ES2308788T3 - Proceso para la produccion de acido (s)- o (r)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metilpropionico. - Google Patents
Proceso para la produccion de acido (s)- o (r)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metilpropionico. Download PDFInfo
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Abstract
SE DESCRIBEN NUEVOS MICROORGANISMOS Y UNA NUEVA ENZIMA CAPAZ DE UTILIZAR, COMO FUENTE EXCLUSIVA DE NITROGENO, LA AMIDA DEL ACIDO PROPIONICO DE FORMULA (VI), EN FORMA DE RACEMATO O COMO ISOMEROS OPTICAMENTE ACTIVOS. SE DESCRIBE IGUALMENTE UN PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR EL ACIDO (S) - O (R) - 3, 3, 3 - TRIFLUOR - 2 - HIDROXI 2 - METILPROPIONICO DE FORMULAS (I) Y (II), A PARTIR DEL ESTER TRIFLUORACETO - ACETO. LAS TRES PRIMERAS ETAPAS DEL PROCESO SON QUIMICAS, MIENTRAS QUE LA CUARTA ETAPA ES MICROBIOLOGICA.
Description
\global\parskip0.950000\baselineskip
Proceso para la producción de ácido (S)- o
(R)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metilpropiónico.
La presente invención se refiere a un nuevo
proceso para la producción de ácido (S)- o
(R)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metilpropiónico
así como nuevos microorganismos, que son capaces de aprovechar la
amida del ácido propiónico de la fórmula
en forma del racemato o de sus
isómeros ópticamente activos como fuente única de
nitrógeno.
El ácido
(S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico
es un producto intermedio importante para la producción de amidas
terapéuticas (EP-A 0 524 781).
En lo que sigue se abrevia el ácido
3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metilpropiónico
como 2,2-HTFMPS y la amida del ácido
3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metilpropiónico
como 2,2-HTFMPA.
De acuerdo con J. Chem. Soc. 1251, p. 2329 se
describe un proceso para la producción de
(S)-2,2-HTFMPS, en el cual el
racemato correspondiente se transforma por medio de
dimetoxiestricnina en el enantiómero (S) deseado. Este proceso
tiene el inconveniente de que la dimetoxiestricnina empleada para la
separación del racemato es demasiado cara.
El documento EP-A 0 524 781
describe un proceso para la producción de (S)-HTFMPS
en el cual el racemato correspondiente se transforma por medio de
(S)-(-)-\alpha-metilbencilamina en
el enantiómero (S) deseado. El inconveniente en este proceso es que
tienen que emplearse grandes cantidades de
(S)-(-)-\alpha-metilbencilamina,
por lo que este proceso es también demasiado costoso.
Objeto de la presente invención es poner a
disposición un proceso favorable en costes y técnicamente viable
para la producción de (S)- o
(R)-2,2-HTFMPS.
Este objetivo se resuelve con los
microorganismos correspondientes a la invención según la
reivindicación 1 y la reivindicación 11, los polipéptidos de
acuerdo con la reivindicación 4 y con el proceso de acuerdo con las
reivindicaciones 15 y 16.
Objeto de la presente invención son por
consiguiente microorganismos seleccionados de la naturaleza,
denominados "cepas salvajes", extractos enzimáticos de los
mismos, las enzimas aisladas a partir de ellos con actividad
estereoespecífica de amidohidrolasas así como el DNA/fragmentos de
DNA aislado(s) a partir de las "cepas salvajes", que
codifican una amidohidrolasa estereoespecífica. Objeto de la
presente invención son adicionalmente los denominados
microorganismos alterados por tecnología genética, que contienen
estos fragmentos de DNA o vectores. Un objeto adicional es un
proceso para la producción de (S)- o
(R)-2,2-HTFMPS y un proceso para la
producción de (S)- o (R)-2,2-HTFMPA
con empleo de los microorganismos descritos.
La invención se ilustra adicionalmente por las
figuras siguientes.
Fig. 1 muestra el gráfico de restricción del DNA
aislado
Fig. 2 muestra el plásmido pPRS 1b
Fig. 3 muestra el plásmido pPRS 2a
Fig. 4 muestra el pH óptimo de la
amidohidrolasa
Fig. 5 muestra la cinética de
Michaelis-Menton de la amidohidrolasa
Fig. 6 muestra el óptimo de temperatura de la
amidohidrolasa
Fig. 7 muestra el efecto de metanol de la
amidohidrolasa.
Las "cepas salvajes" correspondientes a la
invención pueden aislarse a partir de muestras de suelo, fango o
aguas residuales con ayuda de técnicas microbiológicas
convencionales. De acuerdo con la invención, el aislamiento se
realiza de tal manera que se cultivan éstos en un medio que contiene
la amida del ácido propiónico de la fórmula VI en forma del
racemato o de uno de sus isómeros ópticamente activos como fuente
única de nitrógeno con una fuente de carbono apropiada de la manera
habitual. A partir del cultivo obtenido por selección se eligen
luego aquellas que son estables y que utilizan la amida del ácido
propiónico de la fórmula VI como fuente única de nitrógeno.
Como fuentes de carbono apropiadas las "cepas
salvajes" pueden utilizar azúcares,
alcoholes-azúcar o ácidos carboxílicos como
sustrato de desarrollo. Como azúcares pueden emplearse p.ej.
glucosa, arabinosa, ramnosa, lactosa o maltosa. Como
alcoholes-azúcar pueden utilizarse por ejemplo
sorbita, manita o glicerina. Como ácido carboxílico puede
utilizarse por ejemplo ácido cítrico. Preferiblemente se emplean
como fuente de carbono glicerina o glucosa.
Como medio de selección y cultivo pueden
emplearse los utilizados habitualmente en el mundo de la técnica,
como por ejemplo un medio de sales minerales de acuerdo con Kulla
et al., Arch. Microbiol. 135, p. 1-7,
1983.
Durante el cultivo y la selección se inducen
convenientemente las enzimas activas de los microorganismos. Como
inductor enzimático puede emplearse la amida del ácido propiónico de
la fórmula VI en forma de racemato o de uno de sus isómeros
ópticamente activos, acetamida o diamida del ácido malónico.
Habitualmente se realiza el cultivo y la
selección a una temperatura de 0 a 42ºC, preferiblemente de 20 a
37ºC y a un valor de pH de 4 a 9, preferiblemente a un valor de pH
de 6 a 8.
"Cepas salvajes" preferidas son amida del
ácido propiónico (formula VI) a aprovechar del género
Klebsiella. Son particularmente muy preferidos
microorganismos de las especies Klebsiella oxytoca PRS 1 (DSM
11009), Klebsiella oxytoca PRS 1K17 (DSM 11623),
Pseudomonas sp. (DSM 11010), Rhodococcus opacus
ID-622 (DSM W11344), Arthrobacter ramosus
ID-620 (DSM 11350), Bacillus sp
ID-621 (DSM 11351), Klebsiella planticula
ID-624 (DSM 11354) y Klebsiella pneumoniae
ID-625 (DSM 11355), así como sus variantes y
mutantes funcionales equivalentes. En este contexto exhiben las
"cepas salvajes" Klebsiella oxytoca (DSM 11009),
Klebsiella planticula ID-624 (DSM 11354) y
Klebsiella pneumoniae ID-625 (DSM 11355)
preferiblemente actividad de (R)-amidohidrolasa, y
las "cepas salvajes" Pseudomonas sp. (DSM 11010),
Rhodococcus opacus ID-622 (DSM 11344),
Arthrobacter ramosus ID-620 (DSM 11150) y
Bacillus sp ID-621 (DSM 11351)
preferiblemente actividad de (S)-amidohidrolasa. Los
microorganismos con la designación DSM 11010, DSM 11009 fueron
depositados en fecha 24.06.1996, los microorganismos con designación
DSM 11355, y DSM 11354 en fecha 27.12.1996, los microorganismos con
la designación DSM 11351, DSM 11350 y DSM 11344 en fecha 13.12.1996
y los microorganismos con la designación DSM 11623 en fecha
20.06.1997 en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg 1b, D-38124
Braunschweig, de acuerdo con el Tratado de Budapest.
Bajo "variantes y mutantes funcionalmente
equivalentes" de las "cepas salvajes" deben entenderse cepas
que poseen esencialmente las mismas propiedades y funciones que los
microorganismos originales. Variantes y mutantes de este tipo
pueden producirse accidentalmente p.ej. por radiación UV o de modo
controlado por mutagénesis química como p.ej. por medio de
intercaladores, tales como colorantes de acridina.
