ES2288976T3 - Esterasa estereoselectiva de aspergillus oryzae. - Google Patents

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Carsten M. Hjort
Heinz-Josef Deussen
Magali Zundel
Soren Ebdrup
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Abstract

Esterasa capaz de realizar una hidrólisis estereoselectiva de ésteres quirales y con actividad arilesterasa y actividad feruloil esterasa y que es: a) un polipéptido codificado por una parte codificante de la esterasa de la secuencia de ADN clonada en un plásmido presente en Escherichia coli con número de depósito DSM 13977; b) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos como el péptido maduro mostrado en la SEC ID NO: 2; c) un análogo del polipéptido definido en (a) o (b) que: i) tiene al menos el 50% de identidad con dicho polipéptido, ii) es immunológicamente reactivo con un anticuerpo dirigido contra dicho polipéptido en forma purificada o iii) es una variante alélica de dicho polipéptido; o d) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos la cual se hibridiza a 60ºC; 2 X SSC; SDS (0.5%) con una cadena complementaria de la secuencia de ácidos nucléicos mostrada como los nucleótidos 629911 y 971-2208 de la SEC ID NO: 1 o una subsecuencia de la mismaque tiene al menos 100 nucleótidos.

Description

Esterasa estereoselectiva de Aspergillus oryzae.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una esterasa, a los métodos de uso y de producción de la misma, y a una secuencia de codificación de la misma. La esterasa es capaz de realizar la hidrólisis estereoselectiva de ésteres quirales y de hidrolizar ésteres de ácido ferúlico.
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Antecedentes de la invención
Es conocida la preparación de ésteres quirales de altas purezas ópticas por hidrólisis asimétrica con enzimas. Así, US 4587462 expone la hidrólisis asimétrica de ésteres alquílicos inferiores de naproxeno con una enzima microbiana, particularmente una esterasa de separación específica de Aspergillus oryzae DSM 2808 (ATCC 11492). US 5155028 expone el seccionamiento de éster enzimático estereoselectivo usando lipasas, esterasas o proteasas, p. ej. lipasas o esterasas de Aspergillus o proteasas de Aspergillus oryzae. JP 7-206756 expone el uso de una enzima para preparar compuestos ópticamente activos. La enzima puede ser una proteasa o esterasa producida por Aspergillus, p. ej. de
A. oryzae.
Enzimas con actividad esterasa de ácido ferúlico son conocidas, p. ej., de Aspergillus oryzae. M. Tenkanen;
Biotechnology and Applied Biochemistry, 27 (1), 19-24 (1998); M. Tenkanen et al., J. Biotechnol., 18 (1-2), 69-84
(1991).
US 5516679 expone una amidohidrolasa de penicilina V de Fusarium oxysporum.
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Resumen de la invención
Los inventores han aislado una esterasa de Aspergillus oryzae que es capaz de realizar la hidrólisis estereoselectiva de ésteres quirales y también tiene actividad de arilesterasa (EC 3.1.1.2) y actividad feruloil esterasa (EC 3.1.1.73). La nueva esterasa tiene sólo una homología limitada a las secuencias de aminoácidos conocidas. Los inventores también aislaron un gen que codificaba la esterasa nueva y la clonaron en una cepa de E. coli.
Por consiguiente, la invención proporciona una esterasa que es capaz de realizar una hidrólisis estereoselectiva de ésteres sustituidos de ácido 3-fenil-propanoico. La esterasa puede ser un polipéptido con una secuencia de aminoácidos como el péptido maduro mostrado en la SEC ID NO: 2.
Además, la esterasa de la invención puede ser un polipéptido codificado por la parte codificante de la esterasa de la secuencia de ADN clonada en un plásmido presente en Escherichia coli número de depósito DSM 13977.
La esterasa puede también ser un análogo del polipéptido definido anteriormente que:
i)
tiene al menos el 50% de identidad con dicho polipéptido,
ii)
es immunológicamente reactivo con un anticuerpo dirigido contra dicho polipéptido en forma purificada,
iii)
es una variante alélica de dicho polipéptido.
Finalmente, la esterasa de la invención puede ser un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que se hibridiza a 60ºC; 2 X SSC; SDS (0.5%) con la cadena complementaria de nucleótidos 572-911 y 971-2208 de la SEC ID NO: 1 o una subsecuencia de la misma de al menos 100 nucleótidos.
La secuencia de ácidos nucléicos de la invención puede comprender una secuencia de ácidos nucléicos que codifica la esterasa anteriormente descrita, o puede codificar una esterasa y comprende:
a) la parte codificante de la esterasa de la secuencia de ADN clonada en un plásmido presente en Escherichia coli DSM 13977,
b) nucleótidos 629-911 y 971-2208 de la SEC, ID Nº: 1 (que codifica el polipéptido maduro), o
c) un análogo de la secuencia de ADN definida en a) o b) que codifica una esterasa que es capaz de realizar una hidrólisis estereoselectiva de ésteres sustituidos de ácido 3-fenil-propanoico y
i)
tiene al menos el 60% de identidad con dicha secuencia de ADN, o
ii)
se hibridiza a 60ºC; 2 X SSC; SDS (0.5%) con la secuencia complementaria de dicha secuencia de ADN.
Otros aspectos de la invención proporcionan un vector de expresión recombinante que comprende la secuencia de ADN, y una célula transformada con la secuencia de ADN o el vector de expresión recombinante.
