Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines ein Protein mit der enzymatischen Aktivität der Creatin-Amidinohydrolase
codierenden DNA-Moleküls,
mit dem Creatin-Amidinohydrolase gentechnisch hergestellt werden
kann, eines das DNA-Molekül
enthaltenden Vektors und eines Verfahrens zur Herstellung von Creatin-Amidinohydrolase
unter Verwendung des Vektors.
Zur
Lösung
der Aufgabe isolierten die Erfinder erfolgreich ein Creatin-Amidinohydrolase-Gen
aus Alcaligenes und ermittelten dessen Struktur. Außerdem erhielten
die Erfinder durch Einfügen
des Creatin-Amidinohydrolase-Gens in eine Vektor-DNA eine rekombinante
DNA, mit der sie einen zur Gattung Escherichia gehörenden Stamm
transformierten, wobei sie zu dem Ergebnis kamen, daß die resultierende
Transformante die Creatin-Amidinohydrolase effizient herstellen
kann, ohne daß dem
Medium Creatin zugesetzt werden muß.
Die
Aufgabe wird somit durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen bezeichneten
Ausführungsformen
gelöst.
Die
vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die Creatin-Amidinohydrolase
mit der unter Seq ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz codieren.
Ferner
betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Moleküle, die eine DNA-Sequenz mit
der unter Seq ID NO. 1 angegebenen Nucleotidsequenz umfassen.
Gegenstand
der Erfindung sind ebenfalls DNA-Moleküle, die mit den oben genannten
erfindungsgemäßen DNA-Molekülen hybridisieren.
Solche DNA-Moleküle
umfassen beispielsweise Fragmente, Modifikationen, Derivate und
allele Varianten der vorstehend beschriebenen DNA-Moleküle. Der
Begriff "Hybridisierung" bedeutet in diesem
Zusammenhang eine Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen
wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY) beschrieben sind. Diese DNA-Moleküle, die
mit den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen hybridisieren;
können
prinzipiell aus jedem beliebigen Organismus (d.h. Prokaryonten oder
Eukaryonten, insbesondere aus Bakterien, Pilzen, Algen, Pflanzen
oder tierischen Organismen) stammen, der derartige DNA-Moleküle besitzt.
Sie stammen vorzugsweise aus dem Mikroorganismus Alcaligenes, insbesondere
Alcaligenes sp. KS-85.
DNA-Moleküle, die
mit den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen hybridisieren,
können
z.B. aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken verschiedener Organismen
isoliert werden.
Die
Identifizierung und Isolierung derartiger DNA-Moleküle kann
dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle oder
Teile dieser DNA-Moleküle
bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z.B. mittels Hybridisierung
nach Standardverfahren (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY).
Als
Hybridisierungsprobe können
z.B. DNA-Moleküle
verwendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die unter Seq
ID NO. 2 angegebene DNA-Sequenz oder Teile dieser Sequenz aufweisen.
Bei den als Hybridisierungsprobe verwendeten DNA-Fragmenten kann es sich auch um synthetische
DNA-Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen DNA-Synthesetechniken
hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der der
erfindungsgemäßen DNA-Moleküle übereinstimmt.
Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
hybridisieren, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse
der Eigenschaften der von dieser Sequenz codierten Proteine erforderlich.
Weiterhin
betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Moleküle, deren Sequenzen aufgrund
des genetischen Codes degeneriert sind im Vergleich zu den Sequenzen
der obengenannten DNA-Moleküle
und die Creatin-Amidinohydrolase codieren.
Ferner
betrifft die Erfindung Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide,
Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren,
die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen DNA-Moleküle enthalten.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die in den Vektoren enthaltenen DNA-Moleküle verknüpft mit DNA-Elementen, die
die Transkription in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen
gewährleisten.
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontische Zellen,
die ein oben beschriebenes erfindungsgemäßes DNA-Molekül oder einen
Vektor enthalten. Dabei handelt es sich vorzugsweise um Zellen der
Gattung Escherichia.
