JPH0690765A - Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びｌ−フコースデヒドロゲナーゼの製造法 - Google Patents
Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びｌ−フコースデヒドロゲナーゼの製造法Info
- Publication number
- JPH0690765A JPH0690765A JP24337292A JP24337292A JPH0690765A JP H0690765 A JPH0690765 A JP H0690765A JP 24337292 A JP24337292 A JP 24337292A JP 24337292 A JP24337292 A JP 24337292A JP H0690765 A JPH0690765 A JP H0690765A
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- JP
- Japan
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- dna
- fdh
- ala
- leu
- fucose
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 特定のアミノ酸配列をコードするＬ−フコー
スデヒドロゲナーゼ遺伝子、特定の塩基配列を有するＬ
−フコースデヒドロゲナーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベ
クターＤＮＡからなる組み換え体ＤＮＡ、及び該組み換
え体ＤＮＡを含むエッシェリシア属に属する微生物を培
養することによりＬ−フコースデヒドロゲナーゼを製造
する方法。 【効果】 本発明により、Ｌ−フコースデヒドロゲナー
ゼ遺伝子及びそれを含む組み換え体ＤＮＡを提供し、こ
の組み換え体ＤＮＡを含む微生物を培養することによ
り、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼを効率よく生産させ
ることができた。
スデヒドロゲナーゼ遺伝子、特定の塩基配列を有するＬ
−フコースデヒドロゲナーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベ
クターＤＮＡからなる組み換え体ＤＮＡ、及び該組み換
え体ＤＮＡを含むエッシェリシア属に属する微生物を培
養することによりＬ−フコースデヒドロゲナーゼを製造
する方法。 【効果】 本発明により、Ｌ−フコースデヒドロゲナー
ゼ遺伝子及びそれを含む組み換え体ＤＮＡを提供し、こ
の組み換え体ＤＮＡを含む微生物を培養することによ
り、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼを効率よく生産させ
ることができた。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−フコースデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及びＬ−フコ
ースデヒドロゲナーゼ (以下、Ｌ−ＦＤＨと略称す
る。) の製造法に関する。Ｌ−ＦＤＨは、次式で示され
る如く、Ｌ−フコース及びＮＡＤＰの共存下にＬ−フコ
ースをＬ−フコノラクトンに酸化すると共にＮＡＤＰを
ＮＡＤＰＨに還元する反応を触媒する酵素である。
ゲナーゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及びＬ−フコ
ースデヒドロゲナーゼ (以下、Ｌ−ＦＤＨと略称す
る。) の製造法に関する。Ｌ−ＦＤＨは、次式で示され
る如く、Ｌ−フコース及びＮＡＤＰの共存下にＬ−フコ
ースをＬ−フコノラクトンに酸化すると共にＮＡＤＰを
ＮＡＤＰＨに還元する反応を触媒する酵素である。
【０００２】Ｌ−フコース＋ＮＡＤＰ→Ｌ−フコノラク
トン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+ そして、Ｌ−ＦＤＨは、血清等のＬ−フコース含有試料
中のＬ−フコース定量用酵素として極めて有用なもので
ある。
トン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+ そして、Ｌ−ＦＤＨは、血清等のＬ−フコース含有試料
中のＬ−フコース定量用酵素として極めて有用なもので
ある。
【０００３】
【従来の技術】従来、Ｌ−ＦＤＨは、例えば、シュード
モナス (Pseudomonas)属に属しＮＡＤＰを補酵素とする
Ｌ−ＦＤＨ生産能を有する菌株を培地に培養し、培養物
よりＬ−ＦＤＨを採取することにより製造されている。
(特開平２-84177号公報)しかしながら、上記の製造法に
よるときには、Ｌ−ＦＤＨの収量等の点で必ずしも満足
すべきものではなかった。
モナス (Pseudomonas)属に属しＮＡＤＰを補酵素とする
Ｌ−ＦＤＨ生産能を有する菌株を培地に培養し、培養物
よりＬ−ＦＤＨを採取することにより製造されている。
(特開平２-84177号公報)しかしながら、上記の製造法に
よるときには、Ｌ−ＦＤＨの収量等の点で必ずしも満足
すべきものではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者等
は、上記問題点を解決すべく種々検討した結果、Ｌ−Ｆ
ＤＨ遺伝子の構造を決定することに成功すると共に、Ｌ
−ＦＤＨをコードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクタ
ーＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得、この組み換
え体ＤＮＡをエッシェリシア (Escherichia)属に属する
菌株に導入したＬ−ＦＤＨ生産能を有する微生物を培地
に培養することによりＬ−ＦＤＨが効率よく生産される
こと等の知見を得、本発明を完成した。
は、上記問題点を解決すべく種々検討した結果、Ｌ−Ｆ
ＤＨ遺伝子の構造を決定することに成功すると共に、Ｌ
−ＦＤＨをコードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクタ
ーＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得、この組み換
え体ＤＮＡをエッシェリシア (Escherichia)属に属する
菌株に導入したＬ−ＦＤＨ生産能を有する微生物を培地
に培養することによりＬ−ＦＤＨが効率よく生産される
こと等の知見を得、本発明を完成した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号２記
載のアミノ酸配列をコードするＬ−フコースデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子にある。さらに、本発明は、前記Ｌ−フコ
ースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターＤＮＡから
なる組み換え体ＤＮＡにある。
載のアミノ酸配列をコードするＬ−フコースデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子にある。さらに、本発明は、前記Ｌ−フコ
ースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターＤＮＡから
なる組み換え体ＤＮＡにある。
【０００６】さらに、本発明は、前記組み換え体ＤＮＡ
を含み、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ生産能を有する
エッシェリシア属に属する微生物を、培地に培養し、培
養物よりＬ−フコースデヒドロゲナーゼを採取すること
を特徴とするＬ−フコースデヒドロゲナーゼの製造法に
ある。以下、本発明を詳細に説明する。
を含み、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ生産能を有する
エッシェリシア属に属する微生物を、培地に培養し、培
養物よりＬ−フコースデヒドロゲナーゼを採取すること
を特徴とするＬ−フコースデヒドロゲナーゼの製造法に
ある。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】先ず、本発明遺伝子のドナーとして用いら
れるものとしては、例えば、シュードモナス sp. No.11
43 (FERM BP-2056) 等が挙げられる。そして、シュード
モナス sp. No.1143の菌株を公知の方法で培養し、遠心
分離して菌体を得る。この菌体より、例えば Current P
rotocols in Molecular Biology unit 2.4 記載の方
法等により染色体ＤＮＡを得る。
れるものとしては、例えば、シュードモナス sp. No.11
43 (FERM BP-2056) 等が挙げられる。そして、シュード
モナス sp. No.1143の菌株を公知の方法で培養し、遠心
分離して菌体を得る。この菌体より、例えば Current P
rotocols in Molecular Biology unit 2.4 記載の方
法等により染色体ＤＮＡを得る。
【０００８】次いで、この染色体ＤＮＡを例えばSau3AI
により部分分解し、染色体ＤＮＡ断片混合物を得る。こ
のようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば、通常
のアガロースゲル電気泳動法により、好ましくは10−20
Kbの大きさのＤＮＡ断片混合物を得、これにアルカリ性
ホスファターゼ処理等を行なった後、更に、例えばフェ
ノール抽出等の精製手段により精製し、また、更に例え
ば、エタノール沈澱等の手段により濃縮し、純化された
ＤＮＡ断片混合物 (この中にＬ−ＦＤＨをコードする遺
伝子を含有するＤＮＡ断片が含まれる。) を得る。
により部分分解し、染色体ＤＮＡ断片混合物を得る。こ
のようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば、通常
のアガロースゲル電気泳動法により、好ましくは10−20
Kbの大きさのＤＮＡ断片混合物を得、これにアルカリ性
ホスファターゼ処理等を行なった後、更に、例えばフェ
ノール抽出等の精製手段により精製し、また、更に例え
ば、エタノール沈澱等の手段により濃縮し、純化された
ＤＮＡ断片混合物 (この中にＬ−ＦＤＨをコードする遺
伝子を含有するＤＮＡ断片が含まれる。) を得る。
【０００９】一方、本発明において用いることの出来る
ベクターＤＮＡとしては、例えば、バクテリオファージ
ベクターＤＮＡ、プラスミドベクターＤＮＡ等が挙げら
れるが、具体的にはλＥＭＢＬ4 ＤＮＡ(STRATAGENE社
製) 等が好ましい。上記バクテリオファージベクターＤ
ＮＡを、Sau3AI断片取り込み可能にするため、例えば制
限酵素 BamHI及びSalI (宝酒造社製) を作用させて消化
し、更にエタノール沈澱処理等を行なうことにより、Sa
u3AI断片取り込み可能なバクテリオファージベクターＤ
ＮＡ断片を得る。
ベクターＤＮＡとしては、例えば、バクテリオファージ
ベクターＤＮＡ、プラスミドベクターＤＮＡ等が挙げら
れるが、具体的にはλＥＭＢＬ4 ＤＮＡ(STRATAGENE社
製) 等が好ましい。上記バクテリオファージベクターＤ
ＮＡを、Sau3AI断片取り込み可能にするため、例えば制
限酵素 BamHI及びSalI (宝酒造社製) を作用させて消化
し、更にエタノール沈澱処理等を行なうことにより、Sa
u3AI断片取り込み可能なバクテリオファージベクターＤ
ＮＡ断片を得る。
【００１０】次いで、上記のシュードモナス sp. No.11
43由来でＬ−ＦＤＨをコードする遺伝子を含有するＤＮ
Ａ断片と、前記のSau3AI断片取り込み可能なバクテリオ
ファージベクターＤＮＡとを混合し、これに、例えばＴ
４ＤＮＡリガーゼ (ベーリンガーマンハイム社製) を作
用させて組み換えファージＤＮＡを得る。この組み換え
ファージＤＮＡは、通常のインビトロパッケージング法
により、ファージ粒子を形成させることができ、更に、
該ファージは、例えば大腸菌P2 392［東洋紡 (株) より
入手］に感染させ、種々のＤＮＡ断片を保有する組み換
えファージのプラークを得ることができる。
43由来でＬ−ＦＤＨをコードする遺伝子を含有するＤＮ
