JP4118689B2 - ＯｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍＡｎｔｈｒｏｐｉ由来のＤ−ヒダントイナーゼ - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

関連出願についてのクロス・リファレンス
本出願は、2001年4月3日出願の米国仮出願番号60/281150の恩恵を主張するものであり、その内容は引用により全体を本発明の一部とする。

技術分野
本発明は、D-ヒダントインを対応するD-N-カルバモイル-α-アミノ酸へとエナンチオ選択的に加水分解する、Ochrobactrum anthropi由来の新規D-ヒダントイナーゼ；該酵素をコードしている核酸；該核酸を含む発現ベクター；および該酵素を発現できる宿主細胞に関するものである。

背景技術
ヒダントイナーゼは5-一置換ヒダントインから対応するN-カルバモイル-α-アミノ酸への変換を触媒する酵素である。この光学的に純粋なN-カルバモイル-α-アミノ酸は、しかる後化学的または酵素的手段によりアミノ酸へと加水分解され得る。この重要なエナンチオ選択性により、それらは、半合成ペニシリンおよびセファロスポリンの製造のための有用な中間体である光学的に純粋なD-またはL-アミノ酸の生成にとって価値あるものとなる。光学的に純粋なN-カルバモイルアミノ酸を生成させるためのヒダントイナーゼの使用は当分野で既知である［Syldatk,C., Muller,R., Siemann,M., Krohn,K., and Wagner,F.(1992)。Biocatalytic production of amino acids and derivatives(D.Rozell and F.Wagner, Ed.) p.75-128 Hanser Publishers, New York]。酵素ヒダントイナーゼはKlebsiella、Corynebacterium、Agrobacterium、Pseudomonas、Bacillus、およびStreptomycesを包含する様々な供給源から単離されている。欧州特許出願EP/0739978 A2は、高温のアルカリ性媒質中で改善された活性と安定性を示す、Agrobacterium tumefaciensから産生されるヒダントイナーゼを記載している。米国特許第5516660号は、D-、L-および/またはD,L-5-一置換ヒダントインからL-α-アミノ酸を生成させることのできるヒダントイナーゼを産生するArthrobacter種の新規標本を開示している。米国特許第5714355号は、親生物の2.7倍までの酵素活性を持つArthrobacter種の突然変異体標本を記載している。PCT公開WO00/58449は、過去に単離されたヒダントイナーゼに比して改善された酵素特性を示す、修飾ヒダントイナーゼを記載している。触媒活性と共に改善されたエナンチオ選択性を示す新たな酵素を単離する必要性が今なお存在する。

発明の要約
本発明は、好ましくは配列番号2に記載の配列または配列番号2と少なくとも80%一致する蛋白の配列を有する、Ochrobactrum anthropi由来の単離精製されたD-ヒダントイナーゼを目的とするものである。

さらに本発明は、該酵素をコードしている核酸、好ましくは配列番号1に記載のゲノムDNAまたはこれに由来するcDNAを目的とするものである。

さらに本発明は、本発明に係る酵素をコードしている核酸を含む組換え宿主細胞を目的とするものである。

さらに本発明は、本発明に係る酵素をコードしている核酸を含む発現ベクターを目的とするものである。

さらに、本発明は、本発明に係る酵素をコードしている核酸を含む適当な細胞を適当な培地で該酵素の発現にとって好適な条件下に培養することを含む、本発明に係る酵素を生成させる方法を目的とするものである。

最後に本発明は、本発明に係るヒダントイナーゼを使用して5-一置換ヒダントインを対応するN-カルバモイル-α-アミノ酸に変換し、高キラル純度生成物を生成させる方法を目的とするものである。

発明の詳細な説明
本発明は、Ochrobactrum anthropi由来のヒダントイナーゼの全体または一部をコードしている核酸配列を含む単離された核酸分子に関するものである。Ochrobactrum anthropiの好ましい菌株は、ブダペスト条約の規定の下にAmerican Type Culture Collecion, Rockville, Maryland, U.S.A.に寄託されたATCC202035である。好ましくはこの核酸分子はＤＮＡ分子であり、核酸配列はＤＮＡ配列である。全てのＤＮＡ配列は、左から右への向きが５’から３’に至る通常の方向である式によって本明細書に表記する。本明細書で使用するヌクレオチド塩基の略語は当分野で常套的なものであり、即ち、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、そしてＧはグアニンであり；またＸはＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧであり、Ｐｕはプリン（即ちＧまたはＡ）であり、そしてＰｙはピリミジン（即ちＴまたはＧ）である。図６（配列番号１）に示すものと実質上同じヌクレオチド配列の全体または一部を有するＤＮＡ配列、またはこのＤＮＡ配列に対し相補的なＤＮＡ配列；または配列番号１もしくはその構成成分とハイブリダイズするＤＮＡ配列が、さらに好ましい。好ましくはこのＤＮＡ配列は緊縮（ストリンジェント）条件下でハイブリダイズする。緊縮ハイブリダイゼーション条件は、 ８５％より大きな、 より好ましくは９０％より大きな相同性のＤＮＡ配列を選択する。緊縮条件下でのＤＮＡのスクリーニングはNature, 313:402-404(1985)に記載の方法に従って実施でき、この内容は引用により本明細書の一部とする。本出願に開示するＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズできるＤＮＡ配列は、例えばこの開示したＤＮＡ配列のアレレ変異体であってよく、またはOchrobactrum anthropi中に天然に存在しそれでいて開示したＤＮＡ配列に関連しているものであってよく、または他の細菌源から誘導することができる。核酸ハイブリダイゼーションの一般技術はManiatis,T. et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982)およびHaymes,B.D. et al., Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Washington,D.C.(1985)に開示されており、これらの文献は引用により本明細書の一部とする。ヒダントイナーゼの一部をコードしているヌクレオチド配列（即ちＤＮＡ配列）の場合、ヌクレオチド配列が少なくとも約１５ヌクレオチドの長さであることが好ましい。

好ましいDNAフラグメントは配列番号4-7のプローブである（各々図3中のプローブ番号1-4）。

本発明に係るヒダントイナーゼ分子は必ずしも触媒活性である必要はない。例えば、触媒的に不活性な酵素またはそのフラグメントは、この蛋白に対する抗体の産生に有用となり得る。

本発明は修飾されたまたは変異体配列を包含することをも企図している。本出願において使用する「修飾された」または「変異体」という語は、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す場合、本明細書に具体的に開示する野生型配列とは異なるヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。

本発明に係るDNA配列は当業者に周知の様々な方法を用いて取得できる。少なくとも三つの主たる択一的方法が利用できる：
(1) 該配列を含むゲノムDNAまたは相補的DNA（cDNA）からの二本鎖DNA配列の単離；
(2) 該DNA配列の化学合成；および
(3) ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による該DNA配列の合成。

第一のアプローチでは、ヒダントイナーゼの全体または一部をコードしているDNA配列を同定するためにゲノムまたはcDNAライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、該酵素の全体または一部をコードしているDNA配列を同定するためにO.anthropiゲノムDNAライブラリーをスクリーニングできる。様々な技術を用いてゲノムDNAまたはcDNAライブラリーをスクリーニングできる。

例えば、該酵素の全体または一部をコードしている標的ゲノムDNAまたはcDNAに存在する配列を複製する標識化一本鎖DNAプローブ配列を用いて、一本鎖型に変性しておいたこのゲノムDNAまたはcDNAのクローンコピーにDNA/DNAハイブリダイゼーション法を実施することができる。

ゲノムDNAまたはcDNAライブラリーはまた、免疫ブロッティング技術を使用して、ヒダントイナーゼの全体または一部をコードしているゲノムDNAまたはcDNAについてスクリーニングできる。

