JPH0319690A - クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有するｄｎａ断片、該ｄｎａ断片を有する組換えベクター及び該組換えベクターを有する形質転換体、並びにクレアチニン・アミドヒドロラーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は、タレアヂニン・ア当ドヒドロラーゼをコード
する遺伝子を有するＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を有する
組換えヘククー、該ヘクターを有する形質転換体および
該形質転換体を用いてクレアチニン・ア旦ドヒドロラー
ゼを製造する方法に関する。

〔従来の技術］ タレアチニン・アごドヒドロラーゼ（ｃｒｅａｔｉｎｉ
ｎｅａｍｉｄｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ，　ＥＣ３．５＋　
２．　１０）はタレアチニンとクレアチンの変換を触媒
する酵素であり、反応式は以下のとおりである。

クレアチニン・ア旦ドヒドロラーゼは血清中あるいは尿
中のタレアチニン及びクレアチンの測定に使用される。

従来、タレアチニン・アミドヒドロラーゼは、例えばシ
ュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属し、ク
レアヂニン・アミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物
を、タレアチニン，クレアチンまたはこれらの混合物の
存在下で培養し、培養物からタレアチニン・アジドヒド
ロラーゼを採取することにより製造されている（Ａｍｉ
ｎｏ　Ａｃｉｄ　−　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ第３５
巻，３９〜４６．　１９７７）。

しかしながら、この方法は培地中にタレアチニン，クレ
アチン等高価な物質を添加することが必要であり、また
タレアチニン・アミドヒドロラーゼの収率も十分でなく
、効率よくクレアチニン・アミドヒドロラーゼを製造す
る方法の開発が望まれていた。

〔発明が解決しようとする課題〕 本発明の課題は、遺伝子工学的手法により、タレアチニ
ン，クレアチン等の高価な物質を使用することなく、高
収率で効率良くタレアチニン・アミドヒドロラーゼを製
造しようとするものであって、このために、タレアチニ
ン・アミドヒドロラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片、
このＤＮＡ断片を含有する組換えベクター、及びこの組
換えベクターを保有する形質転換体を新たに提供するこ
とにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記の従来技術の問題点を解決するため
、タレアチニン・アミドヒドロラーセをコードする遺伝
子を有するＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を有する組換えヘ
クター、該ヘクターを有する形質転換体および該形質転
換体を用いてクレアチニン・アごトヒドロラーゼを製造
する方法について検削してきた。そして、また、クレア
チニン・アＳト゛ヒトロラーゼ生産菌の有するタレアチ
ニン・ア壽ドヒドロラーゼ遺伝子をクローニングし、該
遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得るとともに該遺伝子の
ＤＮＡ配列を決定することに成功した。

次いで該ＤＮＡ断片を有する組換えベクターを得、さら
に該ヘクターを含む形質転換体を創製し、該形質転換体
を用いるクレアチニン・アミドヒドロラーゼの製造方法
を開発し、本発明を完或するに至った。

