DE69110952T2 - Penicillin-G-Acylase, dafür kodierendes Gen und Verfahren zur Herstellung von diesem Enzym. - Google Patents

Penicillin-G-Acylase, dafür kodierendes Gen und Verfahren zur Herstellung von diesem Enzym.

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Description

    Technisches Gebiet
  • Diese Erfindung betrifft ein Gen, das für Penicillin-G- Acylase kodiert, die von diesem Gen kadierte Penicillin-G-Acylase und ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms.
    • Hintergrund und relevante Literatur
  • Die Penicillin-G-Acylase (Benzylpenicillin-Amidohydrolase, auch Penicillinamidase genannt, EC 3.5.1.11) ist ein Enzym, das kommerziell zur Hydrolyse von Penicillin G oder 3-Desacetoxycephalosporin G jeweils zu Phenylessigsäure und 6-Aminopenicillansäure (6-APA) oder 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure (7-ADCA) verwendet wird, die wichtigsten Zwischenprodukte für die industrielle Herstellung von halbsynthetischen Penicillinen und Cephalosporinen. Dieses Enzym katalysiert auch die umgekehrte Reaktion, nämlich die N-Acylierung von 6-APA und 7-ADCA mit organischen Estern unter Bildung ihrer entsprechenden N-acetylierten Penicillin- und 3-Cephemverbindungen. Siehe die Zusammenfassungen von E. J. Vandamme in Microbial Enzyms and Bioconversions, E.H. Rose (Herausgeber), Economic Microbiology, 5, 467-552 (1980) und P.B. Mahajan, Appl. Biochem. Biotechnol. 1, 83-86 (1982).
  • Verschiedene Typen von Mikroorganismen wurden in der Literatur als Penicillin-G-Acylase-bildende Stämme vorgeschlagen. die zur Desacylierung von Penicillin G und 3-Desacetoxycephalosporin G brauchbar sind. Beispiele für solche Acylase bildenden Mikroorganismen sind bestimmte Stämme der Arten Escherichia coli, Kluyvera citrophila und Proteus rettgeri. Es soll auch erwähnt werden, daß eine leichte Penicillin-G-Acylase Aktivität für Ganzzellfraktionen von Alcaligenes faecalis beschrieben wurde (C. A. Claveridge et al., Nature 4733, 237-238 (1960)). Jedoch wurde bis jetzt kein Enzym oder keine Enzyme beschrieben, die für diese Aktivität von A. faecalis verantwortlich sind.
  • Die Verwendung von rekombinanten DNA Verfahren ermöglichte eine Steigerung der Produktionsmengen an im Handel erhältlichen Penicillin-G-Acylasen (Mayer et al., Adv. Biotechnol. 1, 83-86 (1982)) und vergrößerte den Einblick in die Prozessierung dieser Enzyme (Schumacher et al., Nucleic Acids Res. 14, 5713-5727 (1986) ). Die Penicillin-G-Acylase von E. coli wird als großes Vorläuferprotein gebildet, das dann weiser in das Periplasmatische reife Protein prozessiert wird, das aus einer kleinen (α) und einer großen (β) Untereinheit besteht. Die Klonierung und Sequenzierung des Kluyvera citrotphila Acylasegens zeigte eine enge Homologie mit dem E. coli Acylasegen (J. L. Barbero et al., Gene 49, 69- 80 (1986)) Auch für das Proteus rettgeri Penicillin-G-Acylasegen wurde eine kleine und eine große Untereinheit beschrieben (G. O. Daumy et al., Gene 493 69-80 (1986), spanische Patentanmeldung Nr. 86 02933).
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • In einem Aspekt der Erfindung wird ein Gen bereitgestellt, das penicillin-G-Acylase kodiert, das im wesentlichen die in Figur 1 angegebene Struktur aufweist. Das Gen wird vorzugsweise aus A. faecalis erhalten.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der dieses Gen enthält. Es wird ebenfalls ein Wirtssystem bereitgestellt, das eine oder mehrere Kopien dieses Gens enthält.
  • Die Erfindung liefert ferner dieses Penicillin-G-Acylasegen unter der Kontrolle eine Regulons, das Transkriptions- und/oder Translationsregulationssequenzen umfaßt, wobei diese Regulationssequenzen durch andere Transkriptions- und/oder Translationsregulationssequenzen ersetzt sind. Diese letzteren Regulationssequenzen können vom gleichen oder von einem anderen Organismus erhalten werden.
