DE60128927T2

DE60128927T2 - Stereoselektive esterase aus aspergillus oryzae

Info

Publication number: DE60128927T2
Application number: DE60128927T
Authority: DE
Inventors: Peter Rahbek Østergaard; Carsten M. Hjort; Heinz-Josef Deussen; Magali Zundel; Soren Ebdrup; Søren CHRISTENSEN; Shamkant Anant Patkar
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2000-08-07
Filing date: 2001-07-19
Publication date: 2008-02-14
Anticipated expiration: 2021-07-20
Also published as: DE60128927D1; ATE364691T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Esterase, Verfahren zu deren Verwendung und Herstellung und eine Nucleinsäuresequenz, die sie kodiert. Die Esterase ist dazu in der Lage, chirale Ester und Ferulasäureester stereoselektiv zu hydrolysieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist bekannt, chirale Ester von hoher optischer Reinheit durch asymmetrische Hydrolyse mit Enzymen herzustellen. Somit offenbart die US 4587462 die asymmetrische Hydrolyse von Niederalkylestern von Naproxen mit einem mikrobiellen Enzym, insbesondere einer speziellen Spaltesterase aus Aspergillus oryzae 2808 DSM (ATCC 11492). US 5155028 offenbart die enzymatische stereoselektive Esterspaltung unter Verwendung von Lipasen, Esterasen oder Proteasen, z.B. Lipasen oder Esterasen aus Aspergillus oder Proteasen aus Aspergillus oryzae. JP 7-206756 A offenbart die Verwendung eines Enzyms, um optisch aktive Verbindungen herzustellen. Das Enzym kann eine Protease oder eine Esterase sein, die von Aspergillus produziert wird, z.B. Aspergillus oryzae.
Enzyme mit Ferulasäureesteraseaktivität sind bekannt, z.B. aus Aspergillus oryzae, M. Tenkanen, Biotechnology and Applied Biochemistry, 27 (1), 19-24 (1998)), M. Tenkanen et al., J. Biotechnol., 18(1-2), 69-84 (1991).
US 5516679 offenbart eine Penicillin-V-Amidohydrolase aus Fusarium oxysporum.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder habe eine Esterase aus Aspergillus oryzae isoliert, die dazu in der Lage ist, chirale Ester stereoselektiv zu hydrolysieren und auch eine Arylesteraseaktivität (EC 3.1.1.2) und Feruloylesteraseaktivität (EC 3.1.1.73) besitzt. Die neue Esterase weist nur eine begrenzte Homologie mit bekannten Aminosäuresequenzen auf. Die Erfinder haben auch ein Gen isoliert, das die neue Esterase kodiert und es in einen E.coli-Stamm kloniert.
Dementsprechend stellt die Erfindung eine Esterase bereit, die dazu in der Lage ist, substituierte Ester der 3-Phenyl-propansäure stereoselektiv zu hydrolysieren. Die Esterase kann ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz wie das reife Peptid sein, das in SEQ ID NO: 2 dargestellt ist.
Weiterhin kann die Esterase der Erfindung ein Polypeptid sein, das durch den Esterasekodierenden Teil der DNA-Sequenz kodiert wird, die in ein Plasmid kloniert ist, das in E. coli vorliegt, das unter der Nummer DSM 13977 hinterlegt ist.
Die Esterase kann auch ein Analogon des vorstehend definierten Peptides sein, das

i) mindestens 50 % Identität mit dem Polypeptid aufweist,
ii) immunologisch mit einem Antikörper reaktiv ist, der gegen das Polypeptid in gereinigter Form gebildet wird,
iii) eine allelische Variante des Polypeptides.

Schließlich kann die Esterase der Erfindung ein Polypeptid sein, das von einer Nucleinsäuresequenz kodiert wird, die bei 60 °C, 2 x SSC, 0,5 % SDS mit dem komplementären Strang der Nucleotide 572-911 und 971-2208 der SEQ ID NO: 1 oder einer Subsequenz davon mit mindestens 100 Nucleotiden hybridisiert.
Die Nucleinsäuresequenz der Erfindung kann eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die die vorstehend beschriebene Esterase kodiert, oder sie kann eine Esterase kodieren und umfassen:

a) den Esterase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in ein Plasmid kloniert ist, das in Escherichia coli DSM 13977 vorliegt,
b) Nucleotide 629-911 und 971-2208 der SEQ ID NO: 1 (die das reife Polypeptid kodiert), oder
c) ein Analogon der in a) oder b) definierten Sequenz, die eine Esterase kodiert, die dazu in der Lage ist, stereoselektiv einen substituierten Ester der 3-Phenyl-propansäure zu hydrolysieren und
i) mindestens 60 % Identität mit der DNA-Sequenz aufweist, oder
ii) bei 60 °C, 2 x SSC, 0,5 % SDS mit der komplementären Sequenz der DNA-Sequenz hybridisiert.