すなわち、本発明は、 （１）　　タレアヂニン・アごトヒドロラーゼをコード
する遺伝子を有するＤＮＡ断片。

（２）　　タレアチニン・ア貴トヒドロラーゼをコード
する遺伝子が、シュードモナス属に属する微生物由来の
ものである（１）記載のＤＮＡ断片。

（３）以下のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有
する（１）又は（２）記載のＤＮＡ断片。

Ｍｅｔ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　
Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　ＬｅｕＴｈ
ｒ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｕ　　
＾ｌａ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ八Ｉａ　　Ｇｌ
ｙ　　Ａｓｐ　　ＣｙｓＧｌｙ　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　Ｇ
１ｕ Ｃｙｓ　　Ｍｅｔ　　Ａｓｎ　　νａ１八Ｉａ　　Ｖａ
ｌ　　Ｃｙｓ　　ＬｙｓＧｌｙ　Ａｈａ　　Ｌｅｕ　　
Ｖａｌ Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ Ｇｌｙ　Ａｓｎ　　ｔｌｉｓ　　Ｐｈｅ八ｓｐ　　Ｔｉ
ｅ　　Ｉｌｅ　　Ａｒｇ八Ｉａ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　
　ＬｅｕＴｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ １１ｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｌａ Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｊｌｅ　ＧＩｎ Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ Ａｌａ　　Ｖａｌ　　ｌｉｅ　　ＧｌｎＶａｌ　　Ｐｈ
ｅ　　Ｇｌｕ　　ＴｈｒＴｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌｅ
ｕ Ｖａｌ　　八ｓｐ　　ｔｌｉｓ　　ＰｒｏＴｙｒ　　Ａ
ｓｐ　　Ｖａｌ　　ＰｈｅＶａｌ　　Ｌｅｕ ＧＩｎ　ｔｌｉｓ Ａｓｐ　　Ｖａｌ 八ｒｇ　　Ｖａｌ Ｍｅｔ　　Ｐｒｏ Ｇｌｎ　　Ｇｌｎ Ｐｒｏ　Ｇａｙ Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　ＶａｌＧｌｙ　ｌｌｉ
ｓ　｝ｌｉｓ　Ｍｅｔ Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　ＴｈｒＡｌａ　Ｇｌｕ
　Ａｒｇ　　Ｉｌｅ Ｇａｙ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ ［．ｙｓ　　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　ＬｅｕＧｌｕ　　Ｌｅ
ｕ　Ａｌａ　　Ａｒｇ Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｍｅｔ　　ＡｓｎＭｅｔ　　Ｐｈ
ｅ　　Ｉｃｅ　　ＶａＩＬｅｕ　　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　　
Ｌｅｕ Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　　νａＩ Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　　Ｉ．ｙｓ Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ ｔｌｉｓ　Ｇｌｙ Ｇｌｙ　Ｈｉｓ Ｇｌｕ　Ｇｌｙ Ａｒｇ　Ｔｙｒ Ｖａｌ　　νａｌ Ａｓｐ　Ｐｒｏ Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｍｅｔ　　ＬｅｕＶａｌ　　八ｓ
ｐ　　Ｌｅｕ　　ＡｓｐＰｒｏ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　
　ＰｈｅＰｒｏ　Ｖａｌ　　＾ｓｐ　Ｐｒｏ Ａｌａ　　Ｌｅｕ Ａｒｇ　　νａｌ Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ 八Ｉａ　　Ａｒｇ Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌ
ｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＡｌａＬｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ
　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ
　Ｌｅｕｒｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　　Ｃｙｓ　
Ｖａｌ　　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　ＡｌａＡｓｐ　
　Ａｌａ　　Ｔｌｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｐ
ｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ（４）以下のＤＮＡ配列
を有する請求項２記載のＤＮＡ断片。

ＧＧＣＡＡＴＣＡＣＴ　　ＴＣＣＣＣＧＧＣ，ＡＣ　　
ＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧ　　ＧＡＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＣ
ＴＧＡＣＴＧＧ　　ＣＡＣＧＧＴＧＣＡＧ　　ＧＡＣＡ
ＴＣＡＴＣＣ　ＧＣＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴＧ
ＧＴ　　ＧＣＧＣＧＴ（：ＧＣＣ　　ＴＧＧＴＡＣＴＧ
ＡＴ　　ＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＴＡＣＧ八八八八ＴＴ　
　ＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴ　　ＣＧＴＣＧＡＡＧＧＣ　　
ＡＴＣＧＡＣＣＴＣＧＧＧＧＡＣＡＴＣＧＡ　　ＧＣＡ
ＣＧＧＣＧＧＣ　　ＧＴＣＴＴＣＧＡＧＡ　　ＣＣＴＣ
ＣＣＴＧＡＴＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧ　　ＴＣＴＧＣＧＴ
ＣＣＡ　　Ｇ（；ＧＣＡＴＴＧＣＣ　　ＧＡＣＧＣＴＡ
ＴＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＴＴ　　ＣＣＣＧＣＣＣＡＣＣ
　　ＴＧＡ（５）　　（１）〜（４）いずれか記載のＤ
ＮＡ断片を有する組換えヘクター。

（６）　　（５）記載の組換えベクターを有する形質転
換体。

（７）　　（６）記載の形質転換体を培地に培養し、タ
レアチニン・アミドヒドロラーゼを蓄積せしめ、該タレ
アチニン・アミドヒドロラーゼを採取することを特徴と
するクレアチニン・アミト゛ヒ１′ロラーゼの製造法。