免疫ブロッティングまたはハイブリダイゼーション技術のいずれにとっても好適な１つの典型的なスクリーニング法では、ベクターに通常含まれているゲノムDNAライブラリー、またはcDNAライブラリーをまず寒天平板に広げ、次いでクローンをフィルターメンブレン、例えばニトロセルロースメンブレンに移す。次に、ヒダントイナーゼの全体または一部をコードしているゲノムDNAまたはcDNAを含むクローンを同定するため、DNAプローブをクローンにハイブリダイズさせるか、または抗体をクローンに結合させる。

第二のアプローチでは、ヒダントイナーゼの全体または一部をコードしている本発明に係るDNA配列を化学合成する事ができる。例えば、ヌクレオチドの正しい直線配列が形成できるよう、（適当な末端制限部位または相補的末端配列を介して）順次ライゲーションできる100塩基オリゴヌクレオチドの連続として、ヒダントイナーゼをコードしているDNA配列を合成できる。

第三のアプローチでは、ヒダントイナーゼの全体または一部をコードしている本発明に係るDNA配列をPCRを用いて合成できる。簡潔に述べると、標的DNA配列の反対の鎖とハイブリダイズする少なくとも15塩基長の合成DNAオリゴヌクレオチドの対（PCRプライマー）を用いて、標的配列上に介在するDNA領域を酵素的に増幅する。鋳型の熱変性、プライマーのアニーリング、およびDNAポリメラーゼによるアニーリングされたプライマーの3'末端延長というサイクルを反復することで、PCRプライマーの5'末端で規定されるセグメントの増幅がもたらされる。White et al., Trends Genet. 5, 185-189(1989)を参照されたい。

本発明に係るDNA配列は、本発明に従い様々な方法で使用できる。このDNA配列の最も明白な用途は、5-一置換ヒダントインから対応するN-カルバモイル-a-アミノ酸への変換に有用なヒダントイナーゼを製造することである。しかしながらこれらはまた、ヒダントイナーゼに関連する蛋白をコードしている他のDNA配列をハイブリダイゼーションにより選択する、他のcDNAおよびゲノムDNAライブラリーのスクリーニングのためのDNAプローブとして使用することもできる。加えて、ヒダントイナーゼの全体または一部をコードしている本発明に係るDNA配列は、O.anthropi以外の生物由来のヒダントイナーゼ分子をコードしているDNA配列をハイブリダイゼーションによって選択するための、他のcDNAおよびゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするためのDNAプローブとして使用することができる。

ヒダントイナーゼの全体または一部をコードしている本発明に係るDNA配列を修飾して（即ち突然変異させて）種々の突然変異を作ることもできる。このような突然変異は、変性、即ちその突然変異が、突然変異を受けたコドンによりコードされているアミノ酸配列を変化させることもあれば、非変性、即ち突然変異を受けたコドンによりコードされているアミノ酸配列を変化させないこともある。このような修飾DNA配列は、例えば、その突然変異がコードされているポリペプチド中の1またはそれ以上のアミノ酸の除去、置換、挿入、逆位または付加をもたらすよう、当分野で既知の様々な方法を用いてヒダントイナーゼDNA配列を突然変異させることによって製造できる。例えば、Morinaga et al., Bio/Technol. 2, 636-639(1984)、Taylor et al., Nucl.Acids Res. 13, 8749-8764(1985)およびKunkel, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82, 482-492(1985)に記載の位置指定突然変異誘発の方法を利用できる。さらに、位置指定突然変異誘発用のキットを商業的売り主から購入できる。例えば、位置指定突然変異誘発を実施するためのキットはAmersham Corp.（Arlington Heights, IL）から購入できる。加えて、Sayers et al., Nucl.Acids Res. 16, 791-802(1988)に記載の破壊、除去および末端切除法もまた利用できる。変性および非変性突然変異のいずれも本発明に係るポリペプチドの製造または使用において好都合である。例えばこれらの突然変異は、より高レベルの生産、より容易な精製を可能にし、或いはさらなる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を提供し得る。このような修飾DNAおよびポリペプチド分子は全て本発明の範囲内に包含される。

さらに本発明は、本発明に係るヒダントイナーゼの全体または一部をコードしているDNA配列を含む発現ベクターに関するものである。この発現ベクターは好ましくは実質上図6に示すようなヌクレオチド配列を持つDNA配列のうち1個の全体または一部を含む。ヒダントイナーゼの全体または一部をコードしているDNA配列と機能的に連結した1またはそれ以上の調節DNA配列を含む発現ベクターがさらに好ましい。この文脈において使用する「機能的に連結した」という語は、調節DNA配列がヒダントイナーゼの全体または一部をコードしているDNA配列の複製および/または発現を指令できることを意味する。

本発明において有用な発現ベクターはしばしば「プラスミド」の形態をとり、それは、ベクター型においては染色体と結合しない、環状二本鎖DNAループを指す。しかしながら本発明は、同等機能を有するその他の形態の発現ベクターの包含をも意図しており、それらはこの後当分野で知られるようになろう。

本発明において有用な発現ベクターは典型的には、複製起点、該DNA配列の前（即ち上流）に位置するプロモーター、そしてヒダントイナーゼ構造蛋白の全体または一部をコードしているDNA配列がその後に続く。構造蛋白の全体または一部をコードしているDNA配列の後には転写終止配列とベクターの残部が続く。発現ベクターはさらに当分野で既知のその他のDNA配列、例えば発現生成物の安定性を提供する安定性リーダー配列、発現生成物の分泌を提供する分泌リーダー配列、構造遺伝子の発現を調節する（即ち増殖培地中に栄養素またはその他のインデューサーが存在することまたは欠失することにより）配列、形質転換された宿主細胞において表現型の選択を可能にするマーカー配列、プラスミドに有糸分裂での安定性を提供する動原体のような安定性要素、および、制限エンドヌクレアーゼによる開裂のための部位を提供する配列を包含し得る。使用する実際の発現ベクターの性質は、利用しようとする宿主細胞と共存できるものでなければならない。例えば、真菌細胞系でのクローニングの場合、発現ベクターは真菌細胞のゲノムから単離したプロモーター（即ちAspergillus nidulans由来のtrpCプロモーター）を含むべきである。或る発現ベクターは、真菌宿主において自律複製プラスミドのインビボ産生を促進する真菌自律複製配列（ARS；即ちFusarium oxysporumおよびSaccharomyces cerevisiae由来のARS）を含むかも知れない。本発明に係る真菌発現ベクターが真菌ARS配列を持たず、その結果宿主細胞にプラスミドが入った時に宿主染色体に統合される事が好ましい。このような統合は遺伝的安定性を増強するが故に好ましい。本発明が企図する発現ベクターは、少なくとも、本発明に係るヒダントイナーゼDNA配列の、Escherichia coli中での複製および真菌細胞への統合、そして好ましくは発現を指令できる。E.coliの種々の宿主での好適な複製起点は、例えばColEIプラスミド複製起点を包含する。好適なプロモーターは、例えばA.nidulans由来のtrpCプロモーターおよびE.coli由来のneo-r遺伝子プロモーターを包含する。好適な終止配列は、例えばA.nidulans由来のtrp CターミネーターおよびE.coli由来のneo-r遺伝子ターミネーターを包含する。さらに発現ベクターは選択マーカーをコードしている配列を含むことが好ましい。選択マーカーは好ましくは抗生物質耐性である。選択マーカーとして、フレオマイシン耐性（真菌細胞のため）、アンピシリン耐性、およびネオマイシン耐性（細菌細胞のため）が好都合に利用できる。これらの材料は全て当分野で既知であり市販されている。

所望のコード配列と調節配列を含む好適な発現ベクターは当分野で既知の標準的組換えDNA技術を用いて組み立てることができ、その多くがSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1989)に記載されている。