Andere Aspekte der Erfindung stellen einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der die DNA-Sequenz umfasst, und eine Zelle, die mit der DNA-Sequenz oder dem rekombinanten Expressionsvektor transformiert ist, bereit.
Ein Vergleich mit der Sequenz in voller Länge des Standes der Technik zeigt, dass die nächste bekannte Sequenz eine Penicillin-V-Amidohydrolyse aus Fusarium oxysporum ( US 5516679 ) ist. Die reife Aminosäuresequenz der Erfindung weist 48 % Identität mit der bekannten Sequenz auf, und die entsprechende DNA-Sequenz weist 54 % Identität auf.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUR
1 zeigt eine Restriktionskarte des Esteraseexpressions-Plasmids pCaHj585.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Genomische DNA-Quelle
Die Esterase der Erfindung kann aus dem Stamm Aspergillus, insbesondere den Stämmen von A. oryzae, stammen, wobei Sonden verwendet werden, die auf der Basis der DNA-Sequenz der Beschreibung konstruiert wurden.
Ein Stamm von Escherichia coli, der ein Gen enthält, das die Esterase kodiert, wurde von den Erfindern unter den Bedingungen der Budapester Vertrages bei der DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, DE am 11. Januar 2001 unter der Zugangsnummer DSM 13977 hinterlegt.
Rekombinanter Expressionsvektor
Der Expressionsvektor der Erfindung umfasst typischerweise Kontrollsequenzen, die einen Promotor, einen Operator, eine Ribosomenbindungsstelle, ein Translationsinitiationssignal und ggf. einen selektierbaren Marker, einen Transkriptionsterminator, ein Regressorgen oder verschiedene Aktivatorgene kodiert. Der Vektor kann ein autonom replizierender Vektor sein, oder er kann in das Genom der Wirtszelle integriert sein.
Herstellung durch Kultivierung der Transformante
Die Esterase der Erfindung kann durch Transformieren einer geeigneten Wirtszell mit einer DNA-Sequenz, die die Esterase kodiert, Kultivieren des transformierten Organismus unter Bedingungen, die die Produktion des Enzyms ermöglichen, und Widergewinnen des Enzyms aus der Kultur, hergestellt werden.
Der Wirtsorganismus kann eine eukaryotische Zelle sein, insbesondere eine Pilzzelle, wie eine Hefezelle, oder eine filamentöse Pilzzelle, wie ein Stamm von Aspergillus, Fusarium, Trichodeerma oder Saccaromyces, insbesondere A. niger, A. oryzae, F. graminearum, F. sambucinum, F. cerealis oder S. cerevisae. Die Herstellung der Esterase in solchen Wirtsorganismen kann durch allgemeine Verfahren erfolgen, die in EP 238 023 (Novo Nordisk), WO 96/00787 (Novo Nordisk) oder EP 244 234 beschrieben sind
Eigenschaften und Verwendung der Esterasen
Die Esterase der Erfindung ist dazu in der Lage, Ester stereoselektiv zu hydrolysieren, einschließlich substituierte Ester der 3-Phenyl-propansäure. Sie hydrolysiert keinen Naproxen-Ethylester.
Die Esterase ist für die Herstellung optisch angereicherter Ester oder Säuren geeignet, z.B. die substituierten Ester der 3-Phenyl-propansäuren und der substituierten 3-Phenyl-propansäuren für die pharmazeutische Verwendung.
Die Esterase weist auch eine Arylesterase-Aktivität (EC 3.1.1.2) und eine Feruloyl-Esterase-Aktivität (EC 3.1.1.73) auf, und ist zum Hydrolysieren der Feruloyl-Ester in die Ferulasäure und Alkohol geeignet. Sie ist geeignet für die Freisetzung von Ferulasäure, die an Hemicellulose gebunden ist, beim Abbau von Pflanzenmaterial und Pflanzenzellwänden geeignet, wie z.B. in GB 2301103 und WO 200014234 beschrieben. Sie kann auch für die Herstellung von Vanillinsäure analog der US 5955137 verwendet werden.
Hybridisierung
Die Hybridisierung wird eingesetzt, um anzuzeigen, dass eine vorgegebene DNA-Sequenz analog zu einer Nucleotid-Sonde ist, die einer DNA-Sequenz der Erfindung entspricht. Die Hybridisierungsbedingungen sind im Detail nachfolgend beschrieben.
Geeignete Bedingungen für die Bestimmung der Hybridisierung zwischen einer Nucleotid-Sonde und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz umfasst das Voreinweichen eines Filters, der die DNA-Fragmente oder die RNA enthält, um in 5 x SSC (Standarskochsalzcitrat) währen 10 Minuten zu hybridisieren, und Vorhybridisieren des Filters in einer Lösung von 5 x SSC (Sambrook et al. 1989), 5 x Denhardt's-Lösung (Sambrook et al 1989), 0,5 % SDS und 100 μg/ml denaturierter beschallter Lachsspermien-DNA (Sambrook et al. 1989), gefolgt von der Hybridisierung in der gleichen Lösung mit einem zufällig geprimten (Feinberg, A.P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13) ³²P-dCTP-markierter (spezifische Aktivität > 1 x 10⁹ cpm/μg) Sonde für 12 Stunden bei etwa 60 °C. Der Filter wird dann zweimal während 30 Minuten in 2 x SSC, 0,5 % SDS bei einer Temperatur von 60 °C und bevorzugter mindestens 65 °C und noch bevorzugter mindestens 68 °C gewaschen.
Moleküle, an die die Oligonucleotid-Sonden unter diesen Bedingungen hybridisieren, werden unter Verwendung eines Röntgenfilms nachgewiesen.
Anordnung und Homologie
Die Esterase und die Nucleotid-Sequnez der Erfindung weisen vorzugsweise Homologien zu den offenbarten Sequenzen von mindestens 80 % Identität auf, insbesondere mindestens 90 % Identität oder mindestens 95 % Indentität, z.B. mindestens 98 % Identität.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die Anordnungen der Sequenzen und die Berechnung der Identitätstreffer unter Verwendung eines Clustal W (J.D. Thompson et al (1994) NAR 22 (22) S. 4673-4680)-Anordnung durchgeführt, die sowohl für die Protein- als auch die DNA-Anordnung einsetzbar ist. Die Defaultscoringmatrices Blosum62mt2and swgapdnamt werden für die Protein- bzw. DNA-Andordnung verwendet. Die Gapopeningpenalty beträgt 10 und die Gapextensionpanalty beträgt 0,1 für Proteine. Die Gapopeningpenalty beträgt 15 und die Gapenxtensionpenalty beträgt 6,66 für die DNA. Die Anordnungen erfolgten unter Verwendung des Computerprogramms allignX, die eine Komponente der Vector NTI Suite 6.0-Packetes von Informax, Inc ist (www.informax.com).
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung einer rohen Esterasepräparation aus Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae IFO4177 wurde unter Verwendung eines Fed-Batch-Prozesses mit Maltose/Maltodextrin oder Glucose als Hauptkohlenstoff-Quellen fermentiert. Das Chargenmedium enthielt: Maltose/Maltodextrin, Ammoniumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat, Hefeextrakt, Buchenxylan, MgSO₄, 7H₂O, Zitronensäure, Kaliumsulfat, Spurenmetalllösung und ein Antischaummittel. Alle diese Komponenten wurden in Konzentrationen verwendet, die alle im Bereich von 1-18 g/l des Endmediums liegen. Der Medium-pH wurde auf 4,5 während der Fermentation gehalten. Die Einspeisung bestand aus Maltose/Maltodextrin oder Glucose im Bereich von 280 g/l. 6,5 kg des Chargenmediums wurden mit 500 ml der Keimkultur beimpft. Nach 15 – 25 Stunden der Chargenfermentation wurde die Zugabe der Einspeisung initiiert, wobei eine Einspeisungs-Zuführ-Geschwindigkeit von 15-25 g Einspeisung pro Stunde verwendet wurde. Der Einspeisungs-Chargen-Zustand wurde für 100 bis 160 Stunden der Fermentation fortgesetzt. Aufgelöster Sauerstoff über 50 % Sättigung wurde mittels einer Kontrolle der Bewegungsgeschwindigkeit durch eine geschlossene Schleife („closed-loop control of the agitation") aufrechterhalten. Die Belüftung wurde auf 1 Volumen Luft pro Volumen des Chargenmediums pro Stunde eingestellt. Ein Headspace-Druck von 0,5 bar Überdruck wurde über die gesamte Fermentation aufrechterhalten. Nach dem Ernten wurde sowohl die Biomasse als auch das nicht gelöste Material in einem Filtrationsschritt entfernt. Der Überstand wurde konzentriert, indem Wasser unter Verwendung von Ultrafiltration, Verdampfung oder Gefriertrocknen entfernt wurde.
Beispiel 2. Herstellung von (2S)-2-Ethoxy-3-(4-hydoxyphenyl)propansäure aus Ethyl(2RS) (+/-)-2-ethyoxy-3-(4-hydroxyphenyl)propanoat