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(Continuación)
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(Continuación)
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(Continuación)
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La enzima correspondiente a la invención con
actividad estereoespecífica de amidohidrolasa puede obtenerse por
ejemplo de las "cepas salvajes" ya descritas y es capaz de
hidrolizar la amida del ácido propiónico de la fórmula
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en forma del racemato o de sus
isómeros (R), así como variantes y mutantes funcionalmente
equivalentes de la
misma.
Bajo "variantes y mutantes funcionalmente
equivalentes" de las enzimas deben entenderse enzimas que poseen
esencialmente las mismas propiedades y funciones. Variantes y
mutantes de este tipo pueden formarse accidentalmente p.ej. por
mutación.
Convenientemente, la enzima se caracteriza
por
- a)
- un pH óptimo de pH 10 \pm 0,5
- b)
- un óptimo de temperatura entre 65 y 70ºC para un valor de pH 10 y
- c)
- un valor K_{M} para el sustrato (R)-2,2-HTFMPA de 32 mM (60ºC en tampón CAPS (ácido 3-(ciclohexilami- no)-1-propanosulfónico) 32 mM de pH 10),
particularmente porque
- d)
- una concentración de metanol de 5 a 20% actúa como inhibidora,
- e)
- la secuencia de aminoácidos N-terminal es: Met-Lys-Trp-Leu-Glu-Glu-Ser-Ile-Met-Ala-Lys-Arg-Gly-Val-Gly-Ala-Ser-Arg-Lys-Pro.
Esta amidohidrolasa estereoespecífica puede
aislarse a partir de las "cepas salvajes" ya descritas, que son
capaces de aprovechar la amida del ácido propiónico de la fórmula
VI en forma del racemato o de sus isómeros R como fuente única de
nitrógeno. Convenientemente la amidohidrolasa se aísla a partir de
las "cepas salvajes" del género Klebsiella,
preferiblemente de Klebsiella oxytoca PRS 1 (DSM 11009) o
Klebsiella oxytoca PRS 1K17 (DSM 11623).
Evidentemente, esta enzima puede asimismo
aislarse de los microorganismos modificados por tecnología genética
derivados de estas "cepas salvajes".
Para la obtención de la amidohidrolasa
estereoespecífica se emplean las "cepas salvajes" en un medio
nutriente acuoso que contiene una fuente de carbono, fuente de
nitrógeno, sales minerales y una fuente de vitaminas, seleccionado
(cultivado) de modo habitual. Convenientemente, las "cepas
salvajes" se cultivan a una temperatura de 20 a 35ºC y a un
valor de pH de 6 a 8. La enzima puede aislarse luego después de
digestión de las células p.ej. por medio de la Prensa Francesa por
un método conocido en sí mismo de purificación enzimática.
El DNA correspondiente a la invención o los
fragmentos de DNA correspondientes a la invención, que codifican
una amidohidrolasa estereoespecífica, como se representa por la
secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO 2, y que se caracterizan por
el gráfico de restricción de acuerdo con Fig. 1 y particularmente
por la secuencia de nucleótidos en SEQ ID NO 1, comprenden también
sus variantes y mutantes genéticas funcionalmente equivalentes, es
decir genes, que se derivan de los genes de los organismos de tipo
salvaje y cuyos productos génicos están esencialmente inalterados
en su función biológica. Las variantes y mutantes genéticas
funcionalmente equivalentes comprenden por tanto por ejemplo
intercambios de bases dentro del marco de la degeneración conocida
del código genético, como pueden obtenerse p.ej. artificialmente a
fin de adaptar la secuencia génica al empleo preferido de codones
de un microorganismo determinado, en el cual debe obtenerse la
expresión. Las variantes y mutantes genéticas comprenden también
deleciones, inserciones y sustituciones de bases o codones, con tal
que el producto génico de los genes modificados de este tipo se
mantenga esencialmente inalterado en su función biológica. De este
modo están comprendidas p.ej. secuencias génicas, que exhiben una
alta homología con respecto a las secuencias de tipo salvaje, por
ejemplo mayor que 70%, y son capaces de hibridarse en condiciones
severas de hibridación, p.ej. a temperaturas comprendidas entre 60
y 70ºC y a 0,5 hasta 1,5 M de contenido de sal, particularmente a
una temperatura de 67ºC y con contenido de sal 0,8 M con el
complemento de las secuencias de tipo salvaje.
Como material de partida para el DNA
correspondiente a la invención pueden servir las "cepas
salvajes" ya descritas, que se emplean como material de partida
para el aislamiento de la amidohidrolasa estereoespecífica
correspondiente a la invención.
El aislamiento de los genes intactos o de los
fragmentos de DNA intactos correspondientes a la invención puede
realizarse según métodos conocidos a partir de un banco de genes de
un microorganismo apropiado como Klebsiella oxytoca, a
partir del cual pueden aislarse y clonarse de manera conocida el gen
de amidohidrolasa, o fragmentos del mismo por hibridación con
oligonucleótidos marcados, que contienen las secuencias parciales
del gen de amidohidrolasa. En lo que sigue se abrevia el gen de
amidohidrolasa como sad.
Para la mejora de la transcripción, el gen sad
se pone bajo el control de un promotor fuerte. La elección del
promotor depende de las condiciones de expresión deseados, por
ejemplo de si se desea una expresión constitutiva o inducida, o del
microorganismo en el cual debe realizarse la expresión.
Promotores apropiados son los promotores P_{L}
y P_{R} del fago Lambda (véase Schauder et al., Gene, 52,
279-283, 1987), el promotor P_{trc} (Amann et
al., Gene, 69, 301-315, 1988), los promotores
P_{Nm}, P_{St} (M. Labes et al., Gene, 89,
37-46, 1990), el promotor P_{trp} (Amann et
al., Gene, 25, 167-178, 1983), el promotor
P_{lac} (Amann et al. Gene, 25, 167-178,
1983) y el promotor P_{tac}, un híbrido de los promotores
P_{trp} y P_{lac} mencionados, que puede emplearse como promotor
constitutivo o inducible (Russel y Bennett, Gene, 20,
232-243, 1982). Preferiblemente se emplea el
promotor P_{lac}.
Para el empleo en la promoción de p.ej.
(R)-2,2-HTFMPS en una cepa de
producción apropiada se incorporan convenientemente los fragmentos
de DNA correspondientes a la invención con ayuda de técnicas
conocidas en vectores apropiados conocidos, preferiblemente
vectores de expresión.
Como vectores pueden emplearse plásmidos
autónomos y autorreplicables o vectores de integración.
\newpage
Dependiendo de la clase de los vectores
seleccionados, dichos genes sad pueden expresarse en diversos
microorganismos. Como vectores son apropiados no sólo vectores con
espectro hospedador específico sino también vectores con espectro
hospedador amplio ("intervalo de hospedador amplio"). Ejemplos
de vectores con espectro hospedador específico, p.ej. para E.
coli son pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2,
95-113), el comercialmente
pBLUESCRIPT-KS+®, disponible comercialmente
pBLUESCRIPT-SK+® (Stratagene), pUC18/19
(Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103 - 119,
1985), pK18/19 (Pridmore, Gene, 56, 309 - 312, 1987), pRK29OX
(Alvarez-Morales et al., Nucleic Acids
Research, 14, 4207 - 4227) y pRA95 (que puede obtenerse de Nycomed
Pharma AS, Huidove, Dinamarca). Preferiblemente se emplea
pBLUESCRIPT-KS+®.
Como vectores "de intervalo de hospedador
amplio" pueden emplearse todos aquellos vectores que son
apropiados para bacterias Gram-negativas.
Ejemplos de tales vectores de "intervalo de
hospedador amplio" son pRK290 (Ditta et al., PNAS, 77,
7347-7351, 1980) o sus derivados, pKT240
(Bagdasarian et al., Gene, 26, 273-282, 1983)
o sus derivados, pGSS33 (Sharpe, Gene, 29, 93-102,
1984), pVK 100 (Knauf y Nester, Plasmasid, 8, 45-54,
1982) o sus derivados, pME285 (Haas e Itoh, Gene, 36,
27-36, 1985) o sus derivados.
