KR0152667B1 - 페니실린 g 아실라아제, 이 효소를 코드화한 유전자 및 이 효소의 제조방법 - Google Patents

페니실린 g 아실라아제, 이 효소를 코드화한 유전자 및 이 효소의 제조방법

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Abstract

페니실린G 아실라아제, 이 효소를 코드화한 유전자 및 이 효소의 제조 방법.
본 발명은 페니실린G 아실라아제를 코드화한 유전자, 이 유전자에 의해 코드화된 효소 및 이 유전자를 숙주에 통합하고 발현시킴으로써 상기 효소를 생산하는 방법에 관한 것이다. 유전자는 Alcaligenes faecalis 미생물 균주로부터 바람직하게 얻어진다.

Description

페니실린G 아실라아제, 이 효소를 코드화한 유전자 및 이 효소의 제조 방법
제1도는 A. faecalis 페니실린G 아실라아제 유전자 영역의 물리지도.
pAF1 삽입체가 도시되어 있음.
제2도는 플라스미드 pMcTNde의 구조.
제3도는 플라스미드 pMCTAFlA의 구조.
제4도는 tac 프로모터의 구조.
제5도는 trp 프로모터의 구조.
제6도는 플라스미드 pKTAFA의 구조.
제7도는 p78 프로모터의 구조.
제8도는 pf3 프로모터의 구조.
서열리스트 1는 A. faecalis의 페니실린G 아실라아제 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 신규 pac 효소의 아미노산 서열.
서열리스트 2는 tac 프로모터의 뉴클레오티드 서열.
서열리스트 3는 trp 프로모터의 뉴클레오티드 서열.
서열리스트 4는 p78 프로모터의 뉴클레오티드 서열.
서열리스트 5는 pf3 프로모터의 뉴클레오티드 서열.
본발명은 페니실린G 아실라아제를 코드화한 유전자, 이 유전자에 의해 코드화된 페니실린G 아실라아제 및 이 효소를 생산하는 방법에 관한 것이다.
페니실린G 아실라아제(벤질페니실린 아미도히드롤라아제, 페니실린 아미다아제라고도 함: EC 3.5.1.11)는 페니실린G 또는 3-데사세톡시-세팔로스포린G를 페닐아세트산 및 6-아미노페니실란산(6-APA) 또는 7-아미노데사세톡시 세팔로스포란산(7-ADCA)으로 각각 가수분해하는 효소로서 이들 가수분해 물질은 반합성 페니실린 및 세팔로스포린의 상업적인 생산을 위한 매우 중요한 중간생성물이다.
또한 이 효소는 역반응 즉 유기에스테르와 함께 6-APA 및 7-ADCA의 N-아실화를 촉매하여 각각 대응되는 N-아세틸화된 페니실린 및 3-세펨 화합물을 생성한다. (Vandamme, E.J.,의 개괄서, In: Microbial Enzymes and Bioconversions, E. H. Rose (Ed.), Economic Microbiology 5, 467-552(1980): 및 P.B. Mahajan, Appl. Biochem. Biotechnol. 1, 83-86 (1982) 참조)
페니실린G 및 3-데사세톡시세팔로스포린G의 탈아실화에 유용한 페니실린G 아실라아제 생산균주로서 다양한 종류의 미생물들이 관련 문헌에 제시되어 있다. 이와같은 아실라아제 생산 미생물에는 Escherichia coli, Kluyvera citrophila 및 Proteus rettgeri 종의 일부 균주들이 있다. 일부 페니실린G 아실라아제 활성이 Alcaligenes faecalis의 총 세포단편에서 관찰됨을 주지하여야 한다(C. A. Claveridge외, Nature 4733, 237-238(1960)).그러나 이 활성의 원인이 되는 A. faecalis로부터의 효소에 대하여서는 지금까지 거의 밝혀지지 않았다.