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung
eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität der Creatin-Amidinohydrolase
durch die Züchtung
der vorstehend beschriebenen Wirtszellen, die bevorzugt zur Gattung
Escherichia gehören
und befähigt
sind, mit Hilfe der rekombinanten DNA Creatin-Amidinohydrolase herzustellen,
und die anschließende
Gewinnung eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität der Creatin-Amidinohydrolase
aus der Kultur.
Kurze Beschreibung der
Zeichungen
1 zeigt
das pH-Optimum der Creatin-Amidinohydrolase, die gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
Bedingungen der Messung:
Bei
jedem pH-Wert wurde im entsprechenden Puffer 10 Minuten bei 37°C inkubiert.
Die Menge des durch die Enzymreaktion erzeugten Harnstoffs wurde
gemessen.
Puffer für die Reaktionslösung
- 50
mmol/l Natriumacetat-Salzsäure-Puffer
- 50
mmol/l Phosphatpuffer
- 50
mmol/l Tris-HCl-Puffer
2 zeigt
das Temperatur-Optimum der Creatin-Amidinohydrolase, die gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
Bedingungen der Messung:
In
50 mM Phosphatpuffer, pH 7,7, wurde 10 Minuten bei den jeweiligen
Temperaturen inkubiert. Die Menge des durch die Enzymreaktion erzeugten
Harnstoffs wurde gemessen.
3 zeigt
den pH-Bereich, in welchem die Creatin-Amidinohydrolase, die gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, stabil ist.
Bedingungen der Behandlung:
Die
Behandlung beim jeweiligen pH-Wert erfolgte für 17 Stunden bei 25°C
- 50
mM Natriumacetat-Salzsäure-Puffer
- 50
mM Phosphatpuffer
- 50
mM Tris-HCl-Puffer
- 50
mM Glycin-NaOH-Puffer
- 50
mM CAPS-Puffer
4 zeigt
die thermische Stabilität
der Creatin-Amidinohydrolase, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung erhalten wurde.
Bedingungen der Behandlung:
In
50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, wurde 30 Minuten bei den jeweiligen
Temperaturen inkubiert.
Bedingungen der Messung:
In
50 mM Phosphatpuffer, pH 7,7, wurde 10 Minuten bei 37°C inkubiert.
Die Menge des durch die Enzymreaktion erzeugten Harnstoffs wurde
gemessen.
Das
erfindungsgemäße Creatin-Amidinohydrolase-Gen
kann z.B. folgendermaßen
erhalten werden. Alcaligenes sp. KS-85 wird gezüchtet, wie z.B. in "Current Protocols
in Molecular Biology" (Wiley
Interscience, 1989) beschrieben. Die auf diese Weise gezüchteten
Bakterien werden einer Extraktion unterworfen, wodurch genomische
DNA erhalten wird.
Alcaligenes
sp. KS-85 ist ein Stamm, der aus Bodenproben in der Kyoto-Präfektur,
Japan, durch Absuchverfahren erhalten wurde, seine mikrobiologischen
Eigenschaften werden nachstehend beschrieben. Die meisten mikrobiologischen
Eigenschaften wurden gemäß den Verfahren
identifiziert, die von Takeharu Hasegawa in "Biseibutsu no Bunrui to Doutei" (Klassifizierung
und Identifizierung von Bakterien), Tokyo University Press (1975),
beschrieben werden. Als Referenz für die Klassifizierung und Identifizierung
verwendeten die Erfinder außerdem "Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology", B.
Aufl. (1974).
Mikrobiologische Eigenschaften
von Alcaligenes sp KS-85
(A) Morphologische Eigenschaften
Beobachtet
unter einem Mikroskop (nach 24- bis 48-stündiger Züchtung bei 30°C auf Fleischbrühe-Agarmedium,
pH 9,0)
- (1) Zellform und -größe: 0,5
bis 1,0 × 0,5
bis 4,0 μm,
stäbchenförmiges Bakterium
- (2) Beweglichkeit: beweglich durch umgebende Flagellen
- (3) Spore: fehlt
- (4) Gram-Färbbarkeit:
negativ
- (5) Säurefestigkeit:
negativ
(B) Wachstumszustand in
verschiedenen Medien (pH 8 0)
(1) Fleischbrühe-Agarplattenkultur:
Blaßgelbe und
weißliche
runde Kolonien von 2 bis 3 mm Durchmesser erscheinen nach fünf Tagen Züchtung bei
30°C. Die
Oberfläche
ist glatt und fettartig glänzend
mit einem transparenten Rand.