Ａ断片と、前記のSau3AI断片取り込み可能なバクテリオ
ファージベクターＤＮＡとを混合し、これに、例えばＴ
４ＤＮＡリガーゼ (ベーリンガーマンハイム社製) を作
用させて組み換えファージＤＮＡを得る。この組み換え
ファージＤＮＡは、通常のインビトロパッケージング法
により、ファージ粒子を形成させることができ、更に、
該ファージは、例えば大腸菌P2 392［東洋紡 (株) より
入手］に感染させ、種々のＤＮＡ断片を保有する組み換
えファージのプラークを得ることができる。
【００１１】このプラークの中からのＬ−ＦＤＨ遺伝子
を含むＤＮＡ断片を保有する組み換えファージの検索
は、例えば［γ-32P］ＡＴＰ(Amersham Japan より入
手) で標識したオリゴヌクレオチドをプローブとして、
Current Protocols in Molecular Biology unit 6.3
記載の方法によりプラークハイブリダイゼーションを行
い実施することができる。
を含むＤＮＡ断片を保有する組み換えファージの検索
は、例えば［γ-32P］ＡＴＰ(Amersham Japan より入
手) で標識したオリゴヌクレオチドをプローブとして、
Current Protocols in Molecular Biology unit 6.3
記載の方法によりプラークハイブリダイゼーションを行
い実施することができる。
【００１２】このようにして得られた組み換え体ファー
ジ (その中にＬ−ＦＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を含有
している。) から、例えば、Molecular Cloning P.371-
372(Cold Spring Harbor Laboratory, 1982年) 記載の
方法により純化されたファージＤＮＡを得ることができ
る。この純化された組み換え体ファージＤＮＡの中には
Ｌ−ＦＤＨをコードする遺伝子以外に不用なＤＮＡが大
量に存在するので、次の操作により該不用なＤＮＡを除
去する。すなわち、純化された組み換えＤＮＡに、Ｌ−
ＦＤＨ遺伝子上に切断部位を有していない制限酵素、例
えば、EcoRI を作用させて消化し、ＤＮＡ断片混合物を
得る。このＤＮＡ断片混合物中の何れのＤＮＡ断片にＬ
−ＦＤＨをコードする遺伝子が含有されているかは、上
述の放射性オリゴヌクレオチドプローブを用いたサザン
ハイブリダイゼーションにより判定する。次いで、上記
のように消化して得られたＤＮＡ断片混合物について、
通常のアガロースゲル電気泳動を行い、Ｌ−ＦＤＨをコ
ードする遺伝子を含有するものと判定されたＤＮＡ断片
のみを、GENECLEAN II kit［フナコシ (株) より入手］
を用いて精製し、純化された EcoRI消化断片または Aor
51HI (宝酒造社製) 及びMluI (宝酒造社製) 消化断片
(この中にＬ−ＦＤＨをコードする遺伝子が含有されて
いる。) を得る。
ジ (その中にＬ−ＦＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を含有
している。) から、例えば、Molecular Cloning P.371-
372(Cold Spring Harbor Laboratory, 1982年) 記載の
方法により純化されたファージＤＮＡを得ることができ
る。この純化された組み換え体ファージＤＮＡの中には
Ｌ−ＦＤＨをコードする遺伝子以外に不用なＤＮＡが大
量に存在するので、次の操作により該不用なＤＮＡを除
去する。すなわち、純化された組み換えＤＮＡに、Ｌ−
ＦＤＨ遺伝子上に切断部位を有していない制限酵素、例
えば、EcoRI を作用させて消化し、ＤＮＡ断片混合物を
得る。このＤＮＡ断片混合物中の何れのＤＮＡ断片にＬ
−ＦＤＨをコードする遺伝子が含有されているかは、上
述の放射性オリゴヌクレオチドプローブを用いたサザン
ハイブリダイゼーションにより判定する。次いで、上記
のように消化して得られたＤＮＡ断片混合物について、
通常のアガロースゲル電気泳動を行い、Ｌ−ＦＤＨをコ
ードする遺伝子を含有するものと判定されたＤＮＡ断片
のみを、GENECLEAN II kit［フナコシ (株) より入手］
を用いて精製し、純化された EcoRI消化断片または Aor
51HI (宝酒造社製) 及びMluI (宝酒造社製) 消化断片
(この中にＬ−ＦＤＨをコードする遺伝子が含有されて
いる。) を得る。
【００１３】一方、本発明において用いることのできる
ベクターＤＮＡとしては、いかなるものでもよく、プラ
スミドベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤ
ＮＡ等が挙げられるが、具体的には例えば、プラスミド
pUC118、pUC119、pBLUESCRIPT II (STRATAGENE製) Ｄ
ＮＡ等が好ましい。上記ベクターＤＮＡに制限酵素、例
えば EcoRI、SmaI等 (宝酒造社製) を作用させて消化
し、切断されたベクターＤＮＡを得る。
ベクターＤＮＡとしては、いかなるものでもよく、プラ
スミドベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤ
ＮＡ等が挙げられるが、具体的には例えば、プラスミド
pUC118、pUC119、pBLUESCRIPT II (STRATAGENE製) Ｄ
ＮＡ等が好ましい。上記ベクターＤＮＡに制限酵素、例
えば EcoRI、SmaI等 (宝酒造社製) を作用させて消化
し、切断されたベクターＤＮＡを得る。
【００１４】次いで、上記のＬ−ＦＤＨをコードする遺
伝子を含有するＤＮＡ断片と切断されたベクターＤＮＡ
とを混合し、これに例えばＴ4 ＤＮＡリガーゼ (ベーリ
ンガーマンハイム社製) を作用させて組み換えＤＮＡを
得る。この組み換えＤＮＡを用いて、例えば大腸菌K-1
2、好ましくは大腸菌JM109(宝酒造より入手) 、XL1-Blu
e (フナコシより入手) 等を形質転換して夫々の菌株を
得る。この形質転換は、D. M. Morrisonの方法 (Method
s in Enzymology, vol.68,326-331, 1979年) により行
なうことができる。
伝子を含有するＤＮＡ断片と切断されたベクターＤＮＡ
とを混合し、これに例えばＴ4 ＤＮＡリガーゼ (ベーリ