本発明はさらに、ヒダントイナーゼの全体または一部をコードしているDNA配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞に関するものである。この宿主細胞は好ましくは、実質上図6に示したヌクレオチド配列を有するDNA配列のうち１つの全体または一部を含む、発現ベクターを含む。さらに、ヒダントイナーゼの全体または一部をコードしているDNA配列の複製および/または発現を指令でき、該DNAと機能的に連結した1またはそれ以上の調節DNA配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞が好ましい。加えて、触媒活性でないヒダントイナーゼ分子をコードするよう修飾された（即ち破壊、除去または末端切除された）DNA配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞もまた包含される。好適な宿主細胞は真核および原核宿主細胞の両者、例えばE.coli細胞を包含する。好適な真核宿主細胞は例えばR.toruloides、Cephalosporium acremonium、およびPenicillium chrysogenum細胞を包含する。好ましい宿主細胞は、ブダペスト条約の規定の下にAmerican Type Culture Collecion, Rockville, Maryland, U.S.A.に寄託されたプラスミドpBMS2000を含むE.coli ATCC98563である。

発現ベクターは当分野で既知の様々な方法によって宿主細胞中に導入できる。例えば、発現ベクターによる宿主細胞のトランスフェクションはポリエチレングリコール仲介プロトプラスト形質転換法によって実施できる。しかしながら宿主細胞に発現ベクターを導入するためのその他の方法、例えば電気穿孔、パーティクルガンによる注入、またはプロトプラスト融合もまた利用できる。

発現ベクターを適当な宿主細胞中に導入したならば、この宿主細胞を、大量のヒダントイナーゼを発現させるような条件の下で培養することができる。

ヒダントイナーゼの全体または一部をコードしているDNA配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞は、以下の五つの一般的アプローチのうちの1またはそれ以上によって同定できる：(a) DNA-DNAハイブリダイゼーション；(b) マーカー遺伝子機能の存在または不在；(c) 宿主細胞におけるヒダントイナーゼmRNA転写物の産生によって測定した転写レベルの評価；(d) 遺伝子産物の免疫学的検出；および(e) 酵素検定（酵素検定は好ましい同定法である）。

第一のアプローチでは、ヒダントイナーゼの全体または一部をコードしているDNA配列の存在が、該DNA配列に相補的なプローブを用いるDNA-DNAまたはRNA-DNAハイブリダイゼーションによって検出できる。

第二のアプローチでは、組換え発現ベクター宿主系を、一定のマーカー遺伝子機能（例えばアセトアミド利用、抗生物質に対する耐性、殺真菌薬に対する耐性、ウラシルプロトトロフィー、など）の存在または不在に基づいて同定および選択することができる。ヒダントイナーゼの全体または一部をコードしているDNA配列と同じプラスミドに、ヒダントイナーゼコード配列の調節に用いられるのと同じまたは異なるプロモーターの調節下でマーカー遺伝子を入れることができる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、ヒダントイナーゼの全体または一部をコードしているDNA配列を持つ組換え発現ベクター全体が存在することを示す。

第三のアプローチでは、ヒダントイナーゼmRNA転写物の産生をハイブリダイゼーション検定によって評価できる。例えば、ポリアデニル化RNAを単離し、該RNA配列に相補的なプローブを用いるノーザンブロッティングまたはヌクレアーゼ保護検定によって分析できる。別法として、宿主細胞の全核酸を抽出し、係るプローブとのハイブリダイゼーションについて検定してもよい。

第四のアプローチでは、ヒダントイナーゼの全体または一部の発現を免疫学的に、例えばウエスタンブロッティングによって評価できる。

第五のアプローチでは、既知の方法を用いてヒダントイナーゼ酵素活性を検定することにより、ヒダントイナーゼの発現を測定できる。

本発明に係る発現ベクター、プラスミドまたはDNA分子のDNA配列は当分野で既知の様々な方法によって決定できる。例えば、Sanger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74, 5463-5467(1977)に記載のジデオキシ鎖終止法、またはProc.Natl.Acad.Sci.USA 74, 560-564(1977)に記載のマクサム-ギルバート法が利用できる。

全ての発現ベクターおよびDNA調節配列が等しく良好に機能して本発明に係るDNA配列を発現させる訳でないことは無論理解されるべきである。全ての宿主細胞が同じ発現系で等しく良好に機能する訳でないこともまた同様である。しかしながら当業者は、本明細書に記載の指針を用いて、不要な実験を行うことなく、そして本発明の範囲を逸脱することなく、発現ベクター、DNA調節配列、および宿主細胞の中から選択を行うことができる。

本発明はさらに、ヒダントイナーゼの全体または一部を含むポリペプチド分子であって、好ましくは実質上図5に示したアミノ酸配列のうち１つの全体または一部を有するポリペプチド分子に関するものである。ヒダントイナーゼの一部を含むポリペプチド分子の場合、ポリペプチド分子が少なくとも約10アミノ酸長であることが好ましい。

本明細書に明記する全てのアミノ酸残基は天然のL配置である。J.Biol.Chem. 243, 3557-3559(1969)の標準ポリペプチド命名法に従い、アミノ酸残基の略語は以下の対応表に示すとおりである：

記号 アミノ酸
1文字コード 3文字コード
Y Tyr L-チロシン
G Gly L-グリシン
F Phe L-フェニルアラニン
M Met L-メチオニン
A Ala L-アラニン
S Ser L-セリン
I Ile L-イソロイシン
L Leu L-ロイシン
T Thr L-スレオニン
V Val L-バリン
P Pro L-プロリン
K Lys L-リジン
H His L-ヒスチジン
Q Gln L-グルタミン
E Glu L-グルタミン酸
W Trp L-トリプトファン
R Arg L-アルギニン
D Asp L-アスパラギン酸
N Asn L-アスパラギン
C Cys L-システイン

本明細書ではアミノ酸配列は全て、左から右への向きがアミノ末端からカルボキシ末端に至る常套的な方向である式によって表記する。

本発明に係るポリペプチドは合成手段、即ち当業者の知悉する方法による、その構成アミノ酸からの該ポリペプチドの化学合成によって取得できる。例えば、Houghton et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 82, 5131-5135(1985)に記載の固相法が利用できる。このポリペプチドは、ヒダントイナーゼの全体または一部をコードしているDNA配列を発現する真核または原核宿主細胞での生産、または、ヒダントイナーゼの全体または一部をコードしているDNA配列によりコードされているmRNAのインビトロ翻訳によって取得するのが好ましい。例えば、図6に記載のDNA配列を上記のPCRを用いて合成し、適当な発現ベクター中に挿入し、次いでこれを用いて適当な宿主細胞を形質転換させることができる。次にこの組換え宿主細胞を培養してヒダントイナーゼを産生させる。これらの手段によるポリペプチドの産生のための技術は当分野で知られており、本明細書に記載する。

本発明に係る単離精製されたD-ヒダントイナーゼは好ましくは配列番号2の配列または配列番号2と少なくとも80%一致する蛋白の配列を有する。

本発明の範囲内の変異体アミノ酸またはDNA配列は、本明細書に具体的に開示した配列に対し相同的である。具体的に開示した配列と変異体配列の間の相同性の程度（一致パーセント）は例えば、Devereux et al.（Nucl.Acids Res. 12:387, 1984）が記載しUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group（UWGCG）から入手可能なGAPコンピュータープログラムバージョン6.0を用いて二つの配列を比較することによって決定できる。GAPプログラムは、SmithおよびWatermanによって修正された（Adv.Appl Math 2:482, 1981）NeedlemanとWunschの並置法（J.Mol.Biol. 48:443, 1970）を利用している。簡潔に述べると、GAPプログラムは類似性を、類似している並置記号（即ちヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を二つの配列のうち短い方の記号の総数で除したものとして定義している。GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメータは、(1) ヌクレオチドについての単一比較マトリックス（一致に対して数値1を、不一致に対して0を含む）、およびSchwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358, 1979に記載のGribskov and Burgess, Nucl.Acids Res. 14:6745, 1986の加重比較マトリックス；(2) 各間隙に対して3.0のペナルティ、そして各間隙中の各記号に対してさらに0.10のペナルティ；および(3) 末端間隙に対してはペナルティ無し、を包含する。

