ES2308788T3 - Proceso para la produccion de acido (s)- o (r)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metilpropionico. - Google Patents

Proceso para la produccion de acido (s)- o (r)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metilpropionico. Download PDF

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Abstract

SE DESCRIBEN NUEVOS MICROORGANISMOS Y UNA NUEVA ENZIMA CAPAZ DE UTILIZAR, COMO FUENTE EXCLUSIVA DE NITROGENO, LA AMIDA DEL ACIDO PROPIONICO DE FORMULA (VI), EN FORMA DE RACEMATO O COMO ISOMEROS OPTICAMENTE ACTIVOS. SE DESCRIBE IGUALMENTE UN PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR EL ACIDO (S) - O (R) - 3, 3, 3 - TRIFLUOR - 2 - HIDROXI 2 - METILPROPIONICO DE FORMULAS (I) Y (II), A PARTIR DEL ESTER TRIFLUORACETO - ACETO. LAS TRES PRIMERAS ETAPAS DEL PROCESO SON QUIMICAS, MIENTRAS QUE LA CUARTA ETAPA ES MICROBIOLOGICA.

Description

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Proceso para la producción de ácido (S)- o (R)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metilpropiónico.
La presente invención se refiere a un nuevo proceso para la producción de ácido (S)- o (R)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metilpropiónico así como nuevos microorganismos, que son capaces de aprovechar la amida del ácido propiónico de la fórmula
1
en forma del racemato o de sus isómeros ópticamente activos como fuente única de nitrógeno.
El ácido (S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico es un producto intermedio importante para la producción de amidas terapéuticas (EP-A 0 524 781).
En lo que sigue se abrevia el ácido 3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metilpropiónico como 2,2-HTFMPS y la amida del ácido 3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metilpropiónico como 2,2-HTFMPA.
De acuerdo con J. Chem. Soc. 1251, p. 2329 se describe un proceso para la producción de (S)-2,2-HTFMPS, en el cual el racemato correspondiente se transforma por medio de dimetoxiestricnina en el enantiómero (S) deseado. Este proceso tiene el inconveniente de que la dimetoxiestricnina empleada para la separación del racemato es demasiado cara.
El documento EP-A 0 524 781 describe un proceso para la producción de (S)-HTFMPS en el cual el racemato correspondiente se transforma por medio de (S)-(-)-\alpha-metilbencilamina en el enantiómero (S) deseado. El inconveniente en este proceso es que tienen que emplearse grandes cantidades de (S)-(-)-\alpha-metilbencilamina, por lo que este proceso es también demasiado costoso.
Objeto de la presente invención es poner a disposición un proceso favorable en costes y técnicamente viable para la producción de (S)- o (R)-2,2-HTFMPS.
Este objetivo se resuelve con los microorganismos correspondientes a la invención según la reivindicación 1 y la reivindicación 11, los polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 4 y con el proceso de acuerdo con las reivindicaciones 15 y 16.
Objeto de la presente invención son por consiguiente microorganismos seleccionados de la naturaleza, denominados "cepas salvajes", extractos enzimáticos de los mismos, las enzimas aisladas a partir de ellos con actividad estereoespecífica de amidohidrolasas así como el DNA/fragmentos de DNA aislado(s) a partir de las "cepas salvajes", que codifican una amidohidrolasa estereoespecífica. Objeto de la presente invención son adicionalmente los denominados microorganismos alterados por tecnología genética, que contienen estos fragmentos de DNA o vectores. Un objeto adicional es un proceso para la producción de (S)- o (R)-2,2-HTFMPS y un proceso para la producción de (S)- o (R)-2,2-HTFMPA con empleo de los microorganismos descritos.
La invención se ilustra adicionalmente por las figuras siguientes.
Fig. 1 muestra el gráfico de restricción del DNA aislado
Fig. 2 muestra el plásmido pPRS 1b
Fig. 3 muestra el plásmido pPRS 2a
Fig. 4 muestra el pH óptimo de la amidohidrolasa
Fig. 5 muestra la cinética de Michaelis-Menton de la amidohidrolasa
Fig. 6 muestra el óptimo de temperatura de la amidohidrolasa
Fig. 7 muestra el efecto de metanol de la amidohidrolasa.
Las "cepas salvajes" correspondientes a la invención pueden aislarse a partir de muestras de suelo, fango o aguas residuales con ayuda de técnicas microbiológicas convencionales. De acuerdo con la invención, el aislamiento se realiza de tal manera que se cultivan éstos en un medio que contiene la amida del ácido propiónico de la fórmula VI en forma del racemato o de uno de sus isómeros ópticamente activos como fuente única de nitrógeno con una fuente de carbono apropiada de la manera habitual. A partir del cultivo obtenido por selección se eligen luego aquellas que son estables y que utilizan la amida del ácido propiónico de la fórmula VI como fuente única de nitrógeno.
Como fuentes de carbono apropiadas las "cepas salvajes" pueden utilizar azúcares, alcoholes-azúcar o ácidos carboxílicos como sustrato de desarrollo. Como azúcares pueden emplearse p.ej. glucosa, arabinosa, ramnosa, lactosa o maltosa. Como alcoholes-azúcar pueden utilizarse por ejemplo sorbita, manita o glicerina. Como ácido carboxílico puede utilizarse por ejemplo ácido cítrico. Preferiblemente se emplean como fuente de carbono glicerina o glucosa.
Como medio de selección y cultivo pueden emplearse los utilizados habitualmente en el mundo de la técnica, como por ejemplo un medio de sales minerales de acuerdo con Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, p. 1-7, 1983.
Durante el cultivo y la selección se inducen convenientemente las enzimas activas de los microorganismos. Como inductor enzimático puede emplearse la amida del ácido propiónico de la fórmula VI en forma de racemato o de uno de sus isómeros ópticamente activos, acetamida o diamida del ácido malónico.
Habitualmente se realiza el cultivo y la selección a una temperatura de 0 a 42ºC, preferiblemente de 20 a 37ºC y a un valor de pH de 4 a 9, preferiblemente a un valor de pH de 6 a 8.
"Cepas salvajes" preferidas son amida del ácido propiónico (formula VI) a aprovechar del género Klebsiella. Son particularmente muy preferidos microorganismos de las especies Klebsiella oxytoca PRS 1 (DSM 11009), Klebsiella oxytoca PRS 1K17 (DSM 11623), Pseudomonas sp. (DSM 11010), Rhodococcus opacus ID-622 (DSM W11344), Arthrobacter ramosus ID-620 (DSM 11350), Bacillus sp ID-621 (DSM 11351), Klebsiella planticula ID-624 (DSM 11354) y Klebsiella pneumoniae ID-625 (DSM 11355), así como sus variantes y mutantes funcionales equivalentes. En este contexto exhiben las "cepas salvajes" Klebsiella oxytoca (DSM 11009), Klebsiella planticula ID-624 (DSM 11354) y Klebsiella pneumoniae ID-625 (DSM 11355) preferiblemente actividad de (R)-amidohidrolasa, y las "cepas salvajes" Pseudomonas sp. (DSM 11010), Rhodococcus opacus ID-622 (DSM 11344), Arthrobacter ramosus ID-620 (DSM 11150) y Bacillus sp ID-621 (DSM 11351) preferiblemente actividad de (S)-amidohidrolasa. Los microorganismos con la designación DSM 11010, DSM 11009 fueron depositados en fecha 24.06.1996, los microorganismos con designación DSM 11355, y DSM 11354 en fecha 27.12.1996, los microorganismos con la designación DSM 11351, DSM 11350 y DSM 11344 en fecha 13.12.1996 y los microorganismos con la designación DSM 11623 en fecha 20.06.1997 en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg 1b, D-38124 Braunschweig, de acuerdo con el Tratado de Budapest.
Bajo "variantes y mutantes funcionalmente equivalentes" de las "cepas salvajes" deben entenderse cepas que poseen esencialmente las mismas propiedades y funciones que los microorganismos originales. Variantes y mutantes de este tipo pueden producirse accidentalmente p.ej. por radiación UV o de modo controlado por mutagénesis química como p.ej. por medio de intercaladores, tales como colorantes de acridina.
Descripción Taxonómica de Klebsiella oxytoca PRS 1 (DSM 11009)
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(Continuación)
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(Continuación)
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Descripción Taxonómica de Pseudomonas sp (DSM 11010)
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(Continuación)
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La enzima correspondiente a la invención con actividad estereoespecífica de amidohidrolasa puede obtenerse por ejemplo de las "cepas salvajes" ya descritas y es capaz de hidrolizar la amida del ácido propiónico de la fórmula
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en forma del racemato o de sus isómeros (R), así como variantes y mutantes funcionalmente equivalentes de la misma.