(2) Fleischbrühe-Agarschrägkultur:
Der
Mikroorganismus wächst
in neun Tagen stationärer
Kultur bei 30°C,
wobei er sich auf dem Medium ausbreitet. Der Mikroorganismus ist
beige und erzeugt kein Pigment.
(3) Fleischbrühe-Flüssigkultur:
Der
Mikroorganismus wächst
in neun Tagen stationärer
Kultur bei 30°C,
wobei an der Oberfläche
des Flüssigmediums
eine Membran entsteht und am Boden Niederschläge erzeugt werden.
(4) Fleischbrühe-Gelatine-Kultur:
Der
Mikroorganismus wächst
in 30 Tagen stationärer
Kultur bei 20°C
nur oben auf dem Medium, wobei die Gelatine nicht verflüssigt wird.
(5) Lackmus-Milch:
Lackmus-Milch
wird in neun Tagen stationärer
Kultur bei 30°C
nicht verfestigt oder verflüssigt,
während
im Medium Alkali produziert wird, wodurch der ursprüngliche
pH-Wert des Mediums ansteigt.
(C) Physiologische Eigenschaften:
Die
meisten der folgenden Tests wurden in Medien durchgeführt, deren
pH-Wert auf 6,5 eingestellt war.
- (1) Nitratreduktion:
nicht reduziert
- (2) Denitrifikation: fehlt (Nitrit wird unter aeroben Bedingungen
erzeugt.)
- (3) MR-Test: negativs
- (4) VP-Test: negativ
- (5) Indolbildung: nicht gebildet
- (6) Hydrogensulfidbildung: nicht gebildet
- (7) Stärkehydrolyse:
nicht hydrolysiert
- (8) Citronensäureverwertung:
nicht verwertet
- (9) Verwertung anorganischer Stickstoffquellen: nicht verwertet
(Nitrat und Ammoniumsalz)
- (10) Pigmentbildung: nicht gebildet
- (11) Urease: negativ
- (12) Oxidase: positiv
- (13) Katalase: positiv
- (14) Temperatur- und pH-Bereich für das Wachstum: 15 bis 45°C und pH
6,0 bis 9,0
- (15) Verhalten gegenüber
Sauerstoff: aerob
- (16) O-F-Test (Hugh-Leifson-Verfahren): weder Oxidation noch
Fermentation finden statt.
- (17) Bildung von Säure
und Gas aus Zucker: keine
(Die
getesteten Zucker sind: L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose,
D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Trehalose,
D-Sorbit, D-Mannit, Inosit, Glycerin und Stärke.)
Der
vorliegende Stamm wurde nach den vorstehend beschriebenen mikrobiologischen
Eigenschaften identifiziert, er wurde der Gattung Alcaligenes zugeordnet
und mit Alcaligenes sp. KS-85 bezeichnet. Dieser Stamm wurden als
FERM BP-4487 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology,
Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt.
Die
wie vorstehend beschrieben hergestellte genomische DNA wird sodann
mit einem Restriktionsenzym, wie z.B. EcoRI, partiell gespalten
und durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch DNA-Fragmente
als EcoRI-Spaltprodukte erhalten werden, die vorzugsweise eine Länge von
2 bis 5 kb aufweisen. Diese können
gegebenenfalls, z.B. mit alkalischer Phosphatase, weiter behandelt
werden, ferner können
sie nach Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, wie z.B. Phenolextraktion,
gereinigt werden und außerdem
nach bestimmten Verfahren, einschließlich Ethanolfällung, eingeengt
werden, wodurch gereinigte DNA-Fragmente erhalten werden, die das
gewünschte
Creatin-Amidinohydrolase-Gen enthalten.