Una comparación con secuencias de longitud total de la técnica anterior muestra que la secuencia más conocida es una amidohidrolasa de penicilina V de Fusarium oxysporum (US 5516679). La secuencia de aminoácidos madura de la invención tiene el 48% de identidad con la secuencia conocida, y las secuencias de ADN correspondientes tienen el 54% de identidad.
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Breve descripción del dibujo
Figura 1 muestra un mapa de restricción del plásmido de expresión de esterasa pCaHj585.
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Descripción detallada de la invención Fuente de ADN genómico
La esterasa de la invención puede ser derivada de cepas de Aspergillus, particularmente cepas de A. oryzae, con la utilización de sondas diseñadas en base a la secuencia de ADN en esta especificación.
Una cepa de Escherichia coli conteniendo un gen que codifica la esterasa fue depositada por los inventores según las condiciones del tratado de Budapest con el DSMZ - Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig DE el 11 de enero de 2001 bajo el número de acceso DSM 13977.
Vector de expresión recombinante
El vector de expresión según la invención normalmente incluye secuencias de control que codifican un promotor, operador, centro de unión del ribosoma, señal de iniciación de la traducción, y, opcionalmente, un marcador seleccionable, un terminador de la transcripción, un gen represor o varios genes activadores. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, o puede ser integrado en el genoma de la célula huésped.
Producción por cultivo del transformante
La esterasa de la invención puede ser producida transformando una célula huésped adecuada con una secuencia de ADN que codifica la esterasa, cultivando el organismo transformado bajo condiciones que permiten la producción de la enzima, y recuperando la enzima del cultivo.
El organismo huésped puede ser una célula eucariótica, en particular una célula fúngica, tal como una célula de levadura o una célula fúngica filamentosa, tal como una cepa de Aspergillus, Fusarium, Trichoderma o Saccharomyces, particularmente A. Niger, A. oryzae, F. graminearum, F. sambucinum, F. cerealis o S. cerevisiae. La producción de la esterasa en organismos huéspedes de este tipo puede ser realizada por los métodos generales descritos en EP 238,023 (Novo Nordisk), WO 96/00787 (Novo Nordisk) o EP 244,234 (Alko).
Propiedades y usos de la esterasa
La esterasa de la invención es capaz de realizar la hidrólisis estereoselectiva de ésteres incluso de ésteres sustituidos de ácidos 3-fenil-propanoicos. No hidroliza el éster etílico de naproxeno.
La esterasa es útil para la preparación de ésteres o ácidos, enriquecidos ópticamente p. ej. ésteres sustituidos de ácidos 3-fenil-propanoicos y ácidos 3-fenil-propanoicos sustituidos para el uso farmacéutico.
La esterasa también tiene actividad de arilesterasa (EC 3.1.1.2) y actividad feruloil esterasa (EC 3.1.1.73) y es útil en la hidrolización de ésteres feruloílicos en ácido ferúlico y alcohol. Es útil para la liberación de ácido ferúlico unido a hemicelulosa para la degradación de la materia vegetal y de las paredes celulares vegetales, p. ej. como se describe en GB 2301103 y WO200014234. Puede también ser usada para la producción de ácido vanílico en analogía con US 5955137.
Hibridación
La hibridación se utiliza para indicar que una secuencia de ADN dada es análoga a una sonda de nucleótidos correspondiente a una secuencia de ADN según la invención. Las condiciones de la hibridación están descritas con detalle más abajo.
Las condiciones adecuadas para determinar la hibridación entre una sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN o ARN homóloga implica un prerremojo del filtro que contiene los fragmentos de ADN o ARN para hibridizarse en 5 X SSC (citrato de solución salina estándar) durante 10 min, y prehibridación del filtro en una solución de 5 X SSC (Sambrook et al. 1989); 5 X Solución de Denhardt's (Sambrook et al. 1989); SDS (0.5%) y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sonicado (Sambrook et al. 1989), seguido de la hibridación de la misma solución que contiene una sonda cebada de forma aleatoria (Feinberg, A.P. y Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13); marcada en ^{32}-P-dCTP (actividad específica > 1 X 10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a aprox. 60ºC. El filtro es luego lavado dos veces durante 30 minutos en 2 X SSC; SDS (0.5%) a una temperatura de 60ºC, más preferiblemente al menos 65ºC, incluso más preferiblemente al menos 68ºC.
Las moléculas que la sonda de oligonucleótidos hibridiza bajo estas condiciones son detectadas usando una película de rayos x.
Alineamiento y homología
La esterasa y la secuencia de nucleótidos según la invención preferiblemente tienen homologías a las secuencias descritas de al menos el 80% de identidad, particularmente al menos el 90% de identidad o al menos el 95% de identidad, p. ej. al menos el 98% de identidad.