재조합 DNA방법을 이용함으로써 상업적으로 사용되는 페니실린G 아실라아제의 생산 수준이 증가하게 되었으며(Mayer외, Adv. Biotechnol. 1, 83-86(1982))또한 이들 효소의 공정에 대한 식견을 넓히게 되었다(Schumacher외, Nucleic Acids Res. 14, 5713-5727(1986)). E. coli의 페니실린G 아실라아제는 큰 선구단백질로 생성되는 것으로 밝혀졌으며 이 선구단백질은 작은 소단위(α) 및 큰 소단위(β)로 구성되는 외질 성숙 단백질로 진행된다. Kluyvera citrophila 아실라아제 유전자를 클로닝 및 서열화한 결과, E. coli 아실라아제 유전자와 상당한 상동성이 있음이 밝혀졌다(J. L. Barbero 외 Gene 49, 69-80(1986)). 또한 Proteus rettgeri 페니실린G 아실라아제 유전자에 대해서도 작은 소단위 및 큰 소단위가 관찰되었다(G. O. Daumy 외, Gene 49, 69-80(1986); 스페인 특허출원 제 8602933호).
본 발명의 일면에서, 제1도에 도시된 구조를 근본적으로 가지는 페니실린G 아실라아제를 코드화하는 유전자가 제공된다. 이 유전자는 A. faecalis로부터 바람직하게 얻어진다.
본 발명의 다른 면에서, 상기 유전자를 포함하는 벡터가 제공되며 또한 상기 유전자의 하나 또는 그 이상의 사본을 포함하는 숙주시스템이 제공된다. 또한 본발명은 다른 전사 및/또는 해독 조절 서열로 대체된 전사 및/또는 해독 조절서열을 포함하는 레귤론의 통제하에 위치하는 상기 페니실린G 아실라아제 유전자를 제공한다. 대체하는 조절 서열은 동일 유기체 또는 다른 유기체로부터 얻어질 수도 있다.
또한 본발명은 상기 조절서열에 관하여 조작된, 본발명의 페니실린G 아실라아제 유전자를 포함하는 벡터 및 이 벡터를 포함하는 숙주를 제공한다. 이 유전자의 발현에 의하여 얻어지는 페니실린G 아실라아제 효소는 놀라울 정도로 좋은 안정성과 높은 특이활성을 가진다.
본발명의 또다른 면에서, 단리된 형태의 상기 페니실린G 아실라아제 효소가 제공된다. 대규모의 아실화 및 탈아실화 과정에 사용될 때에는 고정화형태로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 상기 효소를 코드화하고 있는 형질전환 숙주를 발효시켜 페니실린G 아실라아제를 생산하고 페니실린G 아실라아제를 단리된 형태로 회수하는 방법을 제공한다.
이들 및 기타 발명의 구체화에 대해 이하 본명세서에서 좀더 상세히 개괄한다.
신규 Alcaligenes faecalis 페니실린G 아실라아제(pac)효소는 다음과 같은 본질적인 방식으로 단리될 수 있다; 예컨대 KPA 유도인자의 선택적인 존재하에 pH 6내지 8 특히 7의 인산염 완충용액에서 이스트 추출물을 함유하는 적당한 배지에서 A. faecalis 균주를 배양한다. 어떤 A. faecalis 균주도 사용될 수 있다.
그 다음 바람직한 두단계의 근본적인 방법 즉, 예컨대 첫단계의 에스테르화된 셀룰로오스 및 그 뒤 특히 수산화인회석을 사용한 겔 크로마토그래피에 의하여 정제한다.
정제된 효소의 펩티드 단편 바람직하게는 각 소단위의 NH2-말단의 아미노산의 서열을 분석한다. 결정된 아미노산 서열로부터, 유전자 서열을 검출할 수 있는 DNA프로브가 유도된다. 초기에는 A. faecalis의 페니실린 가수분해 활성은 정제된 페니실린 아실라아제에 존재하는 것으로 확립되었으나 26kD 및 59 kD 크기의 두 소단위의 헤테로이합체에 존재하는 것으로 밝혀졌다.
A. faecalis pac 유전자는 다음과 같은 근본적인 방법으로 크로모좀 DNA로부터 특성확인될 수 있다. 이 유전자는 제1도에 도시된 근본적인 구조를 가진다. 제1도에 도시된 서열과 혼성화가 가능하며 근본적으로 동일한 구조를 가지는 효소를 코드화한 모든 상동 유전자들은 본발명에 포함된다는 사실을 명심하여야 한다.
하이브리드 안정성에 미치는 상이한 요소들의 영향을 분석하여 얻어진 다음 방정식: Tm = 81 + 16.6(log10 Ci) + 0.4(%G + C) - 600/n - 1.5% mis - match (Ausubeld외, 상기)
(상기식에서 n=프로브의 가장 짧은 사슬의 길이
Ci=이온세기(M)
G+C=염기조성)
은 DNA-DNA 혼성화 기술을 사용하여 어느 정도의 상동성이 있는지를 결정하는데 이용될 수 있다.
