DE4330774A1 - Isoliertes L-Fucosedehydrogenase-Gen, rekombinante DNA, und Verfahren zur Herstellung von L-Fucosedehydrogenase - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes L-Fucose­ dehydrogenase-Gen, eine rekombinante DNA und ein Verfahren zur Herstellung von L-Fucosedehydrogenase (nachstehend als "L-FDH" bezeichnet).

L-FDH ist ein Enzym, das in Gegenwart von L-Fucose und NADP die Oxidation von L-Fucose zu L-Fuconolacton und die gleich­ zeitige Reduktion von NADP zu NADPH gemäß folgender Reaktion katalysiert:

L-Fucose + NADP → L-Fuconolacton + NADPH + H⁺

L-FDH ist äußerst nützlich als Enzym zur quantitativen Be­ stimmung von L-Fucose in einer L-Fucose enthaltenden Probe, beispielsweise Serum.

Üblicherweise wurde L-FDH z. B. nach einem Verfahren herge­ stellt, bei dem ein zur Gattung Pseudomonas gehörender und zur Herstellung von L-FDH, dessen Coenzym NADP ist, befähig­ ter bakterieller Stamm in einem Medium gezüchtet und an­ schließend die L-FDH aus der Kultur gewonnen wurde (japani­ sche veröffentlichte nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 84,177/90).

Dieses bekannte, im Stand der Technik beschriebene Verfahren ist bezüglich der L-FDH-Ausbeute etc. nicht befriedigend.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfah­ ren bereitzustellen, mit dem L-FDH in ausreichender Ausbeute erhalten werden kann.

Bei Forschungsarbeiten zur Lösung dieses Problems gelang den Erfindern die Isolierung und die Strukturbestimmung von L- FDH, sie erhielten eine rekombinante DNA, die dieses L-FDH codierende Gen, inseriert in eine Vektor-DNA, umfaßt. Sie stellten fest, daß L-FDH durch Züchten eines zur Herstellung von L-FDH befähigten Mikroorganismus in einem Medium effizi­ ent hergestellt werden kann, wobei die rekombinante DNA in einen zur Gattung Escherichia gehörenden bakteriellen Stamm inseriert ist.

Die Erfindung umfaßt somit die Bereitstellung eines isolier­ ten L-Fucosedehydrogenase-Gens, das die spezifische in SEQ ID No 1 (Fig. 2) gezeigte Basensequenz besitzt, die die spe­ zifische, in SEQ ID No. 2 (Fig. 3) gezeigte Aminosäurese­ quenz codiert.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Bereit­ stellung einer rekombinanten DNA, die dieses L-Fucosedehy­ drogenase-Gen, in eine Vektor-DNA inseriert, umfaßt.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Bereit­ stellung eines Verfahrens zur Herstellung von L-Fucosedehy­ drogenase, das die Züchtung eines diese rekombinante DNA tragenden und zur Herstellung von L-Fucosedehydrogenase be­ fähigten Mikroorganismus umfaßt, der zur Gattung Escherichia gehört, und im Anschluß daran die Gewinnung von L-Fucosede­ hydrogenase aus der Kultur.

Fig. 1 stellt die Restriktionskarte für die rekombinante DNA des Plasmids pFD203 dar.

Fig. 2 zeigt die DNA-Sequenz des L-Fucosedehydrogenasegens.

Fig. 3 zeigt die von der DNA-Sequenz gemäß Fig. 2 codierte Aminosäuresequenz.

Zu den Spender-Mikroorganismen für das erfindungsgemäße Gen gehören z. B. Pseudomonas sp. Nr. 1143 (FERM BP-2056) etc.

Der Bakterienstamm Pseudomonas sp. Nr. 1143 wird nach einem aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren gezüchtet, an­ schließend werden die Mikroorganismen durch Zentrifugation geerntet. Die genomische DNA wird nach einem Verfahren, wie es z. B. in Kapitel 2.4 von Current Protocols in Molecular Biology beschrieben ist, aus den Mikroorganismen erhalten.