Para los objetivos de la presente invención, los alineamientos de las secuencias y el cálculo de los niveles de identidad fueron realizados usando un alineamiento de Clustal W (J.D. Thompson et al (1994) NAR 22 (22) págs. 4673-4680), útil tanto para el alineamiento de la proteína como del ADN. Las matrices de puntuación por defecto Blosum62mt2 y swgapdnamt son usadas para los alineamientos de las proteínas y del ADN respectivamente. La penalización por abertura de espacio es 10 y la penalización por extensión de espacio: 0,1 para las proteínas. - la penalización por abertura de espacio es 15 y la penalización por extensión de espacio es 6,66 para el ADN. Los alineamientos fueron hechos usando el programa informático allignX que es un componente del paquete vector NTI Suite 6.0 de Informax, Inc (www.informax.com))
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Ejemplos
Ejemplo 1
Preparación de una preparación de esterasa en bruto de Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae IF04177 fue fermentada usando un proceso de flujo discontinuo con maltosa/maltodextrina o glucosa como fuente principal de carbono. El medio continuo contenía: maltosa/maltodextrina, sulfato de amonio, dihidrogenfosfato de potasio, extracto de levadura, xilano de haya, MgSO_{4},7H_{2}O, ácido cítrico, sulfato de potasio, solución de metal traza y un agente antiespumante. Todos estos componentes fueron usados en concentraciones todas en la gama de 1-18 g/l de medio final. El pH del medio fue mantenido en 4.5 en toda la fermentación. El alimento consistió en maltosa/maltodextrina o glucosa en la gama de 280 g/L. Se inocularon 6.5 kg de medio continuo con 500 ml de cultivo de semillas. Después de 15-25 horas de fermentación continua la adición de alimento fue iniciada usando un nivel de adición de alimento de 15-25 g de alimento por hora. Este estado en flujo discontinuo continuó durante 100-160 horas de fermentación. El oxígeno disuelto por encima del 50% de saturación fue mantenido por medio de un control en bucle cerrado del nivel de agitación. La aireación fue mantenida a 1 volumen de aire por volumen de medio continuo por hora. Una presión "headspace" con una sobrepresión de 0.5 bar fue mantenida en toda la fermentación. Después de la cosecha del caldo, tanto la biomasa como la materia no disuelta fue eliminada en una fase de filtración. El sobrenadante fue concentrado mediante la eliminación del agua mediante ultrafiltración, evaporación o
liofilización.
Ejemplo 2
Preparación de ácido (2S)-2-Etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoico y (2R)-2-Etoxi- 3-(4-hidroxifenil)propanoato de etilo
(2RS) (+/-) 2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoato de etilo (0.5 g) fue agitado con 60 mg de la preparación de esterasa liofilizada de Aspergillus oryzae en 1 ml de tampón fosfato 1 M (pH=7) con cosolventes orgánicos (según la tabla a continuación) a 27ºC. La mezcla reactiva fue vertida en 20 ml de MeOH después de 4 h para detener las reacciones enzimáticas seguido del análisis por electroforesis quiral capilar para determinar el exceso enantiomérico (ee) como sigue:
Se utilizó la electroforesis capilar HP 3D y 80.5/72.0 cm; 50 mM de burbuja capilar HP. El electrolito fue HS-\beta-CD (Regis) (2%p/v) y TM-\beta-CD (Sigma) (2%p/v) en un tampón de borato de 25 mM pH 9.3 (HP). La mezcla reactiva fue diluida aproximadamente 25 veces en un tampón de borato de 5 mM, pH 9.3 (o concentración final aprox. 0.025 mg/ml - 0.1 mg/ml) e inyectada (50 mbar en 4.0 segundos). El voltaje aplicado fue 30 kV.
1
Ejemplo 3
Preparación de ácido (2S)-2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoico y (2R)-2-etoxi- 3-(4-hidroxifenil)propanoato de etilo
(2R/S) (+/) 2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoato de etilo (5 g) fue añadido a un tampón de fosfato acuoso 0.1 M pH 7 (10 ml). 100 mg de la preparación de esterasa liofilizada de Aspergillus oryzae fue añadida y la mezcla fue agitada durante 18 horas a la temperatura ambiente. Durante ese tiempo, el pH de la mezcla reactiva fue mantenido constante a pH=6-8 por la adición de NaOH. La mayor parte del agua fue evaporada al vacío. Se añadió metanol a la pasta restante para detener la hidrólisis. El precipitado que se formó fue filtrado y el metanol fue evaporado al vacío. El aceite restante fue disuelto en agua seguido de la extracción del éster no reaccionado con éter terc-butilmetílico (TBME)(ee_{ester} = 87%, determinado como en el ejemplo 2). La fase acuosa fue acidificada hasta pH = 3 y el ácido extraído con TBME. Tras el secado con Na_{2}SO_{4} y la evaporación del TBME; se obtuvo 1.8 g de ácido (2S)-2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoico como un aceite, que cristalizó en reposo (p.f. = 105ºC, ee_{ácido} = >99%, determinado como en el ejemplo 2).
Ejemplo 4
Purificación de la esterasa Fermentación de Aspergillus oryzae IFO4177
La fermentación con flujo discontinuo de un derivado de Aspergillus oryzae IFO4177 fue realizada en un medio que contenía maltodextrina como fuente de carbono, úrea como fuente de nitrógeno y extracto de levadura. La fermentación con flujo discontinuo fue realizada inoculando un cultivo de un frasco de agitación de A. oryzae en un medio comprendiendo 3,5% de la fuente de carbono y 0,5% de la fuente de nitrógeno. Después de 24 horas de cultivo a pH 5.0 y 34ºC se inició el suministro continuo de fuentes de nitrógeno y carbono adicionales. La fuente de carbono fue mantenida como el factor de limitación y se estableció que el oxígeno estaba presente en exceso. El cultivo de flujo discontinuo fue continuado durante 4 días, después de los cuales la enzima fue recuperada por centrifugado, ultrafiltración, filtración, filtración del germen y secado por atomización.