ンガーマンハイム社製) を作用させて組み換えＤＮＡを
得る。この組み換えＤＮＡを用いて、例えば大腸菌K-1
2、好ましくは大腸菌JM109(宝酒造より入手) 、XL1-Blu
e (フナコシより入手) 等を形質転換して夫々の菌株を
得る。この形質転換は、D. M. Morrisonの方法 (Method
s in Enzymology, vol.68,326-331, 1979年) により行
なうことができる。
【００１５】上記Ｌ−ＦＤＨ遺伝子を含有するＤＮＡを
もちいて、後述の実施例の項目 (５) に示す方法によっ
て、Ｌ−ＦＤＨ遺伝子の全塩基配列の解析を行い、次い
で前記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列を確定する。次に、上記のＬ−
ＦＤＨ生産能を有するエッシェリシア属に属する菌株を
培養してＬ−ＦＤＨを生産する。
もちいて、後述の実施例の項目 (５) に示す方法によっ
て、Ｌ−ＦＤＨ遺伝子の全塩基配列の解析を行い、次い
で前記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列を確定する。次に、上記のＬ−
ＦＤＨ生産能を有するエッシェリシア属に属する菌株を
培養してＬ−ＦＤＨを生産する。
【００１６】この培養は、通常の固体培養法或いは液体
培養法のいずれでもよいが、好ましくは液体培養法が用
いられる。また、培養に使用する培地としては、例えば
酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリ
カーあるいは大豆もしくは小麦麹の浸出液等の一種以上
の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄ある
いは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更
に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したもの
が用いられる。
培養法のいずれでもよいが、好ましくは液体培養法が用
いられる。また、培養に使用する培地としては、例えば
酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリ
カーあるいは大豆もしくは小麦麹の浸出液等の一種以上
の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄ある
いは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更
に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したもの
が用いられる。
【００１７】なお、培地の初発pHは７−９に調節するの
が適当である。また培地は30−42℃、好ましくは37℃前
後で６−24時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培
養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該培養
物よりＬ−ＦＤＨを採取するには、通常の酵素採取手段
を用いて得ることができる。上記の如くして得られるＬ
−ＦＤＨは、特開平２-84177号公報記載のＬ−ＦＤＨの
理化学的性質と全く同じ性質を示すものである。
が適当である。また培地は30−42℃、好ましくは37℃前
後で６−24時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培
養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該培養
物よりＬ−ＦＤＨを採取するには、通常の酵素採取手段
を用いて得ることができる。上記の如くして得られるＬ
−ＦＤＨは、特開平２-84177号公報記載のＬ−ＦＤＨの
理化学的性質と全く同じ性質を示すものである。
【００１８】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
する。但し、本発明はこれら実施例によりその技術的範
囲が限定されるものではない。 実施例 １. シュードモナス sp. No.1143染色体ＤＮＡの調製 シュードモナス sp. No.1143 (FERM BP-2056) を培地
［0.1% Polypepton, 0.1% yeast extract, 0.09% KH2PO
4, 0.11% K2HPO4, 0.05% MgSO47H2O 及び0.001%FeSO47H
2O, (pH7.0)］100mlに接種し、30℃40時間振盪培養し
た。この培養物を8000r.p.m.で10分間遠心分離して集菌
後、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY I
nterscience, 1989) unit 2.4 記載の方法に従い処理し
て、染色体ＤＮＡの約100μg を得た。 ２. 染色体ＤＮＡライブラリーの作製 上記染色体ＤＮＡ 100μg を常法に従いSau3AI部分分解
した後、アガロースゲル電気泳動により10〜20kb画分の
ＤＮＡ断片を10μg 得た。バクテリオファージベクター
ＥＭＢＬ4 ＤＮＡ 1μgのBamHI消化物と上記シュードモ
ナスsp.No.1143染色体ＤＮＡ Sau3AI 消化物２μg と
を、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ (ベーリンガーマンハイム社
製) １unitで連結し、in vitro packaging kit(Gigapac
k Gold, Stratagene社製) でパッケージングを行ない、
E.coli P2 392(Stratagene社より入手) に感染させ、約
50000個のプラークを得た。得られたプラークをナイロ
ンメンブレンフィルター Hybond-N+（アマシャム社製)
に、アマシャム社のプロトコールに従いブロッティング
した。 ３. プラークハイブリダイゼーションによるＬ−ＦＤＨ
遺伝子の単離 シュードモナス sp. No.1143の培養菌体からＤＥＡＥ−
セファデクス、セファデクスG-100 を使用して精製した