Ethyl(2RS) (+/-)-2-ethyoxy-3-(4-hydroxyphenyl)propanoat (0,5 g) wurde mit 60 mg lyophilisierter Esterase-Präparation aus Aspergillus oryzae in 1 ml 1M Phosphatpuffer (pH = 7) mit eine organischen Co-Lösungsmittel (gemäß der nachfolgenden Tabelle) bei 27 °C geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde nach 4 Stunden in 20 ml MeOH, um die enzymatische Reaktion zu stoppen, gefolgt von der Analyse durch chirale Kapillarelektrophorese, um den Enantiomerenüberschuss (ee) wie folgt zu bestimmen: HP 3D Kapillarelektrophorese und 80.5/72.0 cm, 50 mm HP-Glockenkapillare („bubble capillary") wurde verwendet. Der Elektrolyt war HS-β-CD (Regies) (2 % w/v) und TM-β-CD (Sigma) (2 % w/v) in 25 mM Boratpuffer pH 9,3 (HP). Das Reaktionsgemisch wurde etwa 25-fach in Boratpuffer 5 mM pH 9,3 verdünnt (oder Endkonzentration von ca. 0,025 mg/ml bis 0,1 mg/ml) und injiziert (50 mbar in 4 Sekunden). Die angewendete Spannung betrug 30 kV.

Co-Lösungsmittel	Produkt_Säure (%)	(ee)_Säure (%)
Aceton/0,1 ml	37	93
Aceton/0,3 ml	31	94
THF/0,1 ml	36	94
THF/0,2 ml	31	93
THF/0,3 ml	21	91
2-Propanol/0,1 ml	36	97
2-Propanol/0,3 ml	27	93
Ethanol/0,1 ml	35	96
Ethanol/0,2 ml	32	96
Ethanol/0,3 ml	22	93