  • Die vorliegende Erfindung liefert ferner einen Vektor, der dieses Penicillin-G-Acylasegen enthält, das in Bezug auf die Regulationssequenzen wie oben angedeutet, verändert ist, und einen Wirt, der diesen Vektor enthält. Das Penicillin-G-Acylaseenzym, das aus der Expression dieses Gens resultiert, hat eine überraschend gute Stabilität und eine hobe spezifische Aktivität.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird dieses Penicillin-G-Acylaseenzym in isolierter Form bereitgestellt. Wenn es in Acylierungs- oder Desacylierungsprozessen in großem Maßstab verwendet wird, wird es vorzugsweise in immobilisierter Form verwendet.
  • Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Herstellung von Penicillin-G-Acylase durch Fermentation eines transformierten Wirts, der dieses Enzym kodiert und die Gewinnung der Penicillin-G-Acylase in isolierter Form.
  • Diese und andere Ausführungsformen werden im folgenden ausführlicher erläutert.
    • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Figur 1: Physikalische Karte der A. faecalis Penicillin-G-Acylase Genregion. Hierbei ist das Insert von pAF1 gezeigt
  • Figur 2: Struktur des Plasmids pMcTNde
  • Figur 3: Struktur des Plasmids pMCTAF1A
  • Figur 4: Struktur des tac-Promotors
  • Figur 5: Struktur des trp-Promotors
  • Figur 6: Struktur des Plasmids pKTAFA
  • Figur 7: Struktur des p78-Promotors
  • Figur 8: Struktur des pf3-Promotors
    • Kurze Beschreibung der Seguenzlisten
  • Sequenzliste 1: Nukleotidsequenz des Penicillin-G-Acylasegens von A. faecalis und die abgeleitete Aminosäuresequenz des neuen Pac-Enzyms
  • Sequenzliste 2: Nukleotidsequenz des tac-Promotors
  • Sequenzliste 3: Nukleotidsequenz des trp-Promotors
  • Sequenzliste 4: Nukleotidsequenz des p78-Promotors
  • Sequenzliste 5: Nukleotidsequenz des pf3-Promotors
    • Spezifische Ausführungsformen
  • Das neue Penicillin-G-Acylaseenzym (Pac) von Alcaligenes faecalis kann auf eine Weise isoliert werden, die an sich bekannt ist: Beispielsweise wird ein A. faecalis Stamm in einem geeigneten Kulturmedium angezogen, das beispielsweise aus Hefeextrakt in einer gepufferten Lösung, insbesondere in einem Phosphatpuffer bei einem ph von etwa 6-8, insbesondere etwa 7, wahlweise in Gegenwart des Induktionsmittels KPA besteht. Es kann jeder A. faecalis Stamm verwendet werden. Das Enzym wird dann durch ein Verfahren gereinigt, das an sich bekannt ist, vorzugsweise in zwei Schritten, der erste beispielsweise mit veresterter Cellulose und anschließend die Anwendung der Gelchromatographie, insbesondere unter Verwendung von Hydroxylapatit.
  • Das gereinigte Enzym kann einer Aminosäureanalyse der Peptidfragmente unterworfen werden, vorzugsweise des NH&sub2;-Terminus jeder Untereinheit. Aus der bestimmten Aminosäureseguenz kann eine DNA Sonde zur Detektion der Gensequenz abgeleitet werden. Es wurde zum ersten Mal festgestellt, daß die Penicillin hydrolysierende Aktivität von A. faecalis von der gereinigten Penicillinacylase herrührt, die sich als Heterodimer aus zwei Untereinheiten mit einer Größe von 26 kDa und 59 kDa herausstellt.
  • Das A. faecalis Pac-Gen kann aus chromosomaler DNA auf eine Weise identifiziert werden, die an sich bekannt ist. Das Gen besteht im wesentlichen aus einer Struktur, die in Figur 1 angegeben ist. Es ist verständlich, daß alle homologen Gene, die mit der in Figur 1 gezeigten Sequenz hybridisieren können und die ein Enzym kodieren, das im wesentlichen dieselbe Struktur aufweist, von dieser Erfindung erfaßt sind. Die folgende Gleichung, die aus der Analyse der Einflüsse verschiedener Faktoren auf die Hybridstabilität abgeleitet ist
  • Tm = 81 + 16,6 (log10 Ci) + 0,4 (% G + C) - 600/n - 1,5 % Mismatch (Ausubel et al., siehe obige Literaturstelle), in der
  • n = die Länge der kürzesten Kette der Sonde
  • Ci = die Ionenstärke (M)
  • G + C = die Basenzusammensetzung ist
  • kann zur Bestimmung verwendet werden, welcher Homologiegrad mittels DNA-DNA Hybridisierungstechniken detektiert werden kann.