그러므로, 근본적으로 같은 구조의 개념은 보존적 변이가 포함될 수 있는 서열 즉 동일한 아미노산을 코드화하지만 상기식에 따라서 DNA서열의 35%; 좀더 전형적으로는 10%까지가 상이한 서열을 포괄하는 것을 의미한다.
이미 밝혀진 E. coli 페니실린G 아실라아제의 아미노산 서열(Schumacher외, 상기)과 신규 A. faecalis pac 효소의 아미노산 서열의 상동성을 비교한 결과, 단지 43%의 전반적인 상동성이 밝혀졌다. 더욱이, Kluyvera citrophila pac 효소의 밝혀진 아미노산 서열(Barbero외, 상기)과의 상동성은 단지 44%이었다. A. faecalis pac 유전자는 E. coli에서 자체 프로모터 및/또는 유도 tac 또는 trp 프로모터(제4 및 5도 참조)의 통제하에서 발현될 수 있다. 페니실린G 아실라아제의 생성 결과는 매우 양호하다. tac 프로모터가 있는 A. faecalis pac 유전자를 이용한 효소의 생산은 본래의 A. faecalis 균주의 경우 만큼 높은 생산을 나타낸다. 그러나 후자의 경우에는 유도인자로서 페닐아세테이트 칼륨을 사용할 필요성을 가진다. trp 프로모터의 통제하에 A. faecalis pac 유전자를 가지는 E. coli 균주는 -다른 유도작용도 없이- 상기 언급된 균주의 경우보다 5배나 더 높은 페니실린G 아실라이제 생산을 나타낸다.
두 균주에 있어서는, 고가의 페닐아세테이트 유도인자를 사용하는 유도작용에 의존하지 않아도 된다.
상동 DNA만을 가지는 생산 균주를 얻기위하여 A. faecalis 자체로의 형질전환이 개발되었다. A. faecalis로의 성공적인 DNA형질전환은 상이한 두 방법에 의하여 이루어질 수 있다.
첫번째, E. coli로부터 A.faecalis로의 광범위 숙주 플라스미드에 의한 접합 전달이 이루어질수 있다. 두번째, 레플리콘 RSF 1010에 근거한 플라스미드로 A. faecalis의 전기도입(electroporation)법을 사용할 수 있다(BIORAD-gene pulser).
A. faecalis 유전자의 클로닝에서는 다른 전사서열이 사용될 수 있다. 첫번째로, A. faecalis pac 유전자는 자체 프로모터의 통제하에 A. faecalis에 클로닝될 수 있다. 페니실린G 아실라아제의 생산은 여분의 pac 유전자 없이 또한 페닐아세테이트 칼륨 유도작용에 거의 의존하지 않고 A. faecalis 균주와 비교하여 상당히 개선될 수 있다. 두번째로, 다른 프로모터와는 독립적으로 E. coli trp 프로모터를 사용하면 페니실린G 아실라아제가 거의 유사하게 높은 양으로 얻어진다. 세번째로는 Pseudomonas aeruginosa 파아지 pf3으로부터 얻은 두 발현인자 즉 pf3 및 p78 프로모터(Luiten, PhD thesis, Nijmegen(1986))를 사용하면 페니실린G 아실라아제의 생산은 그 자체의 프로모터 또는 E. coli trp 프로모터의 통제하에 여분의 pac 유전자로 A. faecalis 균주로 얻어진 생산량보다 다소 낮다. 그러나 여분의 pac 유전자없는 A. faecalis 균주의 경우에 비해 여전히 향상되며 페닐아세테이트 칼륨의 유도작용에 훨씬 덜 의존적이다.
종래 기술분야에서는 페니실린G 아실라아제를 단리된 형태로 생산하는데 A. faecalis를 사용하는 것은 제시되지 않았다. 또한 E. coli의 효소에 비하여 신규 A. faecalis 페니실린G 아실라아제 효소의 개선된 특성 뿐만 아니라 A. faecalis로부터 페니실린G 아실라아제의 생산을 증가시키고 용이하게 하기위한 재조합 DNA방법의 이용에 대해서도 지금까지 종래 기술분야에서는 제시되지 않았다.