Beispiel 3: Herstellung von (2S)-2-Ethoxy-3-(4-hydroxyphenyl)propansäure und Ethyl(2R)-2-ethoxy-3-(4-hydroxyphenyl)propanoat
Ethyl(2R/S) (+/-)2-ethoxy-3-(4-hydroxyphenyl)propanoat (5 g) wurde zu einem wässrigen 0,1 M Phosphatpuffer pH 7 (10 ml) gegeben. 100 mg der lyophilisierten Esterasepräparation aus Aspergillus oryzae wurde zugegeben und das Gemisch wurde währen 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Während dieser Zeit wurde der pH des Reaktionsgemisches konstant auf pH = 6 bis 8 durch Zugabe von NaOH gehalten. Das Meiste des Wassers wurde im Vakuum verdampft. Methanol wurde zu der verbleibenden Aufschlämmung zugegeben, um die Hydrolyse zu stoppen. Das Präzipitat, das gebildet wurde, wurde abfiltriert, und das Methanol wurde im Vakuum verdampft. Das verbleibende Öl wurde in Wasser aufgelöst, gefolgt von der Extraktion von nicht umgesetzten Ester mit tert.-Butylmethylether (TBME) (ee_ester = 87 %, bestimmt wie in Beispiel 2). Die Wasserphase wurde angesäuert auf pH = 3 und die Säure mit TBME extrahiert. Nach dem Trocknen über Na₂SO₄ und Verdampfen des TBME wurden 1,8 g (2S)-2-Ethoxy-3-(4-hydroxyphenyl)propansäure als Öl erhalten, das beim Stehen kristallisierte (Smp. = 105 °C, ee_Säure => 99 %, bestimmt wie in Beispiel 2).
Beispiel 4: Reinigung der Esterase
Fermentation von Aspergillus oryzae IFO4177
Die Fed-Batch-Fermentation eines Derivates von Aspergillus oryzae IFO4177 wurde in einem Medium durchgeführt, das Maltodextrin als Kohelnstoffquelle, Harnstoff als Stickstoffquelle und Hefeextrakt umfasst. Die Fed-Batch-Fermentation wurde durch Beimpfen einer Schüttelkulturflasche von A. oryzae in einem Medium durchgeführt, das 3,5 % der Kohlenstoffquelle und 0,5 % der Stickstoffquelle umfasst. Nach 24 Stunden Kultivieren bei pH 5,0 und 34 °C wurde die kontinuierliche Zufuhr einer zusätzlichen Kohlenstoff- und Stickstoffquelle initiiert. Die Kohlenstoffquelle wurde als limitierender Faktor gehalten, und es wurde sichergestellt, dass Sauerstoff in Überschuss vorliegt. Die Fed-Batch-Kultivierung wurde für 4 Tage fortgesetzt, nach denen das Enzym durch Zentrifugation, Ultrafiltration, Filtration, Keimfiltration („germ filtration") und Sprühtrocknen wieder gewonnen wurde.
Assay für die Esterhydrolyse
Der Assay ist ein auf einem pH-Indikator beruhender Assay, in dem die Abnahme mit p-Nitrophenol gemessen wird, wenn das Enzym den Ester (2RS) (+/-) 2-Ethoxy-3-(4-hydroxyphenyl)propanoat spaltet. Die Pufferkapazität der Enzymprobe, die in Rede steht, muss gering sein, da eine hohe Puffer-Kapazität in der Probe den pH-Rückgang unterdrückt.
50 μl Enzym (verdünnt in 5 mM BES (Sigma B-6420), pH 7,1) wurde mit 100 μl der Assay-Lösung (eine Mischung von 400 μl Ethyl (2RS) (+/-) 2-ethoxy-3-(4-hydroxyphenyl)propanoat (55 mM in Acetonitril, 2000 μl 5 mM p-Nitrophenol in 5 mM BES, pH 7,1 und 7600 μl 5 mM BES pH 7,1) gemischt. Nach einer Verzögerungsperiode von 5 Minuten wurde die Abnahme der OD₄₅₀ in den nächsten 10 Minuten als Maß der Enzymaktivität aufgezeichnet. Wenn die Neigung der aufgezeichneten Kurve von der Linearen abweicht, wurde der Assay mit einer höheren Enzymverdünnung wiederholt.
Reinigung der Esterase 24 g des sprühgetrockneten Aspergillus oryzae-Überstandes wurde in 375 ml 5 mM CH₃COOH/NaOH, pH 4,0 aufgelöst, und der pH wurde auf 4,0 eingestellt. Die Lösung wiese eine Leitfähigkeit von 1 mS/cm auf. Die Lösung wurde auf eine 100 ml S-Sepharose FF-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen, die mit 25 mM CH₃COO/NaOH, pH 4,0 äqulibiriert wurde. Nach dem Waschen der Säule mit dem gleichen Puffer wurde die Säule mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M über 5 Säulenvolumen eluiert.
Fraktionen (10 ml) von der Säule wurden hinsichtlich der Esterase-Aktivität analysiert, und die Fraktionen 42 bis 46 wurden vereinigt. Der 42-46-Pool wurde über Nacht gegen 10 mM KH₂PO₄(NaOH, pH 7,0, in einem Dialyseröhrchen dialysiert und dann auf eine 40 ml Q-Sepharose FF-Säule (Amersham Pharmacia Biothech) aufgetragen, die mit 20 mM KH₂PO₄/NaOH, pH 7,0, äqulibriert wurde. Nach dem Waschen der Säule mit dem gleichen Puffer wurde die Säule mit einem linearen NaCL-Gradienten von 0 bis 0,25 M über 5 Säulenvolumen eluiert. Fraktionen von der Säule wurden hinsichtlich der Aktivität analysiert. Die Aktivität nicht zurückgehaltener Fraktionen wurde gefunden. Der pH der nicht zurückgehaltenen Fraktionen wurde auf pH 8,0 eingestellt und auf die gleiche 40 ml Q-Sepharose FF-Säule aufgetragen, aber dieses Mal mit 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0, aqulibriert. Nach dem Waschen der Säule mit dem HEPES-Puffer, wurde die Säule mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,25 M über 5 Säulenvolumen eluiert. Fraktionen (4 ml) von der Säule wurden hinsichtlich der Aktivität analysiert, und Fraktionen 18 bis 22 wurden vereinigt. Der 18-22-Pool wurde 10-fach mit entionisiertem Wasser verdünnt und auf eine 8 ml SOURCE Q-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) aufgebracht, die mit 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0, äquilibriert war. Nach dem Waschen der Säule mit dem gleichen Puffer wurde die Säule mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 