に関するものである。

尚、上記のタレアチニン・アミドヒドロラーゼ遺伝子を
含有するＤＮＡ断片については、よく知られているよう
に、多くのアミノ酸についてはそれをコードする遺伝子
のＤＮＡ配列は複数存在する。その塩基配列は一義的に
は決まらず多数の可１０ 能性があり得る。本発明者等により明らかにされたタレ
アチニン・アミトヒトロラーゼのアξノ酸配列をコート
する遺伝子の場合も、そのＤＮＡ配列は天然の遺伝子の
塩基配列以外にも多数の可能性があり、本発明のＤＮＡ
配列は、天然のＤＮＡ配列のみに限定されるものではな
く、本発明により明らかにされたタレアチニン・アミド
ヒドロラーゼのアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配
列も含むものである。さらに遺伝子組換え技術によれば
、基本となるＤＮＡの特定部位に、該ＤＮＡがコー１・
するものの基本的な特性を変化させることなく、あるい
はその特性を改善するように、人為的に変異を起すこと
ができる。本発明により提供される、天然の塩基配列を
有するＤＮＡあるいは天然のものとは異なる塩基配列を
有するＤＮＡ６こ関しても同様に人為的に挿入、欠失、
置換を行うことにより天然の遺伝子を同等あるいは改善
された特性とすることが可能であり、本発明はそのよう
な変異遺伝子をも当然に含むものである。

以下本発明を実施するための各ステップについで詳細に
説明する。

（ａ）　　タレアチニン・アごドヒＩ・ロラーゼをコー
ｌする遺伝子を有するＤＮＡ断片及び組換えヘクターの
調製 本発明に用いられる組換えベクターは、例えばエシェリ
ヒア属に属する微生物などの宿主微生物の培養された細
胞内での複製能を有するベククＤＮＡに、タレアチニン
・アミ１゛ヒトロラーゼ生産能を有する微生物から調製
されたクレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする
遺伝子を有するＤＮＡ断片を組の込んでなるものである
。

好適な例としては、シュードモナス・プチダＰＳ７株を
栄養培地で培養し、培養物を得る。この培養物を、例え
ば５，　ＯＯＯｒｐｍ以上、好ましくは８．０００〜］
０．０００ｒｐｍで５分以上、好ましくは１０〜１５分
間遠心分離してシュードモナス・プチダＰＳ−７株の菌
体を得る。

この菌体より、例えばＲｃｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ
　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　Ｒ．
ｌ．．ｅｔ　ａｌ．　Ａｄｄｉｓｏｎ−ＷｅＳｌｅｙＰ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ．　１９８３）記
載の方法あるいはｌ１ １２ Ｋｏｉｚｕｍｉ　Ｊ．らの方法（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉ
ｏｅｎｇ．，２７，　７２１〜７２８．　１９８５）等
により染色体ＤＮＡを得ることができる。

この染色体ＤＮＡに制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ（東洋
紡製）を３０゜Ｃ以上、好ましくは３７”Ｃ、酵素１〜
１００ユニットで３０分以上、好ましくは１〜２時間作
用させて切断し、種々の大きさの染色体ＤＮＡ断片混合
物を得る。

このようにして得られたＤＮＡ断片混合物から、例えば
シヨ糖密度勾配遠心分離等により低分子量のＤＮＡ断片
（ＩＫｂ以下）を除き、さらにエタノール沈澱法等の濃
縮手段により濃縮し、タレアチニン・アミドヒドロラー
ゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片混合物を得
る。

一方本発明に用いるベクターＤＮＡとしては、如何なる
ものでもよく、例えばプラスミドヘクタＤＮＡ　　ハタ
テリオファージヘクターＤＮＡ等が挙げられるが、好適
な例としてはプラスミドヘククーｐＢＲ３２２，　ｐＵ
ｃ１９（東洋紡製），　バクテリオファージベクターλ
ＺＡＰ，ＥＭＢＬ３（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）等が挙
げられる。

次に上記ヘクターＤＮＡに」二記のようにして得たタレ
アチニン・アミトヒドロラーゼをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡ断片混合物を連結する。

連結には例えば大腸菌Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼ，Ｔ，−
ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）など、好ましくはＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼを４〜３７“Ｃ１好ましくは４〜１６゜Ｃ
で酵素１〜１００ユニッ１・１時間以上、好ましくは４
〜１６時間作用させ、組換えＤＮＡを得る。