  • Daher soll der Ausdruck "im wesentlichen mit einer Struktur" Sequenzen umfassen, die konservative Mutationen einschließen, bei denen die Sequenz dieselbe Aminosäuresequenz kodiert, die sich aber gemäß der obigen Gleichung bis zu 35 %, typischerweise bis zu 10 % in der DNA Sequenz unterscheiden können.
  • Ein Homologievergleich der Aminosäuresequenz des neuen A. faecalis Pac-Enzyms mit der veröffentlichten Sequenz der Penicillin-G-Acylase von E. coli (Schumacher et al., siehe obige Literaturstelle) zeigte eine Gesamthomologie von nur 43 %. Darüberhinaus beträgt die Homologie zur bekannten Aminosäuresequenz des Pac-Enzyms von Kluyvera citrophila (Barbero et al., siehe obige Literaturstelle) ebenfalls nur 44 %.
  • Das Pac-Gen von A. faecalis kann in E. coli unter der Kontrolle seines eigenen Promotors und/oder des induzierbaren tacoder trp-Promotors (siehe Figuren 4 und 5) exprimiert werden. Die Ergebnisse der Penicillin-G-Acylasebildung sind überraschend gut. Unter Verwendung dieses Pac-Gens mit dem tac-Promotor ist die Produktion ebenso hoch, wie die des ursprünglichen A. faecalis Stamms, wobei im letzeren Fall Kaliumphenylacetat als Induktionsmittel zugegeben werden muß. Der E. coli Stamm zeigt mit dem A. faecalis Pac-Gen unter der Kontrolle des trp-Promotors ohne jedes Induktionsmittel eine Penicillin-G-Acylasebildung, die fünfmal höher ist, als die der oben erwähnten Stämme. In beiden Stämmen kann die Abhängigkeit von der Induktion mittels Kaliumphenylacetat als Induktionsmittel, das teuer ist, jetzt vermieden werden.
  • Um einen Produktionsstamm zu erhalten, der nur homologe DNA enthält, wurde eine Transformation in A. faecalis selbst entwickelt. Eine erfolgreiche DNA Transformation in A. faecalis kann geeigneterweise durch zwei verschiedene Verfahren erreicht werden. Zuerst kann ein Konjugationstransfer von Plasmiden mit breitem Wirtsspektrum von E. coli in A. faecalis erhalten werden. Zweitens kann die Elektroporation (BIORAD-gene pulser) von A. faecalis mit Plasmiden verwendet werden, die auf dem Replikon RSF 1010 basieren.
  • Bei der Klonierung des A. faecalis Gens können verschiedene Transkriptionssequenzen verwendet werden. Zuerst kann das A. faecalis Pac-Gen in A. faecalis unter der Kontrolle des eigenen Promotors kloniert wenden. Die Bildung der Penicillin-G-Acylase ist verglichen mit dem A. faecalis Stamm ohne zusätzliche Pac-Gene stark verbessert und kaum von der Induktion durch Kaliumphenylacetat abhängig. Zweitens führt die Verwendung des E. coli trp-Promotors, der von jeglichem Induktionsmittel unabhängig ist, zur Erlangung einer ähnlich hohen Menge an Penicillin-G-Acylase. Drittens ist durch die Anwendung von zwei Expressionselementen, die vom Phagen pf3 von Pseudomonas aeruginosa stammen, die Promotoren pf3 und p78 (Luitgen, Doktorarbeit, Nijmegen (1986)) die Bildung der Penicillin-G-Acylase etwas geringer, als die, die mit einem A. faecalis Stamm mit zusätzlichen Pac-Genen unter der Kontrolle des eigenen oder des E. coli trp-Promotors etwas geringer, aber ist verglichen mit dem A. faecalis Stamm ohne zusätzliche Pac-Gene immer noch verbessert und viel weniger von der Induktion durch Kaliumphenylacetat abhängig.
  • Der Stand der Technik beschreibt die Verwendung von A. faecalis zur Bildung von Penicillin-G-Acylase in isolierter Form nicht. Ebenso wurden weder die verbesserten Eigenschaften des neuen A. faecalis Penicillin-G-Acylaseenzyms in Bezug auf das von E. coli noch die Verwendung von rekombinanten DNA Verfahren zur Steigerung und Vereinfachung der Produktion der Penicillin-G- Acylase von A. faecalis im Stand der Technik bis jetzt vorgeschlagen.