150 mM über 30 Säulenvolumen äqulibiriert. Fraktionen (3 ml) 28 und 29 wurden vereinigt und auf eine 300 ml Superdex 75-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) aufgebracht, die mit 20 mM HEPES/NaOH, 200 mM NaCl, pH 8,0 äqulibiriert war. Die Superdex 75-Säule wurde mit dem gleichen Puffer äqulibriert, und Fraktionen (5 ml) wurde hinsichtlich der Aktivität getestet. Der Spitzenwert der Enzymaktivität war in den Fraktionen 6 und 7. Fraktionen 5, 6, 7 und 8 wurden auf etwa 70 μl in einer Polysulfone-Ultrafuge-Einheit mit einem Ausschluss von 10 kDa (Ultrafiltration durch Zentrifugation) konzentriert. Von jeder Fraktion wurden 10 μl auf ein SDS-PAGE-Gel aufgetragen, und es wurde gesehen, dass die Intensität einer ~70 kDa-Bande der Aktivität folgt. Fraktion 6 und 7 wurde für die Spaltung und die Edman-Protein-Sequenzierung verwendet.
Beispiel 5: Spaltung der Esterase in Fragmente und Sequenzierung der Fragmente Reduktion und Alkylierung
75 ml der gereinigten Enzymprobe wurden mit 75 ml SDS PAGE-Probenpuffer mit DTT gemischt und bei 37 °C während 20 Minuten inkubiert. Die Probe wurde auf 95 °C während 3 Minuten erwärmt, gekühlt, und nachfolgend wurden 20 μl 1 M Iodacetamid (in 0,5 M Tris pH 9,2) zugegeben. Die Inkubation erfolgte während 20 Minuten bei Raumtemperatur.
In-Gel-Verdauung
9 Bahnen in einem Novex-SDS PAGE-Gel wurden mit der Probe (alle) beladen. Nach dem Laufen des Gels wurde es nach Standardverfahren von Novex gefärbt. Stücke des Gels, die die ~70 kDa-Bande enthielten, wurden nachfolgend heraus geschnitten und mit einem Messer zerkleinert. Die Gelstücke wurden zweimal mit 0,5 M Tris pH 9,2/Acetonitril (ACN) (1:1) während 45 Minuten bei 37 °C gewaschen. Die Gelstücke wurden mit 100 % ACN während 10 Minuten behandelt, um das Schrumpfen der Stücke zu initieren. Das ACN wurde entfernt und die Stücke in einem Speed-Vac getrocknet. 200 μl 0,1 M (NH₄)HCO₃ wurden zugegeben und für 15 Minuten inkubiert. Das (NH₄)HCO₃ wurde entfernt und 100 ml ACN wurden zugegeben. Wieder wurde die Inkubation für 10 Minuten gefolgt von der Entfernung von ACN und dem Trocknen in einem Speed-Vac durchgeführt. Der Zyklus von alternierender (NH₄)HCO₃- und ACN-Zugabe/Entfernung wurde 2x wiederholt. Nach dem letzten Trockenschritt wurden 25 μl 0,1 μg/μl Acromobacter-Lysylendopeptidase in 0,1 M Tris pH 9,2, 10 % ACN zugegeben. Die Inkubation erfolgte über 20 Minuten. Dann wurden 250 μl 0,1 M Tris pH 9,2, 10 % ACN zugegeben. Die Inkubation wurde über Nacht bei 37 °C fortgesetzt.
Dann wurden 40 μl 10 % Trifluoressigsäure (TFA) zugegeben, und nach einer Inkubation während 10 Minuten wurde der Überstand entfernt (aufgespart für die Kontrolle). Die Extraktion der Peptide erfolgte 2x durch Zugabe von 200 μl 0,1 % TFA, 60 % ACN zu den Gelstücken und Inkubation während 45 Minuten bei 37 °C. Alle Extrakte wurden gesammelt (65 μl + 200 μl + 200 μl) und in einem Speed-Vac auf 50 ml konzentriert. 50 μl 0,1 % TFA wurden zugegeben und die Probe auf 50 μl wieder getrocknet.
Trennung der Peptide
Die wurde auf einer RP-HPLC an einer 2 x 50 mm Vydac C-18-Säule unter Verwendung eines TFA/ACN-Lösungsmittel-Systems (Gradient von 0 % bis 64 % ACN in 0,1 % TFA über 31 Minuten, 150 μl, Detektion bei 214 nm) laufen gelassen. Kontrollen mit leeren Gelstücken wurden parallel laufen gelassen. Die ausgewählten Peptide von der Trennung wurden einer Sequenzanalyse durch Edman-Abbau unterzogen.
Peptidsequenzen
Die Sequenzanalyse der Peptide zeigte, dass drei verschiedene Sequenzen erhalten wurden. Die bestimmten Sequenzen wurden als 161299Afr15 (SEQ ID NO: 3), 161299Afr17 (SEQ ID NO: 4) und 161299Afr23 (SEQ ID NO: 5) bezeichnet.
Beispiel 6: Klonieren der Esterasegene
Partielles Klonieren der Esterasegene durch PCR
Es wurde gefunden, dass die drei Peptidsequenzen, die in Beispiel 5 bestimmt wurden, etwas Homologie zur Penicillin-V-Amidohydrolase aus Fusarium oxysporum (GenSeqP: W00290) zeigte. Somit konnten 161299Afr15 (SEQ ID NO: 3), 161299Afr17 (SEQ ID NO: 4) und 161299Afr23 (SEQ ID NO: 5) mit den Aminosäuren 381-398, 349-366 bzw. 181-201 der GeneSeqP: W00290 zugeordnet werden.
Basierend auf dieser Anordnung, wurden zwei PCR-Primer konstruiert, um einen Teil des A. oryzae-Esterase-Gens zu amplifizieren.
Ein Primer (B2716F09, SEQ ID NO: 6), der der Sens-Richtung der Proteinsequenz des Peptides 161299Afr23 (Aminosäuren 13-21 der SEQ ID NO: 5) entspricht wurde synthetisiert.
Ein Primer (B2716F11, SEQ ID NO: 7), der der Antisens-Richtung der Proteinsequenz des Peptides 161299Afr15 (Aminosäuren 4-12 der SEQ ID NO: 3) entspricht, wurde synthetisiert.
Diese beiden PCR-Primer wurden für die Amplifikation eines Esterasegenfragmentes in der folgenden Weise verwendet: Genomische DNA wurde aus Aspergillus oryzae IFO 4177 wie von Yelton et al. (M.M:Yelton, J.E. Mamer und W.E. Timberlake (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474) beschrieben hergestellt.
Das Expand-PCR-System (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Schweiz) wurde für die Amplifikation nach den Anweisungen des Herstellers für diese und die nachfolgenden PCR-Amplifikationen verwendet. Die Magnesium-Konzentration wurde in allen PCR-Reaktionen bei 2,5 mM gehalten.