この組換えＤＮＡを用いて、例えば［ｉ．ｃｏｌｉ　Ｋ
１２、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ］０９株、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ　ＩＩＢＩＯＩ株、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＸＬＩ−ｂｌ
ｕｅ株（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）などを形質転換ある
いは形質導入して、それぞれの菌体を得る。この形質転
換及び形質導入は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　１９８２）記載の
方法により行なうことができる。

そして上記菌株よりタレアチニン・アミドヒドロラーゼ
生産能を有する菌株をスクリーニングすることにより、
タレアチニン・アミドヒドロラゼをコードする遺伝子を
含有する組換体ＤＮＡが１３ １４ 得られる。さらに上記組換えＤＮＡ中のタレアチニン・
ア健Ｉ・ヒ１゛ロラーゼをコードする遺伝子を含イｆず
るＤＮＡ断片を常法に従い小断片化して上記ブラスミｌ
・ヘクターＤＮＡと連結し、タレアチニン・ア旦ドヒド
ロラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ配列を有
する絹換えプラスミトを得ることができる。

（ｂ）　　形質転換体の調製 このようにして得られたクレアチニン・アミドヒドロラ
ーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ配列を有する
Ｍｉ換えプラスミドを前記の形質転換法により例えばエ
シェリヒア属、シュードモナス属、バヂルス属、に属す
る微生物に導入することにより、所望の遺伝形質とベク
ターＤＮＡの形質を併せもつ形質転換体が得られる。

前記ユシェリヒア属に属する微生物としてはＥ．ｃｏｌ
ｉ　Ｊ旧０９　　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ，　Ｅ．ｃ
ｏｌｉ　Ｃ６００．　［ｉ．ｃｏｌｉＤｌ＋−１等が挙
げられる。かくして得られた微生物の好適な例としては
、例えばＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐｃＮＨ５２１）
（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０７４８）がある。

（Ｃ）　　クレアチニン・アミドヒドロラーゼの製造上
記で得られた形質転換体を培養するには、クレアチニン
・アミドヒドロラーゼの生産に適した培地であって且つ
宿主微生物の生育乙こ適した培地を用いる。

本発明を実施するに当っては、通常エシェリヒア属の生
育培地として用いられるＬ　Ｂ培地（１・リプトン，酵
母エキス，食塩）、ＢＰＢ培地（Ｄｉｒｃｏポリペプト
ン，酵母エキス，リン酸カリウム）、栄養・寒天培地（
１）ｉｆｃｏ　０００１）、１・リブ１・ン、食塩培地
等を基本培地として用いればよい。その他、必要に応し
て炭素源、窒素源の他にア多ノ酸、ビタミン等の栄養素
を添加してもよい。

培養方法は通常振盪培養あるいは通気撹拌培養で行なう
。培養温度は２０〜４５゜Ｃの範囲、好ましくは３７゜
Ｃ付近、培養ｐＨは５〜８の範囲、好ましくはｐＨ７付
近に制御するのが良い。これら以外の条件下でも使用す
る菌株が生育すれば実施できる。

培養期間は１〜２日間で生育し、菌体内にタレアチニン
・アミドヒド℃コラーゼが生威蓄積される。

１５ １６ 本酵素の精製法は一般に使用される精製法を用いればよ
い。例えば、抽出法には超音波破砕、ガラスビーズを用
いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性剤など、
いずれを用いてもよい。

さらに抽出液については公知の硫安や芒硝などの塩析法
、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法
、プロタミンやボリエチレンイミンなどの凝集法さらに
はＤＥΔＥ（ジエチルア実ノエチル）セファロース　（
ファルマシア製），ＣＭ（カルボキシメチル）セファロ
ース　（ファルマシア製）などのイオン交換クロマト法
および七フアクリルＳ−３００（ファルマシア製）など
のゲル濾過法などにより精製することができる。

上記精製手段により得られる精製タレアチニン・アミド
ヒドロラーゼの理化学的性質はＤＮＡ供与株、例えばシ
ュードモナス・プチダＰＳ−７株の生産するクレアチニ
ン・アジドヒドロラーゼの理化学的性質と全く同様であ
る。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