De este modo se obtuvieron por ejemplo los
plásmidos pPRS 1b (Fig. 2), pPRS 2a (Fig. 3), pPRS 4 y pPRS 7.
Para la obtención de las cepas de producción
para la fermentación, es decir, cepas que pueden emplearse para la
obtención de p.ej. (R)-2,2-HTFMPS,
los fragmentos de DNA o vectores correspondientes a la invención
deben introducirse en las cepas salvajes deseadas y apropiadas para
la expresión. Convenientemente, los microorganismos se transforman
para ello de una manera habitual y conocida en sí misma con los
vectores que contienen los fragmentos de DNA correspondientes a la
invención. Los microorganismos pueden luego contener el fragmento
de DNA correspondiente a la invención en una molécula vectora o
integrado en su cromosoma.
Cepas salvajes apropiadas, preferiblemente cepas
con alta tolerancia de sustrato y materia prima son por ejemplo
microorganismos de los géneros Pseudomonas, Comamonas, Bacillus,
Rhodococcus, Acinetobacter, Rhizobium, Agrobacterium,
Rhizobium/Agrobacterium o Escherichia, siendo preferidos
los últimos. Son particularmente preferidos los microorganismos
Escherichia coli DH5, Escherichia coli
XL1-Blue® y Escherichia coli
XL1-Blue MRF'®. Cepas de producción apropiadas son
por consiguiente por ejemplo microorganismos de las especies
Escherichia coli DH5 y Escherichia coli
XL1-Blue MRF'®, que contienen respectivamente los
plásmidos pPRS 1b, pPRS 2a, pPRS 4 o pPRS 7.
El microorganismo Escherichia coli
SL1-Blue MFR®/pPRS 2a fue depositado bajo la
designación DSM 11635 en la Deutschen Sammlung für
Mikroorganismasen und Zellkulturen GmbH, D-38124
Braunschweig, Mascheroderweg 1b, de acuerdo con el Tratado de
Budapest.
El aislamiento de las cepas salvajes
transformadas (cepas de producción) puede realizarse a partir de un
medio nutriente selectivo, al cual se añade un antibiótico, frente
al cual son resistentes las cepas por medio de un gen marcador que
se encuentra en el vector o en el fragmento de DNA.
El proceso correspondiente a la invención para
la producción de (S)- o
(R)-2,2-HTFMPS de las fórmulas
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y/o de (R)- o
(S)-2,2-HTFMPA de las
fórmulas
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\newpage
comprende la transformación de la
amida del ácido propiónico de la
fórmula
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por medio de los microorganismos ya
descritos correspondientes a la invención o por medio de las enzimas
aisladas de ellos con actividad estereoespecífica de
amidohidrolasa.
Convenientemente, en este caso el proceso para
la producción de (R)-2,2-HTFMPS y/o
de (S)-2,2-HTFMPA se realiza por
medio de las "cepas salvajes" del género Klebsiella,
preferiblemente de la especie Klebsiella oxytoca PRS 1 (DSM
11009), Klebsiella oxytoca PRS 1K17 (DSM 11623),
Klebsiella planticula ID-1624 (DSM 11354),
Klebsiella pneumoniae ID-625 (DSM 11355),
por medio de los microorganismos modificados por tecnología genética
derivados de estas "cepas salvajes", o por medio de la enzima
con una amidohidrolasa estereoespecífica.
El proceso para la producción de
(S)-2,2-HTFMPS y/o
(R)-2,2-HTFMPA se realiza
convenientemente por medio de las "cepas salvajes" de las
especies Pseudomonas sp. (DSM 11010), Rhodococcus
opacus ID-622 (DSM 11344), Arthrobacter
ramosus ID-620 (DSM 11350) y Bacillus sp.
ID-621 (DSM 11351).
La biotransformación puede realizarse después de
cultivo convencional de los microorganismos con células en reposo
(células que no se encuentran en crecimiento, que no necesitan ya
fuentes de carbono y energía) o con células en crecimiento.
Preferiblemente la biotransformación se realiza con células en
reposo.
Para la biotransformación pueden emplearse
medios habituales para los expertos, como p.ej. tampón de fosfato
de molaridad baja, tampón HEPES o el medio de sales minerales
descrito previamente.
Convenientemente, la biotransformación se
realiza con adición una sola vez o continuada de la amida del ácido
propiónico (fórmula VI) de tal manera que la concentración no
sobrepase 10% en peso, preferiblemente 2,5% en peso.
El valor de pH del medio puede estar comprendido
en un intervalo de 4 a 10, preferiblemente de 5 a 9,5.
Convenientemente la biotransformación se realiza a una temperatura
de 10 a 60ºC, preferiblemente de 20 a 40ºC.
El (S)- o
(R)-2,2-HTFMPS o la (S)- o
(R)-2,2-HTFMPA obtenido(a) de
este modo puede aislarse por métodos de acabado convencionales
tales como p.ej. por extracción.
Por variación de los nutrientes en el medio y
por ajuste de las condiciones de fermentación al microorganismo
respectivo de manera habitual puede mejorarse adicionalmente el
rendimiento de (S)- o (R)-2,2-HTFMPS
o la (S)- o (R)-2,2-HTFMPA.
Opcionalmente el (S)- o
(R)-2,2-HTFMPA se hidroliza o bien
químicamente en presencia de una base o microbiológicamente por
medio de microorganismos del género Rhodococcus para dar el
ácido respectivo.
Como base puede emplearse un hidróxido de metal
alcalino. Como hidróxido de metal alcalino se emplean
convenientemente hidróxido de sodio o de potasio.
Convenientemente la hidrólisis microbiológica se
realiza con microorganismos de las especies Rhodococcus equi,
Rhodococcus rhodochrous o Rhodococcus sp.
S-6. Preferiblemente con microorganismos de la
especie Rhodococcus equi TG 328 (DSM 6710) o de sus
variantes y mutantes funcionalmente equivalentes. El microorganismo
Rhodococcus equi TG 328 se describe en el documento
US-PS 5258305 y fue depositado en fecha 13.09.1991
en el organismos Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig,
Mascheroderweg 1b, de acuerdo con el Tratado de Budapest.
Habitualmente se cultivan estos microorganismos
antes de la hidrólisis microbiológica propiamente dicha de acuerdo
con Gilligan et al (Appl. Microbiol. Biotech., 39, 1993,
720-725). La hidrólisis microbiológica se realiza
en principio según métodos habituales para los expertos en la
técnica. Convenientemente, la hidrólisis se realiza a una
temperatura de 20 a 40ºC y a un pH de 6 a 9.
\newpage
La producción de la amida del ácido propiónico
de la fórmula
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se realiza de tal manera que
inicialmente, en la primera etapa, el éster del ácido
trifluoroacético de la
fórmula
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se transforma con un ácido mineral
en trifluoroacetona de la
fórmula
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\vskip1.000000\baselineskip
Como ácido mineral puede emplearse por ejemplo
ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico o ácido fosfórico.
Preferiblemente se emplea ácido sulfúrico, ácido fosfórico o ácido
nítrico, y particularmente ácido sulfúrico.
Convenientemente, la transformación se realiza
en la primera etapa en un disolvente polar prótico como p.ej. en un
alcohol inferior, en agua o en una mezcla alcohol
inferior-agua. Como alcohol inferior puede emplearse
por ejemplo metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol,
terc-butanol o isobutanol.
La transformación en la primera etapa se realiza
convenientemente a una temperatura de 50 a 100ºC, preferiblemente a
una temperatura de 70 a 95ºC.
En la segunda etapa del proceso correspondiente
a la invención se transforma la trifluoroacetona (formula IV) con
un cianuro en el nitrilo de ácido propiónico de la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como cianuro se emplea convenientemente un
cianuro de metal alcalino tal como cianuro de sodio o potasio,
preferiblemente cianuro de sodio.
La transformación en la segunda etapa se realiza
convenientemente en presencia de un ácido mineral. Como ácido
mineral pueden emplearse los mismos que se han descrito
anteriormente. Preferiblemente se emplea como ácido mineral ácido
sulfúrico.
Habitualmente el ácido mineral se emplea en
exceso referido a la trifluoroacetona. Preferiblemente se emplean
de 1 a 10 moles de ácido mineral por mol de trifluoroacetona. Como
disolvente pueden emplearse los mismos que en la primera etapa.