この方法で製造したポリペプチドは、次いで様々な蛋白精製技術を用いて単離精製できる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよびイムノアフィニティクロマトグラフィーといったクロマトグラフィー法が利用できる。

本明細書中使用する「単離および精製」という語は、D-ヒダントイナーゼが天然または細胞環境に存在する構成成分を実質上含まないことを意味する。

本発明に係る変換プロセスに加えて、本発明に係るポリペプチドは様々なその他の方法に使用できる。例えばこのポリペプチドは、該ポリペプチドと結合可能なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を既知の方法で製造するために使用できる。続いてこれらの抗体は、イムノアッセイ技術、例えばラジオイムノアッセイまたは酵素イムノアッセイを利用して、試料、例えば細胞試料中の本発明に係るポリペプチドを検出するために使用できる。抗体はまた、本発明に係るポリペプチドを精製し様々な原料からそれらを単離するためのアフィニティクロマトグラフィーにも使用できる。

殆どのアミノ酸残基と停止シグナルに対して1以上のコドンが存在することに起因する遺伝コードの縮重性のため、図6に示したものと同じアミノ酸配列をコードしている別のDNA配列を、本発明に係るポリペプチドの製造に利用できる。加えて、これらのDNAとアミノ酸配列のアレレ変異が天然に存在し、またはそれを当分野で既知の方法を用いて意図的に導入できるという事が理解できるであろう。これらの変異は、配列全体の中の1またはそれ以上のアミノ酸の相違によって、または該配列中の1またはそれ以上のアミノ酸の除去、置換、挿入、逆位または付加によって表される。このようなアミノ酸置換は例えば、関与している残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および/または両親媒性の類似に基づいて行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸とグルタミン酸を包含し；正に荷電したアミノ酸はリジンとアルギニンを包含し；似通った親水性値を持つ非荷電極性頭部基または非極性頭部基を有するアミノ酸は以下を包含する：ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、チロシン。考えられるその他の変異は、前記ポリペプチドの塩およびエステル、ならびに前記ポリペプチドの前駆体、例えばメチオニン、N-ホルミルメチオニンのようなN-末端置換基およびリーダー配列を有する前駆体を包含する。このような変異は全て本発明の範囲内に包含される。

本発明はさらに、本発明に係るヒダントイナーゼを発現できる発現ベクターを含む宿主細胞を培養することを含む、ヒダントイナーゼを製造する方法に関するものである（「生物学的製造」法）。

本発明に係るヒダントイナーゼは、5-一置換ヒダントインから対応するD-N-カルバモイル--アミノ酸への変換を立体選択的に触媒する酵素であり、故に本発明はさらにこのプロセスをも目的としている（「変換」法）。本発明に係る変換法は立体選択的、即ち、出発物質がDおよびL-異性体のラセミ混合物であっても主としてD-異性体を産生する。この変換法は、純粋なヒダントイナーゼ、部分精製または粗製ヒダントイナーゼ、または細胞全体を利用できる。

本発明に係る変換法は以下のように表すことができる：

［式中、RはHまたは炭化水素部分である］。本発明に係るD-ヒダントイナーゼ酵素はヒダントイン部分に特異的に作用するため、「R」部分の個別的化学的性質は重要でない。上の反応によって生成するN-カルバミル-D-アミノ酸は所望により第二工程において下に示すようなD-アミノ酸へと変換される。

［式中、Rは前記と同意義である］。上の第二工程は当分野で既知の常套的方法、例えばBayerのHONO法（Takehahashi, et al., J.Fermentation Technology, 57:328, 1979）を用いる化学的または酵素的方法を介して達成できる。

本発明に係る変換法は、使用する宿主細胞の発酵後に（二段階発酵および変換）、またはそれと同時に、即ち後者の場合、in situ発酵および変換（一段階発酵および変換）によって実施できる。一段階法では、当該微生物を適当な培地中で、その微生物の充分な増殖が達成されるまで増殖させることができる。次いで式IIの化合物を微生物の培地に添加し、酵素による立体選択的変換を、好ましくは完全な変換が達成できるまで発酵と共に続ける。

二段階法では、第一段階において該微生物を適当な発酵用培地中で所望の酵素活性が現れるまで増殖させることができる。その後、遠心分離によって細胞を収穫し、収穫した細胞を適当な緩衝溶液に懸濁することにより微生物の細胞懸濁液を作製する。tris-HCl、燐酸塩、酢酸ナトリウムなどのような緩衝液を使用できる。水もまた微生物細胞の懸濁液の調製に使用できる。第二段階では、式IIの化合物をこの微生物細胞懸濁液と混合し、酵素による立体選択的変換が微生物細胞懸濁液により触媒される。この変換は好ましくは式IIの化合物の全てまたは殆ど全てが立体選択的に加水分解されるまで実施する。

この変換法では、細胞を当分野で既知の常套法によって固定化することができる（例えばImmobilized Enzymes for Industrial Reactors, 1975, Ed.R.Messing, Academic Press, New York;およびImmobilized Microbial Cells ACS Symposium Series 106, 1979, K.Venkasubramanian, American Chemical Society, Washington D.C.を参照されたい）。固定化は、細胞またはヒダントイナーゼ抽出物の共有結合的付着または捕捉を含み、或いは無機もしくは有機表面への細胞の吸着を含み得る。ヒダントイナーゼ抽出物または適切に誘導した全細胞は、様々な支持マトリックス、例えばアガロース、セルロース、デキストラン、ガラス、HYPOL（Hampshire Chemicals, Lexington, Massachusetts）、ポリアクリルアミドコポリマーもしくはポリスチレン上への共有結合的付着によって、またはアルギナート、カラギーナン、寒天、ポリアクリルアミドによる捕捉によって固定化でき、または、硝酸/酢酸セルロース、ナイロン、脂質ポリアミドなどといったポリマーメンブレン内部にマイクロカプセル化し、または、シリカ、アルミナ、カオリン、イオン交換樹脂、多孔性ガラス、粘土、セルロース、コラーゲン、燐酸カルシウムゲル、ベントナイト、炭素もしくはタイプZおよびタイプCZバイオキャリアー（W.R.Grace & Company）のような無機もしくは有機表面への吸着によって固定化できる。変換が完了した後、固定化された酵素を反応混合物から物理的に分離して次の反応に使用できる。

該酵素の生物学的産生のためまたはin situ酵素的変換のための微生物の増殖は、適当な培地を用いて当業者により達成できる。微生物増殖のための適当な培地はその微生物細胞の増殖に必要な栄養素を提供するものを包含し、実質上その宿主細胞の増殖要件に応じて変わり得る。増殖のための典型的な培地は、必要な炭素源、窒素源、および微量元素を含む。インデューサーもまた添加できる。本明細書で使用する「インデューサー」という語は、微生物細胞内で所望の酵素的変換活性の形成を増強する任意の化合物を包含する。好適なインデューサーはヒダントイン、ヒダントイン酸および式Iの化合物を包含する。インデューサーの量は典型的には総反応混合物の約0.1ないし約1.0重量パーセントである。

炭素源は、マルトース、乳糖、グルコース、フルクトース、グリセロール、ソルビトール、蔗糖、澱粉、マンニトール、プロピレングリコールなどといった糖類；酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどといった有機酸；グルタミン酸ナトリウムなどといったアミノ酸；およびエタノール、プロパノールなどといったアルコールを包含できる。窒素源は、N-ZアミンA、コーンスティープリカー、大豆ミール、牛肉エキス、酵母エキス、モラセス、パン酵母、トリプトン、ニュートリソイ、ペプトン、イーストアミン、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどを包含できる。

微量元素は、燐酸塩およびマグネシウム、マンガン、カルシウム、コバルト、ニッケル、鉄、ナトリウムおよびカリウム塩を包含できる。

使用する培地は1以上の炭素もしくは窒素源またはその他の栄養素を含むことができる。

好ましい培地は以下の成分（重量%）を含有する水性培地を包含する：
培地1 培地2
麦芽エキス 1% ペプトン 0.3%
酵母エキス 1% グリセロール 4%
ペプトン 1% 麦芽エキス 1%
グルコース 2% 酵母エキス 1%
pH7.0 pH7.0