Bajo "variantes y mutantes funcionalmente equivalentes" de las enzimas deben entenderse enzimas que poseen esencialmente las mismas propiedades y funciones. Variantes y mutantes de este tipo pueden formarse accidentalmente p.ej. por mutación.
Convenientemente, la enzima se caracteriza por
a)
un pH óptimo de pH 10 \pm 0,5
b)
un óptimo de temperatura entre 65 y 70ºC para un valor de pH 10 y
c)
un valor K_{M} para el sustrato (R)-2,2-HTFMPA de 32 mM (60ºC en tampón CAPS (ácido 3-(ciclohexilami- no)-1-propanosulfónico) 32 mM de pH 10),
particularmente porque
d)
una concentración de metanol de 5 a 20% actúa como inhibidora,
e)
la secuencia de aminoácidos N-terminal es: Met-Lys-Trp-Leu-Glu-Glu-Ser-Ile-Met-Ala-Lys-Arg-Gly-Val-Gly-Ala-Ser-Arg-Lys-Pro.
Esta amidohidrolasa estereoespecífica puede aislarse a partir de las "cepas salvajes" ya descritas, que son capaces de aprovechar la amida del ácido propiónico de la fórmula VI en forma del racemato o de sus isómeros R como fuente única de nitrógeno. Convenientemente la amidohidrolasa se aísla a partir de las "cepas salvajes" del género Klebsiella, preferiblemente de Klebsiella oxytoca PRS 1 (DSM 11009) o Klebsiella oxytoca PRS 1K17 (DSM 11623).
Evidentemente, esta enzima puede asimismo aislarse de los microorganismos modificados por tecnología genética derivados de estas "cepas salvajes".
Para la obtención de la amidohidrolasa estereoespecífica se emplean las "cepas salvajes" en un medio nutriente acuoso que contiene una fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales minerales y una fuente de vitaminas, seleccionado (cultivado) de modo habitual. Convenientemente, las "cepas salvajes" se cultivan a una temperatura de 20 a 35ºC y a un valor de pH de 6 a 8. La enzima puede aislarse luego después de digestión de las células p.ej. por medio de la Prensa Francesa por un método conocido en sí mismo de purificación enzimática.
El DNA correspondiente a la invención o los fragmentos de DNA correspondientes a la invención, que codifican una amidohidrolasa estereoespecífica, como se representa por la secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO 2, y que se caracterizan por el gráfico de restricción de acuerdo con Fig. 1 y particularmente por la secuencia de nucleótidos en SEQ ID NO 1, comprenden también sus variantes y mutantes genéticas funcionalmente equivalentes, es decir genes, que se derivan de los genes de los organismos de tipo salvaje y cuyos productos génicos están esencialmente inalterados en su función biológica. Las variantes y mutantes genéticas funcionalmente equivalentes comprenden por tanto por ejemplo intercambios de bases dentro del marco de la degeneración conocida del código genético, como pueden obtenerse p.ej. artificialmente a fin de adaptar la secuencia génica al empleo preferido de codones de un microorganismo determinado, en el cual debe obtenerse la expresión. Las variantes y mutantes genéticas comprenden también deleciones, inserciones y sustituciones de bases o codones, con tal que el producto génico de los genes modificados de este tipo se mantenga esencialmente inalterado en su función biológica. De este modo están comprendidas p.ej. secuencias génicas, que exhiben una alta homología con respecto a las secuencias de tipo salvaje, por ejemplo mayor que 70%, y son capaces de hibridarse en condiciones severas de hibridación, p.ej. a temperaturas comprendidas entre 60 y 70ºC y a 0,5 hasta 1,5 M de contenido de sal, particularmente a una temperatura de 67ºC y con contenido de sal 0,8 M con el complemento de las secuencias de tipo salvaje.
Como material de partida para el DNA correspondiente a la invención pueden servir las "cepas salvajes" ya descritas, que se emplean como material de partida para el aislamiento de la amidohidrolasa estereoespecífica correspondiente a la invención.
El aislamiento de los genes intactos o de los fragmentos de DNA intactos correspondientes a la invención puede realizarse según métodos conocidos a partir de un banco de genes de un microorganismo apropiado como Klebsiella oxytoca, a partir del cual pueden aislarse y clonarse de manera conocida el gen de amidohidrolasa, o fragmentos del mismo por hibridación con oligonucleótidos marcados, que contienen las secuencias parciales del gen de amidohidrolasa. En lo que sigue se abrevia el gen de amidohidrolasa como sad.
Para la mejora de la transcripción, el gen sad se pone bajo el control de un promotor fuerte. La elección del promotor depende de las condiciones de expresión deseados, por ejemplo de si se desea una expresión constitutiva o inducida, o del microorganismo en el cual debe realizarse la expresión.
Promotores apropiados son los promotores P_{L} y P_{R} del fago Lambda (véase Schauder et al., Gene, 52, 279-283, 1987), el promotor P_{trc} (Amann et al., Gene, 69, 301-315, 1988), los promotores P_{Nm}, P_{St} (M. Labes et al., Gene, 89, 37-46, 1990), el promotor P_{trp} (Amann et al., Gene, 25, 167-178, 1983), el promotor P_{lac} (Amann et al. Gene, 25, 167-178, 1983) y el promotor P_{tac}, un híbrido de los promotores P_{trp} y P_{lac} mencionados, que puede emplearse como promotor constitutivo o inducible (Russel y Bennett, Gene, 20, 232-243, 1982). Preferiblemente se emplea el promotor P_{lac}.
Para el empleo en la promoción de p.ej. (R)-2,2-HTFMPS en una cepa de producción apropiada se incorporan convenientemente los fragmentos de DNA correspondientes a la invención con ayuda de técnicas conocidas en vectores apropiados conocidos, preferiblemente vectores de expresión.
Como vectores pueden emplearse plásmidos autónomos y autorreplicables o vectores de integración.
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Dependiendo de la clase de los vectores seleccionados, dichos genes sad pueden expresarse en diversos microorganismos. Como vectores son apropiados no sólo vectores con espectro hospedador específico sino también vectores con espectro hospedador amplio ("intervalo de hospedador amplio"). Ejemplos de vectores con espectro hospedador específico, p.ej. para E. coli son pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2, 95-113), el comercialmente pBLUESCRIPT-KS+®, disponible comercialmente pBLUESCRIPT-SK+® (Stratagene), pUC18/19 (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103 - 119, 1985), pK18/19 (Pridmore, Gene, 56, 309 - 312, 1987), pRK29OX (Alvarez-Morales et al., Nucleic Acids Research, 14, 4207 - 4227) y pRA95 (que puede obtenerse de Nycomed Pharma AS, Huidove, Dinamarca). Preferiblemente se emplea pBLUESCRIPT-KS+®.
Como vectores "de intervalo de hospedador amplio" pueden emplearse todos aquellos vectores que son apropiados para bacterias Gram-negativas.
Ejemplos de tales vectores de "intervalo de hospedador amplio" son pRK290 (Ditta et al., PNAS, 77, 7347-7351, 1980) o sus derivados, pKT240 (Bagdasarian et al., Gene, 26, 273-282, 1983) o sus derivados, pGSS33 (Sharpe, Gene, 29, 93-102, 1984), pVK 100 (Knauf y Nester, Plasmasid, 8, 45-54, 1982) o sus derivados, pME285 (Haas e Itoh, Gene, 36, 27-36, 1985) o sus derivados.
De este modo se obtuvieron por ejemplo los plásmidos pPRS 1b (Fig. 2), pPRS 2a (Fig. 3), pPRS 4 y pPRS 7.
Para la obtención de las cepas de producción para la fermentación, es decir, cepas que pueden emplearse para la obtención de p.ej. (R)-2,2-HTFMPS, los fragmentos de DNA o vectores correspondientes a la invención deben introducirse en las cepas salvajes deseadas y apropiadas para la expresión. Convenientemente, los microorganismos se transforman para ello de una manera habitual y conocida en sí misma con los vectores que contienen los fragmentos de DNA correspondientes a la invención. Los microorganismos pueden luego contener el fragmento de DNA correspondiente a la invención en una molécula vectora o integrado en su cromosoma.