Im Anschluß daran wird die genomische DNA partiell gespal­ ten, beispielsweise mit Sau3AI, wobei ein Gemisch genomi­ scher DNA-Fragmente erhalten wird. Mit diesem Gemisch wird z. B. eine übliche Agarosegelelektrophorese durchgeführt, wo­ bei ein Gemisch von DNA-Fragmenten, die vorzugsweise 10 bis 20 kb lang sind, erhalten wird. Im Anschluß daran wird die Probe mit alkalischer Phosphatase etc. behandelt, danach durch ein Reinigungsverfahren, beispielsweise Phenolextrak­ tion, gereinigt und beispielsweise durch Ethanolpräzi­ pitation konzentriert, wobei ein gereinigtes Gemisch von DNA-Fragmenten (von denen einige das L-FDH codierende Gen enthalten) erhalten wird.

Zu den Vektor-DNA-Molekülen, die in der vorliegenden Erfin­ dung verwendet werden können, gehören beispielsweise Bacte­ riophagenvektor-DNA oder Plasmidvektor-DNA, besonders bevor­ zugt ist λEMBL4-DNA (von STRATAGENE).

Die vorstehend erwähnte Bacteriophagenvektor-DNA wird mit Restriktionsenzymen, beispielsweise BamHI und SalI (von Takara Shuzo Co., Ltd.), gespalten, woran sich eine Etha­ nolpräzipitation etc. anschließt, so daß ein zur Aufnahme eines Sau3AI-Fragments befähigtes Bacteriophagenvector-DNA- Fragment erhalten wird.

Danach werden diese DNA-Fragmente mit dem aus der Gattung Pseudomonas sp. Nr. 1143 erhaltenen, L-FDH codierenden Gen mit der vorstehenden Bacteriophagenvektor-DNA, die ein Sau3AI-Fragment aufnehmen kann, gemischt und das Gemisch beispielsweise mit T4 DNA-Ligase (von Boehringer Mannheim GmbH) behandelt, wobei rekombinante Phagen-DNA-Moleküle er­ halten werden. Aus den erhaltenen rekombinanten Phagen-DNA- Molekülen können nach dem üblichen in vitro-Verpackungsver­ fahren Phagenpartikel gebildet werden, mit denen man wie­ derum E. coli P2 392 (von Toyobo Co., Ltd.) infiziert, wobei Plaques rekombinanter Phagen erhalten werden, die eine Viel­ falt von DNA-Fragmenten enthalten.

Das Absuchen der Plaques nach rekombinanten Phagen, die das L-FDH-Gen enthaltende DNA-Fragmente tragen, kann durch die in Kapitel 6.3 von Current Protocols in Molecular Biology beschriebene Plaque-Hybridisierung unter Verwendung eines beispielsweise mit [γ-³²P]ATP (von Amersham, Japan) markier­ ten Oligonucleotids als Sonde erfolgen.

Die Reinigung der Phagen-DNA-Moleküle aus den so erhaltenen rekombinanten Phagen (von denen einige das L-FDH-Gen enthal­ tende DNA-Fragmente tragen) kann beispielsweise durch ein in Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, Sei­ ten 371-372) beschriebenes Verfahren erfolgen.

Die so gereinigten rekombinanten Phagen-DNA-Moleküle enthal­ ten neben dem L-FDH codierenden Gen eine große Anzahl unnö­ tiger DNA-Moleküle, die nach dem nachstehenden Verfahren entfernt werden können: Die gereinigten rekombinanten DNA- Moleküle werden mit einem Restriktionsenzym, für das es keine Spaltstelle auf dem L-FDH-Gen gibt, beispielsweise EcoRI, gespalten, so daß ein Gemisch aus DNA-Fragmenten er­ halten wird. Mit den so gespaltenen DNA-Fragmenten wird da nach eine übliche Agarosegelelektrophorese durchgeführt und zur Identifizierung eines L-FDH-Gen enthaltenden DNA-Frag­ ments im Anschluß daran eine Southern-Hybridisierung mit dem vorstehend erwähnten radioaktiven Oligonucleotid als Sonde. Die erhaltenen DNA-Fragmente, die das L-FDH-Gen enthalten, werden danach mit einem GENECLEAN II-Kit (von Funakoshi K.K.) gereinigt, wobei ein mit EcoRI oder mit Aor51HI (von Takara Shuzo Co., Ltd.) und MluI (von Takara Shuzo Co., Ltd.) gespaltenes Fragment (das das L-FDH codierende Gen enthält) erhalten wird.