Convenientemente, la segunda etapa se realiza a
una temperatura de -20 a 100ºC, preferiblemente de 0 a 20ºC.
En la tercera etapa del proceso correspondiente
a la invención, el nitrilo del ácido propiónico de la fórmula V se
transforma, sea químicamente en un ácido mineral concentrado o
microbiológicamente por medio de microorganismos mutados del género
Rhodococcus en la amida del ácido propiónico de la fórmula
VI.
Como ácidos minerales pueden emplearse los
mismos que en las etapas primera y segunda. Bajo un "ácido mineral
concentrado" se entiende en lo que sigue un ácido mineral al 30
hasta 100%. Convenientemente se emplea en la tercera etapa un ácido
mineral al 75 hasta 100%, preferiblemente un ácido mineral al 90
hasta 100%. La transformación química en la tercera etapa se
realiza convenientemente a una temperatura de 0 a 160ºC,
preferiblemente de 70 a 120ºC.
Los microorganismos mutados del género
Rhodococcus no contienen ya amidasa alguna y por consiguiente ya no
son capaces de transformar una amida en el ácido correspondiente. La
mutación puede realizarse según métodos conocidos (J. H. Miller,
Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory,
1972 p. 24). Métodos de mutación convenientes son el método de
desplazamiento de marco, el método de deleción o el método
transposón-inserción.
Especies de microorganismos apropiadas para la
mutación con Rhodococcus equi, Rhodococcus rhodochrous o
Rhodococcus sp. S-6. Preferiblemente se muta
el Rhodococcus equi TG 328 (DSM 6710) descrito previamente,
obteniéndose Rhodococcus equi TG 328-2 (DSM
11636), o sus variantes y mutantes funcionalmente equivalentes. El
microorganismo TG 328-2 fue depositado en fecha
30.06.1997 en el Deutschen Sammlung für Mikroorganismasen und
Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig,
Mascheroderweg 1b, de acuerdo con el Tratado de Budapest. Este
microorganismo se cultiva en las mismas condiciones que los
microorganismos no mutados ya descritos anteriormente.
El (R)- y
(S)-2,2-HTFMPA son compuestos no
descritos todavía en la bibliografía y son por tanto asimismo objeto
de la invención. Estos pueden emplearse como nuevos productos
intermedios para la producción de (R)- o
(S)-2,2-HTFMPS, p.ej. por
hidrólisis en presencia de una base.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se añadieron 500 g (4,9 mol) de ácido sulfúrico
concentrado (96%, Merck) a 1 l de agua destilada y se calentó el
todo a 73ºC. Se añadieron luego lentamente 500 g (2,69 mol) de
trifluoroacetato de etilo, con lo que se formaron dos fases. La
mezcla de reacción se calentó hasta la temperatura de reflujo y se
separó por destilación la trifluoroacetona así formada. Después de
2 h se aislaron 293,8 g de trifluoroacetona como líquido incoloro,
lo que era equivalente a un rendimiento de aprox. 90%. El análisis
GC indicó una pureza de 92,1%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se añadieron 39,4 g de cianuro de sodio (0,763
mol) a 174 ml de agua destilada y se enfrió el todo a -1ºC. A
continuación se añadieron gota a gota 100 g de trifluoroacetona
(0,822 mol), con lo que se calentó la mezcla de reacción a 6ºC. Una
vez terminada la adición de trifluoroacetona, se añadieron a
4-5ºC 293,4 g de ácido sulfúrico 6 N (1,4916 mol
H'). Se agitó luego la mezcla de reacción durante una noche a la
temperatura ambiente. Seguidamente se extrajo con etiléter o con
terc-butilmetiléter, y las fases orgánicas reunidas
se destilaron a la presión normal a 32ºC o bajo un ligero vacío
(300-120 mbar). En total se obtuvieron 88 g de
producto con una pureza de 91,2% (medida por medio de GC), lo que
corresponde a un rendimiento de 75,6%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se cargó inicialmente en atmósfera de argón
ácido sulfúrico de 98%. Se añadieron a ello 15 g de nitrilo del
ácido
2-hidroxi-2-metil-3,3,3-trifluorometilpropiónico
(86,9% según GC) y se calentó la mezcla de reacción a 95ºC. Después
de la adición del material de partida, la mezcla de reacción se
calentó durante 15 min a 114ºC. Después de ello se enfrió la mezcla
de reacción a 5ºC, con lo que se formó una solución densa de color
pardo. A continuación se añadieron gota a gota 40 g de agua
destilada. En este caso, la mezcla de reacción no debería
calentarse por encima de 15ºC. La suspensión amarillenta así formada
se enfrió durante 15 min a -15ºC y se filtró luego. La torta del
filtro se lavó con 20 ml de agua enfriada con hielo y se secó luego
a vacío. Se obtuvieron así 12,64 g de un producto bruto de color
amarillento claro. A continuación se calentó el producto bruto a
reflujo en 13 ml de acetato de etilo y se enfrió después a la
temperatura ambiente. A esta suspensión se añadieron 15 ml de
hexano y se enfrió el todo a 0ºC. Después de ello se lavó una vez
más con hexano. Después del secado a vacío se obtuvieron 11,8 g de
producto, lo que era equivalente a un rendimiento de 80,2%; punto
de fusión 143,1-144,3ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la mutación se incubó Rhodococcus
equi TG 328 de la manera estándar en "caldo nutriente" con
acridina ICR 191 durante una noche a 30ºC. Después de ello se
cosecharon las células y se lavaron con solución de NaCl al 0,9%.
Se incubaron luego las células en medio reciente durante una noche a
30ºC.
La selección de las células mutadas se realizó
en un medio de sales minerales de acuerdo con Gilligan et al
(Appl. Microbiol. Biotech., 39, 1993, 720-725) en
presencia de fluoroacetamida como "agente contraselectivo".
Este agente "contraselectivo" destruye solamente las bacterias
en crecimiento. Los mutantes, que ya no contienen amidasa alguna y
no crecen con (R,S)-2,2-HTFMPA,
sobreviven y se acumulan.
A continuación se cosecharon las células, se
lavaron con solución de NaCl al 0,9%, se incubaron durante una
noche en medio reciente y se extendieron luego en placas. Las
colonias se testaron respecto a actividad de nitrilohidratasa. La
frecuencia de la mutación deseada era 2%.
El mutante de Rhodococcus equi TG
328-2 se cultivó en un medio de sales minerales de
acuerdo con Gilligan et al (ibid). Las células
lavadas se incubaron a una DO_{650\ nm} = 5,0 no sólo con solución
de nitrilo del ácido
2-hidroxi-2-metil-3,3,3-trifluorometilpropiónico
(al 1%) sino también con una solución de
(R,S)-2,2-HTFMPA (al 1%) en tampón
de fosfato 100 mM (pH 7,7) a 37ºC. Después de 16 h se observó por
medio de análisis GC, que el nitrilo se había transformado
cuantitativamente en amida, mientras que la amida ya no se
hidrolizaba al ácido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
A 10 g de muestra de suelo se añadieron 100 ml
de tampón de fosfato (0,1 M, pH 7,0) y el todo se dejó en reposo
durante 10 minutos y se filtró. Se inoculó luego el sobrenadante
(5,0 ml) o 1 ml de agua residual (ARA, Visp) en un medio de sales
minerales (25 ml; Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, p.
1-7, 1983), que contenía glicerina y
(R,S)-2,2-HTFMPA (relación
carbono/nitrógeno 5\cdot1). A continuación se incubó este cultivo,
hasta que se formó un cultivo mixto, que puede utilizar (R)- y/o
(S)-2,2-HTFMPA como fuente única de
nitrógeno. Este cultivo se inoculó luego varias veces y se incubó a
30ºC hasta que se formó un cultivo mixto.