Cepas salvajes apropiadas, preferiblemente cepas con alta tolerancia de sustrato y materia prima son por ejemplo microorganismos de los géneros Pseudomonas, Comamonas, Bacillus, Rhodococcus, Acinetobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Rhizobium/Agrobacterium o Escherichia, siendo preferidos los últimos. Son particularmente preferidos los microorganismos Escherichia coli DH5, Escherichia coli XL1-Blue® y Escherichia coli XL1-Blue MRF'®. Cepas de producción apropiadas son por consiguiente por ejemplo microorganismos de las especies Escherichia coli DH5 y Escherichia coli XL1-Blue MRF'®, que contienen respectivamente los plásmidos pPRS 1b, pPRS 2a, pPRS 4 o pPRS 7.
El microorganismo Escherichia coli SL1-Blue MFR®/pPRS 2a fue depositado bajo la designación DSM 11635 en la Deutschen Sammlung für Mikroorganismasen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig, Mascheroderweg 1b, de acuerdo con el Tratado de Budapest.
El aislamiento de las cepas salvajes transformadas (cepas de producción) puede realizarse a partir de un medio nutriente selectivo, al cual se añade un antibiótico, frente al cual son resistentes las cepas por medio de un gen marcador que se encuentra en el vector o en el fragmento de DNA.
El proceso correspondiente a la invención para la producción de (S)- o (R)-2,2-HTFMPS de las fórmulas
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y/o de (R)- o (S)-2,2-HTFMPA de las fórmulas
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comprende la transformación de la amida del ácido propiónico de la fórmula
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por medio de los microorganismos ya descritos correspondientes a la invención o por medio de las enzimas aisladas de ellos con actividad estereoespecífica de amidohidrolasa.
Convenientemente, en este caso el proceso para la producción de (R)-2,2-HTFMPS y/o de (S)-2,2-HTFMPA se realiza por medio de las "cepas salvajes" del género Klebsiella, preferiblemente de la especie Klebsiella oxytoca PRS 1 (DSM 11009), Klebsiella oxytoca PRS 1K17 (DSM 11623), Klebsiella planticula ID-1624 (DSM 11354), Klebsiella pneumoniae ID-625 (DSM 11355), por medio de los microorganismos modificados por tecnología genética derivados de estas "cepas salvajes", o por medio de la enzima con una amidohidrolasa estereoespecífica.
El proceso para la producción de (S)-2,2-HTFMPS y/o (R)-2,2-HTFMPA se realiza convenientemente por medio de las "cepas salvajes" de las especies Pseudomonas sp. (DSM 11010), Rhodococcus opacus ID-622 (DSM 11344), Arthrobacter ramosus ID-620 (DSM 11350) y Bacillus sp. ID-621 (DSM 11351).
La biotransformación puede realizarse después de cultivo convencional de los microorganismos con células en reposo (células que no se encuentran en crecimiento, que no necesitan ya fuentes de carbono y energía) o con células en crecimiento. Preferiblemente la biotransformación se realiza con células en reposo.
Para la biotransformación pueden emplearse medios habituales para los expertos, como p.ej. tampón de fosfato de molaridad baja, tampón HEPES o el medio de sales minerales descrito previamente.
Convenientemente, la biotransformación se realiza con adición una sola vez o continuada de la amida del ácido propiónico (fórmula VI) de tal manera que la concentración no sobrepase 10% en peso, preferiblemente 2,5% en peso.
El valor de pH del medio puede estar comprendido en un intervalo de 4 a 10, preferiblemente de 5 a 9,5. Convenientemente la biotransformación se realiza a una temperatura de 10 a 60ºC, preferiblemente de 20 a 40ºC.
El (S)- o (R)-2,2-HTFMPS o la (S)- o (R)-2,2-HTFMPA obtenido(a) de este modo puede aislarse por métodos de acabado convencionales tales como p.ej. por extracción.
Por variación de los nutrientes en el medio y por ajuste de las condiciones de fermentación al microorganismo respectivo de manera habitual puede mejorarse adicionalmente el rendimiento de (S)- o (R)-2,2-HTFMPS o la (S)- o (R)-2,2-HTFMPA.
Opcionalmente el (S)- o (R)-2,2-HTFMPA se hidroliza o bien químicamente en presencia de una base o microbiológicamente por medio de microorganismos del género Rhodococcus para dar el ácido respectivo.
Como base puede emplearse un hidróxido de metal alcalino. Como hidróxido de metal alcalino se emplean convenientemente hidróxido de sodio o de potasio.
Convenientemente la hidrólisis microbiológica se realiza con microorganismos de las especies Rhodococcus equi, Rhodococcus rhodochrous o Rhodococcus sp. S-6. Preferiblemente con microorganismos de la especie Rhodococcus equi TG 328 (DSM 6710) o de sus variantes y mutantes funcionalmente equivalentes. El microorganismo Rhodococcus equi TG 328 se describe en el documento US-PS 5258305 y fue depositado en fecha 13.09.1991 en el organismos Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig, Mascheroderweg 1b, de acuerdo con el Tratado de Budapest.
Habitualmente se cultivan estos microorganismos antes de la hidrólisis microbiológica propiamente dicha de acuerdo con Gilligan et al (Appl. Microbiol. Biotech., 39, 1993, 720-725). La hidrólisis microbiológica se realiza en principio según métodos habituales para los expertos en la técnica. Convenientemente, la hidrólisis se realiza a una temperatura de 20 a 40ºC y a un pH de 6 a 9.
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La producción de la amida del ácido propiónico de la fórmula
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se realiza de tal manera que inicialmente, en la primera etapa, el éster del ácido trifluoroacético de la fórmula
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se transforma con un ácido mineral en trifluoroacetona de la fórmula
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Como ácido mineral puede emplearse por ejemplo ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico o ácido fosfórico. Preferiblemente se emplea ácido sulfúrico, ácido fosfórico o ácido nítrico, y particularmente ácido sulfúrico.
Convenientemente, la transformación se realiza en la primera etapa en un disolvente polar prótico como p.ej. en un alcohol inferior, en agua o en una mezcla alcohol inferior-agua. Como alcohol inferior puede emplearse por ejemplo metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, terc-butanol o isobutanol.
La transformación en la primera etapa se realiza convenientemente a una temperatura de 50 a 100ºC, preferiblemente a una temperatura de 70 a 95ºC.
En la segunda etapa del proceso correspondiente a la invención se transforma la trifluoroacetona (formula IV) con un cianuro en el nitrilo de ácido propiónico de la fórmula
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Como cianuro se emplea convenientemente un cianuro de metal alcalino tal como cianuro de sodio o potasio, preferiblemente cianuro de sodio.
La transformación en la segunda etapa se realiza convenientemente en presencia de un ácido mineral. Como ácido mineral pueden emplearse los mismos que se han descrito anteriormente. Preferiblemente se emplea como ácido mineral ácido sulfúrico.
Habitualmente el ácido mineral se emplea en exceso referido a la trifluoroacetona. Preferiblemente se emplean de 1 a 10 moles de ácido mineral por mol de trifluoroacetona. Como disolvente pueden emplearse los mismos que en la primera etapa.
Convenientemente, la segunda etapa se realiza a una temperatura de -20 a 100ºC, preferiblemente de 0 a 20ºC.
En la tercera etapa del proceso correspondiente a la invención, el nitrilo del ácido propiónico de la fórmula V se transforma, sea químicamente en un ácido mineral concentrado o microbiológicamente por medio de microorganismos mutados del género Rhodococcus en la amida del ácido propiónico de la fórmula VI.
Como ácidos minerales pueden emplearse los mismos que en las etapas primera y segunda. Bajo un "ácido mineral concentrado" se entiende en lo que sigue un ácido mineral al 30 hasta 100%. Convenientemente se emplea en la tercera etapa un ácido mineral al 75 hasta 100%, preferiblemente un ácido mineral al 90 hasta 100%. La transformación química en la tercera etapa se realiza convenientemente a una temperatura de 0 a 160ºC, preferiblemente de 70 a 120ºC.
Los microorganismos mutados del género Rhodococcus no contienen ya amidasa alguna y por consiguiente ya no son capaces de transformar una amida en el ácido correspondiente. La mutación puede realizarse según métodos conocidos (J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972 p. 24). Métodos de mutación convenientes son el método de desplazamiento de marco, el método de deleción o el método transposón-inserción.