Jede beliebige Vektor-DNA kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden, beispielsweise Plasmidvektor-DNA-Moleküle oder Bacteriophagenvektor-DNA-Moleküle, besonders bevorzugt sind DNA-Moleküle wie Plasmid pUC118, pUC119 oder pBLUESCRIPT II (von STRATAGENE). Diese Vektor-DNA wird mit einem Restriktionsenzym, beispielsweise EcoRI oder SmaI (von Takara Shuzo Co., Ltd.), gespalten, wobei gespaltene Vektor- DNA entsteht.

Das vorstehende, das L-FDH codierende Gen enthaltende DNA- Fragment wird mit gespaltener Vektor-DNA gemischt und das Gemisch mit T4 DNA-Ligase (von Boehringer Mannheim GmbH) be­ handelt, wobei rekombinante DNA gebildet wird.

Mit der rekombinanten DNA wird beispielsweise E. coli K-12, vorzugsweise E. coli JM109 (von Takara Shuzo Co., Ltd.), oder XL1-Blue (von Funakoshi K.K.) transformiert, wobei eine aus dem jeweiligen bakteriellen Stamm entstehende Transfor­ mante erhalten wird. Die Transformation kann nach dem Ver­ fahren von Morrison (Methods in Enzymology, Bd. 68 (1979) 326-331) durchgeführt werden.

Nach dem nachstehend in Abschnitt 5 des Beispiels beschriebenen Verfahren wird die vorstehende, das L-FDH-Gen enthaltende DNA hinsichtlich der gesamten Nucleotidsequenz des L-FDH-Gens analysiert und danach die von dieser Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz bestimmt.

Dieser zur Gattung Escherichia gehörende und zur Herstellung von L-FDH befähigte transformierte bakterielle Stamm wird zur Herstellung von L-FDH, wie nachstehend beschrieben, ge­ züchtet.

Das Züchten der Transformante kann entweder in herkömmlicher Feststoff- oder Flüssigkultur erfolgen, vorzugsweise in Flüssigkultur.

Für die Züchtung wird ein Medium verwendet, das ein oder mehrere anorganische(s) Salz(e) umfaßt, beispielsweise Ka­ liumdihydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Magnesium­ sulfat, Eisen(III)-chlorid, Eisen(III)-sulfat und Mangansul­ fat, und, falls erforderlich, eine Zuckerquelle, Vitamine, etc., die zu einer oder mehreren Stickstoffquelle(n) gegeben werden, beispielsweise Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, und eine Bohnen- und/oder Buchweizen-Immer­ sionslösung.

Der anfängliche pH-Wert des Mediums wird vorzugsweise auf 7 bis 9 eingestellt. Die Züchtung wird vorzugsweise 6 bis 24 Stunden bei 30 bis 42°C, bevorzugt um 37°C, durch eine Spin­ ner-Suspensionskultur unter Belüftung, Schüttelkultur, sta­ tionäre Kultur, etc. durchgeführt. Nach Beendigung der Inku­ bation kann L-FDH aus der Kultur mit üblichen Mitteln zur Enzymgewinnung erhalten werden.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der so erhaltenen L-FDH stimmen vollständig mit denen der in der japanischen veröffentlichten nicht-geprüften Patentanmeldung Nr. 84,177/90 offenbarten L-FDH überein.

Das nachstehende Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel 1. Präparation genomischer DNA von Pseudomonas sp. Nr. 1143

Pseudomonas sp. Nr. 1143 (FERM BP-2056) wurde in 100 ml Me­ dium, pH 7,0 [0,1% Polypepton, 0,1% Hefeextrakt, 0,09% KH₂PO₄, 0,11% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄·7H₂O und 0,001% FeSO₄·7H₂O) geimpft und 40 Stunden bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Danach wurden die Mikroorganismen durch 10- minütiges Zentrifugieren der Kultur bei 8000 UpM geerntet und im Anschluß daran nach dem in Kapitel 2.4 von Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience, 1989) beschriebenen Verfahren behandelt, wobei etwa 100 µg ge­ nomische DNA erhalten wurden.