El cultivo puro de estos microorganismos se
obtuvo con ayuda de técnicas microbiológicas tradicionales. Las
cepas de microorganismos obtenidas de este modo se sometieron a test
sobre placas de agar respecto a su crecimiento en
(R,S)-2,2-HTFMPA. Las cepas
positivas se testaron de nuevo. Con estas cepas se inoculó luego un
medio de precultivo. Los microorganismos contenidos en este
precultivo se pasaron al medio de sales minerales y se ensayaron
luego respecto a su capacidad para utilizar selectivamente
(R)-2,2-HTFMPA y/o
(S)-2,2-HTFMPA como fuente única de
nitrógeno, ensayando el sobrenadante por medio de GC respecto a la
formación de (R)-2,2-HTFMPS o
(S)-2,2-HTFMPS y respecto al
enriquecimiento de uno de los dos enantiómeros amídicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la determinación de la actividad de las
hidrolasas se ajustó la suspensión de microorganismos a una densidad
óptica de 4,0 a 650 nm. Como medio sirvió un tampón de fosfato (100
milimolar) pH 7,0, con 0,5% en peso de
(R,S)-2,2-HTFMPA. Esta suspensión se
incubó 2 horas a 30ºC con agitación. El NH_{4}' liberado por la
hidrolasa se determinó colorimétricamente o por medio de un
electrodo de amonio y el HTFMPA se determinó por GC. La actividad
se expresó como g de (R)- o
(S)-2,2-HTFMPA no
transformada/l/h/densidad óptica a 650 nm, suponiendo que 1 mmol de
NH_{4}' formado equivale a = 1 mmol de HTFMPA no transformado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Klebsiella oxytoca PRS 1 (DSM 11009),
Klebsiella planticula ID-624 (DSM 11354) o
Klebsiella pneumoniae ID-625 (DSM 11355) se
incubaron en placas de medio de sales minerales-agar
con glicerina como fuente de carbono y
(R,S)-2,2-HTFMPA como fuente única
de nitrógeno durante 2 días a 30ºC. La formulación del medio de
sales minerales se describe en Kulla et al, Arch. Microbiol,
135, p. 1-7, 1983. Con estos microorganismos
extendidos en placas se inoculó un medio de precultivo con la misma
composición y se incubó durante 2 días a 30ºC.
El mismo medio de sales minerales (600 ml) se
inoculó con 50 ml de precultivo para la inducción y producción de
biomasas y se incubó a 30ºC durante 21 horas. A continuación se
cosecharon las células por centrifugación y se recogieron en tampón
de fosfato 0,1 M de pH 7,0. Después de la resuspensión de las
células en tampón de fosfato 0,05 M (500 ml, pH 8,0) se ajustó una
densidad óptica a 650 nm de 10 y se añadió 1,0% en peso de
(R,S)-2,2-HTFMPA. Después de una
incubación de aprox. 5,5 h a 40ºC se transformó
(R)-2,2-HTFMPA completamente en el
ácido correspondiente, lo que (sic) una pureza óptica (ee) de 100% y
un rendimiento de 48%.
El transcurso de la reacción se (sic) por medio
de la liberación de NH_{4}' y por medio del análisis GC del
sobrenadante.
\vskip1.000000\baselineskip
De manera análoga al Ejemplo 4.1, se aislaron
los microorganismos Pseudomonas sp. (DSM 11010),
Rhodococcus opacus ID-622 (DSM 11344),
Arthrobacter ramosus ID-620 (DSM 11350) y
Bacillus sp ID-621 (DSM 11351). La duración
de la inducción fue de 2 días en condiciones iguales por lo demás a
las del Ejemplo 4.3.
En contraposición al Ejemplo 4.3, la
biotransformación en el caso de estos microorganismos se realizó con
0,5% en peso de (R,S)-2,2-HTFMPA.
La cepa Pseudomonas sp (DSM 11010) posee una hidrolasa
(S)-específica y la actividad de la hidrolasa se
determinó a pH 6,0 como 0,09 g de
(S)-2,2-HTFMPA (ee = 86%) no
transformada/l/h/D.O. 650 nm).
\vskip1.000000\baselineskip
196 ml de una mezcla de reacción que contenía
(S)-2,2-HTFMPA y
(R)-2,2-HTFMPS (obtenida en el
Ejemplo 4.3) tampón de fosfato 0,1 M (250 ml), pH 10, se extrajeron
3 veces con acetato de etilo (200 ml). Las fases orgánicas reunidas
se secaron con Na_{2}SO_{4} y se concentraron luego por
evaporación a 40ºC y 50 mbar. De este modo se obtuvieron 912 mg de
producto húmedo. Se disolvió éste en acetato de etilo caliente (1,3
ml) y la solución se enfrió luego a la temperatura ambiente.
Después de adición de hexano (2 ml) se precipitó el producto. La
mezcla se enfrió a 0ºC, se filtró el producto y se secó luego a
vacío a 50ºC. De este modo se obtuvieron 791 mg de
(S)-2,2-HTFMPA, lo que era
equivalente a un rendimiento de 78,2% referido a la mitad de la
cantidad empleada. Por medio de análisis GC quiral se identificó
solamente el isómero (S).
\newpage
La fase acuosa remanente se ajustó con HCl conc.
a pH 1 y se extrajo luego dos veces con acetato de etilo (200 ml).
Los extractos se concentraron por evaporación a 40ºC y se secaron
luego. A continuación se añadió 1 ml de tolueno y se enfrió el todo
a la temperatura ambiente. Se añadieron una vez más 2 ml de hexano y
se enfrió el todo a 0ºC. El sólido se lavó 2-3
veces con hexano y se secó luego. En total se obtuvieron, a partir
de la fase acuosa después de secado a vacío a 35ºC, 664 mg de
(R)-2,2-HTFMPS, lo que corresponde a
un rendimiento de 65,7% referido a la mitad de la cantidad
empleada. Por medio de análisis GC quiral se identificó solamente
el isómero (R).
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de reacción que contenía
(S)-2,2-HTFMPA y
(R)-2,2-HTFMPS (obtenida en el
Ejemplo 4.3) se sometió a ultrafiltración, a fin de separar el
material celular. La solución resultante de ello se sometió a
electrodiálisis. Con ello, el
(R)-2,2-HTFMPS y todas las sales
tampón se desplazaron a través de la membrana. Después de la
terminación de la electrodiálisis se obtuvo una solución de
(S)-2,2-HTFMPA puro (2342,2 g). Esta
solución se destiló a 135ºC y 20 mbar hasta que se hubieron
obtenido 447 g de producto. Se añadieron luego 32,7 g de NaOH
sólido (0,8 mol) y la mezcla de reacción se calentó durante 3 h a
temperatura de reflujo. Pasado este tiempo, la
(S)-2,2-HTFMPA se había transformado
completamente en (S)-2,2-HTFMPS. La
solución se enfrió a una temperatura inferior a 25ºC y el pH se
ajustó con 93,6 g de HCl conc. desde pH 13,8 a pH 1,0. La fase
acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo (500 ml). Las
fracciones orgánicas reunidas se secaron con Na_{2}SO_{4} y se
filtraron luego. La solución se concentró por evaporación en el
evaporador rotativo hasta una suspensión espesa. Se añadieron a la
suspensión dos veces 20 ml de tolueno cada vez, a fin de concentrar
una vez más la suspensión obtenida de este modo. Se añadieron luego
una vez más 10 ml de tolueno, a fin de calentar el todo a reflujo.
La solución se enfrió a la temperatura ambiente y se añadió hexano
(30 ml) hasta que precipitó el producto. La suspensión se enfrió a
-10ºC y el producto se recogió por ultrafiltración. Después de
secado a vacío (temperatura < 35ºC) se obtuvieron 14,1 g (0,0892
mol) de (S)-2,2-HTFMPS puro (valor
ee 99,7%), lo que era equivalente a un rendimiento de 35%
(calculado a partir de la mitad del producto de partida).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se introdujeron 0,47 g de hidróxido de sodio
(11,6 mmol) en 5 ml de agua destilada. Se añadieron a lo anterior
650 mg (4,14 mmol) de (S)-2,2-HTFMPA
y se calentó el todo a temperatura de reflujo. Después de 2 horas se
enfrió la mezcla de reacción a la temperatura ambiente y se ajustó
el pH a 1,0 con HCl al 10%. Seguidamente se extrajo la mezcla dos
veces con acetato de etilo (10 ml). Las fases orgánicas reunidas se
secaron sobre Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron por
evaporación a una temperatura máxima de 40ºC. Después de secado en
el horno de vacío (45 min a 35ºC) se obtuvieron 618 mg de
(S)-2,2-HTFMPS, lo que era
equivalente a un rendimiento de 94,4%. Por medio de análisis GC
quiral se identificó solamente un isómero.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron Rhodococcus equi TG 328
(DSM 6710) en un medio de sales minerales de acuerdo con Gilligan
et al. (ibid). Las células lavadas con una DO_{650\
nm} = 5,0 se incubaron con una solución de
(S)-2,2-HTFMPA (1% en tampón de
fosfato 100 mM, pH 7,7) a 37ºC. Después de 16 h se observó por
análisis GC, que el (S)-2,2-HTFMPA
se había transformado cuantitativamente en el
(S)-2,2-HTFMPS.