Especies de microorganismos apropiadas para la mutación con Rhodococcus equi, Rhodococcus rhodochrous o Rhodococcus sp. S-6. Preferiblemente se muta el Rhodococcus equi TG 328 (DSM 6710) descrito previamente, obteniéndose Rhodococcus equi TG 328-2 (DSM 11636), o sus variantes y mutantes funcionalmente equivalentes. El microorganismo TG 328-2 fue depositado en fecha 30.06.1997 en el Deutschen Sammlung für Mikroorganismasen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig, Mascheroderweg 1b, de acuerdo con el Tratado de Budapest. Este microorganismo se cultiva en las mismas condiciones que los microorganismos no mutados ya descritos anteriormente.
El (R)- y (S)-2,2-HTFMPA son compuestos no descritos todavía en la bibliografía y son por tanto asimismo objeto de la invención. Estos pueden emplearse como nuevos productos intermedios para la producción de (R)- o (S)-2,2-HTFMPS, p.ej. por hidrólisis en presencia de una base.
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Ejemplo 1
Producción de trifluoroacetona
Se añadieron 500 g (4,9 mol) de ácido sulfúrico concentrado (96%, Merck) a 1 l de agua destilada y se calentó el todo a 73ºC. Se añadieron luego lentamente 500 g (2,69 mol) de trifluoroacetato de etilo, con lo que se formaron dos fases. La mezcla de reacción se calentó hasta la temperatura de reflujo y se separó por destilación la trifluoroacetona así formada. Después de 2 h se aislaron 293,8 g de trifluoroacetona como líquido incoloro, lo que era equivalente a un rendimiento de aprox. 90%. El análisis GC indicó una pureza de 92,1%.
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Ejemplo 2
Producción del nitrilo del ácido 2-hidroxi-2-metil-3,3,3-trifluorometilpropiónico
Se añadieron 39,4 g de cianuro de sodio (0,763 mol) a 174 ml de agua destilada y se enfrió el todo a -1ºC. A continuación se añadieron gota a gota 100 g de trifluoroacetona (0,822 mol), con lo que se calentó la mezcla de reacción a 6ºC. Una vez terminada la adición de trifluoroacetona, se añadieron a 4-5ºC 293,4 g de ácido sulfúrico 6 N (1,4916 mol H'). Se agitó luego la mezcla de reacción durante una noche a la temperatura ambiente. Seguidamente se extrajo con etiléter o con terc-butilmetiléter, y las fases orgánicas reunidas se destilaron a la presión normal a 32ºC o bajo un ligero vacío (300-120 mbar). En total se obtuvieron 88 g de producto con una pureza de 91,2% (medida por medio de GC), lo que corresponde a un rendimiento de 75,6%.
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Ejemplo 3
a) Producción química de (R,S)-2,2-HTFMPA
Se cargó inicialmente en atmósfera de argón ácido sulfúrico de 98%. Se añadieron a ello 15 g de nitrilo del ácido 2-hidroxi-2-metil-3,3,3-trifluorometilpropiónico (86,9% según GC) y se calentó la mezcla de reacción a 95ºC. Después de la adición del material de partida, la mezcla de reacción se calentó durante 15 min a 114ºC. Después de ello se enfrió la mezcla de reacción a 5ºC, con lo que se formó una solución densa de color pardo. A continuación se añadieron gota a gota 40 g de agua destilada. En este caso, la mezcla de reacción no debería calentarse por encima de 15ºC. La suspensión amarillenta así formada se enfrió durante 15 min a -15ºC y se filtró luego. La torta del filtro se lavó con 20 ml de agua enfriada con hielo y se secó luego a vacío. Se obtuvieron así 12,64 g de un producto bruto de color amarillento claro. A continuación se calentó el producto bruto a reflujo en 13 ml de acetato de etilo y se enfrió después a la temperatura ambiente. A esta suspensión se añadieron 15 ml de hexano y se enfrió el todo a 0ºC. Después de ello se lavó una vez más con hexano. Después del secado a vacío se obtuvieron 11,8 g de producto, lo que era equivalente a un rendimiento de 80,2%; punto de fusión 143,1-144,3ºC.
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b) Producción microbiológica de (R,S)-2,2-HTFMPA (por medio de microorganismos mutados del género Rhodococcus)
Para la mutación se incubó Rhodococcus equi TG 328 de la manera estándar en "caldo nutriente" con acridina ICR 191 durante una noche a 30ºC. Después de ello se cosecharon las células y se lavaron con solución de NaCl al 0,9%. Se incubaron luego las células en medio reciente durante una noche a 30ºC.
La selección de las células mutadas se realizó en un medio de sales minerales de acuerdo con Gilligan et al (Appl. Microbiol. Biotech., 39, 1993, 720-725) en presencia de fluoroacetamida como "agente contraselectivo". Este agente "contraselectivo" destruye solamente las bacterias en crecimiento. Los mutantes, que ya no contienen amidasa alguna y no crecen con (R,S)-2,2-HTFMPA, sobreviven y se acumulan.
A continuación se cosecharon las células, se lavaron con solución de NaCl al 0,9%, se incubaron durante una noche en medio reciente y se extendieron luego en placas. Las colonias se testaron respecto a actividad de nitrilohidratasa. La frecuencia de la mutación deseada era 2%.
El mutante de Rhodococcus equi TG 328-2 se cultivó en un medio de sales minerales de acuerdo con Gilligan et al (ibid). Las células lavadas se incubaron a una DO_{650\ nm} = 5,0 no sólo con solución de nitrilo del ácido 2-hidroxi-2-metil-3,3,3-trifluorometilpropiónico (al 1%) sino también con una solución de (R,S)-2,2-HTFMPA (al 1%) en tampón de fosfato 100 mM (pH 7,7) a 37ºC. Después de 16 h se observó por medio de análisis GC, que el nitrilo se había transformado cuantitativamente en amida, mientras que la amida ya no se hidrolizaba al ácido.
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Ejemplo 4
Producción de (S)-2,2-HTPMPA y (R)-2,2-HTFMPS por medio de un microorganismo que contiene una amidohidrolasa (cepa salvaje) 4.1. Selección y aislamiento de microorganismos con actividad de (R)- y (S)-amidasa
A 10 g de muestra de suelo se añadieron 100 ml de tampón de fosfato (0,1 M, pH 7,0) y el todo se dejó en reposo durante 10 minutos y se filtró. Se inoculó luego el sobrenadante (5,0 ml) o 1 ml de agua residual (ARA, Visp) en un medio de sales minerales (25 ml; Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, p. 1-7, 1983), que contenía glicerina y (R,S)-2,2-HTFMPA (relación carbono/nitrógeno 5\cdot1). A continuación se incubó este cultivo, hasta que se formó un cultivo mixto, que puede utilizar (R)- y/o (S)-2,2-HTFMPA como fuente única de nitrógeno. Este cultivo se inoculó luego varias veces y se incubó a 30ºC hasta que se formó un cultivo mixto.
El cultivo puro de estos microorganismos se obtuvo con ayuda de técnicas microbiológicas tradicionales. Las cepas de microorganismos obtenidas de este modo se sometieron a test sobre placas de agar respecto a su crecimiento en (R,S)-2,2-HTFMPA. Las cepas positivas se testaron de nuevo. Con estas cepas se inoculó luego un medio de precultivo. Los microorganismos contenidos en este precultivo se pasaron al medio de sales minerales y se ensayaron luego respecto a su capacidad para utilizar selectivamente (R)-2,2-HTFMPA y/o (S)-2,2-HTFMPA como fuente única de nitrógeno, ensayando el sobrenadante por medio de GC respecto a la formación de (R)-2,2-HTFMPS o (S)-2,2-HTFMPS y respecto al enriquecimiento de uno de los dos enantiómeros amídicos.
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4.2. Determinación de la actividad de la (R)- o (S)-2,2-HTFMPA-amidohidrolasa
Para la determinación de la actividad de las hidrolasas se ajustó la suspensión de microorganismos a una densidad óptica de 4,0 a 650 nm. Como medio sirvió un tampón de fosfato (100 milimolar) pH 7,0, con 0,5% en peso de (R,S)-2,2-HTFMPA. Esta suspensión se incubó 2 horas a 30ºC con agitación. El NH_{4}' liberado por la hidrolasa se determinó colorimétricamente o por medio de un electrodo de amonio y el HTFMPA se determinó por GC. La actividad se expresó como g de (R)- o (S)-2,2-HTFMPA no transformada/l/h/densidad óptica a 650 nm, suponiendo que 1 mmol de NH_{4}' formado equivale a = 1 mmol de HTFMPA no transformado.