培地のpHは好ましくは約6ないし8、最も好ましくは6.5に調節し、121℃で30分間滅菌し、次いで滅菌後に約6.5ないし7.5、好ましくは7.0に調節する。

宿主細胞の増殖の間、培地のpHは好ましくは4.0および9.0の間に、最も好ましくは6.0および8.0の間に維持する。前もって製造したヒダントイナーゼを用いる変換プロセスのためには、pHは好ましくは約8および11の間、より好ましくは約9および10の間である。

温度は、生物学的製造および変換プロセスに利用できる熱エネルギーの尺度であり、このプロセスに十分なエネルギーが利用できることが確実となるよう維持すべきである。宿主細胞の増殖を含む本発明方法のための好適な温度範囲は約15℃から約60℃までである。好ましい温度範囲は約25℃から約40℃までである。前もって製造したヒダントイナーゼをこの変換プロセスに使用する場合、温度は好ましくは約30℃ないし約75℃の間、より好ましくは約40℃ないし約45℃の間である。

本発明の実施にとって圧力が重要であるとは知られておらず、利便性のため典型的には大気圧を使用する。

増殖しつつある宿主細胞を利用する本発明方法は、好ましくは好気的条件下で実施する。反応混合物の攪拌と通気は立体選択的還元プロセスの間の酸素利用量に影響し、これは例えば一段階または二段階プロセスでの微生物の増殖中、振盪フラスコ培養または発酵タンクで実施できる。50ないし500RPMの範囲の攪拌が好ましく、50ないし100RPMが最も好ましい。培地容量当たり毎分約0.1ないし10容量の空気（即ち0.1ないし10v/v）の通気が好ましく、培地容量当たり毎分約5容量の空気（即ち5v/VT）の通気が最も好ましい。

立体選択的変換プロセスでは、式IIの化合物を微生物（即ち宿主細胞）または本明細書に記載の酵素で最初に処理した時間から測定して、例えば約4ないし48時間、好ましくは12ないし24時間で式IIの化合物の完全な変換が起こり得る。反応生成物の形成は高速液体クロマトグラフィー（HPLC）または単純比色検定で監視できる。

変換プロセスには反応媒質として水性の液体を使用するのが好ましいが、前もって製造したヒダントイナーゼを用いる場合は有機液体、または混和性もしくは非混和性（二相性）有機/水性液体混合物もまた使用できる。

変換プロセスでは、化合物と反応媒質の合計重量に対して0.1ないし30重量%の式II出発物質を使用するのが好ましい。溶解度を増大させるため、高濃度のヒダントインを約10%(wt.)濃度までメタノールのような溶媒に懸濁できる。出発物質に比較した使用する酵素または微生物の量は、本発明に係る立体選択的酵素変換の触媒作用を可能にするように選択する。

前もって製造した酵素を用いる変換プロセスでは、一般にヒダントイナーゼをml当たり約0.5ないし約10単位の濃度になるよう添加する。

本発明に係る立体選択的変換の生成物は、抽出蒸留、結晶化、カラムクロマトグラフィーなどのような既知の方法によって単離精製できる。

式Iの所望化合物を反応媒質の残りの化合物から分離する好ましい方法は、Amicon（Beverly, Massachusetts）S10Y3螺旋限外濾過カートリッジまたは類似製品に反応混合物を通過させることによる。N-カルバミル D-アミノ酸を含有する除蛋白透過物は常套的化学技術により各々のD-アミノ酸に開裂させる事ができる。ヒダントイナーゼを含有している保持物質はその後の変換プロセスに使用できる。

本発明に係る変換プロセスは高収率の式Iの化合物を産む。典型的な収率は約80%より高く、好ましくは約90%より高く、より好ましくは約95%より高く、最も好ましくは約99%である。本プロセスはまた優れた光学純度をもたらす。典型的な光学純度は約90%より高く、好ましくは約95%より高く、最も好ましくは99%より高い。

以下の実施例は本発明をさらに説明するものである。これらの実施例は本発明のさらなる理解を提供し、本発明の範囲を限定する意図は無い。

実施例

ヒダントイナーゼ酵素源としてのOchrobactrum anthropiの全細胞の使用。
1.1 Ochrobactrum anthropiの洗浄細胞による連続的変換
トリプチカーゼソイ（pH8.0）斜面培養からOchrobactrum anthropi 1エーゼ量を500mlの標準フラスコ当たり100mlのBPYNH生産培地を入れたフラスコ2個に接種し、37℃で24時間振盪した。
BPYNH生産培地：
0.5%牛肉エキス粉末
0.5%酵母エキス
1%バクト-ペプトン
0.15% NaCl
0.1% ヒダントイン
(pH8.0）

全ブロス（200ml）を12000rpm、10℃で15分間遠心分離し、0.9%食塩水で1回洗浄し、125mlフラスコ中の食塩水10mlに再懸濁し、再度37℃に温めた。DL-p-ヒドロキシフェニルヒダントイン（200mgアリコート）を400mM TAPS緩衝液（pH8.7）5mlに懸濁し、37℃に予熱した。細胞懸濁液を加え、1N NaOHでpHを速やかに8.5に調節し、H₂Oで最終容量を20mlとし、施栓したフラスコ中37℃でインキュベーションした。試料を採取し（800μl）12%TCA 200μlで不活性化した。上清を前記のように検定した。変換パーセントの結果を以下の表にまとめる。

表１
洗浄した細胞の再利用。変換%。
1回目の使用 2回目の使用 3回目の使用
1時間 5時間 24時間 4.5時間 23時間 5時間 23時間
5% 18% 54% 9% 34% 12% 27%

1.2 ヒダントイナーゼ活性の温度プロフィール
500mlの標準フラスコ当たり100mlのBPYNH生産培地に培養を接種し、37℃で22時間振盪した。細胞を洗浄し、1mlを10X濃度で0.45%食塩水/100mM TAPS pH8.5/10mg/ml DL-p-ヒドロキシフェニルヒダントイン中、28℃、32℃、37℃、および42℃で5時間および24時間インキュベートした。12% TCA 250μlで反応を停止させ、上清を検定した。相対活性を図1に示す。最適な活性は42℃より高い温度で起こる。

1.3 全細胞のグルタルアルデヒドおよびアセトン処理の効果
培養の洗浄細胞懸濁液0.5mlアリコートを、燐酸緩衝液（pH7.0）中、最終濃度2%のグルタルアルデヒド（G.A.）0.5ml、または燐酸緩衝液中2%のG.A. 0.5mlとアセトン1ml、またはアセトンのみ0.5mlで、室温で10分間処理した。処理した細胞を、0.9%食塩水10ml、次いで食塩水+1mg/ml硫酸アンモニウムで洗浄し、100mM TAPS緩衝液（pH8.5）1mlに再懸濁した。再懸濁した細胞懸濁液を100mM TAPS（pH8.5）中で10mg/mlのD,L-p-ヒドロキシフェニルヒダントインと共に（最終容量800μl）42℃で4時間インキュベートした。12% TCA 200μlで反応を停止させ検定した。

表２
ヒダントイナーゼ活性に及ぼすグルタルアルデヒドとアセトンの効果：
処理 相対活性
対照（緩衝液のみ） 1
グルタルアルデヒド 1.2
グルタルアルデヒド/アセトン 1.2
アセトン 2.8

1.4 ヒダントイナーゼ活性の至適pH
Ochrobactrum anthropiのグルタルアルデヒド処理細胞濃縮液を使用して、200mM TAPS緩衝液中10mg/ml DL-p-ヒドロキシフェニルヒダントインと共に種々のpHおよび42℃でインキュベーションを行った。一方の実験でpH8.0-8.8の範囲を、そして他方の実験でpH8.8-9.8をカバーした。正常pHに戻すための調節を試料採取時刻および少なくとも30分毎に行った。図2は、活性の至適pHがpH8.8である事を示している。