Das folgende thermische Cycling-Programm wurde auf einem MJ Research PCT 150-Thermocycler betrieben.

94 °C für 1 Minute	1 Zyklus
94 °C für 10 Sekunden
Temperaturanstieg bei –0,5 °C/Sek.
50 °C für 10 Sekunden	40 Zyklen
72 °C für 30 Sekunden
72 °C für 1 Minute	1 Zyklus.

Ein PCR-Produkt von etwa 550 Basenpaaren wurde an einem 1 % Agarose-Gel nachgewiesen. Dieses Fragment wurde wieder gewonnen und in den pCR4-TOPO-Vektor nach den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen BV, Groning, Niederlande) kloniert.
Ein Plasmid mit einem Insert der angenommenen Größe, pCaHj571 wurde für die Sequenzierung ausgewählt und es wurde unter Verwendung der folgenden Primer sequenziert: –48 Revers (SEQ ID NO: 8) und –40 Universal (SEQ ID NO: 9).
Alle Sequenzierungsreaktionen wurden unter Verwendung des BigDye^TM Terminator Cylce Sequencing Kits von Perkin-Elmer Corporation (USA) durchgeführt, und die Reaktionen liefen an einem ABI 3700 Kapillarsequenzer von Perkin-Elmer nach den Anweisungen des Herstellers.
Die Sequenz kodiert eine Proteinsequenz, die zur F. oxysporum-Amidohydrolase homolog ist und ebenso die Peptidsequenz 161299Afr17 kodiert, und es wurde somit gefolgert, dass das amplifizierte Fragment Teil des Esterase-Gens ist. Die Sequenz des PCR-Fragments ist als SEQ ID NO: 27 dargestellt.
Genomisches Klonieren des Esterasegens
Eine Cosmid-Bibliothek von A. oryzae IFO4177 wurde früher wie in der WO 9801470 beschrieben hergestellt.
Das Insert pCaHj571 wurde mit DIG unter Verwendung des Plasmids als Templat in einer PCR-Reaktion zusammen mit den Primern B2716F09 und B2716F11 und dem PCR DIG Probensynthese-Kit von Roche Molecular Biochemicals nach den Anweisungen des Herstellers markiert.
Das mit DIG-markierte Fragment wurde verwendet, um die Cosmidbibliothek unter Verwendung der Empfehlungen der Roche Molecular Biochemicals zu untersuchen, und die Hybridisierungssignale wurden unter Verwendung der CSPD-Detektion nach den Anweisungen der Roche Molecular Biochemicals und unter Verwendung einer LAS 1000 plus CDC-Kamera, die von Fujifilm hergestellt wurde, visualisiert.
Ein Cosmid mit einem klaren Hybridisierungssignal wurde isoliert und als pCaHj577 bezeichnet.
Ein Southern-Blot unter Verwendung der genomischen DNA von A. oryzae IFO4177 wurde durchgeführt, wobei die gleiche Sonde, Hybridisierungsbedingungen und Nachweis-Verfahren wie für die Cosmid-Isolierung eingesetzt wurden. Die DNA wurde mit den Restriktionsenzymen BamH I, Bgl II, EcoR I, Hind III, Mlu I, Mun I, Sac I, SaL I oder Xho I verdaut. Zusätzlich wurde eine Asp 718-Verdauung durchgeführt, und doppelte Verdauungen von Asp 718 und der Liste der gerade oben aufgeführten Enzyme wurden gemacht.
Der Southern-Blot zeigte, dass das 5'-Ende des Esterase-Gens auf einem etwa 1,4 Kilobasen Asp718-Fragment vorlag. Das 3'-Ende des Gens schien auf einem etwa 2 Kilobasenpaar Mun I – EcoR I-Fragment vorzuliegen.
Das 5'- und das 3'-Ende des Gens wurde durch inverse PCR in der folgenden Weise kloniert: Von der in SEQ ID NO: 27 gegebenen Sequenz, wurden die folgenden Primer konstruiert: B2998F06 (SEQ ID NO: 10), B3591G12 (SEQ ID NO: 11) und B2998F07 (SEQ ID NO: 12).
Für die inverse 5'-PCR wurden 500 ng von pCaHj577 mit Asp 781 verdaut, und die gebildeten Fragmente wurden an einem 1 % Agarose-Gel getrennt. Fragmente von etwa 1,4 Kilobasen wurden aus dem Gel wieder gewonnen und in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml aufgelöst. Der Ligationspuffer und die T4 DNA-Ligase (Roche Molecular Biochemical) wurden zugegeben und die Lösung wurde bei 16 °C für etwa 18 Stunden inkubiert. Das Gemisch wurde durch Ethanol-Präzipitation konzentriert, und das Ligations-Produkt wurde als Templat in einer PCR-Reaktion unter Verwendung der Primer B2998F06 und B3591G12 und den PCR-Bedingungen, die in dem vorangehenden Abschnitt beschrieben wurden, eingesetzt. Ein PCR-Produkt von etwa 1 Kilobase wurde in einem 1 % Agarose-Gel nachgewiesen. Das Fragment wurde wieder gewonnen und in den pCR4-TOPO-Vektor kloniert. Die Sequenzierung eines der gebildeten Plasmids zeigte, dass das Insert das 5'-Ende der Esterase ist. Das Plasmid wurde als pCaHj578 bezeichnet.
Für die 3'-inverse-PCR wurden 500 ng pCaHj577 mit Mun I und EcoR I verdaut, und die gebildeten Fragmente wurden an einem 1 % Agarose-Gel getrennt. Fragmente von etwa 2 Kilobasen wurden wieder aus dem Gel gewonnen und in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml aufgelöst. Die Ligation und die Konzentrierung erfolgte wie mit dem 5'-Ende. Das Ligations-Produkt wurde als Templat in einer PCR-Reaktion unter Verwendung der Primer B2998F06 und B2998F07 verwendet. Ein PCR-Produkt von etwa 1,1 Kilobasen wurde an einem 1 % Agarose-Gel nachgewiesen. Dieses Fragment wurde wieder gewonnen und in den pCR4-TOPO-Vektor kloniert. Das Sequenzieren von einem der gebildeten Plasmide zeigte, dass das Insert das 3'-Ende der Esterase ist. Das Plasmid wurde als pCaHj579 bezeichnet.
Sequenzieren des Esterase-Gens
Das Esterase-Gen wurde unter Verwendung des Plasmids pCaHj571, pCaHj577, pCaHj578 und pCaHj579 als Templat und den folgenden Primern sequenziert:
–48 Revers (SEQ ID NO: 8), –40 Universal (SEQ ID NO: 9), B2998F06 (SEQ ID NO: 10), B3591G12 (SEQ ID NO: 11), B2998F07 (SEQ ID NO: 12), B3864E07 (SEQ ID NO: 13), B3864E08 (SEQ ID NO: 14), B3998D09 (SEQ ID NO: 15), B3998D10 (SEQ ID NO: 16), B3998D11 (SEQ ID NO: 17) und B3591G11 (SEQ ID NO: 18).
Alle Sequenzierungsreaktionen wurden unter Verwendung des BigDye^TM Terminator Cycle sequencing Kits von Perkin-Elmer Corporation (USA) durchgeführt, und die Reaktionen liefen an einem ABI 3700 Kapillar-Sequenzer der Perkin-Elmer Corporation nach den Anweisungen des Herstellers.
Die Sequenz ist zusammen mit der Translation in der SEQ ID NO: 1 gezeigt. Ein einzelnes Intron wurde von dem Computerprogramm NetGene2 (P.G. Korning et al (1996) Nucl. Acids. Res. 24: 3439-3452) vorausgesagt.
Durch die Analyse der Poteinsequenz wurde eine sekretorische Signalsequenz unter Verwendung des Computerprogramms Signale (H. Nielsen et al (1997) Potein Eng. 10: 1-6) vorausgesagt.
Beispiel 7: Expression des Esterasegens
Das Aspergillus-expressions-Plamid pCaHj527 ( WO 0070064 ) besteht aus einer Expressionscassette, die auf dem neutralen Amylase II-Promotor von Aspergillus niger basiert, der an die nicht tranlatierte Leader-Sequenz der Triose-Phosphat-Isomerase von Aspergillus nidulans (Pna2/tpi) und den Amyloglycosidase-Terminator von Aspergillus niger (Tamg) fusioniert ist. Auch liegt auf dem Plasmid der Aspergillus-selektive Marker amdS aus Aspergillus nidulans vor, der das Wachstum auf Acetamid als einzige Stickstoff-Quelle ermöglicht, und den URA3-Marker aus Saccharomyces cerevisiae, der das Wachstum des pyrF-defizienten Escherichia coli-Stamms DB6507 (ATCC 35673) ermöglicht. Die Transformation in E. coli DB 6507 unter Verwendung des URA3-Gens als selektiver Marker von S. cerevisiae wurde in der folgenden Weise durchgeführt:
E. coli DB6507 wurde durch das Verfahren von Mandel und Higa (Mandel, M. und A. Higa (1970) J. Mol. Biol. 45, 154) kompetent gemacht. Die Transfomanten wurden auf festem M9 Medium (Sambrook et al (1989) Molecular cloning, a laboratory manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press), ergänzt mit 1 g/l Casaminosäuren, 500 μg/l Thiamin und 10 mg/l Kanamycin, selektiert.
PCaHj527 wurde in der folgenden Weise modifiziert:
Der Pna2/tpi-Promoter, der auf pCaHj527 vorliegt, wurde einer ortsspezifischen Mutagenese durch einen einfachen PCR-Ansatz unterzogen.
Nucleotide 134-144 wurden von SEQ ID NO: 19 geändert in SEQ ID NO: 20, wobei der mutagene Primer 141223 (SEQ ID NO: 21) verwendet wurde.
Nucleotide 423-436 wurden von SEQ ID NO: 22 geändert in SEQ ID NO: 23, wobei der mutagene Primer 141222 (SEQ ID NO: 24) verwendet wurde.
Das resultierende Plasmid wurde als pMT 2188 bezeichnet.
Das Esterase-Gen wurde in pMT 2188 in der folgenden Weise kloniert: Das Esterase-Gen wurde aus pCaHj577 amplifiziert, wobei die in Beispiel 6 beschriebenen PCR-Bedingungen eingesetzt wurden, mit der Ausnahme, dass nur 20 Zyklen benutzt wurden. Die Primer waren die folgenden: B6093H05 (SEQ ID NO: 25) und B6093H03 (SEQ ID NO: 26).
Das frühere PCR-Fragment wurde mit BamH I und Xho I verdaut, und das große Fragment wurde in pMT2188 ligiert, das mit dem gleichen Enzym verdaut wurde. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli DB6507 transformiert. Von einem Plasmid, das aus einem der Kolonien gebildet wurde, wurde durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung besttigt, dass es das erwartete Insert aufwies. Dieses Plasmid wurde als pCaHj585 bezeichnet. Eine Restriktionskarte von pCaHj585 ist in 1 gezeigt.
PCaHj585 wurde in Aspergillus oryzae BECh2 ( WO 0039322 ) transformiert, fermentiert und wie in der WO 95/00636 wieder gewonnen.
Beispiel 8: Verwendung der Esterase für die stereoselektive Hydrolyse chiraler Ester