A. faecalis pac 유전자에 의하여 생산되고 그람- 네가티브 미생물, 바람직하게는 Alcaligenes 또는 Escherichia 더욱 바람직하게는 A. faecalis에 클로닝한 페니실린G 아실라아제는 놀라울 정도로 많은 양이 생산된다. 더욱이 페니실린G 아실라아제 유전자의 안정성 및 특히 특이활성은 지금까지 밝혀진 페니실린 아실라아제 보다 훨씬 더 우수하다. 또한 A. faecalis 정제물이 제공된다. 이 정제물은 바람직한 페니실린G 기질상에서 알려진 페니실린 아실라아제의 활성보다 더 우수한 특이 활성을 타나낸다. 더욱이, 정제물은 E. coli 페니실린 아실라아제과 비교하여 A. faecalis 페니실린G 아실라아제의 열안정성을 측정하는데 이용된다. A. faecalis 페니실린G 아실라아제의 안정성은 E. coli페니실린G 아실라아제에 비해 상당히 우수하여 산업적 조건하에서 더 오래 사용할 수 있다.
페니실린G 아실라아제 및 본 발명에 의해 제공되는 효소는 산업적 조건에서 고정화형태로 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로 고정화되는 담체로서는 키토산, 산화알루미늄, 산화실리슘, 이온교환수지 또는 아크릴레이트비드 예컨대 Eupergit와 선택적으로 가교결합된 젤라틴이 속한다. 다음 실시예에서 본발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
[아실라아제 유전자의 검출 및 클로닝]
Maniatis 외(1982 및 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory), Ausubel 외(1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc., New York)또는 B. Perbal(1988, A Practical Guide to Molecular Cloning, 제2판, John Wiley and Sons Inc., New York)에 기술되어 있는 일반적인 클로닝 기술에 따라 실시하였다. 이들 문헌에는 rDNA분자의 제조 및 증식, 유전자도서관의 제조방법 및 부위지정 또는 임의적인 DNA변이 방법에 대하여 상세히 기술되어 있다. DNA조작에 사용되는 효소는 상업적 제품공급자로부터 구입하여 그 지시에 따라 사용하였다. 플라스미드와 E. coli 클로닝 숙주는 Phabagen collection(puvlic culfure collectiong, Utrecht)로부터 얻었다.
[배지]
상기 Garcia 등에 기술된 대로 페닐아세틸 L-루신(fal)의 선택배지를 제조하였다. 기초배지는 다음과 같다;
M63 기초아가, 2g/l 글루코오스, 1mg/l 티아민, 10mg/l L-프롤린 및 적당한 항생제(50μg/㎖) 클로람페니콜(cap) 또는 25μg/㎖ 암피실린(amp)). 아실 L-루신의 존재하에서 주로 성장하는 E. coli HB101(Leu-)의 형질전환체는 아실라아제 유전자를 함유하고 있는 것으로 여겨진다.
기초 E* 배지 :
16g/l Difco 아가, 포자인자
0.2g/l MgSO4·7H2O, 10g/1 KH2PO4
3.5g/l Na(NH4) HPO4, 1.6g/1 시트르산나트륨
4xLBC 배지 :
이스트 추출물 20g/l, 박토트립톤 40g/1, NaCl 10g/l, 카사미노산 4g/l, 바실돈 0.25g/l (포리제 86-013, Basildon Chemical Corporation), pH 7.0
AF(Alcaligenes faecalis) 배지 :
이스트 추출물 15g/l, Na2HPO4·2H2O 4.5g/1, KH2PO43.4g/1, pH7.0(유도작용의 경우 : 페닐아세트산 칼륨(KPA)1.0g/l)
2xTY 배지 :
16g/l 박토 트립톤, 10g/l 이스트 추출물, 5g/l NaCl. 페닐아세틸 루신은 LGSS,Transferbureau Nijmegen 으로부터 구입하였다. A. faecalis pac 유전자 공여 균주 및 재조합 플라스미드의 숙주로서 A. faecalis 균주 ATCC 19018 (NCTC 415로도 기탁되어 있음)를 사용하였다.