Als
Vektor-DNA, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann
eine Bakteriophagenvektor-DNA, Plasmidvektor-DNA und dergleichen
erwähnt
werden, wobei vorzugsweise insbesondere Plasmid pUC118 (Takara Shuzo
Co., Ltd.) und dergleichen eingesetzt werden. Zur Ligierung des
vorstehend hergestellten EcoRI-Spaltproduktes ist die Spaltung des
Plasmidvektors mit EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) erforderlich, gegebenenfalls
kann das Spaltprodukt mit Ethanol gefällt werden.
Anschließend wird
das vorstehende genomische DNA-Fragment, das das aus Alcaligenes
stammende, gewünschte
Gen enthält,
in Gegenwart einer Ligase, wie z.B. T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim),
an den vorstehenden, mit EcoRI gespaltenen Plasmidvektor ligiert,
wodurch eine rekombinante Plasmid-DNA erhalten wird.
Diese
rekombinante DNA kann verwendet werden, um Wirte, wie z.B. E. coli
K12, vorzugsweise E. coli JM109 (erhältlich von Toyobo), XL-Blue
(erhältlich
von Funakoshi) und dgl., zu transformieren, wodurch Kolonien erhalten
werden können,
die rekombinante DNAs mit verschiedenen Genfragmenten umfassen.
Die
resultierenden Kolonien können
nach solchen Kolonien abgesucht werden, die eine rekombinante DNA
mit dem gewünschten
Creatin-Amidinohydrolase-Gen enthalten, hierfür wird eine Koloniehybridisierung eingesetzt,
die in den vorstehend erwähnten "Current Protocols
in Molecular Biology" (Wiley
Interscience, 1989) beschrieben wird, wobei ein Oligonucleotid,
das durch Endmarkierung des in Beispiel 1, Punkt (3), erhaltenen
Genfragmentes mit Digoxigenin (Boehringer Mannheim) hergestellt
wird, als Sonde eingesetzt werden kann.
Die
resultierende rekombinante DNA, die das gewünschte Creatin-Amidinohydrolase-Gen
enthält, kann
durch Techniken, wie z.B. CsCl-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation
und dergleichen, gereinigt werden.
Die
auf diese Weise gereinigte Plasmid-DNA wird für die Sequenzierung des Creatin-Amidinohydrolase-Gens
verwendet, wie in Beispiel 1, Punkt (4), beschrieben, und die durch
diese Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz bestimmt. Diese
Aminosäuresequenz
wird in SEQ ID NR. 2 gezeigt. Das Gen, das diese ermittelte Aminosäuresequenz
codiert, ist das Creatin-Amidinohydrolase-Gen
der vorliegenden Erfindung.
Da
die das Gen enthaltende rekombinante DNA, die wie vorstehend erhalten
wurde, keinen Promotor für
die Expression in E. coli umfaßte,
erzeugten Bakterien, die mit dieser rekombinanten DNA transformiert
waren, keine Creatin-Amidinohydrolase. Aus diesem Grund müssen Transformanten,
die die Creatin-Amidinohydrolase auch tatsächlich produzieren, gemäß der nachstehenden
Beschreibung hergestellt werden.
Eine
DNA, die ausschließlich
aus einem Bereich besteht, der Creatin-Amidinohydrolase codiert,
wird in der Polymerasekettenreaktion ("Polymerase Chain Reaction", nachstehend abgekürzt PCR)
erhalten, wobei das vorstehend gereinigte rekombinante Plasmid als
Matrize eingesetzt wird und zwei synthetische Oligonucleotid-Primer
verwendet werden, die aus 30 Nucleotiden bestehen, welche 10 Aminosäuren im
N- bzw. C-Terminus
des Creatin-Amidinohydrolase-Gens codieren (die C-terminale Seite ist
die komplementäre
Kette). Die auf diese Weise erhaltene DNA wird in eine Vektor-DNA
eingefügt,
die eine DNA-Sequenz enthält,
die einen Promotor, Operator, eine Ribosomenbindungsstelle und dgl.
umfaßt,
hergeleitet vom E. coli-Lactose-Operon und dgl. (vgl. "The Operon", S. 227, Cold Spring
Harbor Laboratory, 1980). Die verwendete Vektor-DNA umfaßt z.B. Plasmid-DNA, Bakteriophagen-DNA
und dergleichen. Die auf diese Weise konstruierte rekombinante DNA
wird zur Transformation oder Transduktion von Wirten, wie z.B. E.
coli K12, vorzugsweise JM109 (Toyobo), XL-Blue (Funakoshi) und dgl.,
eingesetzt, wodurch jeweils eine Transformante erhalten wird.