  • Die Penicillin-G-Acylase, die mit Hilfe des A. faecalis Pac-Gens gebildet wird, vorzugsweise in einem gramnegativen Organismus kloniert ist, vorzugsweise in einen Alcaligenes oder Escherichia Mirkoorganismus, vor allem in A. faecalis, wird überraschenderweise in großen Mengen gebildet. Darüberhinaus ist die Stabilität und speziell die spezifische Aktivität des Penicillin-G-Acylasegens viel größer, als die der bisher bekannten Penicillinacylasen.
  • Eine gereinigte Präparation von A. faecalis wird ebenfalls geliefert, die eine höhere spezifische Aktivität dieses Enzyms auf dem bevorzugten Substrat Penicillin G zeigt, als alle derzeit bekannten Penicillinacylasen. Darüberhinaus wird die gereinigte Präparation zur Bestimmung der Thermostabilität der A. faecalis Penicillin-G-Acylase im Vergleich zur E. coli Penicillinacylase verwendet. Die Stabilität der A. faecalis Penicillin-G-Acylase ist signifikant besser, als die der E. coli Penicillin-G-Acylase, was eine verlängerte Verwendung unter industriellen Bedingungen erlaubt.
  • Vorzugsweise wird die Penicillin-G-Acylase und auch die durch diese Erfinung bereitgestellte in industriellen Prozessen in immobilislerter Form verwendet. Der Träger, auf dem sie immobilisiert ist, umfaßt typischerweise Gelatine, die wahlweise mit Chitosan, Aluminiumoxid, Siliciumoxid, Ionenaustauscherharzen oder Acrylatkügelchen, wie beispielsweise Eupergit , quervernetzt ist.
  • Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung.
    • Materialien und Methoden Klonierung und Detektion der Acylasegene
  • Allgemeine Klonierungstechniken werden ausgeführt, wie sie von Maniatis et al., (1982 und 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory) oder Ausubel et al., (1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc., New York) oder B. Perbal (1988, A Practicai Guide to Molecular Cloning, zweite Ausgabe, John Wiley and Sons, Inc. New York) beschrieben sind. Diese Handbücher beschreiben im Detail die Protokolle zur Konstruktion und Vermehrung von rDNA Molekülen, die Verfahren zur Herstellung von Genbänken und die Protokolle zur Mutation von DNA an einem bestimmten Ort oder zufällig. Enzyme, die für die DNA Manipulationen verwendet werden, werden von kommerziellen Herstellern bezogen und gemäß deren Anweisungen verwendet. Plasmide und- E. coli Klonierungswirte werden von öffentlichen Kulturensammlungen bezogen, wie der Phabagen Collection (Utrecht).
    • Medien
  • Selektivmedien für Phenylacetyl-L-Leucin (fal) werden hergestellt, wie dies beschrieben wurde (Garcia et al., siehe obige Literaturstelle) . Minimalplatten sind folgendermaßen zusmamengesetzt M63 Minimalagar, 2 g/l Glucose, 1 mg/l Thiamin, 10 mg/l L-Prolin und das geeignete Antibiotikum (25 ug/ml Chloramphenicol (Cap) oder 50 ug/ml Ampicillin (Amp)) . Transformanden von E. coli HB101 (Leu-), die ausschließlich in Gegenwart des Acyl-L-Leucins wachsen, dürften ein Acylasegen enthalten.
    • Minimal E* Medium:
  • 16 g/l Difco-Agar, Spurenelemente 0,2 g/l MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 10 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 3,5 g/l Na(NH&sub4;)HPO&sub4;, 1,6 g/l Natriumcitrat
    • 4xLBC Medium:
  • Hefeextrakt 20 g/l, Bactotrypton 40 g/l, NaCl 10 g/l, Casaminosäuren 4 g/l, Basildon 0,25 g/l (Antifoam 86-013, Basildon Chemical Corporation), pH 7,0.
    • AF (Alcaligenes faecalis) Medium:
  • Nefeextrakt 15 g/l, Na&sub2;HPO&sub4; 2 H&sub2;O 4,5 g/l, KM&sub2;PO&sub4; 3,4 g/l, pH 7,0 (im Fall einer Induktion: Kaliumphenylessigsäure (KPA) 1,0 g/l)
    • 2xTY Medium:
  • 16 g/l Bacto-Trypton, 10 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl. Phenylacetylleucin wird von LGSS, Transferbüro Nijmegen bezogen.