1.5 pH8.8、9.3および9.8における酵素の安定性
pHプロフィール研究由来のグルタルアルデヒド処理細胞をpH8.8、9.3および9.8に約4時間維持した。固体を洗浄し、25mM TAPS（pH8.8）および10mg/ml D,L-p-ヒドロキシフェニルヒダントインに再懸濁し、42℃で4時間インキュベートした。結果は、酵素の最大安定性がpH8.8の処理時であることを示した。pHプロフィール研究における活性の至適pH8.8は恐らくpH9.3または9.8よりもpH8.8の場合の方が酵素の安定性が高いことによるものであろう。

表３
アルカリ性pHでのヒダントイナーゼの安定性
pH 相対活性
8.8 1.75
9.3 1.17
9.8 0.62

1.6 変換速度に及ぼす基質濃度の効果
D,L-p-ヒドロキシフェニルヒダントイン基質は5mg/mlでは完全に溶解しないため、懸濁液を作製し、グルタルアルデヒド処理細胞と共にインキュベートした。インキュベーションは200mM TAPS（pH8.8）中、42℃で6時間実施し、pH調節を少なくとも毎時行って正常に戻した。反応を検定し、生成物をmg/mlで下に記録した。

表４
変換速度に及ぼす基質濃度の効果
基質
mg/ml 30分 60分 2 3/4時間 4時間 6時間 %
変換
5 .56 1.0 1.9 2.1 2.2 40%
10 .75 1.4 3.4 4.0 4.4 40%
20 .82 1.5 4.0 6.2 7.7 35%
50 .95 1.6 4.2 6.3 9.2 17%

1.7 ヒダントイナーゼの固定化
ヒダントイナーゼの粗製抽出液を洗浄細胞濃縮液のミクロフルイダイズによって取得した。粗製抽出液とセライトを2容量のアセトンおよび4%グルタルアルデヒドと共にスラリー化することにより酵素をセライト上に固定化し、水洗した。遠心分離により固体を回収したが、これは湿重量1g当たり約0.3IUの活性を持っていた。

固定化酵素との反応の後、反応混合物を濾過して酵素を取り除き、次いで十分の一容量となるまで蒸発させた。pHを5.0に調節し、混合物を活性炭処理して濾液をpH2.0に調節した。直ちにN-カルバモイルアミノ酸が結晶化し、0℃で1時間保存した後この結晶を濾過し、水洗乾燥した。

この物質の旋光性を測定し、当研究所で製造した真性のD-N-カルバモイル（4-ヒドロキシフェニルグリシン）の値および文献値と比較した。

表５
酵素的に製造した生成物の旋光性
[α]20D （C=0.5%、50:50水性エタノール）
酵素によるD-N-カルバモイルアミノ酸 -170.80゜
合成によるD-N-カルバモイルアミノ酸 -173.08゜
旋光性の文献値 -175゜

この旋光性は、バイオリアクターから単離した物質がD-配置を持つことを明確に示している。また、これが少なくとも純度98%である事をも示している。

1.8 固定化ヒダントイナーゼの再利用
グルタルアルデヒド固定化酵素（9.23g湿重量）を400mM TAPS(pH8.7)20mlに懸濁し、D,L-p-ヒドロキシフェニルヒダントイン400mgを加え、窒素を積層して42℃、130rpmで23時間振盪した。当初pHは4時間ほど低下したが、最終的には安定化し、むしろ僅かに上昇した。最初の6時間は1時間に1回pHを調節して正常に戻し、800μlの試料を採取し、12% TCA 200μlで不活性化し検定した。24時間の時点で酵素固体を水洗し、新たな基質を加え、前と同様にインキュベートしこれを3回連続した。酵素を2回目と3回目の間にH₂O中に保存した。

カルバモイルアミノ酸のmg/mlで表した結果を以下の表に示す（2回目と3回目は生成物およそ1-1.3mg/mlの繰り越しを反映している）。

表６
固定化ヒダントイナーゼの再利用
（生成物のmg/ml）
時間 1日目/1回目 2日目/2回目 3日目/3回目
1 1.8 2.8 2.3
2 2.8 - 3.1
3 - 7.1 -
4 5.9 - 5.7
5 - 10.2 -
6 9.2 - 7.8
7 10.4 - 9.4
22 - 10.9 -
23 10.9 - -

ヒダントインの最終的回収率：
1日目 2日目 3日目
273mg(62%) 255mg(58%) 274mg(63%)

Ochrobactrum anthropi由来のヒダントイナーゼの精製および特性決定。
2.1 ヒダントイナーゼの精製
トリプチカーゼ大豆3%またはYNH寒天（pH8.0）上の斜面培養を500ml標準フラスコ当たり100mlのYNH培地中に接種し、250rpm、28℃で24時間振盪した。種菌を500ml標準フラスコ当たり100mlのCSH-8培地（pH7.0）中に4%で交雑させ、250rpm、28℃で24時間振盪した（全ブロスの最終pH 〜 7.9-8.1）。

YNH : 1%酵母エキス粉末 CSH-8： 8%コーンスティープリカー
0.15% NaCl 0.5%蔗糖
0.1% ヒダントイン 0.1% ヒダントイン
(pH8.0) (pH7.0)

全細胞を遠心分離により10リットルブロスから収穫し、H₂Oに再懸濁して1.0リットルとした。細胞をミクロフルイダイザー（Microfluidics Corporation)に3回通過させることにより破壊した。この混合物を遠心分離して細胞残屑を除去し、得られたペレットを200mlで1回洗浄した。得られた粗製酵素の最終容量は1.3リットルであった。

清澄化した画分に硫酸アンモニウムを60%飽和となるまで添加した。沈殿した酵素を遠心分離で集めた。このペレットを50mM HEPES(pH7.5)に最終容量250mlとなるまで溶解した。酵素を遠心分離して残存する不活性固体を除去した。この酵素を50mM HEPES(pH7.5)緩衝液に対して一夜透析し、Centriprep 30（30000MWCO）で50mlまで濃縮した。

濃縮した酵素溶液を、50mM HEPES(pH7.5)で前もって平衡化した45x300mm DEAE Trisacrylカラムに適用した。カラムを2カラム容量の同緩衝液で再度洗浄した。酵素を50mM HEPES(pH7.5)中0-300mM NaClの勾配500mlで溶離した。画分を蛋白含有量と活性について検定した。活性ピーク画分をCentriprep 30（30000 MWCO）でおよそ2.0mlまで濃縮した。

DEAE Trisacrylカラムからの濃縮液を10x300mm Superose 12カラム（50mM HEPES pH7.5で前もって平衡化）に適用し、同緩衝液約60mlで溶離した。

Superose 12カラムについての活性ピーク画分をプールし、Centricon 30（30000 MWCO）で1.0mlに濃縮し、1mmの10%ポリアクリルアミドゲルに適用し、固有条件下でランした。このゲルを切片に切り、個々の切片を活性について検定した。ヒダントイナーゼ活性を含む切片を電気溶離して酵素を回収した。このプロセスによって得られた酵素はSDS-Pageで>90%均質であると測定された。

2.2 ヒダントイナーゼの分子量決定
ゲル濾過クロマトグラフィーは、天然のヒダントイナーゼの分子量がおよそ100000ないし110000ダルトンであることを示した。

還元SDSゲル上でランしたヒダントイナーゼの熱変性試料はおよそ53000ダルトンに単一バンドを与え、一方非還元SDSゲル上では同じ試料は57000および53000ダルトンに殆ど等しい強度のバンドを与えた。この事は、このヒダントイナーゼ蛋白が恐らく57000でランする二次構造を持つホモ二量体（53000）である事を示している。