Ｌ−ＦＤＨを、 GrossとWitkopの方法(Journalof Biolo
gical Chemistry, 237巻, 1856頁, 1962年) に従い、臭
化シアン処理して、ペプチド断片化した。これを逆相Ｈ
ＰＬＣで分取し、プロテインシーケンサー (アプライド
バイオシステム社製、モデル470A) により、アミノ酸配
列を決定した。得られたアミノ酸配列Ile Pro Ala Leu
Gly Tyr Gly Ala Ala Asn ValGly Asn Leu Phe に対応
するポリヌクレオチドATICCIGCICTIGGITATGGIGCIGCIAAT
GTIGGIAATCTITT (プローブＦ44) 、及びアミノ酸配列Me
t Val Ala Gly Arg TyrThr Leu Leu Glu Gln Pro に対
応するポリヌクレオチドの逆鎖 GGTTGTTCIAGIAGIGTATAI
CGICCIGCIACCAT (プローブＦ35) (Ａはアデニン、Ｃは
シトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン、Ｉはイノシン酸
を夫々示す。) をＤＮＡシンセサイザー (アプライドバ
イオシステム社製、モデル 392) で合成した。この合成
ＤＮＡ 1μg を［γ-32P］ＡＴＰ (アマシャム社製) と
Ｔ4 ポリヌクレオチドキナーゼ (宝酒造社製) で末端標
識し、プラークハイブリダイゼーションのプローブとし
た。Current Protocols in Molecular Biology unit 6.
3 に記載の方法に従いプラークハイブリダイゼーション
を行い、ポジティブクローン３株を得た。 ４. Ｌ−ＦＤＨ遺伝子の解析 単離したポジティブクローン３株のファージＤＮＡを常
法(Molecular Cloning, ed. Maniatis et al., p.85, C
old Spring Harbor Laboratory, USA, 1982)に従って夫
々調製し、上記合成オリゴヌクレオチドをプローブとし
てサザンハイブリダイゼーション (J. Mol. Biol., 98,
503, 1975) を行なったところ、PstIで切り出される約
0.55kbのＤＮＡ断片が３株において共通にプローブとハ
イブリダイズすることがわかった。そこで、これら３株
のうち１株についてこのPstI断片を含む EcoRI断片をア
ガロースゲル電気泳動の後、GENECLEAN II (フナコシよ
り購入) により調製し、EcoRI で切断したプラスミド p
UC119 ＤＮＡに挿入した。次いで、この挿入断片中から
Ｌ−ＦＤＨ遺伝子を含む Aor51HI (宝酒造より購入) と
MluI (宝酒造より購入) にはさまれた1.５kbのＤＮＡ断
片を上記の方法で調製し、更にＤＮＡ Blunting kit (
宝酒造より購入) を用いて末端を平滑化後、SmaI (宝酒
造より購入) で切断したpBLUESCRIPT II SK (STRATAGEN
E 社より購入) に挿入して組み換え体プラスミドpFD203
ＤＮＡを作製した。
する。但し、本発明はこれら実施例によりその技術的範
囲が限定されるものではない。 実施例 １. シュードモナス sp. No.1143染色体ＤＮＡの調製 シュードモナス sp. No.1143 (FERM BP-2056) を培地
［0.1% Polypepton, 0.1% yeast extract, 0.09% KH2PO
4, 0.11% K2HPO4, 0.05% MgSO47H2O 及び0.001%FeSO47H
2O, (pH7.0)］100mlに接種し、30℃40時間振盪培養し
た。この培養物を8000r.p.m.で10分間遠心分離して集菌
後、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY I
nterscience, 1989) unit 2.4 記載の方法に従い処理し
て、染色体ＤＮＡの約100μg を得た。 ２. 染色体ＤＮＡライブラリーの作製 上記染色体ＤＮＡ 100μg を常法に従いSau3AI部分分解
した後、アガロースゲル電気泳動により10〜20kb画分の
ＤＮＡ断片を10μg 得た。バクテリオファージベクター
ＥＭＢＬ4 ＤＮＡ 1μgのBamHI消化物と上記シュードモ
ナスsp.No.1143染色体ＤＮＡ Sau3AI 消化物２μg と
を、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ (ベーリンガーマンハイム社
製) １unitで連結し、in vitro packaging kit(Gigapac
k Gold, Stratagene社製) でパッケージングを行ない、
E.coli P2 392(Stratagene社より入手) に感染させ、約
50000個のプラークを得た。得られたプラークをナイロ
ンメンブレンフィルター Hybond-N+（アマシャム社製)
に、アマシャム社のプロトコールに従いブロッティング
した。 ３. プラークハイブリダイゼーションによるＬ−ＦＤＨ
遺伝子の単離 シュードモナス sp. No.1143の培養菌体からＤＥＡＥ−
セファデクス、セファデクスG-100 を使用して精製した
Ｌ−ＦＤＨを、 GrossとWitkopの方法(Journalof Biolo
gical Chemistry, 237巻, 1856頁, 1962年) に従い、臭
化シアン処理して、ペプチド断片化した。これを逆相Ｈ
ＰＬＣで分取し、プロテインシーケンサー (アプライド
バイオシステム社製、モデル470A) により、アミノ酸配
列を決定した。得られたアミノ酸配列Ile Pro Ala Leu
Gly Tyr Gly Ala Ala Asn ValGly Asn Leu Phe に対応
するポリヌクレオチドATICCIGCICTIGGITATGGIGCIGCIAAT
GTIGGIAATCTITT (プローブＦ44) 、及びアミノ酸配列Me
t Val Ala Gly Arg TyrThr Leu Leu Glu Gln Pro に対
応するポリヌクレオチドの逆鎖 GGTTGTTCIAGIAGIGTATAI
CGICCIGCIACCAT (プローブＦ35) (Ａはアデニン、Ｃは
シトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン、Ｉはイノシン酸
を夫々示す。) をＤＮＡシンセサイザー (アプライドバ
イオシステム社製、モデル 392) で合成した。この合成
ＤＮＡ 1μg を［γ-32P］ＡＴＰ (アマシャム社製) と
Ｔ4 ポリヌクレオチドキナーゼ (宝酒造社製) で末端標
識し、プラークハイブリダイゼーションのプローブとし
た。Current Protocols in Molecular Biology unit 6.
3 に記載の方法に従いプラークハイブリダイゼーション
を行い、ポジティブクローン３株を得た。 ４. Ｌ−ＦＤＨ遺伝子の解析 単離したポジティブクローン３株のファージＤＮＡを常
法(Molecular Cloning, ed. Maniatis et al., p.85, C
old Spring Harbor Laboratory, USA, 1982)に従って夫
々調製し、上記合成オリゴヌクレオチドをプローブとし
てサザンハイブリダイゼーション (J. Mol. Biol., 98,
503, 1975) を行なったところ、PstIで切り出される約
0.55kbのＤＮＡ断片が３株において共通にプローブとハ
イブリダイズすることがわかった。そこで、これら３株
のうち１株についてこのPstI断片を含む EcoRI断片をア
ガロースゲル電気泳動の後、GENECLEAN II (フナコシよ
り購入) により調製し、EcoRI で切断したプラスミド p
UC119 ＤＮＡに挿入した。次いで、この挿入断片中から
Ｌ−ＦＤＨ遺伝子を含む Aor51HI (宝酒造より購入) と
MluI (宝酒造より購入) にはさまれた1.５kbのＤＮＡ断
片を上記の方法で調製し、更にＤＮＡ Blunting kit (
宝酒造より購入) を用いて末端を平滑化後、SmaI (宝酒
造より購入) で切断したpBLUESCRIPT II SK (STRATAGEN
E 社より購入) に挿入して組み換え体プラスミドpFD203
ＤＮＡを作製した。
【００１９】このpFD203の制限酵素による開裂地図を図
１に示した。 ５. 塩基配列の決定 pFD203をKilo-Sequence 用 deletion kit ( 宝酒造より
購入) 及び370 ＤＮＡSequencing System (アプライド
バイオシステム社より購入) を用いて塩基配列の決定を
行なった。決定した塩基配列を配列番号１に示し、また
前記配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子から翻訳
されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示し
た。Ｌ−ＦＤＨ遺伝子は 987塩基のコーディング領域を
もち、329個のアミノ酸をコードしていた。 ６. Ｌ−ＦＤＨ遺伝子の大腸菌の発現 上記４で作製した組み換え体プラスミド pFD203 ＤＮＡ
を用いてD. M. Morri-son の方法 (Methods in Enzymol
ogy, 68, 326, 1979) に従い、大腸菌XL1-Blueを形質転
換し形質転換体、大腸菌組み換え体XL1-Blue (pFD203)
を得た。なお大腸菌(E.coli)XL1-Blue (pFD203) は、工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第3996号
(FERM BP-3996) として寄託されている。
１に示した。 ５. 塩基配列の決定 pFD203をKilo-Sequence 用 deletion kit ( 宝酒造より
購入) 及び370 ＤＮＡSequencing System (アプライド
バイオシステム社より購入) を用いて塩基配列の決定を
行なった。決定した塩基配列を配列番号１に示し、また
前記配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子から翻訳
されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示し
た。Ｌ−ＦＤＨ遺伝子は 987塩基のコーディング領域を
もち、329個のアミノ酸をコードしていた。 ６. Ｌ−ＦＤＨ遺伝子の大腸菌の発現 上記４で作製した組み換え体プラスミド pFD203 ＤＮＡ
を用いてD. M. Morri-son の方法 (Methods in Enzymol
ogy, 68, 326, 1979) に従い、大腸菌XL1-Blueを形質転
換し形質転換体、大腸菌組み換え体XL1-Blue (pFD203)
を得た。なお大腸菌(E.coli)XL1-Blue (pFD203) は、工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第3996号
(FERM BP-3996) として寄託されている。
【００２０】このようにして得られた大腸菌XL1-Blue(p
FD203)を１mM ＩＰＴＧ(isopropyl-β-D-galactoside)
を含むＴＹ培地 (１% Bacto-trypton, 0.5% Bacto-yeas
t extract, 0.5% NaCl) 10ml中で、pH7.2 、温度37℃で
16時間培養した。培養物中のＬ−ＦＤＨ活性を特開平２
-84177号公報記載の方法により測定した結果、0.1 U/ml
であった。
FD203)を１mM ＩＰＴＧ(isopropyl-β-D-galactoside)
を含むＴＹ培地 (１% Bacto-trypton, 0.5% Bacto-yeas
t extract, 0.5% NaCl) 10ml中で、pH7.2 、温度37℃で
16時間培養した。培養物中のＬ−ＦＤＨ活性を特開平２
-84177号公報記載の方法により測定した結果、0.1 U/ml
であった。
【００２１】
【発明の効果】本発明により、Ｌ−フコースデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子及びそれを含む組み換え体ＤＮＡを提供
し、この組み換え体ＤＮＡを含み、Ｌ−フコースデヒド
ロゲナーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する微