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Ejemplo
6
Klebsiella oxytoca PRS 1 formaba una
cápsula mucilaginosa, que confería a la cepa propiedades
desfavorables durante la fermentación. Una cepa negativa respecto a
formación de cápsula era ventajosa para la separación de las
células y la elaboración subsiguiente. Se aislaron mutantes
negativos respecto a la formación de cápsula por medio de Acrilina
ICR 191 (J.H. Miller, Experiments Inmolecular Genetics, Cold Spring
Harbor, 1972), como se describe a continuación.
Se inoculó Klebsiella oxytoca PRS 1 en
medio de sales minerales que contenía 0,2% de glucosa y en presencia
de acridina ICR 191, y se incubó durante una noche a 30ºC. A
continuación se inoculó este cultivo en medio reciente y se incubó
una vez más durante una noche a 30ºC. El cultivo se diluyó y se
extendió en placas de agar nutriente. Se escogieron y se ensayaron
las colonias no mucilaginosas. Los mutantes se aislaron con una
frecuencia de 0,18%. Un ejemplo de tales mutantes es Klebsiella
oxytoca PRS IK17 (DSM 11623). Este mutante exhibía el mismo
comportamiento de crecimiento que el tipo salvaje. La enzima
R-específica posee la misma actividad que en
Klebsiella oxytoca PRS 1, si bien la cepa no formaba cápsula
mucilaginosa alguna. Este mutante se utilizó para la
caracterización enzimática y la clonación del gen.
\vskip1.000000\baselineskip
El DNA cromosómico de un cultivo nocturno
reciente de Klebsiella oxytoca PRS 1K17 (100 ml de caldo
nutriente de levadura, 30ºC) se aisló según el método modificado de
R.H. Chesney et al (J. Mol. Biol. 130, 1979), 161-
173).
173).
Las células centrifugadas (15 min, 6500 x g,
4ºC) se resuspendieron en tampón Tris (2,25 ml, 0,05 mol/l, pH 8,0,
10% (p/v) de sacarosa).
Después de la adición de 375 \mul de solución
de lisozima (10 mg/ml; 0,25 mol/l de tampón
Tris-HCl, pH 8,0) y 900 \mul de EDTA de
concentración 0,1 mol/l, pH 8,0, se enfrió la suspensión en hielo
durante 10 min. A esto siguió la adición de 450 \mul de SDS al 5%
(p/v) y de 50 \mul de ribonucleasa (10 mg/ml H_{2}O) y una
incubación a 37ºC durante 30 min. la incubación se continuó después
de la adición de una punta de espátula de proteinasa K y 400 \mul
de pronasa (20 ml/ml H_{2}O) durante 2 h.
Se centrifugó después de mezcladura con 4,3 g de
CsCl (30 min, 40.000 x g, 20ºC), se trató con 250 \mul de bromuro
de etidio (10 mg/ml), y se centrifugó en la ultracentrífuga (tubitos
Vti 65.2) (más de 8 h, 246.000 x g, 20ºC). Bajo luz UV de onda
larga se filtró con succión la banda de DNA de los tubitos. Después
de adición del tampón TE en un volumen 4 veces mayor (10 mmol/l de
Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mmol/l) se extrajo el
bromuro de etidio 3 veces con n-butanol saturado de
agua. El DNA se precipitó con isopropanol, se recogió en tampón TE
y se incubó 15 min a 65ºC. La preparación podía guardarse a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
5 \mug de Klebsiella oxytoca PRS 1K17 y
4,5 \mug de DNA vector (pBLUESCRIPT-KS+®) se
cortaron respectivamente con 20 unidades de enzima de restricción
HindIII en un volumen total de tampón de restricción de 100 \mul
(6,5 h a 37ºC). Los DNAs se precipitaron con etanol y se secaron en
el concentrador Speed Vac®. Los precipitados se recogieron en el
tampón de ligación (20 mmol/l tampón Tris, 10 mmol/l DTT
(ditiotreitol), 10 mmol/l MgCl_{2}, 0,6 mol/l ATP
(adenosintrifosfato), pH 7,2) y se reunieron (volumen de ligación
100 \mul).
Después de la adición de 1 unidad de
DNA-ligasa T4 se incubó durante una noche a
13ºC.
El DNA de la mezcla de ligación se precipitó con
isopropanol y se recogió en 30 \mul de agua para la
transformación.
\vskip1.000000\baselineskip
Células competentes de E. coli
XL1-Blue MRF'® se transformaron por medio de
electroporación con la mezcla de ligación según el método descrito
de S. Fiedler y R. Wirth (Analyt. Biochem., 170, 1988,
38-44).
Para la detección del plásmido se seleccionó en
agar nutriente con ampicilina (100 \mug/ml) y para la detección
del "inserto" con 0,5 mmol/l de IPTG
(isopropil-\beta-D-tiogalactosido)
y X-Gal (30 \mug/ml,
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranosido)
por incubación a 37ºC.
Para una frecuencia de transformación de 1,7 x
10^{8} cfu/ml ("unidades formadoras de colonias" = células
vivas) prácticamente todos los clones poseían una "inserción"
de HindIII.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Clones con plásmidos híbridos ("inserción"
de HindIII) se ensayaron en medio mínimo-agar según
H. Kulla et al. (Arch. Mikrobiol., 135, 1983,
1-7) con 0,4% (v/v) de glicerina como fuente de C,
0,2% (p/v) de (R,S)-2,2-HTFMPA como
fuente única de nitrógeno y ampicilina (5 \mug/ml) para
estabilización del plásmido, respecto a su capacidad de
crecimiento. Únicamente los clones que contenían el gen sad de
amidohidrolasa intacto en la "inserción" de DNA en el plásmido
eran capaces de utilizar el
(R,S)-2,2-HTFMPA como fuente de
nitrógeno, transformar éste en el (R)-ácido buscado y crecer en
este medio mínimo. Los clones seleccionados de tal manera contenían
todos ellos un plásmido híbrido del vector
pBLUESCRIPT-KS+® con una "inserción" HindIII de
aprox. 2,73 kb.
De este modo se identificó la cepa E.
coli XL1-Blue-MRF'® con el
plásmido designado como pPRS 2a, a partir del cual se aisló el
plásmido pPRS 2a y se caracterizó más detalladamente.
\newpage
Ejemplo
8
Por análisis de restricción según procedimiento
convencional (Current Protocols Molecular Biology, John Wiley and
Sons, Nueva York, 1987, sección 2), se construyó un gráfico de
restricción aproximativo de pPRS 2a respecto a XhoI, DraII, SmaI,
PstI, SalI, BamHI. Fig. 1 muestra el gráfico de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Debido al código genético pudo formularse y
sintetizarse un oligómero de DNA mixto para la secuencia peptídica
N-terminal de la amidohidrolasa de Klebsiella
oxytoca PRS 1K17 y con una máquina sintetizadora de DNA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
AS = secuencia de aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos de DNA separados por
electroforesis en gel de agarosa (0,6%), que se obtuvieron después
de restricciones diversas (BamHI, SmaI, DraII, HindIII, EcoRI) de
pPRS 2a, se transfirieron por el proceso conocido de
"transferencia Southern" sobre nitrocelulosa (Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nueva York, 1987,
sección 29 y siguientes).
Los oligómeros de DNA se marcaron del mismo modo
en el terminal 3' con digoxigenina.
La hibridación contra las "transferencias
Southern" se realizó según el procedimiento conocido (en la
fuente bibliográfica mencionada anteriormente).
Por hibridación frente al oligómero nucleotídico
correspondiente a la secuencia de proteínas
N-terminal pudo marcarse un fragmento de DNA
SmaI-BamHI de 1,44 kb de tamaño o un fragmento de
DNA DraII-BamHI de 1,52 kb de tamaño en el plásmido
híbrido pPRS 2a.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de DNA DraII-BamHI
de 1,52 kb de tamaño, o el fragmento de DNA
PstI-BamHI de 1,91 kb de tamaño, que codificaba la
amidohidrolasa (R)-específica de Klebsiella oxytoca
PRS 1K17, se insertó en el DNA vector
pBLUESCRIPT-KS+® digerido del mismo modo.