  • Der A. faecalis Stamm ATCC 19018 (ebenfalls hinterlegt als NCTC 415) wird als Donorstamm für das A. faecalis Pac-Gen und als Wirt für rekombinante Plasmide verwendet.
  • Die E. coli Stämme JM101, WK6 und HB101 (Phabagen, Utrecht) werden als Wirte für rekombinante Plasmide verwendet.
    • Beispiel 1 Reinigung und Charakterisierung der A. faecalis Penicillinacylase
  • Der Stamm A. faecalis ATCC 19018 wird in AF Medium angezogen. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und im folgenden Puffer resuspendiert: Tris 0,1 M pH 8,0, EDTA 0,2 mM, Lysozym 0,02 mg/ml und für 2 Stunden bei 30ºC inkubiert. Der Zelldebris wird durch Zentrifugation entfernt.
  • Die Penicillin-G-Acylase (Pac) wird in zwei Schritten gereinigt. Den Ersten erhält man mit Carboxymethylcellulose (CM-52 Whatman). Der Zweite besteht aus der Eliminierung der verbleibenden kontaminierenden Proteine durch eine Hydroxylapatitgelchromatographie (Biogel HTP von Biorad) . Das entstehende reine Pac besteht aus zwei nicht identischen Untereinheiten. Die kleine (α) und die große (β) Untereinheit werden einer NH&sub2;-terminalen Aminosäureanalyse unterzogen. Das Ergebnis ist folgendes:
  • Untereinheit α (26 kDa) NH&sub2;-Q-X-Q-X-V-E-V-M-X-T
  • Untereinheit β (59 kDa) NH&sub2;-S-N-L-W-S-T-X-P-E-X-V
    • Beispiel 2 Klonierung des A. faecalis Penicillinacylasegens
  • Chromosomale DNA von A. faecalis (ATCC 19018) wird isoliert und partiell mit Sau3A verdaut. Fraktionen, die von 4 kb bis 7 kb reichen, werden gereinigt und in den Vektor pACY184 ligiert, der mit BamHI verdaut wurde. Die DNA wird in E. coli HB101 transformiert und auf fal-Platten ausplattiert (siehe Methoden). Zwei positive Klone pAF1 und pAF2 können identifiziert werden. Diese Klone werden ebenfalls mit positivem Ergebnis in der Serratia marcescens Uberschichtungstechnik getestet (V. Meevootisom et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 25, 372-378 (1987)). Das 6,4 kb Insert des pAF1 Plasmids ist in Figur 1 gezeigt. Die Lokalisierung des Gens wird mit Hilfe eines Oligonukleotids bestimmt, das auf die NH&sub2;-terminale Sequenz der β-Untereinheit des A. faecalis Pac entworfen wurde.
  • Das folgende Oligonukleotid wird als Hybridisierungssonde auf dem pAF1 Insert verwendet:
  • AGC AAC CTG TGG AGC A/C C/G C TGC CCG GAG TGC GT Aus der Position des Hybridisierungssignals auf der Restriktionskarte wird die Orientierung des A. faecalis Pac-Gens bestimmt (Figur 1).
    • Beispiel 3 Bestimmung der Sequenz der A. faecalis Penicillinacylase
  • Der 3,9 kb Sau3A-NdeI Subklon des 6,4 kb Inserts zeigt eine Pac-Aktivität, während das 3,1 kb Sau3A-Sphl Fragment inaktiv ist (Figur 1). Die DNA Sequenz des 3,9 kb Inserts wird durch Desoxysequenzierung geeigneter Fragmente in pTZ18R und pTZ19R (Pharmacia) bestimmt. Die kodierende DNA Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz für A. faecalis Pac ist in der Sequenzliste 1 gezeigt. Aus der abgeleiteten Aminosäuresequenz kann geschlossen werden, daß A. faecalis Pac als große einzelne Polypeptidkette kodiert ist, die einer Prozessierung in zwei unterschiedliche Untereinheiten, α und β genannt, unterzogen wird. Am 5' Ende des Vorläufers ist eine typische Signalsequenz für die Translokation des Enzyms in das Periplasma gezeigt.