生物を培養することにより、Ｌ−ＦＤＨを効率よく生産
させることができた。したがって、本発明は、産業上極
めて有用なものである。
ナーゼ遺伝子及びそれを含む組み換え体ＤＮＡを提供
し、この組み換え体ＤＮＡを含み、Ｌ−フコースデヒド
ロゲナーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属する微
生物を培養することにより、Ｌ−ＦＤＨを効率よく生産
させることができた。したがって、本発明は、産業上極
めて有用なものである。
【００２２】
１．配列番号１ （１）配列の長さ： 987 （２）配列の型： 核酸 （３）鎖の数： 2 本鎖 （４）トポロジー： 直鎖状 （５）配列の種類： 染色体DNA （６）起源： 生物名： Pseudomonas sp.No.1143 （７）配列： ATGTCATCGA CTGAGCCTGC CGCGGCCGCT GCCGGCCTGG CCATCCCGGC CCTCGGCTAC 60 GGCGCCGCCA ACGTGGGCAA CCTCTTCCGC GCGCTGAGCG ATGACGAGGC CTGGGCCGTG 120 CTCGAGGCGG CGTGGGATGC CGGCATCCGC TATTACGACA CCGCGCCGCA CTACGGGCTC 180 GGGCTGAGCG AGAAGCGCCT CGGTGCCTTC CTGCAGACCA AGCCGCGCGA CGAGTTCGTC 240 GTGTCGACCA AGGCCGGGCG CCTGCTGCGC CCGAACCCCG AGCGCCGGCC GAGCGGCCTG 300 GACACCGACA ACGACTTCCA CGTGCCCGAC GACCTGCGCC GCGAGTGGGA CTTCACCGAG 360 CAGGGCATCC GTGCGAGCAT CGCCGAGTCG CAGGAGCGGC TCGGGCTCGA CCGCATCGAC 420 CTGCTGTACC TGCACGACCC CGAGCGGCAC GACCTCGACC TCGCGCTCGC CTCGGCCTTC 480 CCGGCGCTCG AGAAGGTGCG CGCCGAGGGC GTCGTGAAGG CGATCGGCAT CGGCTCGATG 540 GTGTCGGATG CCCTGACCCG GGCGGTCCGC GAGGCGGACC TCGACCTCAT CATGGTCGCC 600 GGGCGCTACA CGCTGCTCGA GCAGCCCGCG GCCACCGAGG TGCTGCCTGC ATGCGCTGAG 660 AACGCCACCG GGATCGTCGC GGCATCCGTC TTCAATTCCG GACTGCTCGC GCAGAGCGAG 720 CCGAAGCGCG ACGGACGCTA CGAGTACGGT CAGCTGCCCG ATGAGCTGTG GGATCGCCTG 780 GTGCGGATCG CCGCGATCTG CCGCAACCAC GACGTACCGC TGCCGGCGGC GGCGATCCAG 840 TTCCCGCTGC AGTCGGCCCT GGTGCGCTCG GTCGTGGTCG GCGGCAGCCG CCCCGCGCAG 900 CTGACGCAGA ACGCCGAGTA CGCCGCGCTC GAGATCCCCG CCGGGCTGTG GGCCGAGCTG 960 GCCGAGGCCC GCCTGATCCC CACCCCC 987 ２．配列番号２ （１）配列の長さ： 329 （２）配列の型： アミノ酸 （３）トポロジー： 直鎖状 （４）配列の種類： 蛋白質 （５）起源： 生物名： Pseudomonas sp.No.1143 （６）配列： Met Ser Ser Thr Glu Pro Ala Ala Ala Ala Ala Gly Leu Ala Ile 15 Pro Ala Leu Gly Tyr Gly Ala Ala Asn Val Gly Asn Leu Phe Arg 30 Ala Leu Ser Asp Asp Glu Ala Trp Ala Val Leu Glu Ala Ala Trp 45 Asp Ala Gly Ile Arg Tyr Tyr Asp Thr Ala Pro His Tyr Gly Leu 60 Gly Leu Ser Glu Lys Arg Leu Gly Ala Phe Leu Gln Thr Lys Pro 75 Arg Asp Glu Phe Val Val Ser Thr Lys Ala Gly Arg Leu Leu Arg 90 Pro Asn Pro Glu Arg Arg Pro Ser Gly Leu Asp Thr Asp Asn Asp 105 Phe His Val Pro Asp Asp Leu Arg Arg Glu Trp Asp Phe Thr Glu 120 Gln Gly Ile Arg Ala Ser Ile Ala Glu Ser Gln Glu Arg Leu Gly 135 Leu Asp Arg Ile Asp Leu Leu Tyr Leu His Asp Pro Glu Arg His 150 Asp Leu Asp Leu Ala Leu Ala Ser Ala Phe Pro Ala Leu Glu Lys 165 Val Arg Ala Glu Gly Val Val Lys Ala Ile Gly Ile Gly Ser Met 180 Val Ser Asp Ala Leu Thr Arg Ala Val Arg Glu Ala Asp Leu Asp 195 Leu Ile Met Val Ala Gly Arg Tyr Thr Leu Leu Glu Gln Pro Ala 210 Ala Thr Glu Val Leu Pro Ala Cys Ala Glu Asn Ala Thr Gly Ile 225 Val Ala Ala Ser Val Phe Asn Ser Gly Leu Leu Ala Gln Ser Glu 240 Pro Lys Arg Asp Gly Arg Tyr Glu Tyr Gly Gln Leu Pro Asp Glu 255 Leu Trp Asp Arg Leu Val Arg Ile Ala Ala Ile Cys Arg Asn His 270 Asp Val Pro Leu Pro Ala Ala Ala Ile Gln Phe Pro Leu Gln Ser 285 Ala Leu Val Arg Ser Val Val Val Gly Gly Ser Arg Pro Ala Gln 300 Leu Thr Gln Asn Ala Glu Tyr Ala Ala Leu Glu Ile Pro Ala Gly 315 Leu Trp Ala Glu Leu Ala Glu Ala Arg Leu Ile Pro Thr Pro 329