Ensayo para hidrólisis estérica
El ensayo es un ensayo basado en el indicador del pH, donde la reducción del pH es medida con p-nitrofenol, cuando la enzima secciona el éster de (2RS) (+/) 2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoato de etilo. La capacidad tamponadora de la muestra enzimática en cuestión tiene que ser baja, puesto que una alta capacidad tamponadora en la muestra suprimirá la caída del pH.
Se mezclaron 50 \mul de enzima (diluida en 5 mM de BES (Sigma B-6420), pH 7.1) con 100 \mul de solución de ensayo (una mezcla de 400 \mul de (2RS) (+1) 2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoato de etilo (55 mM en acetonitrilo); 2000 \mul de p-nitrofenol 5 mM en BES 5 mM, pH 7.1 y 7600 \mul de BES 5 mM, pH 7.1). Después de un periodo de 5 minutos, la reducción en la OD_{405} en los siguientes 10 minutos fue vigilada como una medición de la actividad enzimática. Si la pendiente de la curva vigilada se desviaba de la linealidad, el ensayo fue repetido con mayor dilución enzimática.
Purificación de la esterasa
24 g de un sobrenadante de Aspergillus oryzae IFO4177 secado por atomización fueron disueltos en 375 ml 5 mM CH_{3}COOH/NaOH, pH 4.0 y el pH fue ajustado hasta pH 4.0. La solución tiene una conductividad de 1 mS/cm. La solución fue aplicada a una columna de 100 ml de S-Sepharose FF (Amersham pharmacia Biotech) equilibrada en 25 mM de CH_{3}COOH/NaOH, pH 4.0. Después del lavado de la columna con el mismo tampón, la columna fue eluida con un gradiente de NaCl lineal de 0 a 0.5 M sobre 5 volúmenes de columna. Fracciones (10 ml) de la columna fueron analizadas para la actividad esterasa y se agruparon las fracciones 42 - 46. La agrupación 42-46 fue dializada durante la noche contra 10 mM de KH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7.0 en un tubo de diálisis y luego aplicada a una columna Q-Sepharose FF de 40 ml (Amersham pharmacia Biotech) columna equilibrada en 20 mM de KH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7.0. Después del lavado de la columna con el mismo tampón, la columna fue eluida con un gradiente de NaCl lineal de 0 a 0.25 M sobre 5 volúmenes de columna. Se analizó la actividad de las fracciones de la columna. La actividad fue encontrada en la fracción no retenida. El pH de la fracción no retenida fue ajustado hasta pH 8.0 y aplicado a la misma columna Q-Sepharose FF de 40 ml, pero esta vez equilibrada en 20 mM de HEPES/NaOH, pH 8.0. Después del lavado de la columna con el tampón HEPES, la columna fue eluida con un gradiente de NaCl lineal de 0 a 0.25 M sobre 5 volúmenes de columna. Se analizó la actividad de las fracciones (4 ml) de la columna fu y se agruparon las fracciones 18-22. La agrupación 18-22 fue diluida 10 veces con agua desionizada y aplicada a una columna SOURCE Q de 8 ml (Amersham pharmacia Biotech) equilibrada en 20 mM de HEPES/NaOH, pH 8.0. Después del lavado de la columna con el mismo tampón, la columna fue eluida con un gradiente de NaCl lineal de 0 a 150 mM sobre 30 volúmenes de columna. Las fracciones (3 ml) 28 y 29 fueron agrupadas y aplicadas a una columna Superdex75 de 300 ml (Amersham pharmacia Biotech) equilibrada en 20 mM de HEPES/NaOH; 200 mM de NaCl, pH 8.0. La columna Superdex75 fue eluida con el mismo tampón y las fracciones (5 ml) fueron analizadas por su actividad. La actividad enzimática fue máxima en las fracciones 6 y 7. Las fracciones 5, 6, 7 y 8 fueron concentradas hasta aprox. 70 \mul en 10 kDa unidades Ultrafuge de polisulfona cortadas (ultrafiltración por centrifugado). Se aplicaron 10 \mul de cada fracción a un gel de SDS-PAGE, y se observó que la intensidad de una banda de \sim70 kDa siguió a la actividad. Las fracciones 6 y 7 fueron usadas para el seccionamiento y la secuenciación de la proteína de Edman.
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Ejemplo 5
Seccionamiento de la esterasa en fragmentos y secuenciación de los fragmentos Reducción y alquilación
75 \mul de la muestra de enzima purificada fueron mezclados con 75p1 de tampón de muestra SDS PAGE con DTT y se incubó a 37ºC durante 20 min. La muestra fue calentada a 95ºC durante 3 min, enfriada y posteriormente se añadieron 20 \mul de yodoacetamida 1 M (en 0.5 M tris pH 9.2). Se produjo la incubación durante 20 min a la temperatura ambiente.