    • Beispiel 4 Expression der Penicillinacylase in E. coli
  • Das Plasmid pAF1 wird mit SalI verdaut und ein 4,8 kb Fragment wird gereinigt. Das Fragment wird in den mit SalI linearisierten Vektor pMCT-Nde ligiert. Der letztere Vektor wird aus Plasmid pMC5-8 (EP-A 0 351 029) durch Insertion eines Fragments konstruiert, das den tac-Promotor gefolgt von einer RBS Stelle und einer NdeI Klonierungsstelle enthält (Figur 2) . Das entstehende Plasmid pMcTAF1A (Figur 3), das nach der Transformation in E. coli HB101 erhalten wurde, exprimiert Pac unter der Kontrolle des eigenen Promotors und/oder des induzierbaren tac-Promotors (De Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 21 (1983)).
  • Um die Expressionsmenge von Pac weiter zu verbessern, werden zwei starke E. coli Promotoren in einer präzisen Fusion zum Acylasestartcodon kloniert. Um dies auszuführen, wird eine NdeI Schnittstelle am ATG Startcodon mittels ortsspezifischer Oligonukleotidmutagenese (Stanssens et al., 1989) des Plasmids pMcTAF1A unter Bildung von pMcTAF1ANde konstruiert. Dieses Plasmid wird mit NdeI verdaut und rezirkularisiert, was zur korrekten Positionierung des tac-Promotors vor dem Acylasegen führt (Plasmid pMcAFtac) . Um einen weiteren Promotor zu inserieren, wird das Plasmid pMcTAF1Nde mit EcoRI und NdeI verdaut und das große Fragment wird auf einem Agarosegel gereinigt. Die Tryptophanpromotorfragmente werden in dieses gereinigte EcoRI-NdeI Fragment von pMcTAF1ANde mittels 6 synthetischer Oligonukleotide inseriert.
  • die DNA Sequenzen dieser Promotoren sind jeweils in den Sequenzlisten 2 und 3 gezeigt und die Strukturen dieser Promotoren jeweils in den Figuren 4 und 5.
  • Diese Promotorkonstrukte werden in E. coli HB101 transformiert und auf Expression von Pac getestet. Die Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse verglichen mit der Expresionsmenge von A. faecalis ATCC 19018. Die Induktion des tac-Promotors mit Isopropylthio-β-galactosid (IPTG) und des trp-Promotors mit Indolacrylsäure (IAA) wird ebenfalls getestet. Tabelle 1: Expression von Pac in E. coli Stamm Einheiten* A. faecalis * relative Einheiten mit A. faecalis ATCC 19018 mit KPA im Medium als 1,0 standardisiert
  • Verschiedene Plasmide enthaltende E. co-li HB101 werden für 24 Stunden in 4xLBC angezogen. A. faecalis wird in AP Medium für 24 Stunden angezogen.
    • Beispiel 5 Expression der Penicillinacylase in A. faecalis
  • Um einen stabilen Transfer der genetischen Information in A. faecalis zu ermöglichen, müssen ein DNA Transformationssystem und ein stabiler Klonierungsvektor entwickelt werden. Uberraschenderweise wurde gefunden, daß ein triparentales Mating von Plasmid pKT248 (Bagdasarian et al., Gene 16, 237-247 (1981)) in A. faecalis möglich ist, indem man eine beschriebene Technik (Friedman et al., Gene 18, 289-296 (1982)) mit den folgenden Modifizierungen anwendet:
  • - E. coli MC1061, der das Helferplasmid pRK2013 trägt (Figurski & Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 1648 (1979)) wird mit E. coli HB101 (pKT248) und A. faecalis Empfängerstamm auf 2xTY Platten gemischt.
  • - Die Platten werden bei 30ºC über Nacht inkubiert, um die Konjugation stattfinden zu lassen.
  • - Die Konjugationsplatten werden auf Selektivagarplatten gestempelt, die Minimal E* Medium einschließlich Citrat, Spurenelemente und den selektiven Antibiotikumsschritt (50 ug/ml) und Cap (25 ug/ml) enthalten. Die Inkubation wird bei 30ºC über Nacht durchgeführt. Aufgrund der auxotrophen Marker wird gegen die E. coli Stämme selektiert. Die A. faecalis Kolonien werden anschließend auf 2xTY Platten ausplattiert, die 300 ul/ml Streptomycin enthalten.