2. Herstellung einer genomischen DNA-Bank

100 µg der vorstehenden genomischen DNA wurden auf übliche Weise mit Sau3AI partiell gespalten und danach eine Agarose­ gelelektrophorese durchgeführt, wobei 10 µg DNA-Fragmente von Fraktionen von 10 bis 20 kb erhalten wurden. Unter Ver­ wendung einer Einheit T4 DNA-Ligase (von Boehringer Mannheim GmbH) wurden 2 µg dieser Sau3AI-gespaltenen genomischen DNA von Pseudomonas sp. Nr. 1143 mit 1 µg BamHI-gespaltener DNA des Bacteriophagenvektors λEMBL4 ligiert, im Anschluß daran wurde mit einem in vitro-Verpackungskit (Gigapack Gold, von STRATAGENE) verpackt. Man ließ die so hergestellten Phagen­ partikel E. coli P2 392 (von STRATAGENE) infizieren, wobei ungefähr 50 000 Plaques erhalten wurden. Das Blotten der er­ haltenen Plaques auf ein Nylonmembranfilter Hybond-H⁺ (von Amersham) wurde nach den Anleitungen des Herstellers durch­ geführt.

3. Isolierung des L-FDH-Gens durch Plaque-Hybridisierung

L-FDH aus dem gezüchteten Mikroorganismus Pseudomonas sp. Nr. 1143 wurde über DEAE-Sephadex und Sephadex G-100 gerei­ nigt und danach durch Behandlung mit Bromcyan gemäß dem Ver­ fahren von Gross und Witkop (Journal of Biological Chemistry, Bd. 237 (1962), S. 1856) in Peptidfragmente ge­ spalten. Die Peptidfragmente wurden durch Umkehrphasen-HPLC fraktioniert und ihre Aminosäuresequenzen durch ein Protein­ sequenziergerät (Modell 470A, von Applied Biosystems Inc.) untersucht. Das Polynucleotid ATICCIGCICTIGGITATGGIGCIGCIAATGTIGGIAATCTITT (Sonde F44), das der Aminosäuresequenz Ile-Pro-Ala-Leu-Gly-Tyr-Gly-Ala- Ala-Asn-Val-Gly-Asn-Leu-Phe entspricht, und die Kette GGTTGTTCIAGIAGIGTATAICGICCIGCIACCAT (Sonde F35), die komple­ mentär zu dem der Aminosäuresequenz Met-Val-Ala-Gly-Arg-Tyr- Thr-Leu-Leu-Glu-Gln-Pro entsprechenden Polynucleotid ist, wurde unter Verwendung eines DNA-Synthesizers (Modell 392, von Applied Biosystems Inc.) synthetisiert (A steht für Ade­ nin, C für Cytosin, G für Guanin, T für Thymin und I für Inosinsäure). Jeweils 1 µg der synthetischen DNA-Moleküle wurde an den Enden mit [γ-³²P]ATP (von Amersham) unter Ver­ wendung von T4-Polynucleotidkinase (von Takara Shuzo Co., Ltd.) markiert und diese wurden als Sonden für die Plaquehy­ bridisierung verwendet. Plaquehybridisierung wurde nach dem in Kapitel 6.3 von Current Protocols in Molecular Biology beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei drei positive Clone erhalten wurden.