E. coli 균주 JM101, WK6 및 HB101 (Phabagen, Utrecht)를 재조합 플라스미드의 숙주로 사용하였다.
[실시예 1]
A. faecalis 페니실린 아실라아제의 정제 및 특성확인. A. faecalis ATCC 19018 균주를 AF 배지에서 성장시켰다. 원심분리로 세포를 수집하고 다음의 완충용액에 재현탁하였다: Tris 0.1M pH 8.0, EDTA 0.2mM, 라이소자임 0.02mg/㎖. 2시간동안 30℃에서 배양하였다. 세포 파편을 원심분리로 제거하였다.
페니실린G 아실라아제(pac)를 다음 두 단계로 정제하였다. 제1단계는 카르복시메틸 셀룰로오스(CM-52 Whatman)로 얻어진다. 제2단계는 히드록시아파타이트 겔 크로마토그래피(BioraddmlBiogel HTP)를 통하여 잔류오염 단백질을 제거하는 것으로 이루어진다. 얻어진 순수 pac은 동일하지 않은 두 소단위로 이루어져 있는 것 같다. 작은 소단위(α) 및 큰 소단위(β)의 NH2말단 아미노산을 분석하였다. 결과는 다음과 같다.
소단위 α(26 KDa) NH2-Q-X-Q-X-V-E-V-M-X-T
소단위 β(59 KDa) NH2-S-N-L-W-S-T-X-P-E-X-V
[실시예 2]
A. faecalis 페니실린 아실라아제 유전자의 클로닝.
A. faecalis (ATCC 19018)의 크로모좀 DNA를 단리하고 Sau3A로 부분 절단하였다. 4kb 내지 7kb 범위의 단편을 정제하고 BamHI로 절단된 벡터 pACY184에 연결하였다. DNA를 E. coli HB101에 형질전환하고 fal-플레이트(방법참조)에 도말하였다. 두 포지티브 클론 pAF1 및 pAF2를 식별하였다. 또한 이들 클론은 Serratia Marcescens Overlay 기술(Meevootisom, V. 외, Appl. Microbiol. Biotechnol. 25, 372-378 (1987))에서 포지티브 결과로 테스트 되었다. pAF1 플라스미드의 6.4kb 삽입체가 제1도에 도시되어 있다. 유전자의 위치는 A. faecalis pac의 β-소단위의 NH2-말단 서열에 구성되어 있는 올리고뉴클레오티드에 의하여 결정되어진다.
다음의 올리고뉴클레오티드를 pAF1 삽입체의 혼성화 프로브로 사용하였다: AGC AAC CTG TGG AGC A/C C/G C TGC CCG GAG TGC GT.
제한지도상의 혼성화 시그날의 위치로부터 A. faecalis pac 유전자의 방향성을 결정하였다(제1도).
[실시예 3]
A. faecalis 페니실린 아실라아제의 서열 확인.
6.4kb 삽입체의 3.9kb Sau3A-NdeI 서브클론은 pac 활성을 보이는 반면 3.1kb Sau3A-Sphl 단편은 불활성이었다(제1도). 3.9kb 삽입체의 DNA서열을 pTZ18R 및 pTZ19R(Pharm-acia)에서 적당한 단편의 데옥시 서열화방법에 의하여 결정하였다. A.faecalis pac의 코딩 DNA서열 및 아미노산 서열은 서열리스트 1에 도시되어 있다. 아미노산 서열로부터, A. faecalis pac은 상이한 두 소단위 즉 α 및 β로 진행되는 하나의 단일 폴리펩티드 사슬로 코드화되어 있음을 알 수 있다. 선구물질의 5'부위에 효소를 세포외질로 전위시키는데 관여하는 전형적인 시그날 서열이 있다.
[실시예 4]
E. coli에서 페니실린 아실라아제의 발현. 플라스미드 pAF1를 SalI으로 절단하고 4.8kb 단편을 정제하였다. 이 단편을 SalI으로 선형화한 벡터 pMCT-Nde에 연결하였다. 이 벡터는 RBS부위 및 NdeI 클로닝부위가 뒤따르는 tac 프로모터(제2도)를 포함하는 단편을 플라스미드 pMc5-8(EP-A-0351029)에 삽입하여 제조되었다. E. coli HB101에 형질전환한 후 얻어진 플라스미드 pMcTAFIA(제3도)는 자체 프로모터 및/또는 유도 tac 프로모터의 지휘하에서 pac를 발현시킨다(De Boer등, Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 21(1983)).