【図１】組み換え体プラスミドｐＦＤ２０３ＤＮＡの制
限酵素による開裂地図を示す図である。
限酵素による開裂地図を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 堀内 達雄 千葉県野田市野田399番地 財団法人 野 田産業科学研究所内 (72)発明者 中野 衛一 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内
Claims (3)
- 【請求項１】 配列番号２記載のアミノ酸配列をコード
するＬ−フコースデヒドロゲナーゼ遺伝子。 - 【請求項２】 請求項１記載のＬ−フコースデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子を含むベクターＤＮＡからなる組み換え体
ＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項２記載の組み換え体ＤＮＡを含
み、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ生産能を有するエッ
シェリシア属に属する微生物を、培地に培養し、培養物
よりＬ−フコースデヒドロゲナーゼを採取することを特
徴とするＬ−フコースデヒドロゲナーゼの製造法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24337292A JP3132913B2 (ja) | 1992-09-11 | 1992-09-11 | Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びｌ−フコースデヒドロゲナーゼの製造法 |
| DE19934330774 DE4330774A1 (de) | 1992-09-11 | 1993-09-10 | Isoliertes L-Fucosedehydrogenase-Gen, rekombinante DNA, und Verfahren zur Herstellung von L-Fucosedehydrogenase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24337292A JP3132913B2 (ja) | 1992-09-11 | 1992-09-11 | Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びｌ−フコースデヒドロゲナーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0690765A true JPH0690765A (ja) | 1994-04-05 |
| JP3132913B2 JP3132913B2 (ja) | 2001-02-05 |
Family
ID=17102872
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24337292A Expired - Fee Related JP3132913B2 (ja) | 1992-09-11 | 1992-09-11 | Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びｌ−フコースデヒドロゲナーゼの製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3132913B2 (ja) |
| DE (1) | DE4330774A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7575910B2 (en) | 2004-03-17 | 2009-08-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-fuculose and method for producing L-fucose |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE505591C2 (sv) * | 1995-04-28 | 1997-09-22 | Ericsson Telefon Ab L M | Sätt och anordning för tillverkning av en optisk fiberdämpningsanordning samt optisk dämpningsanordning |
-
1992
- 1992-09-11 JP JP24337292A patent/JP3132913B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-09-10 DE DE19934330774 patent/DE4330774A1/de not_active Ceased
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7575910B2 (en) | 2004-03-17 | 2009-08-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-fuculose and method for producing L-fucose |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4330774A1 (de) | 1994-08-18 |
| JP3132913B2 (ja) | 2001-02-05 |
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