TABLA 1 La actividad de hidrolasa de Klebsiella y Pseudomonas
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4.3. Producción de (S)-2,2-HTFMPA y (R)-2,2-HTFMPS
Klebsiella oxytoca PRS 1 (DSM 11009), Klebsiella planticula ID-624 (DSM 11354) o Klebsiella pneumoniae ID-625 (DSM 11355) se incubaron en placas de medio de sales minerales-agar con glicerina como fuente de carbono y (R,S)-2,2-HTFMPA como fuente única de nitrógeno durante 2 días a 30ºC. La formulación del medio de sales minerales se describe en Kulla et al, Arch. Microbiol, 135, p. 1-7, 1983. Con estos microorganismos extendidos en placas se inoculó un medio de precultivo con la misma composición y se incubó durante 2 días a 30ºC.
El mismo medio de sales minerales (600 ml) se inoculó con 50 ml de precultivo para la inducción y producción de biomasas y se incubó a 30ºC durante 21 horas. A continuación se cosecharon las células por centrifugación y se recogieron en tampón de fosfato 0,1 M de pH 7,0. Después de la resuspensión de las células en tampón de fosfato 0,05 M (500 ml, pH 8,0) se ajustó una densidad óptica a 650 nm de 10 y se añadió 1,0% en peso de (R,S)-2,2-HTFMPA. Después de una incubación de aprox. 5,5 h a 40ºC se transformó (R)-2,2-HTFMPA completamente en el ácido correspondiente, lo que (sic) una pureza óptica (ee) de 100% y un rendimiento de 48%.
El transcurso de la reacción se (sic) por medio de la liberación de NH_{4}' y por medio del análisis GC del sobrenadante.
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4.4. Producción de (S)-2,2-HTFMPS y (R)-2,2-HTFMPA por medio de un microorganismo que contiene una (S)-amidohidrolasa
De manera análoga al Ejemplo 4.1, se aislaron los microorganismos Pseudomonas sp. (DSM 11010), Rhodococcus opacus ID-622 (DSM 11344), Arthrobacter ramosus ID-620 (DSM 11350) y Bacillus sp ID-621 (DSM 11351). La duración de la inducción fue de 2 días en condiciones iguales por lo demás a las del Ejemplo 4.3.
En contraposición al Ejemplo 4.3, la biotransformación en el caso de estos microorganismos se realizó con 0,5% en peso de (R,S)-2,2-HTFMPA. La cepa Pseudomonas sp (DSM 11010) posee una hidrolasa (S)-específica y la actividad de la hidrolasa se determinó a pH 6,0 como 0,09 g de (S)-2,2-HTFMPA (ee = 86%) no transformada/l/h/D.O. 650 nm).
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4.5. Elaboración de (S)-2,2-HTFMPA y (R)-2,2-HTFMPS a) Por medio de extracción
196 ml de una mezcla de reacción que contenía (S)-2,2-HTFMPA y (R)-2,2-HTFMPS (obtenida en el Ejemplo 4.3) tampón de fosfato 0,1 M (250 ml), pH 10, se extrajeron 3 veces con acetato de etilo (200 ml). Las fases orgánicas reunidas se secaron con Na_{2}SO_{4} y se concentraron luego por evaporación a 40ºC y 50 mbar. De este modo se obtuvieron 912 mg de producto húmedo. Se disolvió éste en acetato de etilo caliente (1,3 ml) y la solución se enfrió luego a la temperatura ambiente. Después de adición de hexano (2 ml) se precipitó el producto. La mezcla se enfrió a 0ºC, se filtró el producto y se secó luego a vacío a 50ºC. De este modo se obtuvieron 791 mg de (S)-2,2-HTFMPA, lo que era equivalente a un rendimiento de 78,2% referido a la mitad de la cantidad empleada. Por medio de análisis GC quiral se identificó solamente el isómero (S).
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La fase acuosa remanente se ajustó con HCl conc. a pH 1 y se extrajo luego dos veces con acetato de etilo (200 ml). Los extractos se concentraron por evaporación a 40ºC y se secaron luego. A continuación se añadió 1 ml de tolueno y se enfrió el todo a la temperatura ambiente. Se añadieron una vez más 2 ml de hexano y se enfrió el todo a 0ºC. El sólido se lavó 2-3 veces con hexano y se secó luego. En total se obtuvieron, a partir de la fase acuosa después de secado a vacío a 35ºC, 664 mg de (R)-2,2-HTFMPS, lo que corresponde a un rendimiento de 65,7% referido a la mitad de la cantidad empleada. Por medio de análisis GC quiral se identificó solamente el isómero (R).
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b) Por medio de electrodiálisis (aislamiento directo de (S)-HTFMPS
Una mezcla de reacción que contenía (S)-2,2-HTFMPA y (R)-2,2-HTFMPS (obtenida en el Ejemplo 4.3) se sometió a ultrafiltración, a fin de separar el material celular. La solución resultante de ello se sometió a electrodiálisis. Con ello, el (R)-2,2-HTFMPS y todas las sales tampón se desplazaron a través de la membrana. Después de la terminación de la electrodiálisis se obtuvo una solución de (S)-2,2-HTFMPA puro (2342,2 g). Esta solución se destiló a 135ºC y 20 mbar hasta que se hubieron obtenido 447 g de producto. Se añadieron luego 32,7 g de NaOH sólido (0,8 mol) y la mezcla de reacción se calentó durante 3 h a temperatura de reflujo. Pasado este tiempo, la (S)-2,2-HTFMPA se había transformado completamente en (S)-2,2-HTFMPS. La solución se enfrió a una temperatura inferior a 25ºC y el pH se ajustó con 93,6 g de HCl conc. desde pH 13,8 a pH 1,0. La fase acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo (500 ml). Las fracciones orgánicas reunidas se secaron con Na_{2}SO_{4} y se filtraron luego. La solución se concentró por evaporación en el evaporador rotativo hasta una suspensión espesa. Se añadieron a la suspensión dos veces 20 ml de tolueno cada vez, a fin de concentrar una vez más la suspensión obtenida de este modo. Se añadieron luego una vez más 10 ml de tolueno, a fin de calentar el todo a reflujo. La solución se enfrió a la temperatura ambiente y se añadió hexano (30 ml) hasta que precipitó el producto. La suspensión se enfrió a -10ºC y el producto se recogió por ultrafiltración. Después de secado a vacío (temperatura < 35ºC) se obtuvieron 14,1 g (0,0892 mol) de (S)-2,2-HTFMPS puro (valor ee 99,7%), lo que era equivalente a un rendimiento de 35% (calculado a partir de la mitad del producto de partida).
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Ejemplo 5
a) Hidrólisis química de (S)-2,2-HTFMPA a (S)-2,2-HTFMPS
Se introdujeron 0,47 g de hidróxido de sodio (11,6 mmol) en 5 ml de agua destilada. Se añadieron a lo anterior 650 mg (4,14 mmol) de (S)-2,2-HTFMPA y se calentó el todo a temperatura de reflujo. Después de 2 horas se enfrió la mezcla de reacción a la temperatura ambiente y se ajustó el pH a 1,0 con HCl al 10%. Seguidamente se extrajo la mezcla dos veces con acetato de etilo (10 ml). Las fases orgánicas reunidas se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron por evaporación a una temperatura máxima de 40ºC. Después de secado en el horno de vacío (45 min a 35ºC) se obtuvieron 618 mg de (S)-2,2-HTFMPS, lo que era equivalente a un rendimiento de 94,4%. Por medio de análisis GC quiral se identificó solamente un isómero.
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b) Hidrólisis microbiológica de (S)-2,2-HTFMPA a (S)-2,2-HTFMPS
Se cultivaron Rhodococcus equi TG 328 (DSM 6710) en un medio de sales minerales de acuerdo con Gilligan et al. (ibid). Las células lavadas con una DO_{650\ nm} = 5,0 se incubaron con una solución de (S)-2,2-HTFMPA (1% en tampón de fosfato 100 mM, pH 7,7) a 37ºC. Después de 16 h se observó por análisis GC, que el (S)-2,2-HTFMPA se había transformado cuantitativamente en el (S)-2,2-HTFMPS.
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Ejemplo 6
6.1 Obtención de un mutante de Klebsiella oxytoca PRS 1negativo respecto a formación de cápsula
Klebsiella oxytoca PRS 1 formaba una cápsula mucilaginosa, que confería a la cepa propiedades desfavorables durante la fermentación. Una cepa negativa respecto a formación de cápsula era ventajosa para la separación de las células y la elaboración subsiguiente. Se aislaron mutantes negativos respecto a la formación de cápsula por medio de Acrilina ICR 191 (J.H. Miller, Experiments Inmolecular Genetics, Cold Spring Harbor, 1972), como se describe a continuación.