pac의 발현 수준을 좀더 개선하기 위하여 두 개의 강한 E. coli 프로모터를 정교한 결합으로 아실라아제 개시코돈에 클로닝하였다. 이를 위하여, 올리고뉴클레오티드 부위 지정 돌연변이(Stanssens 등, 1989)에 의하여 플라스미드 pMcTAFlA의 ATG 개시코돈에 NdeI 부위를 만들어 플라스미드 pMcTAFlANde를 얻었다. 이 플라스미드를 NdeI으로 절단하고 재환형화하여 tac 프로모터를 아실라아제 유전자 앞의 정확한 위치에 위치시켰다(플라스미드 pMcAFtac). 다른 프로모터를 삽입하기 위하여 플라스미드 pMcTAFlNde를 EcoRI 및 NdeI으로 절단하고 아가로스 겔에서 큰 단편을 정제하였다. 합성 6 올리고뉴클레오티드를 사용하여 pMcTAFlANde의 정제된 이 EcoRI-NdeI 단편에 트립토판 프로모터 단편을 삽입하였다.
이 프로모터의 DNA서열은 각각 서열리스트 2 및 3에 도시되어 있으며 프로모터의 구조는 제 4 및 5도에 각각 도시되어 있다.
이들 프로모터 구성체들은 E. coli HB101에 형질전환하고 pac의 발현을 테스트하였다. 표 1은 A. faecalis ATCC 19018의 발현 수준과 비교하여 그 결과를 나타내고 있다. 또한 이소프로필티오 β-갈락토시드(IPTG)로 tac 프로모터의 유도작용 및 인돌 아크릴산(IAA)으로 trp 프로모터의 유도 작용을 테스터하였다.
다양한 플라스미드를 함유한 E. coli HB101를 4XLBC에서 24시간 배양하였다. A. faecalis를 AF 배지에서 24시간 배양하였다.
[실시예 5]
A. faecalis에서 페니실린 아실라아제의 발현. A. faecalis에 유전정보를 안정하게 전달하기 위하여서는 DNA형질전환 시스템 및 안정적인 클로닝 벡터가 연구되어야 한다. 놀랍게도 Friedman등(Gene 18, 289-296 (1982))에 기술된 방법을 다음의 변형을 가하여 사용함으로써 플라스미드 pKT248(Bagdasarian 등, Gene 16, 239-247(1981))과 A. faecalis의 트리페런털 메이팅(triparental mating)이 가능하다는 사실이 밝혀졌다.
- 헬퍼플라스미드 pRK 2013 (Figurski ＆ Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 1648(1979)를 포함하는 E. coli Mc1061를 2XTY아가 플레이트에서 E. coli(pKT 248) 및 A. faecalis 수용체 균주와 혼합하였다.
- 플레이트를 30℃에서 하룻밤동안 배양하여 접합이 일어나도록 하였다.
- 시트레이트, 포자인자 및 선택표시용 항생제 스템(50μg/㎖)와 캡(25μg/㎖)를 포함하는 최소 E 배지를 함유하는 선택 아가배지에 접합 플레이트를 래플리케이팅 하였다.
30℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 영향요구 마아커에 기인하여 E. coli 균주가 역선택된다. 300μl/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 2xTY 플레이트에 A. faecalis 콜로니를 계속해서 도말하였다. 플라스미드 pKT248의 유일한 SalI 부위에 A. faecalis pac 유전자를 서브클로닝하였다. 플라스미드 pAF1의 TthIIIHpaI 단편을 단리하고 클레나우 중합효소에 넣었다. 또한 선형 pKT248의 SalIqndnl를 평활말단시키고 E. coli HB101에 형질전화 및 fal 플레이트에서 선택한 후 플라스미드 pKTAFA(제6도)를 얻었다. 단리후 상기 언급된 트리패런털 메이팅 기술을 사용하여 이 플라스미드를 A. faecalis에 전달하였다. 얻어진 균주를 A. faecalis 성장배지와 함께 진동 플라스크에서 배양하고 원균주와 비교하였다. 표 2에서 보는 바와 같이 pKTAFA을 가진 균주에서 pac의 생산은 매우 개선되었다. 더욱이 유도인자 KPA가 없어도 높은 생산이 이루어지는 것을 볼수 있다. 이는 상업적 발효배지에서 고가의 유도인자 KPA를 사용하지 않아도 좋도록 하였다.