非還元SDSゲル上での酵素の非煮沸試料は約100000ダルトンに単一バンドを与え、ゲル濾過クロマトグラフィーで得られた結果が確認された。

2.3 ヒダントイナーゼの比活性
調製用未変性ゲル由来の活性バンド溶出液を検定し、BSA標準を用いるPierce Microtiter検定プロトコルにより蛋白を測定した。比活性は蛋白1mg当たり4IUより高いと決定された。

2.4 ヒダントイナーゼのPI値
調製用未変性ゲル由来の活性バンド溶出液を低分子量蛋白マーカーを用いてPhast System IEF-PAGEゲル上3-9のpH範囲でランさせ、ゲルを銀染色した。活性バンド蛋白のPIはおよそ4.5と決定した。

2.5 ヒダントイナーゼのN末端アミノ酸配列
53000DaサブユニットのN末端は自動エドマン配列決定により、
Ala-Lys-Val-Ile-Lys-Gly-Gly-Thr-Val-Ile-Thr-Ala-Asp-Arg-Thr-Phe（配列番号3）
と決定した。

Ochrobactrum anthropi由来のヒダントイナーゼをコードしている遺伝子の単離
3.1 Ochrobactrum anthropi由来の染色体DNAの調製
種菌培地25mlを入れた125mlフラスコ2個にOchrobactrum anthropiの斜面培養を接種した。この培養を1.5%酵母エキス、0.15% NaCl、0.1%ヒダントイン（pH8.0）中、28℃、250rpmで24時間増殖させた。細胞を遠心分離により収穫し、溶菌し、100μg/mlのプロテイナーゼKおよび0.5% SDSを含有するTE（10mM Tris-Cl pH8.0、1mM EDTA）緩衝液中で消化した。この懸濁液を37℃で1時間インキュベートした。次にこのミックスを0.7M NaCl中10% CTAB（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、Sigma H-5882）中65℃で20分間沈殿させ、細胞壁残屑、多糖類、および残存蛋白を除去した（Wilson,K.(1994) Preparation of Genomic DNA from Bacteria, in F.M.Ausubel, R.Brent, R.E.Kingston, D.D.Moore, J.A.Smith, J.G.Seidman, and K.Struhl(Eds.), Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons, New York）。混合物を2回、即ちまずクロロホルム：イソアミルアルコール（24:1）、次いでフェノール:クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）で抽出し、イソプロパノールで沈殿させた。100μg/mlのRNアーゼAを含有するTEにDNAペレットを溶解し、22℃で16時間インキュベートした。2回目のプロテイナーゼK/SDS消化を行い、有機抽出とエタノール沈殿化を反復した。DNAをTEに溶解した。DNA濃度を260nmで分光測光的に測定した。

3.2 Ochrobactrum anthropiのゲノムDNAライブラリーの組み立て
Applied Biosystems 391 DNAシンセサイザーPCR-MATEを用いてN末端アミノ酸配列（上記実験の項2.5）から4個の17量体変性オリゴヌクレオチドプローブを合成し（図3）、γ[³²P]ATP（Amersham AH9968）で末端標識し、制限エンドヌクレアーゼBamHI、EcoRI、およびHindIIIで消化したO.anthropi染色体DNAのサザンブロット（Southern,E.M. 1975, J.Mol.Biol. 98:503-517）をプロービングするのに使用した。ハイブリダイゼーションはTMAC溶液（3M TMAC、0.1M Na₃PO4、pH6.8、5Xデンハート、1% SDS、100μg/ml変性鮭精子DNA、1mM EDTA）緩衝液中46℃で18時間実施した。TMACはテトラメチルアンモニウムクロリド、Sigma T-3411である。この染色体DNAのHindIII消化物のサザンブロットは6kbと12kbという2個のフラグメントを同定し、これらはN末端オリゴヌクレオチドプローブの1つとハイブリダイズした。O.anthropi染色体DNAをHindIIIで消化し、0.8% SeaPlaque（FMC）調製用アガロースゲルで、TAE（0.40M Tris-酢酸塩、0.002M EDTA）緩衝液中を10ボルトで16時間電気泳動した。5-7Kb DNAフラグメントおよび10-14Kbフラグメントを含むゲル切片を切り取り、Glass Max DNA Spin Cartridge系（BRL）で単離した。このHindIIIフラグメントを、アンピシリン選択マーカーをネオマイシン選択マーカーに交換することにより修飾したpBluescript KS+ファージミドベクター（Stratagene）にライゲーションし、HindIIIで開裂させ、細菌アルカリホスファターゼで脱燐酸化した。このライゲーション混合物を使用して、2.5Kvolt、200オーム、25μFdで電気穿孔することによりE.coli XL1-blue細胞（Stratagene）を形質転換させた。形質転換体を30μg/mlネオマイシンを含有するLB寒天上で選択した。

3.3 ヒダントイナーゼ遺伝子を含むクローンの選択
ゲノムライブラリーのコロニーブロットを作製し、N末端オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングした。各フラグメントから12のクローンをさらなる評価のためにまず選択した。プラスミドDNAを、TELT mini-prep法（He, et al., Nucl.Acids Res., 18:1660(1990))を用いて各形質転換体から単離した。これらのクローンのサザン分析により、プローブとハイブリダイズする2個のクローンを同定した。制限分析により、これら2個のクローンが、同一の13Kb HindIIIフラグメントを同じ向きに含んでいることが確定した（図4）。プライマー伸長およびサザンブロッティングによるこの13Kb HindIIIフラグメントのさらなる分析は、このフラグメント内部のヒダントイナーゼ遺伝子の位置および向きを決定した。この2個のクローンのうち一方から4Kb EcoRVフラグメントを単離し、EcoRVで開裂しておいたpBluescript KS+ファージミドベクターpSTKSN中にサブクローニングし、細菌アルカリホスファターゼで脱燐酸化した。プラスミドDNAを上記と同様に12個のコロニーから単離し、EcoRI消化により分析した。2個のクローンが正しいフラグメントを反対の向きに含んでいると同定された（図5）。これら2個のクローンを活性について検定したところ、一方が、元のOchrobactrum細胞の約2倍量の合計細胞酵素を産生することが示された。4Kb EcoRVフラグメントのヌクレオチド配列決定は、プローブ4に相補的な配列を同定した（配列番号7）。隣接DNA配列の翻訳は、先に決定されたN末端アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を生成した（配列番号3）。

3.4 ヌクレオチド配列の決定
この4Kb EcoRVフラグメント上にコードされているヒダントイナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を、fmol DNAサイクル配列決定系（Promega）を用いるジデオキシ鎖終止法（Sanger, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A. 74:5463-5467(1977))によって決定した。遺伝子の同定に使用されたN末端オリゴヌクレオチドプローブ（前進および逆）および合成された内部プライマーを使用して、両方の鎖から遺伝子全体を配列決定した。TBE（0.089M Tris-硼酸塩、0.089M硼酸、0.002M EDTA）緩衝液中7M尿素を含有する7% Long Ranger（AT BIOCHEM）ポリアクリルアミドゲル上で、電気泳動を2700ボルトで実施した。完全なヌクレオチド配列を図6に示す。コード領域は1440bp長であり、480アミノ酸蛋白（MW=53kD）をコードしている。これは該酵素の脱グリコシル化型と一致する（上記の実験の項1.5）。該DNA配列の翻訳から決定したN末端蛋白配列は、上記の実験の項2.5で同定した蛋白配列と同一である。