Digestión en gel
Se cargaron nueve carriles en un gel de SDS-PAGE de Novex con la muestra (todas). Después de la actuación, el gel fue teñido según procedimientos estándares de Novex algunos trozos de gel que contenían la banda de -70 kDa fueron posteriormente recortados y picados con una cuchilla. Los trozos de gel fue lavados 2X en 0.5 M de Tris pH 9.2/Acetonitrilo (ACN) (1:1) durante 45 min a 37ºC. Los trozos del gel fueron tratados con ACN al 100% durante 10 min para introducir una disminución de los trozos. El ACN fue eliminado y los trozos secados en un speed-Vac. de 200 \mul. Se añadió 0.1 M (NH_{4})HCO_{3} y se incubó durante 15 min. El (NH_{4})HCO_{3} fue eliminado y se añadieron 100 \mul de ACN. Nuevamente se incubó durante 10 min seguido de la eliminación del ACN. y secado en un speed-Vac. El ciclo con alternación de (NH_{4})HCO_{3} y adición/eliminación de ACN fue repetido 2X. Después de la última fase de secado se añadieron 25 \mul de 0.1 \mug/\mul de lisil-endopeptidasa Achromobacter en 0.1 M de Tris pH 9.2, 10% ACN. Se incubó durante 20 min. Después se añadieron 350 \mul de Tris 0.1 M pH 9.2, 10% ACN. La incubación fue continuada durante la noche a 37ºC.
Después, se añadieron 40 \mul de ácido trifluoroacético (TFA) al 10% y después de 10 min de incubación, el sobrenadante fue eliminado (guardado para su control). La extracción de los péptidos fue realizada 2 X añadiendo 200 \mul de TFA (0.1%); ACN (60%) a los trozos de gel e incubándolo durante 45 min a 37ºC. Todos los extractos fueron recogidos (65 \mul+200 \mul+200 \mul) y concentrados en el speed-Vac a 50 \mul. 50 \mul de TFA al 0.1% fueron añadidos y la muestra resecada hasta 50 \mul.
Separación de los péptidos
La muestra fue realizada en RP-HPLC en una columna C-18 2x50 mM de Vydac usando un sistema solvente de TFA/ACN (gradiente de 0% a 64% de ACN en 0.1% de TFA durante 31 min; 150 \muL/min, detección a 214 nm). Se realizaron controles con trozos de gel blanco en paralelo. Los péptidos seleccionados de la separación fueron sometidos al análisis de las secuencias por degradación de Edman.
Secuencias peptídicas
Los análisis de las secuencias peptídicas demostraron que se habían obtenido tres secuencias. Las secuencias determinadas fueron denominadas 161299Afr15 (SEC ID NO: 3); 161299Afr17 (SEC ID NO: 4) y 161299Afr23 (SEC ID NO: 5).
Ejemplo 6
Clonación del gen de la esterasa Clonación parcial del gen de la esterasa por PCR
Se encontró que las tres secuencias peptídicas determinadas en el ejemplo 5 mostraban cierta homología a una amidohidrolasa de penicilina V de Fusarium oxysporum (GeneSeqP: WO0290). Así; 161299Afr15 (SEC ID NO: 3); 161299Afr17 (SEC ID NO: 4) y 161299Afr23 (SEC ID NO: 5) podrían ser alineadas con los aminoácidos 381-398, 349-366 y 181-201, respectivamente, de la GeneSeqP: WO0290.
En base a este alineamiento, dos cebadores de la PCR fueron diseñados para amplificar por PCR una parte del gen de la esterasa de A. oryzae.
Un cebador (B2716F09, SEC ID NO: 6) correspondiente a la secuencia proteica en la dirección sentido del péptido 161299Afr23 (aminoácidos 13-21 de la SEC ID NO: 5) fue sintetizado.
Un cebador (B2716F11, SEC ID NO: 7) correspondiente a la dirección antisentido fue sintetizado de la secuencia proteica del péptido 161299Afr15 (aminoácidos 4-12 de la SEC ID NO: 3).
Estos dos cebadores de la PCR fueron usados para la amplificación de un fragmento del gen de la esterasa de la siguiente manera:
Se obtuvo ADN genómico a partir de Aspergillus oryzae IFO 4177 como se describe por Yelton et al. (M.M. Yelton, J.E. Mamer y W.E. Timberlake (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,1470-1474).
El sistema Expand PCR (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Suiza) fue usado para la amplificación según las instrucciones del fabricante para esta amplificación por PCR y para otras posteriores. La concentración de magnesio fue mantenida a 2.5 mM en todas las reacciones de la PCR.
El programa de ciclo térmico siguiente fue realizado en un variador térmico MJ Research PTC 150:
94ºC durante 1 min.
1 ciclo
94ºC durante 10 seg.
Desnivel de temperatura a -0,5ºC/sec.
50ºC durante 10 seg.
40 ciclos
72ºC durante 30 seg.
72ºC durante 1 min.
1 ciclo.
Un producto de la PCR de aprox. 550 bp fue detectado en gel de agarosa (1%). Este fragmento fue recuperado y clonado en el vector pCR4-TOPO según las instrucciones del fabricante (Invitrogen BV, Groningen, Holanda).
Un plásmido con un inserto del tamaño previsto, pCaHj571, fue seleccionado para la secuenciación y fue secuenciado usando los cebadores siguientes: -48 inverso (SEC ID NO: 8) y -40 universal (SEC ID NO: 9).
Todas las reacciones de la secuencia fueron realizadas usando kits de secuenciamiento BigDye^{TM} Terminator de Perkin-Elmer Corporation (EEUU), y las reacciones fueron realizadas en un secuenciador capilar ABI 3700 de Perkin-Elmer Corporation según las instrucciones del fabricante.