Die
Transformation kann auch nach dem Verfahren von D. M. Morrison (Methods
in Enzymology 68 (1979), 326-331), die Transduktion nach dem Verfahren
von B. Hohn (Methods in Enzymology 68 (1979), 299-309) durchgeführt werden.
Der
zur Gattung Escherichia gehörende
Stamm, auf den die Befähigung
zur Herstellung von Creatin-Amidinohydrolase übertragen wurde, wie vorstehend
beschrieben, kann eingesetzt werden, um die Creatin-Amidinohydrolase
folgendermaßen
zu produzieren.
Die
Bakterien können
nach herkömmlichen
Züchtungsverfahren
in festem Medium, vorzugsweise in flüssigem Medium, gezüchtet werden.
Zur
Züchtung
der Bakterien wird ein Medium verwendet, enthaltend eine oder mehrere
Stickstoffquellen, wie z.B. Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt,
Maisquellwasser und ein Soja- oder Weizenkleie-Exsudat, ein oder
mehrere anorganische Salze, wie z.B. Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat,
Magnesiumsulfat, Eisen(III)-chlorid, Eisen(III)-sulfat und Mangansulfat,
gegebenenfalls Zucker oder Kohlenhydrate und Vitamine.
Der
anfängliche
pH-Wert des Mediums wird vorzugsweise auf einen Wert im Bereich
von pH 7 bis 9 eingestellt, sodann werden die Bakterien 6 bis 24
Stunden bei 30 bis 42°C,
vorzugsweise bei etwa 37°C,
in Submerskultur unter Belüftung
mit Rühren,
in Schüttelkultur,
in stationärer
Kultur und dergleichen gezüchtet. Nach
Beendigung der Züchtung
können
herkömmliche
Verfahren zur Gewinnung eingesetzt werden, um die Creatin-Amidinohydrolase
aus der Kultur zu erhalten.
Die
Bakterien werden aus der Kultur durch Filtration, Zentrifugation
oder dergleichen abgetrennt. Die Bakterien können zwar auch nach dem Waschen
direkt anstelle des Enzyms verwendet werden, vorzusweise wird jedoch
die Creatin-Amidinohydrolase gewonnen, indem z.B. die Bakterien
in einer Ultraschallapparatur, French Press, Mühle oder dergleichen aufgeschlossen
werden, die Zellwand mit lytischen Enzymen, wie z.B. Lysozym, lysiert
wird oder das Enzym mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie z.B.
Triton X-100, extrahiert wird.
Die
auf diese Weise erhaltene rohe Enzymlösung kann sodann herkömmlichen
Verfahren unterworfen werden, vorzugsweise einer geeigneten Kombination
aus Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Fällung mit organischem Lösungsmittel,
Ionenaustausch-Chromatographie,
Gelfiltrations-Chromatographie, Adsorptions-Chromatographie, Elektrophorese
und dergleichen, wodurch die Creatin-Amidinohydrolase isoliert wird.
Die
physikalisch-chemischen, enzymatischen Eigenschaften der resultierenden
Creatin-Amidinohydrolase sehen folgendermaßen aus:
(1) Wirkung
1
Mol Creatin wird hydrolysiert, wobei 1 Mol Sarcosin und 1 Mol Harnstoff
erzeugt werden.
(2) Substratspezifität:
Spezifisch
für Creatin
(3) pH-Optimum:
Die
Aktivität
des vorliegenden Enzyms wurde bei verschiedenen pH-Werten in 50
mmol/l Natriumacetat-Salzsäure-Puffer (pH 4,0 bis
6,0), 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,0 bis 7,5) und 50 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 7,5 bis 9,0) bestimmt. Das Ergebnis zeigte, wie aus 1 ersichtlich
ist, daß das
pH-Optimum des vorliegenden Enzyms im Bereich von pH 7,0 bis 9,0
liegt.