El vector pBLUESCRIPT-KS+® con
el fragmento de DNA DraII-BamHI de 1,52 kb de tamaño
se designó como plásmido híbrido pPRS 7. El vector
pBLUESCRIPT-KS+® con el fragmento de DNA
PstI-BamHI de 1, kb de tamaño se designó como
plásmido híbrido pPRS 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento SmaI-BamHI de 1,44
kb de tamaño descrito anteriormente en 8.3 se sometió con ayuda de
un secuenciador de DNA de fluorescencia láser a una secuenciación
por fluorescencia de acuerdo con el método didesoxi de Sanger
modificado. De este modo se determinó la secuencia de nucleótidos
designada como SEQ ID No. 1, a partir de la cual se dedujo para la
amidohidrolasa la secuencia de aminoácidos representada por separado
bajo SEQ ID No. 2.
\newpage
Ejemplo
9
La determinación de la actividad se realizó
análogamente al Ejemplo 4.2.
Los resultados con E. coli/pPRS 1b y
E. coli/pPRS 2a se recogen como ejemplo en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Durante la purificación se determinaron
colorimétricamente las fracciones activas. Después de ello se
determinó la actividad del extracto exento de células y de la
enzima pura por medio de GC. Células de Klebsiella oxytoca
PRS 1 (200 ml; DO_{650} = 21 en tampón de fosfato 100 mM, pH 7,5)
se disgregaron por pasadas durante 3 veces a través de la prensa
francesa a 19.000 psi (1309 bar). Se añadió benzonasa (1 \mul x 30
ml de extracto^{-1}) y se centrifugó luego el extracto durante 15
min a 100.000 x g durante 1 h. El sobrenadante (2,94 mg x ml^{-1})
se calentó durante 10 min a 80ºC y la proteína precipitada se
separó luego por centrifugación. El sobrenadante (170 ml, 0,83 mg x
ml^{-1}) se aplicó a una columna de cromatografía HiLoad
Q-Sepharose 26/10 (Pharmacia), que se había
equilibrado previamente con tampón de fosfato 50 mM (pH 7,5, tampón
A). La proteína no fijada se lavó de la columna con 130 ml de
tampón A. Se aplicó luego un gradiente más lineal (500 ml, NaCl 1 M
- NaCl 0 M en tampón A), siendo el caudal 2,5 ml x min^{-1}. Se
recogieron fracciones de 5 ml y se sometieron a test respecto a
actividad. Las fracciones más activas (30-37; 40 ml)
se reunieron, se concentraron por ultrafiltración a 7,5 ml y el
tampón se sometió luego a intercambio contra un tampón de fosfato 10
mM (pH 7,5) por cromatografía de filtración en gel (Sephadex
G-25 M, PD10, Pharmacia). A continuación se
aplicaron las fracciones activas a una columna de hidroxiapatito (5
ml; Bio-Scale CHTI, BioRad), que se había
equilibrado con un tampón de fosfato 10 mM. Por medio de un
gradiente (90 ml; tampón de fosfato 0,5 mM - tampón de fosfato 10
mM, pH 7,5) se recogieron fracciones de 1 ml a un caudal de 2,0 ml
x min^{-1} y se testaron respecto a actividad. Las fracciones
17-25 y 32-34 exhibían actividad. La
proteína (M 37.000) de la fracción 19 y de las fracciones 33 y 34
era pura conforme a SDS-PAGE. La proteína de la
fracción 20 tenía una pureza mayor que 95%. Se reunieron las
fracciones 20-25, se concentraron a 200 \mul y se
aplicaron luego a una columna de cromatografía por filtración en
gel (Superose 12, Pharmacia). De acuerdo con
SDS-PAGE, las fracciones 23-26
eran
puras.
puras.
\newpage
Se obtuvo una secuencia de aminoácidos
N-terminal por transferencia Western, se digirió
luego la proteína con tripsina, se aisló el péptido por HPLC y se
secuenció.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la caracterización de la amidasa se empleó
un extracto exento de células tratado térmicamente. Células de
Klebsiella oxytoca PRS 1K17 (DSM 11623) (DO_{650} = 160) se
disgregaron por sometimiento a pasadas a través de la prensa
francesa a 19.000 psi (1309 bar). Se añadió benzonasa (1 \mul x 30
ml de extracto^{-1}) y se centrifugó luego el extracto a 20.000 x
g durante 1 hora. El sobrenadante (aprox. 20 mg x ml^{-1} de
proteína) se calentó durante 10 min a 70ºC y la proteína precipitada
se separó luego por centrifugación. El sobrenadante (aprox. 2,0 mg
x ml^{-1}) se concentró a 5,0 mg x ml^{-1} de proteína y se
guardó luego a -20ºC. El paso de calentamiento separó aprox. 90% de
proteína no deseada.
La velocidad de reacción era directamente
proporcional a la concentración de proteína hasta una concentración
de proteína de 0,5 mg x ml^{-1}. Por esta razón se empleó
rutinariamente una concentración de proteína de 0,2 mg x ml^{-1}
para los tests. Para la determinación del pH óptimo, la
concentración de (R,S)-2,2-HTFMPA
(sustrato) se ajustó a 0,5% (32 mM), y la temperatura se mantuvo en
40ºC. Para el test se emplearon los tampones indicados en la Tabla
4.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto de la temperatura sobre la reacción se
determinó en tampón CAPS 100mM (pH 10,0) para una concentración de
sustrato de 0,5% (32 mM). El efecto sobre la concentración de
sustrato se determinó a 60ºC en tampón CAPS 100 mM (pH 10,0) y el
efecto de metanol a 40 y 60ºC para una concentración de sustrato de
1% (64 mM) en tampón CAPS 100 mM (pH 10,0). El valor K_{M} de la
reacción se determinó con el programa Enzfitter, de Biosoft.
Fig. 4 Muestra el valor óptimo de pH. El valor
óptimo de pH se encuentra entre 9,5 y 10,5 (tampón CAPS 100 mM,
concentración de sustrato 32 mM).
Fig. 5 Muestra la cinética de
Michaelis-Menten. El valor KM es 32 mM para
(R)-2,2-HTFMPA (60ºC en tampón CAPS
100 mM, pH 10).
Fig. 6 Muestra el óptimo de temperatura. El
óptimo de temperatura es 70ºC (tampón CAPS 100 mM, concentración de
sustrato 32 mM).
Fig. 7 Muestra el efecto de metanol.
Concentraciones de metanol entre 5 y 20% inhiben la reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
El extracto exento de células tratado
térmicamente se inmovilizó con Eupergit C (Röhm GmbH). Se añadió a
ello Eupergit C (3,0 g) para 15 ml de extracto exento de células
tratado térmicamente (concentración de proteína: 51 mg) en tampón
de fosfato de potasio 1 M (pH 8,0). La mezcla se incubó a la
temperatura ambiente con agitación suave durante 90 h. La enzima
inmovilizada se filtró y se lavó 4 veces con 20 ml de tampón de
fosfato de potasio 100 mM (pH 8,0). La enzima unida al soporte (49
mg) arrojó un peso húmedo de 9,5 g de enzima inmovilizada, que se
guardó en tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 10,0) a 4ºC. Para
testar la actividad y la estabilidad de la enzima inmovilizada, se
pusieron 5 g (25 mg de proteína) en una pequeña columna
cromatográfica. A fin de dejar circular el sustrato (100 ml de
amida racémica al 4% en tampón CAPS 100 mM (pH 10)) entre la columna
y el recipiente, se utilizó una bomba peristáltica (0,135 ml x
min^{-1}). Se llevó el todo al baño de agua. A ciertos intervalos
se retiraron muestras para el análisis. La enzima se mantenía activa
todavía después de 200 h. Con 3 biotransformaciones (cada una con 4
g de sustrato racémico, realizándose la primera a 60ºC y las otras
2 a 40ºC) pudieron obtenerse en total 6 g de
(S)-amida. Al comienzo de la reacción se añadió
enzima inmovilizada (actividad específica = 47 \mug x min^{-1}
x mg de proteína^{-1}) a 60ºC, lo cual es comparable (41%) con
enzima no inmovilizada (actividad específica = 114 \mug x
min^{-1} x mg de proteína^{-1} x mg proteína^{-1}).