La secuencia codificó una secuencia de proteínas homóloga a la amidohidrolasa de F. oxysporum y también codificó la secuencia péptida 161299Afr17, y se concluyó de esta manera que el fragmento amplificado es una parte del gen de la esterasa. La secuencia del fragmento de la PCR se muestra como la SEC ID NO: 27.
Clonación genómica del gen de la esterasa
Una biblioteca de cósmidos de A. oryzae IFO4177 ha sido preparada previamente como se describe en WO 9801470.
El inserto de pCaHj571 fue marcado con DIG usando el plásmido como molde en una reacción de PCR con los cebadores B2716F09 y B2716F11 y el kit de síntesis de sondas PCR DIG de Roche Molecular Biochemicals según las instrucciones del fabricante.
El fragmento marcado por DIG fue usado para sondar filtros de la biblioteca de cósmidos usando las recomendaciones de Roche Molecular Biochemicals, y las señales de hibridación fueron visualizadas usando la detección por CSPD según las instrucciones de Roche Molecular Biochemicals y usando una cámara fotográfica LAS1000 plus CDC fabricada por Fujifilm.
Un cósmido que dio una señal de hibridación clara fue aislado y denominado pCaHj577.
Un análisis de southern blot usando ADN genómico de A. oryzae IFO4177 fue realizado usando la misma sonda, condiciones de hibridación y método de detección que para el aislamiento del cósmido. El ADN fue digerido con las enzimas de restricción BamH I, Bgl II, EcoR I, Hind III, Mlu I, Mun I, Sac I, SaL I o Xho I. Además se hizo una digestión de Asp 718, y digestiones dobles de Asp 718 y se elaboró la lista de enzimas recién indicada.
El southern blot indicó que el extremo 5' del gen de la esterasa estaba presente en un fragmento de Asp718 de aprox. 1.4 kb. El extremo 3' del gen resultó estar presente en un fragmento Mun I - EcoR I de aprox 2 kb.
El extremo 5' y el 3' del gen fue clonado por PCR inversa de la siguiente manera:
A partir de la secuencia dada en la SEC ID NO: 27, se designaron los cebadores de la PCR siguientes: B2998F06 (SEC ID NO: 10), B3591G12 (SEC ID. No: 11) y B2998F07 (SEC ID NO: 12).
Para la PCR, el extremo inverso 5' de 500 ng de pCaHj577 fue digerido con Asp718, y los fragmentos formados fueron separados en gel de agarosa (1%). Fragmentos de aprox. 1.4 kb fueron recuperados del gel y disueltos en un volumen total de 0.5 ml. Tampón de ligación y T4 DNA-ligasa (Roche Molecular Biochemicals) fueron añadidos y la solución fue incubada a 16ºC durante aprox. 18 horas. La mezcla fue concentrada por precipitación del etanol y el producto de la ligación fue usado como molde en una reacción de PCR usando los cebadores B2998F06 y B3591 G12 y las condiciones de la PCR descritas en la sección precedente. Un producto de la PCR de aprox. 1 kb fue detectado en gel de agarosa (1%). Este fragmento fue recuperado y clonado en el vector pCR4-TOPO. La secuenciación de uno de los plás-
midos formados demostró que el inserto era el extremo 5' de la esterasa. Este plásmido fue denominado pCaHj578.
Para la PCR el extremo inverso 3' 500 ng de pCaHj577 fue digerido con Mun I y EcoR I y los fragmentos formados fueron separados en gel de agarosa (1%). Los fragmentos de aprox. 2 kb fueron recuperados del gel y disueltos en un volumen total de 0.5 ml. La ligación y concentración fue realizada como con el extremo 5'. El producto de la ligación fue usado como molde en una reacción PCR usando los cebadores B2998F06 y B2998F07. Un producto de la PCR de aprox. 1.1 kb fue detectado en gel de agarosa (1%). Este fragmento fue recuperado y clonado en el vector pCR4-TOPO. La secuenciación de uno de los plásmidos formados demostró que el inserto era el extremo 3' de la esterasa. Este plásmido fue denominado pCaHj579.
Secuenciación del gen de la esterasa
El gen de la esterasa fue secuenciado usando los plásmidos pCaHj571, pCaHj 577; pCaHj578 y pCaHj579 como moldes y los cebadores siguientes:
-48 inverso (SEC ID NO: 8), -40 universal (SEC ID NO: 9), B2998F06 (SEC ID NO: 10), B3591G12 (SEC ID NO: 11), B2998F07 (SEC ID NO: 12), B3864E07 (SEC ID NO: 13), B3864E08 (SEC. ID Nº: 14), B3998D09 (SEC ID NO: 15), B3998D10 (SEC ID NO: 16), B3998D11 (SEC ID NO: 17), y B3591G11 (SEC ID NO: 18).
Todas las reacciones de la secuencia fueron hechas usando kits de secuenciamiento BigDye^{TM} Terminator de Perkin-Elmer Corporation (USA), y las reacciones fueron realizadas en un secuenciador capilar ABI 3700 de Perkin-Elmer Corporation según las instrucciones del fabricante.
La secuencia está mostrada junto con la traducción como la SEC ID NO: 1. Un único intrón fue predicho por el programa informático NetGene2 (P. G. Koming et. al (1996) Nucl. Acids. Res. 24:3439-3452).
Por el análisis de la secuencia de proteínas una secuencia señal secretora fue predicha usando el programa informático SignalP (H. Nielsen et al (1997) Protein Eng. 10:1-6).