4. Analyse des L-FDH-Gens

Aus jedem der 3 isolierten positiven Clone wurden Phagen- DNA-Moleküle gemäß dem üblichen Verfahren (Molecular Cloning, Herausgeber Maniatis et al., S. 85, Cold Spring Harbor Laboratory, USA, 1982) erhalten und danach eine Southern-Hybridisierung (J. Mol. Biol., Bd. 98 (1975), S. 503) mit den vorstehenden synthetischen Oligonucleotiden als Sonden durchgeführt. Es zeigte sich, daß ein DNA-Fragment von ungefähr 0,55 kb, das durch PstI-Spaltung aus jedem der 3 Clone erhalten wurde, mit den Sonden hybridisiert hatte. Daher wurde ein dieses PstI-Fragment enthaltendes EcoRI- Fragment aus einem der 3 Clone präpariert und danach eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt, woran sich eine Rei­ nigung mit einem GENECLEAN II-Kit (von Funakoshi K.K.) an­ schloß. Das erhaltene Fragment wurde in das mit EcoRI ge­ spaltene Plasmid pUC119 inseriert. Aus dem Insertionsfrag­ ment wurde nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren ein 1,5 kb DNA-Fragment präpariert, das das L-FDH-Gen zwischen den Spaltstellen für Aor51HI (von Takara Shuzo Co., Ltd.) und MluI (von Takara Shuzo Co., Ltd.) enthielt. Dieses wurde unter Verwendung eines "DNA blunting kit" (von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit glatten Enden versehen und danach in mit SmaI (von Takara Shuzo Co., Ltd.) gespaltenen pBLUESCRIPT II SK (von STRATAGENE) inseriert, wobei die rekombinante Plasmid- DNA pFD203 hergestellt wurde.

Die Restriktionskarte von pFD203 ist in Fig. 1 dargestellt.

5. Bestimmung der Nucleotidsequenz

Die Nucleotidsequenz von pFD203 wurde mit einem "deletion kit for Kilo-Sequence" (von Takara Shuzo Co., Ltd.) unter Verwendung des "370 DNA Sequencing System" (von Applied Bio­ systems Inc.) bestimmt. Die ermittelte Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 1) ist in Fig. 2 dargestellt und die Aminosäurese­ quenz des von dem Gen mit der Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 codierten Polypeptids ist in Fig. 3 (SEQ ID Nr. 2) darge­ stellt. Das L-FDH-Gen besitzt einen codierenden Bereich von 987 Basen, die 329 Aminosäuren codieren.

6. Expression des L-FDH-Gens in E. coli

Nach dem Verfahren von Morrison (Methods in Enzymology, Bd. 68 (1979), S. 326) wurde diese vorstehend in 4. hergestellte rekombinante Plasmid-DNA pFD203 in E. coli XL1-Blue trans­ formiert, wobei die E. coli-Transformante XL1-Blue (pFD203) erhalten wurde. E. coli XL1-Blue (pFD203) wurde bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-3996 hinterlegt.

Die Transformante E. coli XL1-Blue (pFD203) wurde 16 Stunden bei einer Temperatur von 37°C in 10 ml 1 mM IPTG (Isopropyl- β-D-galactosid) enthaltendem TY-Medium, pH 7,2 (1% Bacto- Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt, 0,5% NaCl) gezüchtet. Die gemäß der japanischen veröffentlichten nicht-geprüften Pa­ tentanmeldung Nr. 84,177/90 bestimmte L-FDH-Aktivität in der Kultur betrug 0,1 E/ml.

Claims (6)

1. L-Fucosedehydrogenase-Gen, das ein Protein mit der in Fig. 3 gezeigten Aminosäuresequenz codiert.

2. L-Fucosedehydrogenase-Gen mit der in Fig. 2 gezeigten DNA-Sequenz.

3. Vektor, umfassend das L-Fucosedehydrogenase-Gen nach An­ spruch 1 oder 2.

4. Mikroorganismus, der mit der rekombinanten DNA nach An­ spruch 3 transformiert ist.

5. Mikroorganismus nach Anspruch 4, der E. coli XL1-Blue (pFD203) FERM BP-3996 ist.

6. Verfahren zur Herstellung von L-Fucosedehydrogenase, um­ fassend das Züchten eines zur Gattung Escherichia gehö­ renden Mikroorganismus in einem Medium, der die rekom­ binante DNA nach Anspruch 3 trägt und zur Herstellung von L-Fucosedehydrogenase befähigt ist, und danach die Gewinnung von L-Fucosedehydrogenase aus der Kultur.