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: LONZA AG
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Muenchensteinerstrasse 38
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Basilea
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL 4002
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESIGNACIÓN DE LA INVENCIÓN: Proceso para la producción de ácido (S)- o (R)-3,3,3-trifluoro-2- {}\hskip5,7cm hidroxi-2-metilpropiónico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patent In Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1442 Pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: Bicatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Klebsiella oxytoca
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- PROCEDENCIA INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON(ES): pPRS2a
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: tramo (197..1181)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTROS DATOS:/producto= "Amidasa"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 328 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ D NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PR0OCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- PROCEDENCIA INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON(ES): PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
Claims (31)
1. Microorganismos del género Klebsiella,
caracterizados porque exhiben una amidohidrolasa
R-específica y son capaces de utilizar la
R-amida del ácido propiónico de la fórmula VIII
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
como fuente única de nitrógeno, y
extractos enzimáticos de los mismos capacitados para la hidrólisis
de la R-amida del ácido propiónico de la fórmula
VIII.
2. Microorganismo según la reivindicación 1 de
la especie Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticula o
Klebsiella pneumoniae.
3. Microorganismo según la reivindicación 2
seleccionado del grupo constituido por las cepas K. oxytoca
DSM 1109, Klebsiella planticula DSM 11354 y Klebsiella
pneumoniae DSM 11355.
4. Microorganismo según las reivindicaciones 1 a
3, caracterizado porque es un mutante de Klebsiella
negativo respecto a formación de cápsula o es Klebsiella
oxytoca DSM 11623.
5. Microorganismos de las especies
Rhodococcus opacus DSM 11344, Arthrobacter ramosus DSM
11350, Bacillus sp DSM 11351 o Pseudomonas sp. DSM
11010, caracterizados porque exhiben una amidohidrolasa
S-específica y son capaces de utilizar la
S-amida del ácido propiónico de la fórmula VII
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
como fuente única de nitrógeno, y
extractos enzimáticos de los mismos capacitados para la hidrólisis
de la S-amida del ácido propiónico de la fórmula
VII.
6. Microorganismos según la reivindicación 5,
seleccionados del grupo constituido por las cepas Pseudomonas
sp. DSM 11010, Rhodococcus opacus DSM 11344, Arthrobacter
ramosus DSM 11350 y Bacillus sp DSM 11351.
7. Polipéptido, que es una amidohidrolasa
R-específica y es capaz de hidrolizar la
(R)-amida del ácido
3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metilpropiónico
de la fórmula VIII
8. Polipéptido según la reivindicación 7, que
comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID No. 2,
o un derivado de esta secuencia con deleciones, sustituciones,
inserciones, adiciones y/o intercambios de aminoácidos, que está
esencialmente inalterado en su función biológica.
9. Secuencia de DNA que codifica un polipéptido
o un derivado de polipéptido según las reivindicaciones 7 u 8.
10. Secuencia de DNA según la reivindicación 9,
que comprende una secuencia de DNA seleccionada de
- a)
- DNA con la secuencia representada en SEQ ID No. 1, o fragmentos que codifican un polipéptido según la reivindicación 7 de la secuencia representada en SEQ ID No. 1, secuencias complementarias para ello, así como secuencias derivadas de éste, que están degeneradas en las regiones codificantes debido a la variación del código genético; y
- b)
- secuencias de DNA, que se hibridan con las regiones codificantes de las secuencias definidas en (a) en condiciones severas a una temperatura de 67ºC y con un contenido de sal 0,8 M.
11. Secuencia de DNA según las reivindicaciones
9 ó 10, caracterizada por el gráfico de restricción de
acuerdo con Fig. 1.
12. Molécula o vector de DNA recombinante, que
contiene una secuencia de DNA según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11.
13. Microorganismos que contienen una molécula o
vector de DNA recombinante según la reivindicación 12.
14. Microorganismos según la reivindicación 13,
seleccionados de microorganismos de los géneros Escherichia,
Pseudomonas, Comamonas, Acinetobacter,
Rhizobium/Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus,
Rhodococcus, o Agrobacterium.
15. Proceso para la producción de ácido
(S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico
de la fórmula I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y/o de la (R)-amida
del ácido
3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico
de la fórmula
VIII
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
que comprende la transformación de
la amida del ácido propiónico de la fórmula
VI
en la forma de su racemato por
medio de un microorganismo según las reivindicaciones 5 ó 6, o de
las enzimas aisladas a partir de ellos, con actividad
estereoespecífica de amidohidrolasa para el compuesto de la fórmula
I.
16. Proceso según la reivindicación 15,
caracterizado porque se aísla el compuesto de la fórmula I o
VIII.
17. Proceso para la producción de ácido
(R)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico
de la fórmula II
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y/o de la (S)-amida
del ácido
3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico
de la fórmula
VII
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
que comprende la transformación de
la amida del ácido propiónico de la fórmula
VI
en forma de su racemato por medio
de un microorganismo o extractos enzimáticos del mismo según las
reivindicaciones 1 a 4 o de las enzimas aisladas a partir de ellos
con actividad estereoespecífica de amidohidrolasa para dar el
compuesto de la fórmula
II.
18. Proceso según la reivindicación 15,
caracterizado porque se aísla el compuesto de fórmula II y/o
el compuesto de la fórmula VII que se produce por esta
transformación.
19. Proceso según la reivindicación 17 ó 18,
caracterizado porque la enzima aislada es un polipéptido o
derivado de polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 7 u
8.
20. Proceso para la producción de ácido
(S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico,
caracterizado porque se produce como producto intermedio la
(S)-amida del ácido
3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico
de la fórmula VII según el proceso de la reivindicación 17, 18 ó
19, y se hidroliza luego químicamente en presencia de una base o
microbiológicamente por medio de microorganismos de las especies
Rhodococcus equi o Rhodococcus rhodochrous para dar
el compuesto de la fórmula I
21. Proceso para la producción de ácido
(R)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico,
caracterizado porque se obtiene como producto intermedio la
R-amida del ácido
3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico
de la fórmula VIII según el proceso de las reivindicaciones 15 ó
16, y se hidroliza químicamente en presencia de una base o
microbiológicamente por medio de microorganismos de las especies
Rhodococcus equi o Rhodococcus rhodochrous para dar
el compuesto de fórmula II
22. Proceso según las reivindicaciones 20 ó 21,
caracterizado porque la hidrólisis se realiza químicamente
en presencia de una base.
23. Proceso según una cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque la base es un
hidróxido de metal alcalino.
24. Proceso según una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 21, caracterizado porque la amida del
ácido propiónico de la fórmula VI se produce de tal manera que en
la primera etapa el éster del ácido trifluoroacético de la fórmula
III
se transforma con un ácido mineral
en trifluoroacetona de la fórmula
IV
se transforma ésta en la segunda
etapa con un cianuro en el nitrilo del ácido propiónico de la
fórmula
V
y en la tercera etapa se transforma
éste, o bien químicamente con un ácido mineral concentrado, o
microbiológicamente con un microorganismo del género
Rhodococcus, que no contiene amidasa alguna y por tanto no es
capaz de transformar una amida en el ácido correspondiente, en la
amida del ácido propiónico de la fórmula
VI.
25. Proceso según la reivindicación 24,
caracterizado porque el microorganismo es un microorganismo
mutado de las especies Rhodococcus equi o Rhodococcus
rhodochrous, que no contiene amidasa alguna.
26. Proceso según la reivindicación 25,
caracterizado porque el microorganismo es Rhodococcus
equi, TG 328-2' DSM 11636.
27. Proceso según la reivindicación 24,
caracterizado porque en la primera y/o la tercera etapa se
emplea como ácido mineral ácido sulfúrico, ácido fosfórico o ácido
nítrico.
28. Proceso según la reivindicación 24,
caracterizado porque en la segunda etapa se emplea como
cianuro un cianuro de metal alcalino.
29. (R)-Amida del ácido
3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico.
30. (S)-Amida del ácido
3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico.
31. Polipéptido, que es una amidohidrolasa
S-específica y es capaz de hidrolizar la
(S)-amida del ácido
3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico
de la fórmula VII,
que se obtiene a partir de los
microorganismos de la especie Pseudomonas sp. DSM
11010.
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