pac 유전자의 앞에 있는 상이한 프로모터를 테스트하기 위하여 pMcAFtrp, pMcAFpf3 및 pMcAFp78의 EcoRI-SalI 단편 각각을 EcoRI, SalI 선형화- 벡터 pJRD 215(Davison 등, Gene 51, 2750280(1987))에 서브클로닝하였다. E. coli에서 세 개의 모든 프로모터 구성체 즉, pJRDAFtrp, pJRDAFpf3 및 pJRDAFp78가 얻어졌으며 이들을 계속하여 a faecalis ATCC 19018에 전달 하였다. 이들 플라스미드로부터 pac의 발현은 KPA의 유, 무하에서 테스트하였다(표2).
모든 플라스미드를 트리패런털 메이팅을 통하여 A. faecalis ATCC 19018에 전달하였다. 프로모토 p78 및 pf3를 파아지 pf3(Luiten, 상기)으로부터 선택하였다. 이들 프로모터의 DNA 서열은 각각 서열리스트 4 및 5에 도시되어 있으며 이들 프로모터의 구조는 제7도 및 제8도에 각각 도시되어 있다.
[실시예 6]
A. faecalis 페니실린 아실라아제의 안정성.
다음과 같은 과정에 따라 A. faecalis 펜아실라아제 및 E. coli의 열안정성을 테스터하였다: 100mM 인산염나트륨 pH 7.5의 용액에서 5분가 다양한 온도에서 효소용액을 배양하였다. 50mM 페니실린G를 기질로하여 35℃에서 잔류 활성을 측정하였다. 5분후 100%, 50% 및 0% 잔류 활성을 가지는 온도를 측정하였다. 표 2로부터 A. faecalis 효소는 E. coli 효소보다 상당히 더 안정하다는 결론을 내릴수 있다.
효소 조성물 E. coli 5K는 Produktions Gesellschaft fur Biotechnologie Braunschweig(Mayer 등, 상기)로부터 얻었다.

Claims (18)

  1. 서열 리스트 1에 도시된 뉴클레오티드 서열을 근본적으로 가지는 페니실린G 아실라아제를 코드화한 유전자.
  2. 제1항에 있어서, Alcaligenes faecalis로부터 단리되는 것을 특징으로 하는 유전자.
  3. 제1항 또는 제2항의 페니실린G 아실라아제 유전자의 전사 조절 서열.
  4. 제1항 또는 제2항의 페니실린G 아실라아제 유전자의 해독 조절 서열.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각 동일 또는 다른 유기체로부터 얻어지는, 다른 전사 및 /또는 해독 조절 서열로 대체된 전사 및/또는 해독 조절 서열로 이루어지는 레귤론의 통제하에 있는 유전자.
  6. 제1항, 제2항 또는 제5항의 페니실린G 아실라아제 유전자의 하나 또는 그 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 페니실린G 아실라아제 유전자의 전사 서열이 trp프로모터에 의해 대체된 것을 특징으로 하는 벡터.
  8. 제6항 또는 제7항의 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주.
  9. 제8항에 있어서, 그람-네가티브 미생물인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주.
  10. 제9항에 있어서, 미생물이 Alcaligenes 또는 Escherichia 종인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주.
  11. 제10항에 있어서, 미생물이 Alcaligenes faecalis 인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주.
  12. 제8항 내지 제11항중의 어느 한 항의 형질전환된 숙주를 배양하고 단리된 형태로 페니실린G 아실라아제를 회수하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 페니실리G 아실라아제의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제5항중의 어느 한 항의 유전자에 의해 코드화된 아미노산 서열로 근본적으로 이루어지는 단리된 형태의 페니실린G 아실라아제.
  14. 제13항에 있어서, 고정화된 형태인 것을 특징으로 하는 페니실린G 아실라아제.
  15. (i)제6항 또는 제7항의 DNA벡터를 제조하고 (ii) 상기 벡터로 숙주를 형질전환하고 (iii)얻어진 형질전환체를 클로닝 및 선택하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 숙주에서 페니실린G 아실라아제의 생산 또는 생산을 증진시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 그람-네가티브 미생물을 형질전환하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, Alcaligenes 또는 Escherichia 종의 미생물을 형질전환하는 것을 특징으로하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, Alcaligenes faecalis을 형질전환하는 것을 특징으로 하는 방법.
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