(4) Temperatur-Optimum:
Die
Aktivität
des vorliegenden Enzyms wurde bei verschiedenen Temperaturen in
den gleichen Reaktionslösun
gen wie im nachstehenden Punkt (7) bestimmt. Das Ergebnis zeigte,
wie aus 2 ersichtlich ist, daß das Temperatur-Optimum
des vorliegenden Enzyms im Bereich von 35 bis 45°C liegt.
(5) pH-Bereich, in dem
das Enzym stabil ist:
Die
Aktivität
des vorliegenden Enzyms wurde nach einer 17-stündigen Behandlung bei 25°C mit verschiedenen
pH-Werten von 4,0
bis 11,0 in 50 mM Natriumacetat-Salzsäure-Puffer (pH 4,0 bis 6,0),
50 mM Phosphatpuffer (pH 6,0 bis 8,0), 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH
8,0 bis 9,0), 50 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH 9,0 bis 10,0) und 50
mM CAPS-Puffer (pH
10,0 bis 11,0) ermittelt. Das Ergebnis zeigte, wie aus 3 ersichtlich ist,
daß der
pH-Bereich, in welchem das vorliegende Enzym stabil ist, der Bereich
von pH 5,0 bis 10,5 ist.
(6) Hitzestabilität:
Das
Enzym wurde 30 Minuten bei den vorher ermittelten Temperaturen in
50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, behandelt. Das Ergebnis zeigte, wie
aus 4 ersichtlich ist, daß das Enzym bei Temperaturen
bis zu etwa 45°C
stabil ist.
(7) Verfahren zur Messung
der Enzymaktivität:
Die
Messung der Enzymaktivität
wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt. 1 U Enzymaktivität ist als
die Menge definiert, die die Erzeugung von 1 μMol Harnstoff pro Minute bewirkt.
Herstellung der Reagentien
Lösung 1 (Substratlösung)
6,63
g Creatin werden in 500 ml 50 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,7, gelöst.
Lösung 2 (Lösung, die eine Färbung erzeugt)
10
g ρ-Dimethylaminobenzaldehyd
werden in 500 ml Ethanol (Reagens mit garantierter Qualität) gelöst und anschließend mit
einem Gemisch aus 575 ml entionisiertem Wasser und 75 ml konzentrierter
Salzsäure
gemischt.
Meßverfahren
- 1) 0,9 ml von Lösung 1 werden als Substrat
5 Minuten bei 37°C
vorinkubiert.
- 2) 0,1 ml Enzymlösung
(eingestellt auf etwa 1 bis 2 U/ml) werden mit dem Substrat gemischt
und 10 Minuten bei 37°C
umgesetzt.
- 3) Sodann werden 2 ml von Lösung
2 mit der Reaktionslösung
gemischt.
- 4) Anschließend
wird das Gemisch 20 Minuten bei 25°C stehengelassen und die Absorption
bei 435 nm gemessen (OD Probe).
- 5) Als Blindprobe werden 0,9 ml von Lösung 1 10 Minuten bei 37°C inkubiert,
anschließend
2 ml von Lösung 2
und 0,1 ml Enzymlösung
mit der Lösung
1 gemischt und das Gemisch 20 Minuten bei 25°C stehengelassen, sodann wird
die Absorption bei 435 nm gemessen (OD Blindwert).
Berechnung der Aktivität
- U/ml = Δ OD × 18,06* × Verdünnungsstufe(18,06* ist
ein Koeffizient, der aus einer Harnstoff-Eichkurve errechnet wurde.)
(8) Inhibitoren:
Die
Wirkung der Metallsalze in Tabelle 1 wurde untersucht, indem das
jeweilige Salz zur Reaktionslösung
im vorstehenden Punkt (7) zugesetzt wurde. Das Ergebnis zeigte,
wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, daß das vorliegende Enzym durch
AgNO3, HgCl2 und
CuSO4 stark gehemmt wurde.