  • Die Subklonierung des A. faecalis Pac-Gens wird in der Seil Einzelschnittstelle von Plasmid pKT248 ausgeführt. Das TthIII-HpaI Fragment von Plasmid pAF1 wird isoliert und mit Klenowpolymerase aufgefüllt. Die SalI Schnittstelle des linearisierten pKT248 wird ebenfalls stumpfendig gemacht und das Plesmid pKTAFA (Figur 6) wird nach der Transformation in E. coli HB101 und der Selektion auf fal-Platten erhalten. Nach der Isolierung wird dieses Plasmid in A. faecalis mittels der wie oben beschriebenen triparentelen Matingtechnik in A. faecalis transferiert. Der erhaltene Stamm wird in Schüttelkolben mit A. faecalis Wachstumsmedium angezogen und mit dem ursprünglichen Stamm verglichen. Wie es aus Tabelle 2 ersichtlich ist wird die Bildung von Pac im Stamm mit pKTAFA stark verbessert. Darüberhinaus ist ersichtlich, daß sogar in Abwesenheit des Induktionsmittels KPA eine starke Produktion erhalten werden kann. Dies erlaubt das Weglassen des teuren Induktiansmittels KPA aus industriellen Fermentationsmedien.
  • Um heterologe Promotoren vor dem Pac-Gen zu testen, werden jeweils das EcoRI-SalI Fragment von pMcAFtrp, pMcAFpf3 und pMcAFp78 in den mit EcoRI-SalI linearisierten Vektor pJRD215 subkloniert (Davison et al., Gene 51, 275-280 (1987)). Alle drei Promotorkonstruktionen werden in E. coli HB101 als pJRDAFtrp, pJRDAFpf3 und pJRDAFp78 erhalten und anschließend in A. faecalis ATCC 19018 transferiert. Die Expression von Pac durch diese Plasmide wird in Gegenwart oder Abwesenheit von KPA getestet (Tabelle 2) Tabelle 2: Produktion von Pac in A. faecalis Transformanden Stamm PAC Einheiten* relative Einheiten mit A. faecalis ATCC 19018 im Medium mit KPA als 1,0 standardisiert
  • Alle Plasmide werden mittels triparentalem Mating in A. faecalis ATCC 19018 trensferiert. Die Promotoren p78 und pf3 werden aus dem Phagen pf3 (Luiten, siehe obige Literaturstelle) ausgewählt. Die DNA Sequenzen dieser Promotoren sind jeweils in den Sequenzlisten 4 und 5 und die Strukturen dieser Promotoren jeweils in den Figuren 7 und 8 gezeigt.
    • Beispiel 6 Stabilität der A. faecalis Penicillinacylase
  • Die Penicillinacylasen aus A. faecalis und E. coli werden mittels des folgenden Protokolls auf Thermostabilität getestet: Die Enzymlösungen werden bei verschiedenen Temperaturen für 5 Minuten in einer Lösung aus 100 mM Natriumphosphat pH 7,5 inkubiert. Die Restaktivität wird bei 35ºC mit 50 mM Penicillin G als Substrat gemessen. Die Temperaturen mit 100 %, 50 % und 0 % Restaktivität nach 5 Minuten werden bestimmt. Aus Tabelle 3 kann geschlossen werden, daß das A. faecalis Enzym signifikant stabiler ist, als das E. coli Enzym. Tabelle 3 A. faecalis E. coli 5K
  • Die Enzympräparation E. coli 5K wurde von der Produktionsgesellschaft für Biotechnologie in Braunschweig erhalten (Mayer et al., siehe obige Literturstelle) Sequenzliste Nr. 1 SEQUENZNUMMER: 1 SEQUENZTYP: Nukleotid mit entsprechendem Protein SEQUENZLÄNGE: 2451 Basenpaare STRANGART: Einzelsträngig TOPOLOGIE: Linear MOLEKÜLTYP: Genomisch ORGANISMUS: Alcaligenes faecalis MERKMALE: Von 1 bis 2451 bp Peptid EIGENSCHAFTEN: Gen, das Penicillinacylase kodiert Sequenzliste Nr. 1 (Fortsetzung) sequenzliste Nr.