Se inoculó Klebsiella oxytoca PRS 1 en medio de sales minerales que contenía 0,2% de glucosa y en presencia de acridina ICR 191, y se incubó durante una noche a 30ºC. A continuación se inoculó este cultivo en medio reciente y se incubó una vez más durante una noche a 30ºC. El cultivo se diluyó y se extendió en placas de agar nutriente. Se escogieron y se ensayaron las colonias no mucilaginosas. Los mutantes se aislaron con una frecuencia de 0,18%. Un ejemplo de tales mutantes es Klebsiella oxytoca PRS IK17 (DSM 11623). Este mutante exhibía el mismo comportamiento de crecimiento que el tipo salvaje. La enzima R-específica posee la misma actividad que en Klebsiella oxytoca PRS 1, si bien la cepa no formaba cápsula mucilaginosa alguna. Este mutante se utilizó para la caracterización enzimática y la clonación del gen.
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6.2 Producción de DNA cromosómico de Klebsiella oxytoca PRS 1K17 (mutante de PRS 1 negativo respecto a formación de cápsula)
El DNA cromosómico de un cultivo nocturno reciente de Klebsiella oxytoca PRS 1K17 (100 ml de caldo nutriente de levadura, 30ºC) se aisló según el método modificado de R.H. Chesney et al (J. Mol. Biol. 130, 1979), 161-
173).
Las células centrifugadas (15 min, 6500 x g, 4ºC) se resuspendieron en tampón Tris (2,25 ml, 0,05 mol/l, pH 8,0, 10% (p/v) de sacarosa).
Después de la adición de 375 \mul de solución de lisozima (10 mg/ml; 0,25 mol/l de tampón Tris-HCl, pH 8,0) y 900 \mul de EDTA de concentración 0,1 mol/l, pH 8,0, se enfrió la suspensión en hielo durante 10 min. A esto siguió la adición de 450 \mul de SDS al 5% (p/v) y de 50 \mul de ribonucleasa (10 mg/ml H_{2}O) y una incubación a 37ºC durante 30 min. la incubación se continuó después de la adición de una punta de espátula de proteinasa K y 400 \mul de pronasa (20 ml/ml H_{2}O) durante 2 h.
Se centrifugó después de mezcladura con 4,3 g de CsCl (30 min, 40.000 x g, 20ºC), se trató con 250 \mul de bromuro de etidio (10 mg/ml), y se centrifugó en la ultracentrífuga (tubitos Vti 65.2) (más de 8 h, 246.000 x g, 20ºC). Bajo luz UV de onda larga se filtró con succión la banda de DNA de los tubitos. Después de adición del tampón TE en un volumen 4 veces mayor (10 mmol/l de Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mmol/l) se extrajo el bromuro de etidio 3 veces con n-butanol saturado de agua. El DNA se precipitó con isopropanol, se recogió en tampón TE y se incubó 15 min a 65ºC. La preparación podía guardarse a 4ºC.
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6.3 Restricción y ligación del DNA cromosómico
5 \mug de Klebsiella oxytoca PRS 1K17 y 4,5 \mug de DNA vector (pBLUESCRIPT-KS+®) se cortaron respectivamente con 20 unidades de enzima de restricción HindIII en un volumen total de tampón de restricción de 100 \mul (6,5 h a 37ºC). Los DNAs se precipitaron con etanol y se secaron en el concentrador Speed Vac®. Los precipitados se recogieron en el tampón de ligación (20 mmol/l tampón Tris, 10 mmol/l DTT (ditiotreitol), 10 mmol/l MgCl_{2}, 0,6 mol/l ATP (adenosintrifosfato), pH 7,2) y se reunieron (volumen de ligación 100 \mul).
Después de la adición de 1 unidad de DNA-ligasa T4 se incubó durante una noche a 13ºC.
El DNA de la mezcla de ligación se precipitó con isopropanol y se recogió en 30 \mul de agua para la transformación.
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6.4 Transformación de E. coli XL1-Blue MRF'® y selección
Células competentes de E. coli XL1-Blue MRF'® se transformaron por medio de electroporación con la mezcla de ligación según el método descrito de S. Fiedler y R. Wirth (Analyt. Biochem., 170, 1988, 38-44).
Para la detección del plásmido se seleccionó en agar nutriente con ampicilina (100 \mug/ml) y para la detección del "inserto" con 0,5 mmol/l de IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactosido) y X-Gal (30 \mug/ml, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranosido) por incubación a 37ºC.
Para una frecuencia de transformación de 1,7 x 10^{8} cfu/ml ("unidades formadoras de colonias" = células vivas) prácticamente todos los clones poseían una "inserción" de HindIII.
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Ejemplo 7
Cribado de la Klebsiella oxytoca PRS 1K17-GenBank respecto al gen de amidohidrolasa (R)-específico
Clones con plásmidos híbridos ("inserción" de HindIII) se ensayaron en medio mínimo-agar según H. Kulla et al. (Arch. Mikrobiol., 135, 1983, 1-7) con 0,4% (v/v) de glicerina como fuente de C, 0,2% (p/v) de (R,S)-2,2-HTFMPA como fuente única de nitrógeno y ampicilina (5 \mug/ml) para estabilización del plásmido, respecto a su capacidad de crecimiento. Únicamente los clones que contenían el gen sad de amidohidrolasa intacto en la "inserción" de DNA en el plásmido eran capaces de utilizar el (R,S)-2,2-HTFMPA como fuente de nitrógeno, transformar éste en el (R)-ácido buscado y crecer en este medio mínimo. Los clones seleccionados de tal manera contenían todos ellos un plásmido híbrido del vector pBLUESCRIPT-KS+® con una "inserción" HindIII de aprox. 2,73 kb.
De este modo se identificó la cepa E. coli XL1-Blue-MRF'® con el plásmido designado como pPRS 2a, a partir del cual se aisló el plásmido pPRS 2a y se caracterizó más detalladamente.
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Ejemplo 8
Localización del gen de amidohidrolasa (sad) en el fragmento clonado HindIII 8.1 Gráfico de restricción de pPRS 2a
Por análisis de restricción según procedimiento convencional (Current Protocols Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nueva York, 1987, sección 2), se construyó un gráfico de restricción aproximativo de pPRS 2a respecto a XhoI, DraII, SmaI, PstI, SalI, BamHI. Fig. 1 muestra el gráfico de restricción.
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8.2 Formulación de oligómeros de DNA mixtos basada en la secuencia peptídica N-terminal de la amidohidrolasa
Debido al código genético pudo formularse y sintetizarse un oligómero de DNA mixto para la secuencia peptídica N-terminal de la amidohidrolasa de Klebsiella oxytoca PRS 1K17 y con una máquina sintetizadora de DNA.
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18
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AS = secuencia de aminoácidos
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8.3"Hibridación por transferencia Southern" de fragmentos de restricción del plásmido pPRS 2a
Los fragmentos de DNA separados por electroforesis en gel de agarosa (0,6%), que se obtuvieron después de restricciones diversas (BamHI, SmaI, DraII, HindIII, EcoRI) de pPRS 2a, se transfirieron por el proceso conocido de "transferencia Southern" sobre nitrocelulosa (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nueva York, 1987, sección 29 y siguientes).
Los oligómeros de DNA se marcaron del mismo modo en el terminal 3' con digoxigenina.
La hibridación contra las "transferencias Southern" se realizó según el procedimiento conocido (en la fuente bibliográfica mencionada anteriormente).
Por hibridación frente al oligómero nucleotídico correspondiente a la secuencia de proteínas N-terminal pudo marcarse un fragmento de DNA SmaI-BamHI de 1,44 kb de tamaño o un fragmento de DNA DraII-BamHI de 1,52 kb de tamaño en el plásmido híbrido pPRS 2a.
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8.4 Subclonaciones del gen de hidrolasa (sad)
El fragmento de DNA DraII-BamHI de 1,52 kb de tamaño, o el fragmento de DNA PstI-BamHI de 1,91 kb de tamaño, que codificaba la amidohidrolasa (R)-específica de Klebsiella oxytoca PRS 1K17, se insertó en el DNA vector pBLUESCRIPT-KS+® digerido del mismo modo.