Ethyl (2RS) (+/-) 2-ethoxy-3-(4-hydroxyphenyl)propanoat (0,5 g) wurde mit 60 mg des lyophilisierten hydrolytischen Enzymgemisches aus Aspergillus oryzae in 1 ml 1 M Phosphat-Puffer (pH = 7) mit einem organischen Co-Lösungmittel (gemäß der nachfolgenden Tabelle) bei 27 °C geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde in 20 ml MeOH nach 4 Stunden gegossen, um die enzymatische Reaktion zu stoppen, gefolgt von der Analyse durch das chirale CCE-Verfahren 2.

In einem anderen Experiment wurde Ethyl (2R/S) (+/-) 2-ethoxy-3-(4-hydroxyphenyl)propanoat (5 g) zu einem wässrigen 0,1 M Phosphatpuffer pH 7 (10 ml) gegeben. 100 mg des lyophilisierten hydrolytischen Enzymsgemisches aus Aspergillus oryzae wurde zugegeben und das Gemisch wurde während 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Während dieser Zeit wurde der pH des Reaktionsgemisches konstant bei pH = 6 – 8 durch Zugabe von NaOH gehalten. Das Meiste des Wassers wurde im Vakuum verdampft.
Methanol wurde zu der verbleibenden Aufschlämmung zugegeben, um die Hydrolyse zu stoppen. Das Präzipitat, das gebildet wurde, wurde abfiltriert und das Methanol wurde im Vakuum verdampft. Das zurückbleibende Öl wurde in Wasser aufgelöst, gefolgt von der Extraktion von nicht umgesetzten Ester mit TBME (CEE-Verfahren 2: ee_Ester = 87 %). Die Wasserphase wurde auf pH = 3 angesäuert und die Säure mit TBME extrahiert. Nach dem Trocknen über Na₂SO₄ und Verdampfen des TBME wurden 1,8 g (2S)-2-Ethoxy-3-(4-hydroxyphenyl)propansäure als Öl erhalten, das beim Stehen kristallisierte (Smp. 105 °C, CCE-Verfahren 2: ee_Ester => 99 %).