Tabelle
1 Ergebnis
der Hemmung
(9) Km-Wert:
Der
Km-Wert wurde aus Lineweaver-Burk-Diagrammen ermittelt, er betrug
1,3 × 10-2 mol/l (für Creatin).
(10) Molekulargewicht:
Die
Gelfiltration durch eine TSK Gel G3000SWXL-Säule ergab ein Molekulargewicht
von 80 000 ± 5 000.
Wirkung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann Creatin-Amidinohydrolase effizient hergestellt werden,
ohne daß dem
Medium Creatin zugesetzt werden muß.
Beispiel
Die
vorliegende Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels genauer
beschrieben, dieses Beispiel soll jedoch den Umfang der Patentansprüche in keiner
Weise einschränken.
(1) Herstellung von genomischer
DNA aus Alcaligenes sp. KS-85
Alcaligenes
sp. KS-85 (FERM BP-4487) wurde in 200 ml TY-Medium (1 % Bacto-Pepton,
0,5 % Pepton, 0,25 % NaCl) geimpft und 20 Stunden bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Die
Bakterien wurden geerntet, indem die Kultur 10 Minuten bei 6000
UpM zentrifugiert wurde, und anschließend in 25 ml Sorbitlösung (0,9 mol/l
Sorbit, 0,1 mol/l Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 0,1 mol/l EDTA) suspendiert.
Gemäß "Current Protocols
in Molecular Biology" (Wiley
Interscience, 1989) wurden 500 μg
genomische DNA aus der Suspension erhalten.
(2) Herstellung einer
DNA-Genbank
100 μg der vorstehenden
genomischen DNA wurden mit EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd:) partiell
gespalten und durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wobei
10 μg Fragmente
mit einer Größe von 2
bis 5 kb als EcoRI-Spaltprodukte erhalten wurden. 1 μg der Plasmidvektor-pUC118-DNA
(Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde mit EcoRI gespalten und durch 1 Einheit
T4-DNA-Ligase (Boehringer
Mannheim) mit 2 μg
des vorstehenden EcoRI-Spaltproduktes der genomischen DNA ligiert.
Das resultierende Plasmid wurde gemäß dem Verfahren von D. M. Morrison
(Methods in Enzymology 68 (1979), 326-331) in E. coli JM109 transformiert,
wodurch 600 Kolonien erhalten wurden, die sodann auf ein Nylon-Membranfilter
Hybond-N+ (Produkt von Amersham) geblottet
wurden, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt wurden.
(3) Isolierung des Creatin-Amidinohydrolase-Gens
mittels Koloniehybridisierung
Der
Plasmidvektor pLK501, der ein Creatin-Amidinohydrolase-Gen enthielt, hergeleitet
aus der Gattung Flavobacterium (Japanische offengelegte Patentveröffentlichung
Nr. 205786/1987), wurde mit den zwei Restriktionsenzymen SplI und
SmaI partiell gespalten und durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt.
Ein Teil des Creatin-Amidinohydrolase-Gens mit einer Länge von
1,2 kb wurde aus dem Gel eluiert und mit "GENECLEAN II" (Funakoshi) weiter gereinigt. Dieses
Genfragment wurde mit Digoxigenin endmarkiert, wobei ein "DIG Labeling Kit" (Boehringer Mannheim)
verwendet wurde, und als Sonde für
die Koloniehybridisierung eingesetzt. Durch die Koloniehybridisierung
gemäß "Current Protocols
in Molecular Biology" (Wiley
Interscience, 1989) wurden zwei positive Kolonien nachgewiesen.
