DNA。

图2为氧化葡糖杆菌1.110基因组中PQQ合成相关基因

图3为pqqABCDE基因簇PCR扩增。M：DL5000分子量标准；1，2：pqqABCDE扩增产物

图4为质粒pOK12-pqqABCDE的酶切PCR鉴定。M：λ-Hind III分子量标准；1：质粒pOK12-pqqABCDE的双酶切。

图5为pOK12-pqqABCDE/DH5α的活性检测。1：阴性对照pOK12/DH5α；2：SDH+PQQ；3：SDH；4：PQQ；5：SDH+pOK12-pqqABCDE/DH5α裂解液；6：SDH+pOK12-pqqABCDE/DH5α上清液；7：pOK12-pqqABCDE/DH5α裂解液。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1氧化葡糖杆菌1.110基因组DNA的提取

挑取氧化葡糖杆菌1.110单菌落，接种到5mL的HJY液体培养基(1L培养基含15g山梨糖，3g酵母膏，3g玉米浆，15g蛋白胨，4g尿素，2g葡萄糖，0.2g MgSO₄·12H₂O，4g CaCO₃，5gKH₂PO₄，pH 6.8)试管中，200r/min、30℃培养活化48h。按1％的体积比例接种到500mL HJY培养基中，200r/min，30℃培养48h。根据文献进行微生物基因组提取(《精编分子生物学实验指南》F.奥斯伯、R.布伦特、R.E.金斯顿著，颜子颍、王海林译。2.4(39～40))。基因组DNA要求OD值在1.8～2.0之间；样品浓度＞100ng/μL(图1)。

实施例2氧化葡糖杆菌1.110基因组测序

氧化葡糖杆菌1.110经SOLEXA测序，总读长221Mbp，基因组的覆盖率达到了67.2倍。氧化葡糖杆菌1.110基因组大小总计为3,288,404bp，G+C含量为61.76％。使用Glimmer 3.0进行细菌基因组的基因预测，预测有3359个编码框，编码区百分比为91.12％。基因组中发现有59个tRNA和5个rRNA操纵元。

实施例3氧化葡糖杆菌1.110基因组注释中的PQQ合成基因

根据氧化葡糖杆菌1.110全基因组测定序列，经Glimmer 3.0软件基因预测，同COG、KEGG、SWISSPROT、TrEMBL数据库比对并进行基因注释，并进行人工校正。发现氧化葡糖杆菌1.110基因组中PQQ合成基因pqqABCDE，成基因簇排列(图2)。

实施例4氧化葡糖杆菌1.110基因组PQQ合成基因的PCR扩增

根据氧化葡糖杆菌1.110全基因组注释的PQQ合成基因序列设计引物(P1：5’-CG GGATCC TGCATCGAACACCAGAACA-3’BamHI，P2：5’-GG CATATG CGCAAAAGCTGACCAACCT-3’Nde I)，以提取的氧化葡糖杆菌1.110基因组DNA为模板，扩增得到了PQQ合成基因序列pqqABCDE(图3)。

实施例5pqqABCDE基因簇导入大肠杆菌中指导PQQ合成

PCR扩增得到的pqqABCDE基因经BamHⅠ和NdeⅠ双酶切，插入载体pOK12对应酶切位点，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得携带完整结构基因的重组表达质粒pOK12-pqqABCDE。重组质粒经双酶切鉴定和测序鉴定正确(图4)。挑单菌落于LB液体培养基，37℃、220r/min培养12h后，转接于LB液体培养基；37℃、220r/min培养12h，收集1mL菌体，重悬于600L 20mmol/L pH＝8.0Tris-HCl缓冲液中，冰浴超声处理，低温离心，上清液用于酶活性检测。利用DCIP法检测活性，取20L菌体超声裂解液、10L SDH(sorbose dehydrogenase，山梨糖脱氢酶)(60mg/L)、500L DCIP检测液、混合后观察颜色变化。上述药品可以市售获得。

结果如图5所示，将pOK12-pqqABCDE/DH5α菌体裂解后，检测样品的PQQ活性，出现了特异性的检测液褪色。阳性对照及表达样品加入检测液后，检测液立即由绿色变为黄色，说明pOK12-pqqABCDE质粒转入大肠杆菌DH5α后，能够指导PQQ的合成，PQQ的合成量为100μg/mL左右。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.吡咯喹啉醌合成的蛋白系统，其由

1)由SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11所示的蛋白质组成；或由

2)在EQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质组成。

2.编码权利要求1所述蛋白系统的基因簇。

3.根据权利要求2所述的基因簇，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，共有5个基因，具体为：pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE。

4.含有权利要求2或3所述的基因簇的细胞系。

5.含有权利要求2或3所述的基因簇的表达载体。

6.含有权利要求5所述的表达载体的宿主细胞。

7.权利要求2或3所述基因簇在生产吡咯喹啉中的应用。

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