Original (für die Einreichung) – gedruckt am 19.07.2001 09:56:53

0-1	Form- PCT/RO/134 (EASY) Angaben bezüglich hinterlegter Mikroorganismen oder anderen biologischen	PCT-Easy-Version 2.92
0-1-1	Materials (PCT Regel 13bis) Hergestellt unter Verwendung von	(Update 01.03.2001
0-2	Internationale Anmeldung Nr.	PCT/DK01/00508
0-3	Aktenzeichen des Anmelders oder Vertreters	10141-WO
1	Die nachfolgenden Angaben beziehen sich auf die hinterlegten Mikroorganisem oder des biologischen Materials, auf das in der	2-3
1-1	Beschreibung Bezug genommen wird auf	34-3
1-2	Seite Zeile
1-3	Angaben zur Hinterlegung
1-3-1	Name der Hinterlegungsstelle	DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
1-3-2	Adresse der Hinterlegungsstelle	Mascheroder Weg 1b, D38124 Braunschweig, Deutschland
1-3-3	Datum der Hinterlegung	11. Januar 2001 (11.01.2001) DSMZ 13977
1-3-4	Zugangsnummer
1-4	Weitere Angaben	KEINE
1-5	Benannte Staaten, für die die Angaben gemacht werden	Alle benannten Staaten

1-6	Getrennte Angaben Diese Angaben werden später an das Internationale Büro geschickt	KEINE
	Nur für das Anmeldeamt
0-4	Dieses Formblatt wurde mit der internationalen Anmeldung erhalten (ja oder nein)	JA
0-4-1	Bevollmächtigter Sachbearbeiter	Unterschrift Marie Louise Rosendal Bürovorsteher
	Nur zur Verwendung für das Internationale Büro
0-5	Dieses Formblatt wurde vom internationalen Büro erhalten am:
0-5-1	Bevollmächtigter Sachbearbeiter

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Esterase, welche zur stereoselektiven Hydrolyse chiraler Ester befähigt ist und eine Arylesteraseaktivität und Feruloylesteraseaktivität hat und welche ist: a) ein Polypeptid, kodiert von einem Esterase-kodierenden Teil einer DNA-Sequenz, die in ein in Escherichia coli Hinterlegungsnummer DSM 13977 vorhandenem Plasmid kloniert ist; b) ein Polypeptid, das als reifes Peptid eine in SEQ ID NO:2 gezeigte Aminosäuresequenz hat; c) ein Analog des in (a) oder (b) definierten Polypeptids, welches: i) mindestens 50% Identität mit besagtem Polypeptid aufweist, ii) mit einem Antikörper, der gegen besagtes Polypeptid in gereinigter Form gerichtet ist, immunologisch reaktiv ist, oder iii) eine allelische Variante des besagten Polypeptids ist; oder d) ein Polypeptid, welches von einer Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche bei 60°C, 2xSSC, 0,5% SDS mit einem komplementären Strang der als Nukleotide 629-911 und 971-2208 der SEQ ID NO:1 gezeigten Nukleinsäuresequenz oder einer Untersequenz davon mit mindestens 100 Nukleotiden hybridisiert.
Esterase nach Anspruch 1, welche aus einem Stamm von Aspergillus, bevorzugt A. oryzae isoliert worden ist.
Polynukleotid umfassend ein Nukleinsäuresequenz, welche die Esterase nach Anspruch 1 oder 2 kodiert.
Polynukleotid, welches umfasst: a) den Esterase-kodierenden Teil einer DNA-Sequenz, die in ein in Escherichia coli DSM 13977 vorhandenem Plasmid kloniert ist, b) die als Nukleotide 629-911 und 971-2208 der SEQ ID NO:1 gezeigte Nukleinsäuresequenz, c) ein Analog der in a) oder b) definierten Sequenz, welche für eine Esterase kodiert, welche zur stereoselektiven Hydrolyse chiraler Ester befähigt ist und eine Arylesteraseaktivität und eine Feruloylesteraseaktivität hat und i) mindestens 60% Identität mit besagter DNA-Sequenz aufweist, oder ii) bei 60°C, 2xSSC, 0,5% SDS mit einem komplementären Strang der besagten DNA-Sequenz oder einer Untersequenz davon mit mindestens 100 Nukleotiden hybridisiert, iii) eine allelische Variante davon ist, oder d) ein komplementärer Strang von a), b) oder c).
Nukleinsäurekonstrukt umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 3 oder 4, funktionsfähig verbunden mit einer oder mehr Kontrollsequenzen, die befähigt sind, die Expression der Esterase in einem geeigneten Expressionswirt zu steuern.
Rekombinanter Expressionsvektor umfassend das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 5, einen Promotor und transkriptionelle und translationelle Stoppsignale.
Rekombinante Wirtszelle, die mit dem Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 6 transformiert ist.
Verfahren zum Herstellen einer Esterase, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 7 unter Bedingungen, die für die Herstellung der Esterase förderlich sind, und das Gewinnen der Esterase.
Das Verfahren des vorherigen Anspruchs, wobei die Esterase von einem reifen Peptid der SEQ ID NO: 2 abgeleitet sein kann oder ein Analog davon ist, und die Wirtszelle ein transformierter Stamm von A. oryzae ist.
Verfahren zur stereoselektiven Hydrolyse eines chiralen Esters, umfassend Behandeln des Esters mit der Esterase nach Anspruch 1 oder 2.
Verfahren zum Herstellen eines optisch aktiven Carbonsäureesters, umfassend stereoselektives Hydrolysieren einer razemischen Mischung des Esters durch Behandeln mit der Esterase nach Anspruch 1 oder 2, und Gewinnen des optisch aktiven Esters.
Verfahren zum Herstellen einer optisch aktiven Carbonsäure, umfassend stereoselektives Hydrolysieren einer razemischen Mischung eines Esters der Säure durch Behandeln mit der Esterase nach Anspruch 1 oder 2, und Gewinnen der optisch aktiven Säure.
Verfahren zum Hydrolysieren eines Feruloylesters in Ferulinsäure und einen Alkohol, umfassend das Behandeln des Esters mit der Esterase nach Anspruch 1 oder 2.