Ejemplo 7
Expresión del gen de la esterasa
El plásmido de expresión de Aspergillus pCaHj527 (WO 0070064) consiste en un cassette de expresión basado en el promotor de la amilasa II de Aspergillus Niger fusionada a la secuencia líder no traducida de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans (Pna2/tpi) y el terminador de amiloglicosidasa de Aspergillus Niger (Tamg). También está presente en el plásmido el marcador selectivo amdS de Aspergillus de Aspergillus nidulans que permite el crecimiento en acetamida como única fuente de nitrógeno y el marcador URA3 de Saccharomyces cerevisiae que permite el crecimiento de la cepa DB6507 de Escherichia coli carente de pyrF (ATCC 35673). La transformación en E. coli DB6507 usando el gen URA 3 de S. cerevisiae como marcador selectivo fue hecha de la siguiente manera:
E. coli DB6507 fue hecha competente por el método de Mandel y Higa (Mandel, M. y A. Higa (1970) J. Mol. Biol. 45, 154). Los transformantes fueron seleccionados en un medio M9 sólido (Sambrook et. al (1989) Molecular cloning, a laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press) suplementado con 1 g/l de casaminoácidos; 500 \mug/l de tiamina y 10 mg/l de canamicina.
PCaHj527 fue modificado de la siguiente manera:
El promotor Pna2/tpi presente en pCaHj527 fue sometido a mutagenesis dirigida por un simple enfoque de la PCR.
El nucleótido 134 -144 fue alterado desde la SEC ID NO: 19 hasta la SEC ID NO: 20 usando el cebador mutagénico 141223 (SEC ID NO: 21).
El nucleótido 423 - 436 fue alterado desde la SEC ID NO: 22 hasta la SEC ID NO: 23 usando el cebador mutagénico 141222 (SEC ID NO: 24).
El plásmido resultante fue denominado pMT 2188.
El gen de la esterasa fue clonado en pMT2188 de la siguiente manera:
El gen de la esterasa fue amplificado por PCR a partir de pCaHj577 usando las condiciones de la PCR descritas en el ejemplo 6, a excepción de que sólo se usaron 20 ciclos. Los cebadores fueron los siguientes: B6093H05 (SEC ID NO: 25) y B6093H03 (SEC ID NO: 26).
El fragmento de la PCR formado fue digerido con BamH I y Xho I, y el gran fragmento formado fue ligado a pMT2188 digerido con las mismas enzimas. La mezcla de ligación fue transformada en E. coli DB6507. Se confirmó que un plásmido de una de las colonias formadas tenía el inserto previsto por el análisis de restricción y secuenciación del ADN. Este plásmido fue denominado pCaHj585. Un mapa de restricción de pCaHj585 está 
\hbox{mostrado en la figura 1.}
PCaHj585 fue transformado en Aspergillus oryzae BECh2 (WO 0039322), fermentado y recuperado como se describe en WO 95/00636.
Ejemplo 8
Uso de la esterasa para hidrólisis estereoselectiva de éster quiral
(2RS) (+/) 2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoato de etilo (0.5 g) fue agitado con 60 mg de la mezcla liofilizada de la enzima hidrolítica de Aspergillus oryzae en 1 ml de tampón de fosfato 1 M (pH=7) con cosolventes orgánicos (según la tabla a continuación) a 27ºC. La mezcla reactiva fue vertida en 20 ml de MeOH después de 4 h para detener las reacciones enzimáticas seguido del análisis por el método 2 de CCE quiral.
3
En otro experimento, (2R/S) (+/) 2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoato de etilo (5 g) fue añadido a un tampón de fosfato acuoso 0.1 M pH 7 (10 ml). 100 mg de la mezcla enzimática hidrolítica liofilizada de Aspergillus oryzae fue añadida y la mezcla fue agitada durante 18 horas a la temperatura ambiente. Durante este tiempo, el pH de la mezcla reactiva fue mantenido constante a pH=6-8 mediante la adición de NaOH. La mayor parte del agua fue evaporada al vacío. Metanol fue añadido a la pasta restante para detener la hidrólisis. El precipitado que se formó fue filtrado y el metanol fue evaporado al vacío. El aceite restante fue disuelto en agua seguido de la extracción del éster no reaccionado con TBME (método 2 de CCE: ee_{éster} = 87%). La fase acuosa fue acidificada hasta pH = 3 y el ácido extraído con TBME. Después del secado con Na_{2}SO_{4} y evaporación del TBME; se obtuvieron 1.8 g de ácido (2S)-2-etoxi-3-(4-hidroxifenil)propanoico como un aceite, que cristalizó en reposo (p.f. = 105ºC, método 2 de CCE: ee_{ácido} = >99%).