El vector pBLUESCRIPT-KS+® con el fragmento de DNA DraII-BamHI de 1,52 kb de tamaño se designó como plásmido híbrido pPRS 7. El vector pBLUESCRIPT-KS+® con el fragmento de DNA PstI-BamHI de 1, kb de tamaño se designó como plásmido híbrido pPRS 4.
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8.5 Secuenciación del gen de hidrolasa (sad)
El fragmento SmaI-BamHI de 1,44 kb de tamaño descrito anteriormente en 8.3 se sometió con ayuda de un secuenciador de DNA de fluorescencia láser a una secuenciación por fluorescencia de acuerdo con el método didesoxi de Sanger modificado. De este modo se determinó la secuencia de nucleótidos designada como SEQ ID No. 1, a partir de la cual se dedujo para la amidohidrolasa la secuencia de aminoácidos representada por separado bajo SEQ ID No. 2.
\newpage
Ejemplo 9
Determinación de la actividad del clon de (R)-amidohidrolasa
La determinación de la actividad se realizó análogamente al Ejemplo 4.2.
Los resultados con E. coli/pPRS 1b y E. coli/pPRS 2a se recogen como ejemplo en la Tabla 2.
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19
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 10
Purificación enzimática y caracterización enzimática 10.1 Purificación enzimática
Durante la purificación se determinaron colorimétricamente las fracciones activas. Después de ello se determinó la actividad del extracto exento de células y de la enzima pura por medio de GC. Células de Klebsiella oxytoca PRS 1 (200 ml; DO_{650} = 21 en tampón de fosfato 100 mM, pH 7,5) se disgregaron por pasadas durante 3 veces a través de la prensa francesa a 19.000 psi (1309 bar). Se añadió benzonasa (1 \mul x 30 ml de extracto^{-1}) y se centrifugó luego el extracto durante 15 min a 100.000 x g durante 1 h. El sobrenadante (2,94 mg x ml^{-1}) se calentó durante 10 min a 80ºC y la proteína precipitada se separó luego por centrifugación. El sobrenadante (170 ml, 0,83 mg x ml^{-1}) se aplicó a una columna de cromatografía HiLoad Q-Sepharose 26/10 (Pharmacia), que se había equilibrado previamente con tampón de fosfato 50 mM (pH 7,5, tampón A). La proteína no fijada se lavó de la columna con 130 ml de tampón A. Se aplicó luego un gradiente más lineal (500 ml, NaCl 1 M - NaCl 0 M en tampón A), siendo el caudal 2,5 ml x min^{-1}. Se recogieron fracciones de 5 ml y se sometieron a test respecto a actividad. Las fracciones más activas (30-37; 40 ml) se reunieron, se concentraron por ultrafiltración a 7,5 ml y el tampón se sometió luego a intercambio contra un tampón de fosfato 10 mM (pH 7,5) por cromatografía de filtración en gel (Sephadex G-25 M, PD10, Pharmacia). A continuación se aplicaron las fracciones activas a una columna de hidroxiapatito (5 ml; Bio-Scale CHTI, BioRad), que se había equilibrado con un tampón de fosfato 10 mM. Por medio de un gradiente (90 ml; tampón de fosfato 0,5 mM - tampón de fosfato 10 mM, pH 7,5) se recogieron fracciones de 1 ml a un caudal de 2,0 ml x min^{-1} y se testaron respecto a actividad. Las fracciones 17-25 y 32-34 exhibían actividad. La proteína (M 37.000) de la fracción 19 y de las fracciones 33 y 34 era pura conforme a SDS-PAGE. La proteína de la fracción 20 tenía una pureza mayor que 95%. Se reunieron las fracciones 20-25, se concentraron a 200 \mul y se aplicaron luego a una columna de cromatografía por filtración en gel (Superose 12, Pharmacia). De acuerdo con SDS-PAGE, las fracciones 23-26 eran
puras.
\newpage
10.2 Secuenciación de las proteínas
Se obtuvo una secuencia de aminoácidos N-terminal por transferencia Western, se digirió luego la proteína con tripsina, se aisló el péptido por HPLC y se secuenció.
20
\vskip1.000000\baselineskip
10.3 Caracterización de la enzima
Para la caracterización de la amidasa se empleó un extracto exento de células tratado térmicamente. Células de Klebsiella oxytoca PRS 1K17 (DSM 11623) (DO_{650} = 160) se disgregaron por sometimiento a pasadas a través de la prensa francesa a 19.000 psi (1309 bar). Se añadió benzonasa (1 \mul x 30 ml de extracto^{-1}) y se centrifugó luego el extracto a 20.000 x g durante 1 hora. El sobrenadante (aprox. 20 mg x ml^{-1} de proteína) se calentó durante 10 min a 70ºC y la proteína precipitada se separó luego por centrifugación. El sobrenadante (aprox. 2,0 mg x ml^{-1}) se concentró a 5,0 mg x ml^{-1} de proteína y se guardó luego a -20ºC. El paso de calentamiento separó aprox. 90% de proteína no deseada.
La velocidad de reacción era directamente proporcional a la concentración de proteína hasta una concentración de proteína de 0,5 mg x ml^{-1}. Por esta razón se empleó rutinariamente una concentración de proteína de 0,2 mg x ml^{-1} para los tests. Para la determinación del pH óptimo, la concentración de (R,S)-2,2-HTFMPA (sustrato) se ajustó a 0,5% (32 mM), y la temperatura se mantuvo en 40ºC. Para el test se emplearon los tampones indicados en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4
22
El efecto de la temperatura sobre la reacción se determinó en tampón CAPS 100mM (pH 10,0) para una concentración de sustrato de 0,5% (32 mM). El efecto sobre la concentración de sustrato se determinó a 60ºC en tampón CAPS 100 mM (pH 10,0) y el efecto de metanol a 40 y 60ºC para una concentración de sustrato de 1% (64 mM) en tampón CAPS 100 mM (pH 10,0). El valor K_{M} de la reacción se determinó con el programa Enzfitter, de Biosoft.
Fig. 4 Muestra el valor óptimo de pH. El valor óptimo de pH se encuentra entre 9,5 y 10,5 (tampón CAPS 100 mM, concentración de sustrato 32 mM).
Fig. 5 Muestra la cinética de Michaelis-Menten. El valor KM es 32 mM para (R)-2,2-HTFMPA (60ºC en tampón CAPS 100 mM, pH 10).
Fig. 6 Muestra el óptimo de temperatura. El óptimo de temperatura es 70ºC (tampón CAPS 100 mM, concentración de sustrato 32 mM).
Fig. 7 Muestra el efecto de metanol. Concentraciones de metanol entre 5 y 20% inhiben la reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
10.4 Inmovilización de las enzimas
El extracto exento de células tratado térmicamente se inmovilizó con Eupergit C (Röhm GmbH). Se añadió a ello Eupergit C (3,0 g) para 15 ml de extracto exento de células tratado térmicamente (concentración de proteína: 51 mg) en tampón de fosfato de potasio 1 M (pH 8,0). La mezcla se incubó a la temperatura ambiente con agitación suave durante 90 h. La enzima inmovilizada se filtró y se lavó 4 veces con 20 ml de tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 8,0). La enzima unida al soporte (49 mg) arrojó un peso húmedo de 9,5 g de enzima inmovilizada, que se guardó en tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 10,0) a 4ºC. Para testar la actividad y la estabilidad de la enzima inmovilizada, se pusieron 5 g (25 mg de proteína) en una pequeña columna cromatográfica. A fin de dejar circular el sustrato (100 ml de amida racémica al 4% en tampón CAPS 100 mM (pH 10)) entre la columna y el recipiente, se utilizó una bomba peristáltica (0,135 ml x min^{-1}). Se llevó el todo al baño de agua. A ciertos intervalos se retiraron muestras para el análisis. La enzima se mantenía activa todavía después de 200 h. Con 3 biotransformaciones (cada una con 4 g de sustrato racémico, realizándose la primera a 60ºC y las otras 2 a 40ºC) pudieron obtenerse en total 6 g de (S)-amida. Al comienzo de la reacción se añadió enzima inmovilizada (actividad específica = 47 \mug x min^{-1} x mg de proteína^{-1}) a 60ºC, lo cual es comparable (41%) con enzima no inmovilizada (actividad específica = 114 \mug x min^{-1} x mg de proteína^{-1} x mg proteína^{-1}).