- 1 (Fortsetzung) Sequenzliste Nr. 1 (Fortsetzung) End Sequenzliste Nr. 2 SEQUENZNUMMER: 2 SEQUENZTYP: synthetisches Nukleotidfragment SEQUENZLÄNGE: 124 Basenpaare STRANGART: Einzelsträngig TOPOLOGIE: Linear MOLEKÜLTYP: Synthetisch MERKMALE: bp 35-40 = "-35" Region bp 57-62 = "-10" Region bp 110-114 = Shine Dalgarnc lac-Gen EIGENSCHAFTEN: Promotoraktivität (tac-Promotor) Sequenzliste Nr. 3 SEQUENZNUMMER: 3 SEQUENZTYP: synthetisches Nukleotidfragment SEQUENZLÄNGE: 151 Basenpaare STRANGART: Einzelsträngig TOPOLOGIE: Linear MOLEKÜLTYP: Genomisch MERKMALE: bp 84-89 = "-35" bp 107-112 = "-10" bp 134-139 = Shine Dalgarno EIGENSCHAFTEN: Promotoraktivität (trp-Promotor) Sequenzliste Nr. 4 SEQUENZNUMMER: 4 SEQUENZTYP: synthetisches Nukleotidfragment SEQUENZLÄNGE: 114 Basenpaare STRANGART: Einzelsträngig TOPOLOGIE: Linear MOLEKÜLTYP: Genomisch MERKMALE: bp 23-28 = "-35" bp 46-51 = "-10" bp 100-103 = Shine Dalgarno p78 EIGENSCHAFTEN: promotoraktivität (pf3 Promotor) Sequenzliste Nr. 5 SEQUENZNUMMER: 5 SEQUENZTYP: synthetisches Nukleotidfragment SEQUENZLÄNGE: 105 Basenpaare STRANGART: Einzelsträngig TOPOLOGIE: Linear MOLEKÜLTYP: Genomisch MERKMALE: bp 23-28 = "-35" bp 46-51 = "-10" bp 92-95 = Shine Dalgarno lac-Gen EIGENSCHAFTEN: Promotoraktivität (pf3 Promotor)

Claims (18)

1. Gen, das Penicillin-G-Acylase kodiert und im wesentlichen die in der Sequenzliste 1 gezeigte Nukleotidsequenz aufweist.
2. Gen nach Anspruch 1, das aus Alcaligenes faecalis isoliert wurde.
3. Transkriptionsregulationssequenzen des Penicillin-G-Acylasegens nach Anspruch 1 oder 2.
4. Translationsregulationssequenzen des Penicillin-G-Acylasegens nach Anspruch 1 oder 2.
5. Gen nach Anspruch 1 oder 2 unter der Kontrolle eines Regulons, das Transkriptions- und/oder Translationsregulationssequenzen umfaßt, worin eine oder beide der Regulationssequenzen jeweils durch andere Transkriptions- und/oder Translationsregulations Sequenzen ersetzt wurden die vom gleichen oder von einem anderen Organismus erhalten wurden.
6. Vektor, der eine oder mehrere Penicillin-G-Acylasegene nach Anspruch 1, 2 oder 5 enthält.
7. Vektor nach Anspruch 6, worin die Transkriptionssequenzen des Penicillin-G-Acylasegens durch den trp-Promotor ersetzt sind.
8. Transformierter Wirt, der einen Vektor nach Anspruch 6 oder 7 enthält.
9. Transformierter Wirt nach Anspruch 8, der ein gramnegativer Mikroorganismus ist.
10. Transformierter Wirt nach Anspruch 9, worin der Mikroorganismus zur Gattung Alcaligenes oder Escherichia gehört.
11. Transformierter Wird nach Anspruch 10, worin der Mikroorganismus Alcaligenes faecalis ist.
12. Verfahren zur Herstellung von Penicillin-G-Acylase, das die Kultivierung eines transformierten Wirts nach einem der Ansprüche 8 bis 11 und die Gewinnung der Penicillin-G-Acylase in isolierter Form umfaßt.
13. Penicillin-G-Acylase in isolierter Form, die im- wesentlichen aus einer Aminosäuresequenz besteht, die durch das Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert ist.
14. Penicillin-G-Acylase nach Anspruch 13 in immobilisierter Form.
15. Verfahren zur Herstellung oder zur Verbesserung der Herstellung von Penicillin-G-Acylase in einem Wirt, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch (i) Herstellung eines DNA Vektors nach Anspruch 6 oder 7, (ii) Transformation des Wirts mit diesem Vektor und (iii) Klonierung der entstehenden Transformanden und Selektion derselben.
16. Verfahren nach Anspruch 15, gekennzeichnet duch die Transformation eines gramnegativen Mikroorganismus.
17. Verfahren nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch die Transformation eines Mikroorganismus der Gattung Alcaligenes oder Escherichia.
18. Verfahren nach Anspruch 17, gekennzeichnet durch die Transformation von Alcaligenes faecalis.
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