(4) Analyse des Creatin-Amidinohydrolase-Gens
Eine
Plasmid-DNA, die das gewünschte
Creatin-Amidinohydrolase-Gen enthielt, wurde aus einer der vorstehenden
zwei positiven Kolonien durch Ultrazentrifugation abgetrennt und
anschließend
mit EcoRI gespalten. Es wurde gefunden, daß dieses EcoRI-Spaltprodukt
ein genomisches DNA-Fragment mit einer Länge von etwa 2,5 kb enthielt,
das aus Alcaligenes stammte. Sodann wurde die Nucleotidsequenz dieser
Plasmid-DNA mit
einem "Kilo Sequence
Deletion Kit" (Takara
Shuzo Co., Ltd.) und "370
DNA Sequencing System" (Applied
Biosystems) ermittelt. Die auf diese Weise ermittelte Nucleotidsequenz
ist in SEQ ID NR. 1 dargestellt, die hierdurch codierte Aminosäuresequenz
ist in SEQ ID NR. 2 wiedergegeben. Das Creatin-Amidinohydrolase-Gen
besitzt eine codierende Region, die aus 1215 Nucleotiden besteht,
welche 404 Aminosäuren
codieren.
(5) Herstellung des transformierten
E. coli JM109 (pUCE100)
Der
Expressionsvektor pUTE100 wurde folgendermaßen konstruiert, wie in der
Japanischen offengelegten Patentveröffentlichung Nr. 317055/1993
beschrieben. Die DNA des Plasmidvektors pBR322 wurde mit EcoRI und
NruI gespalten sodann unter Verwendung eines "DNA Blunting Kits" (Takara Shuzo Co., Ltd.) mit glatten
Enden versehen, durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und mit "GENECLEAN II" (Funakoshi) gereinigt,
wodurch ein etwa 3,4 kb großes
DNA-Fragment erhalten wurde, das einen Replikationsursprung enthielt.
Dieses DNA-Fragment wurde durch die T4-DNA-Ligase cyclisiert und
mit EcoRI gespalten, wodurch ein lineares Fragment als EcoRI-Spaltprodukt
erhalten wurde. Unabhängig
davon wurde eine DNA-Sequenz, welche die folgende Expressions-Regulations-Region,
umfassend einen Promotor, Operator, eine Ribosomenbindungsstelle
und dgl., hergeleitet vom E. coli-Lactose-Operon und dgl., und eine
HpaI-Restriktionsstelle (vgl. "The
Operon", S. 227,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1980) enthielt,
im DNA-Synthesizer
Modell 392 (Applied Biosystems) synthetisiert und sodann an das
vorstehende EcoRI-Spaltprodukt ligiert, wodurch der Expressionsvektor
pUTE100 erhalten wurde.
Anschließend wurde
durch PCR eine Region synthetisiert, die ausschließlich die
Creatin-Amidinohydrolase codiert, wobei das "Geneamp DNA Amplification Reagent Kit" mit AmpliTaq (Takara
Shuzo Co., Ltd.) verwendet wurde, hierfür wurden die Oligonucleotide
SEQ ID NR. 3 und 4, die die N- bzw. C-terminalen Aminosäuresequenzen
der Creatin-Amidinohydrolase codieren und die im DNA Synthesizer
Modell 392 (Applied Biosystems) synthetisiert wurden, als Primer
eingesetzt und das im vorstehenden Punkt (4) erhaltene EcoRI-Spaltprodukt
als Matrize verwendet. Das resultierende Fragment wurde in eine
HpaI-Stelle der vorstehend erhaltenen Expressionsplasmidvektor-pUTE100-DNA
eingefügt,
wodurch die rekombinante Plasmid-DNA pUCEl00 erhalten wurde.
Die
Transformation von E. coli JM109 (Toyobo) mit der rekombinanten
Plasmid-DNA pUCE100 nach dem Verfahren von D. M. Morrison (Methods
in Enzymology 68 (1979), 326-331) ergab eine Transformante (pUCE100)
von E. coli JM109. Diese Transformante wurde als FERM BP-4803 beim
National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of
Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt. Dieser transformierte
E. coli JM109 (pUCE100) wurde unter Schütteln 16 Stunden in TY-Medium
(1 % Bacto-Pepton, 0,5 % Bacto-Hefeextrakt, 0,5 % NaCl, pH 7,0),
das 1 mmol/l Isopropyl-β-D-galactosid
enthielt, gezüchtet.
Die Aktivität
der Creatin-Amidinohydrolase, die gemäß dem vorstehend beschriebenen
Meßverfahren
unter Verwendung einer Harnstoff-Eichkurve bestimmt wurde, betrug
1,1 U/ml.