5 
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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el solicitante es sólo para la conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido mucho cuidado al elaborar las referencias, no está exento de errores u omisiones y la EPO renuncia a toda responsabilidad en este aspecto. Documentos de patente citados en la descripción
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\bullet US5155028[0002]
\bullet JP7206756[0002]
\bullet US5516679[0004][0012]
\bullet EP238023[0018]
\bullet WO9600787[0018]
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\bullet GB2301103[0021]
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\bullet WO9801470[0052]
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<110> Novozymes A/S
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<120> Esterasa
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<130> 10141
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<160> 27
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<170> PatentIn version 3.0
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<210> 1
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ccccgtgatt gaatagaagt gg 
\hfill
22 
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<210> 11
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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<223> B3591 G12
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tccataatgt acaacggcca gc 
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22 
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<210> 12
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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<223> B2998F07
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<400> 12
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gacgcagata tctcctcttt cc 
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22 
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<210> 13
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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<223> B3864E07
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gattggtgcc tccaggcacg t 
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21 
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<210> 14
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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gcaagtgtac tggttttgca g 
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21 
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<210> 15
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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21 
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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20 
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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<210> 20
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<211> 11
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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<223> Pna2/tpi nucleótido 134-144 alterado
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<400> 20
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11 
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<210> 21
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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<220>
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<221> misc_característica
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<222> ()..()
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<223> 141223
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<400> 21
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ggatgctgtt gactccggaa atttaacggt ttggtcttgc atccc 
\hfill
45 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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<220>
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<221> misc_característica
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<222> ()..()
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<223> Pna2/tpi 423-436
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atgcaattta aact 
\hfill
14 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
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<211> 14
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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<220>
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<221> misc_característica
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<222> ()..()
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<223> Pna2/tpi nucleótido 423-436 alterado
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<400> 23
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cggcaattta acgg 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
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<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 141222
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<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtattgtcc tgcagacggc aatttaacgg cttctgcgaa tcgc 
\hfill
44 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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<220>
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<221> misc_característica
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<222> ()..()
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<223> B6093H05
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<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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ttggatcctt caccatgcct tcacttcgcc ggct 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> B6093H03
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atctcgagtt taaacacatt gccaggcatt 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 572
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae 
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
12

Claims (13)

1. Esterasa capaz de realizar una hidrólisis estereoselectiva de ésteres quirales y con actividad arilesterasa y actividad feruloil esterasa y que es:
a) un polipéptido codificado por una parte codificante de la esterasa de la secuencia de ADN clonada en un plásmido presente en Escherichia coli con número de depósito DSM 13977;
b) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos como el péptido maduro mostrado en la SEC ID NO: 2;
c) un análogo del polipéptido definido en (a) o (b) que:
i)
tiene al menos el 50% de identidad con dicho polipéptido,
ii)
es immunológicamente reactivo con un anticuerpo dirigido contra dicho polipéptido en forma purificada o
iii)
es una variante alélica de dicho polipéptido; o
d) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos la cual se hibridiza a 60ºC; 2 X SSC; SDS (0.5%) con una cadena complementaria de la secuencia de ácidos nucléicos mostrada como los nucleótidos 629-911 y 971-2208 de la SEC ID NO: 1 o una subsecuencia de la misma que tiene al menos 100 nucleótidos.
2. Esterasa según la reivindicación 1 que ha sido aislada de una cepa de Aspergillus, preferiblemente A. oryzae.
3. Polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucléicos que codifica la esterasa según la reivindicación 1 o 2.
4. Polinucleótido que comprende:
a) la parte codificante de la esterasa de la secuencia de ADN clonada en un plásmido presente en Escherichia coli DSM 13977,
b) la secuencia de ácidos nucléicos mostrada como los nucleótidos 629-911 y 971-2208 de la SEC ID NO: 1,
c) un análogo de la secuencia definida en a) o b) que codifica una esterasa que es capaz de realizar una hidrólisis estereoselectiva de ésteres quirales y con actividad arilesterasa y actividad feruloil esterasa y que tiene al menos el 60% de identidad con dicho polinucleótido
ii)
se hibridiza a 60ºC; 2 X SSC; SDS (0.5%) con una cadena complementaria de dicha secuencia de ADN o una subsecuencia de la misma con al menos 100 nucleótidos,
iii)
es una variante alélica de la misma, o
d) una cadena complementaria de a), b) o c).
5. Constructo de ácidos nucléicos que comprende el polinucleótido según la reivindicación 3 o 4 operativamente enlazado a una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la esterasa en un huésped de expresión adecuado.
6. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos según la reivindicación 5, un promotor, y señales de detención transcripcional y traduccional.
7. Célula huésped recombinante transformada con el constructo de ácidos nucléicos según la reivindicación 6.
8. Método para la producción de una esterasa comprendiendo el cultivo de la célula huésped según la reivindicación 7 bajo las condiciones propicias para producción de la esterasa, y recuperación de la esterasa.
9. Método según la reivindicación precedente donde la esterasa puede ser derivada del péptido maduro de la SEC ID NO: 2 o es un derivado análogo, y la célula huésped es una cepa transformada de A. oryzae.
10. Método para la hidrólisis estereoselectiva de un éster quiral, comprendiendo el tratamiento del éster con la esterasa según la reivindicación 1 o 2.
11. Método para producir un éster dicarboxílico ópticamente activo, comprendiendo la hidrolización estereoselectiva de una mezcla racémica del éster mediante el tratamiento con la esterasa según la reivindicación 1 o 2, y recuperación del éster ópticamente activo.
12. Método para producir un ácido dicarboxílico ópticamente activo, comprendiendo la hidrolización estereoselectiva de una mezcla racémica de un éster del ácido mediante el tratamiento con la esterasa según la reivindicación 1 o 2, y recuperación del ácido ópticamente activo.
13. Método de hidrolización de un feruloil éster en ácido ferúlico y un alcohol, comprendiendo el tratamiento del éster con la esterasa según la reivindicación 1 o 2.
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