E.coliにおけるヒダントイナーゼ遺伝子の発現
4.1 発現ベクターへのサブクローニング
ヒダントイナーゼ遺伝子のコード領域にPCRで突然変異を起こさせて、コード領域の翻訳開始部位にBamHIおよびNcoI制限部位を、そして該遺伝子の3'末端にBamHI部位を挿入し、発現ベクターへのクローニングを促進させた。以下のプライマーをPCR反応用に合成した：
5'-GGGAACGAGGATCCATGGCAAAGGT-3'（配列番号10）
（BamHIおよびNcoI部位を含む）
5'-AACTCATGCGCGGATCCCGAAGCTG-3'（配列番号11）
（BamHI部位を含む）
PCRフラグメントをBamHIで消化しGlass Max DNA Spin Cartridge系（BRL）でカラム精製した。このフラグメントをBamHIで開裂しておいたpBluescriptファージミドベクターpSTKSNにライゲーションし、細菌アルカリホスファターゼで脱燐酸化した。ライゲーションミックスを用いてE.coli DH5αmcrコンピテント細胞（BRL）を形質転換させた。プラスミドDNAを、上記実験項3.3に記載のように6個のコロニーから単離し、BamHI消化により分析した。クローンのうち5個が正しい組み立て物を含んでおり、これらをNcoI消化によってさらに分析した。5個全てがNcoI部位を持っていた。これらのうち1個を幾つかの発現ベクターへのサブクローニング用に選択した（図7）。このクローンをpKSHY3と命名した。

pKSHY3をNcoIおよびBamHIで消化し、次にTAE緩衝液中の0.8% SeaPlaque（FMC）調製用アガロースゲルで、40ボルトで4時間電気泳動した。1479bp NcoI/BamHIフラグメントをこのゲルから切り取り、Glass Max DNA Spin Cartridge系（BRL）で単離した。このフラグメントを、NcoIおよびBamHIで開裂させておいた発現ベクターpBMS1000（米国特許第6068991号、2000年5月30日、S.W.Lin and T.Franceschini, “高発現Escherichia Coli発現ベクター”、この内容は引用により本明細書の一部とする）にライゲーションした。このライゲーションミックスを用いてE.coli DH5αmcrコンピテント細胞（BRL）を形質転換させた。コロニーをNcoI/BamHI消化物によってスクリーニングしたところ、全てが正しい組み立て物を与えた（図8）。このクローンをpBMS1000HY-1と命名した。このクローンを用いてE.coli宿主W3110、BL21、および#7（ATCC23736）を形質転換させた。

4.2 E.coli宿主での発現
各宿主から2個のクローンを振盪フラスコ評価のために選択した。制限分析は各々のクローンが正しい組み立て物を含んでいることを確認した。新しい一夜培養を用いて、ネオマイシン選択下に増殖させたTブロス培養25mlに接種した。培養を37℃でインキュベートし、A₆₀₀が2となるまで増殖させた。零時点を測定し、次いでこの培養に0.4mM IPTGを誘導した。1時間および2時間の時点を採用した。培養を収穫して活性を検定し、還元条件下に20-25mAで電気泳動させた4-20%蛋白勾配ゲル（Enprotech）で、その時点の発現について分析した。蛋白ゲルは、元のOchrobactrum細胞に比較して増大した発現レベルを示す。表7に活性の結果をまとめる。これらの結果に基づき、BL21をさらなるヒダントイナーゼ発現研究のための最良の宿主として選択した。

表７
試料 湿重量（g/10ml） ヒダントイナーゼ活性（IU/g)
T7-1 0.09 7.5
W3110-1 0.21 3.3
W3110-2 0.18 3.5
BL21-1 0.19 8.0
BL21-2 0.13 8.0
7-1 0.16 4.6
7-2 0.24 4.2

組換えヒダントイナーゼの特性決定および固定化
5.1 基質特異性
ヒダントイナーゼ遺伝子を含むE.coli BL21を実施例4.2に記載のように増殖させた。細胞を遠心分離し100mM炭酸緩衝液（pH9.0）で洗浄し、同緩衝液に再懸濁し、超音波処理によって破壊した。この酵素を実施例2に記載のように精製した。精製酵素を種々のヒダントインを基質として基質特異性について試験した。結果を表9にまとめる。

表９
基質 比活性（IU/mg）
ヒダントイン 7.5
ウラシル 1.8
2-チオウラシル N.D.
5-メチルヒダントイン 10.6
5,5-ジフェニルヒダントイン N.D.
ヒドロキシメチル 5,5-ジメチルヒダントイン 5.6
p-ヒドロキシメチルヒダントイン 1.9
D,L ヒダントイン 5-酢酸 1.8
2-チオヒダントイン 4.3

5.2 金属イオン要件
種々の金属イオンを100mM濃度で添加したヒダントインを用いて精製ヒダントイナーゼを検定した。結果を下の表10にまとめる。

表１０
金属イオン比活性：
無し（EDTA） 4.8 Mg（II） 5.2
Ca（II） 3.6 Mn（II） 7.1
Co（II） 3.6 Ni（II） 3.6
Cu（II） 1.2 Zn（II） 1.8
Fe（III） 3.8
Fe（II） 9.3

金属イオン不在下でも活性はあるが、Fe(II)およびMn(II)はこの酵素の活性を刺激すると思われる。

5.3 精製および固定化組換えヒダントイナーゼの至適温度
この組換え酵素を実施例1.7で非精製酵素について記載したように固定化した。固定化酵素と精製酵素を種々の温度で検定し、至適温度を決定した。結果を下の表11に示す。

表１１
温度 相対活性
固定化酵素 精製酵素
25 73 38
37 100 69
45 100 100
55 93 85
65 94 80
75 82 66

本発明を明確性および理解の目的で説明と実施例によって幾分詳細に記載してきたが、付記した請求項の範囲内で幾らかの変更および修飾を施せるということは明らかである。

細胞全体におけるヒダントイナーゼ活性の温度プロフィール。

グルタルアルデヒド処理した細胞におけるヒダントイナーゼ活性のpH至適条件。

本発明において有用なDNAおよびポリペプチドのフラグメント。プローブ1-4を本発明に係る酵素の取得に使用した。プローブ1から4まではそれぞれ配列番号4から7である。アミノ酸配列は配列番号9であり、これは該アミノ酸配列の直下に示すDNA配列によりコードされている（配列番号8）。配列番号8の逆が配列番号10である。

プラスミドhyd13fの模式的表示。

プラスミドhyd4fの模式的表示。

本発明に係る酵素をコードしているゲノムDNA配列（配列番号1）および本発明に係る酵素のアミノ酸配列（配列番号2）。エドマン配列決定により決定したN末端配列（配列番号3）を太字で示す。

pKSHY3の組み立て。

pBMS1000HY-1の組み立て。

Claims (19)

1. 配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている配列を含む、単離された核酸分子。
2. 請求項１に記載の核酸分子に対し相補的な配列を有する核酸に対し相補的なまたは該核酸とストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズできる配列を有する、単離された核酸分子。
3. ＤＮＡ分子である請求項１に記載の核酸分子。
4. ＤＮＡ分子である請求項２に記載の核酸分子。
5. 配列番号１のヌクレオチド配列を有する、請求項３に記載の単離されたＤＮＡ分子。
6. 配列番号２のアミノ酸配列 を有する、単離されたポリペプチド。
7. 請求項１に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
8. 複製起点、プロモーター、および転写終止配列をさらに含む、請求項７に記載の発現ベクター。
9. 選択マーカー遺伝子をさらに含む、請求項８に記載の発現ベクター。
10. 配列番号１のＤＮＡ配列を含む、請求項７に記載の発現ベクター。
11. 該ベクターがプラスミドである、請求項７に記載の発現ベクター。
12. 該プラスミドが、プラスミドｈｙｄ１３ｆおよびプラスミドｈｙｄ４ｆという群から選ばれる、請求項１１に記載の発現ベクター。
13. 請求項７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
14. 請求項８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
15. 請求項９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
16. 真核生物および原核生物という群から選ばれる、請求項１３に記載の宿主細胞。
17. 請求項１３に記載の宿主細胞を該ポリペプチドの発現をもたらす条件下で培養することを含む、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを生成する方法。
18. ５−一置換ヒダントインを、対応するＤ−Ｎ−カルバモイルアミノ酸を形成するのに好適な条件下で、配列番号２に示すＤ−ヒダントイナーゼ と接触させることを含む、５−一置換ヒダントインを立体選択的に変換する方法。
19. ５−一置換ヒダントインがラセミ混合物である、請求項１８に記載の方法。

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