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: LONZA AG
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Muenchensteinerstrasse 38
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Basilea
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CÓDIGO POSTAL 4002
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
DESIGNACIÓN DE LA INVENCIÓN: Proceso para la producción de ácido (S)- o (R)-3,3,3-trifluoro-2- {}\hskip5,7cm hidroxi-2-metilpropiónico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
SOPORTE DE DATOS: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: Patent In Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1442 Pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: Bicatenario
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Klebsiella oxytoca
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
PROCEDENCIA INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON(ES): pPRS2a
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DISTINTIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: tramo (197..1181)
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTROS DATOS:/producto= "Amidasa"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
23
24
\hskip1,2cm
25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 328 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ D NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
26
\hskip1,2cm
27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
290
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
30
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PR0OCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: PRS1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,2cm
37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLASE: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CLASE DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
INDIVIDUO/AISLADO: PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
PROCEDENCIA INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON(ES): PRS1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
38

Claims (31)

1. Microorganismos del género Klebsiella, caracterizados porque exhiben una amidohidrolasa R-específica y son capaces de utilizar la R-amida del ácido propiónico de la fórmula VIII
\vskip1.000000\baselineskip
39
\vskip1.000000\baselineskip
como fuente única de nitrógeno, y extractos enzimáticos de los mismos capacitados para la hidrólisis de la R-amida del ácido propiónico de la fórmula VIII.
2. Microorganismo según la reivindicación 1 de la especie Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticula o Klebsiella pneumoniae.
3. Microorganismo según la reivindicación 2 seleccionado del grupo constituido por las cepas K. oxytoca DSM 1109, Klebsiella planticula DSM 11354 y Klebsiella pneumoniae DSM 11355.
4. Microorganismo según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque es un mutante de Klebsiella negativo respecto a formación de cápsula o es Klebsiella oxytoca DSM 11623.
5. Microorganismos de las especies Rhodococcus opacus DSM 11344, Arthrobacter ramosus DSM 11350, Bacillus sp DSM 11351 o Pseudomonas sp. DSM 11010, caracterizados porque exhiben una amidohidrolasa S-específica y son capaces de utilizar la S-amida del ácido propiónico de la fórmula VII
\vskip1.000000\baselineskip
40
\vskip1.000000\baselineskip
como fuente única de nitrógeno, y extractos enzimáticos de los mismos capacitados para la hidrólisis de la S-amida del ácido propiónico de la fórmula VII.
6. Microorganismos según la reivindicación 5, seleccionados del grupo constituido por las cepas Pseudomonas sp. DSM 11010, Rhodococcus opacus DSM 11344, Arthrobacter ramosus DSM 11350 y Bacillus sp DSM 11351.
7. Polipéptido, que es una amidohidrolasa R-específica y es capaz de hidrolizar la (R)-amida del ácido 3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metilpropiónico de la fórmula VIII
41
8. Polipéptido según la reivindicación 7, que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID No. 2, o un derivado de esta secuencia con deleciones, sustituciones, inserciones, adiciones y/o intercambios de aminoácidos, que está esencialmente inalterado en su función biológica.
9. Secuencia de DNA que codifica un polipéptido o un derivado de polipéptido según las reivindicaciones 7 u 8.
10. Secuencia de DNA según la reivindicación 9, que comprende una secuencia de DNA seleccionada de
a)
DNA con la secuencia representada en SEQ ID No. 1, o fragmentos que codifican un polipéptido según la reivindicación 7 de la secuencia representada en SEQ ID No. 1, secuencias complementarias para ello, así como secuencias derivadas de éste, que están degeneradas en las regiones codificantes debido a la variación del código genético; y
b)
secuencias de DNA, que se hibridan con las regiones codificantes de las secuencias definidas en (a) en condiciones severas a una temperatura de 67ºC y con un contenido de sal 0,8 M.
11. Secuencia de DNA según las reivindicaciones 9 ó 10, caracterizada por el gráfico de restricción de acuerdo con Fig. 1.
12. Molécula o vector de DNA recombinante, que contiene una secuencia de DNA según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
13. Microorganismos que contienen una molécula o vector de DNA recombinante según la reivindicación 12.
14. Microorganismos según la reivindicación 13, seleccionados de microorganismos de los géneros Escherichia, Pseudomonas, Comamonas, Acinetobacter, Rhizobium/Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Rhodococcus, o Agrobacterium.
15. Proceso para la producción de ácido (S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico de la fórmula I
\vskip1.000000\baselineskip
42
\vskip1.000000\baselineskip
y/o de la (R)-amida del ácido 3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico de la fórmula VIII
\vskip1.000000\baselineskip
43
\vskip1.000000\baselineskip
que comprende la transformación de la amida del ácido propiónico de la fórmula VI
44
en la forma de su racemato por medio de un microorganismo según las reivindicaciones 5 ó 6, o de las enzimas aisladas a partir de ellos, con actividad estereoespecífica de amidohidrolasa para el compuesto de la fórmula I.
16. Proceso según la reivindicación 15, caracterizado porque se aísla el compuesto de la fórmula I o VIII.
17. Proceso para la producción de ácido (R)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico de la fórmula II
\vskip1.000000\baselineskip
45
\vskip1.000000\baselineskip
y/o de la (S)-amida del ácido 3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico de la fórmula VII
\vskip1.000000\baselineskip
46
\vskip1.000000\baselineskip
que comprende la transformación de la amida del ácido propiónico de la fórmula VI
47
en forma de su racemato por medio de un microorganismo o extractos enzimáticos del mismo según las reivindicaciones 1 a 4 o de las enzimas aisladas a partir de ellos con actividad estereoespecífica de amidohidrolasa para dar el compuesto de la fórmula II.
18. Proceso según la reivindicación 15, caracterizado porque se aísla el compuesto de fórmula II y/o el compuesto de la fórmula VII que se produce por esta transformación.
19. Proceso según la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque la enzima aislada es un polipéptido o derivado de polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8.
20. Proceso para la producción de ácido (S)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico, caracterizado porque se produce como producto intermedio la (S)-amida del ácido 3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico de la fórmula VII según el proceso de la reivindicación 17, 18 ó 19, y se hidroliza luego químicamente en presencia de una base o microbiológicamente por medio de microorganismos de las especies Rhodococcus equi o Rhodococcus rhodochrous para dar el compuesto de la fórmula I
48
21. Proceso para la producción de ácido (R)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico, caracterizado porque se obtiene como producto intermedio la R-amida del ácido 3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico de la fórmula VIII según el proceso de las reivindicaciones 15 ó 16, y se hidroliza químicamente en presencia de una base o microbiológicamente por medio de microorganismos de las especies Rhodococcus equi o Rhodococcus rhodochrous para dar el compuesto de fórmula II
49
22. Proceso según las reivindicaciones 20 ó 21, caracterizado porque la hidrólisis se realiza químicamente en presencia de una base.
23. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque la base es un hidróxido de metal alcalino.
24. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, caracterizado porque la amida del ácido propiónico de la fórmula VI se produce de tal manera que en la primera etapa el éster del ácido trifluoroacético de la fórmula III
50
se transforma con un ácido mineral en trifluoroacetona de la fórmula IV
51
se transforma ésta en la segunda etapa con un cianuro en el nitrilo del ácido propiónico de la fórmula V
52
y en la tercera etapa se transforma éste, o bien químicamente con un ácido mineral concentrado, o microbiológicamente con un microorganismo del género Rhodococcus, que no contiene amidasa alguna y por tanto no es capaz de transformar una amida en el ácido correspondiente, en la amida del ácido propiónico de la fórmula VI.
25. Proceso según la reivindicación 24, caracterizado porque el microorganismo es un microorganismo mutado de las especies Rhodococcus equi o Rhodococcus rhodochrous, que no contiene amidasa alguna.
26. Proceso según la reivindicación 25, caracterizado porque el microorganismo es Rhodococcus equi, TG 328-2' DSM 11636.
27. Proceso según la reivindicación 24, caracterizado porque en la primera y/o la tercera etapa se emplea como ácido mineral ácido sulfúrico, ácido fosfórico o ácido nítrico.
28. Proceso según la reivindicación 24, caracterizado porque en la segunda etapa se emplea como cianuro un cianuro de metal alcalino.
29. (R)-Amida del ácido 3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico.
30. (S)-Amida del ácido 3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico.
31. Polipéptido, que es una amidohidrolasa S-específica y es capaz de hidrolizar la (S)-amida del ácido 3,3,3-trifluoro-2-hidroxi-2-metil-propiónico de la fórmula VII,
53
que se obtiene a partir de los microorganismos de la especie Pseudomonas sp. DSM 11010.
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