（１）　　シュードモナス・プチダＰＳ−７株の染色体
ＤＮＡの調製 シュートモナス・プチダＰＳ−７株を栄養培地（ボリペ
プトン２．０％、酵母エキス０４％、麦芽エキス０．１
％、リン酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム１．
４％、硫酸マグネシウム０．Ｏｌ％、グルコース２．０
％）１００ｍＡ＋に接種し、３０゜Ｃで８時間振盪培養
して培養液を得た。この培養物を１２，　ＯＯＯｒｐｍ
１０分間遠心分離して湿菌体約１ｇを得た後、該菌体か
らＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ（ＲｏｄｒｉｇｕｅｚＲ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．Ａｄｄ
ｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍ
ｐａｎｙ＋１９８３）記載の方法により染色体ＤＮＡ約
１．８ｍｇを調製した。次にこの染色体ＤＮＡＩＯＯμ
ｇを制限酵素ＥｃｏＲＴ（東洋紡製）５０ユニットで３
７゜Ｃ、３時間切断した。切断後５〜２０％シヨ糖密度
勾配遠心分離を行なって１〜１０Ｋｂ画分のＤＮＡ断片
約１０μｇを言周製した。

（２）　　タレアチニン・アミドヒドロラーゼをコー１
する遺伝子を含有するＤＮＡ断片及び該ＤＮ１７ １８ Ａ断片を有する組換えヘクターの調製 ハタテリオファージヘクターλＺＡＰ　（ＥｃｏＲＩ切
断済、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）ｌμｇと上記（］）で
得られたＥｃｏＲＩで切断した染色体ＤＮＡ０．５μｇ
をＴ４−ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）■ユニットで■６
゜Ｃ、１２時間反応させＤＮＡを連結した。連結したＤ
ＮＡはλＤＮＡインビト口パンケージングキットＧｉｇ
ａｐａｃｋＧｏｌｄ　（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用
いてパソケージングした。パッケージングにより得られ
た組換えファジはＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．ｃｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇ　ｌｌａｒｂｏｒ，　１９８２）記載の方法でＥ
．ｃｏｌｉ　ＸＬＩｂｌｕｅ　（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ
製）　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｖｏｌ．１６　Ｎｏ．１５　７５８３　〜７６００、１
９８Ｂ）に形質導入した。使用ＤＮＡＩμｇ当り約ＩＸ
ＩＯ’個のファージプラークが得られた。

タレアチニン・アミトヒドロラーゼをコードする遺伝子
を含有するＤＮＡを有する組換えファージ検索は、酵素
免疫テストにより行なった。酵素免疫テストは、Ｇｅｎ
ｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ヘーリンガーマイハイム製
）を用いて行なった。本酵素免疫テス１・は、タレアヂ
ニン・アミドヒドロラーゼ約１００ｐｇの検出限界を示
し、上記ファージプラーク１０００個あたり１〜２個の
陽性信号が得られた。

酵素免疫テストで陽性のプラーク３個よりＳＴＲＡＴＡ
ＧＥＮＥ製λＺＡＰ使用マニュアルの指示に従い組換え
プラスミドを切り出した。得られた３種の組換えプラス
ｓトをＥｃｏＲＩで切断ずると、異なったハンドの他に
３種の組換えプラスご］に共通な４．２ＫｂのＤＮＡ断
片が見い出された。この４．２　ＫｂのＥｃｏＲＩ断片
約２μｇから＾ｐａ＋（東洋紡製）を用いて２．５Ｋｂ
のＡｐａＩ−［ｉｃｏＲＩ断片を切断した。生したＤＮ
Ａ断片は、低融点アガロースゲル中でその大きさに応し
て分離され、２．５ＫｂのＡｐａｌ−ＥｃｏＲＩ断片が
単離された。

低融点アガロースからのＤＮＡ断片の単紬はＳｔｒｙｈ
ｌ　Ｋ．の方法（Ｓｔｒｕｈｌ　Ｋ．，Ｂｉｏｔｅｃｔ
＋ｎｉｑｕｅｓ，　３４５２．　１９８５）により行な
った。他のすべてのＤＮＡ断片の単離もこの方法で行な
った。

プラスもＦヘクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ（旧３
−）　（ＳＴＲＡＴＡＧ［！Ｎ製）約１．ｌｌＢを八ｐ
ａＩ及びＥｃｏＲＩで切断して１９ ２０ 開環し、これに前記調製した２．５Ｋｂの八ｐａｌ−Ｅ
ｃｏＲｌ断片約０．５μｇを混合し、Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼ１ユニソトで１６゜Ｃ、１２時間反応させてＤＮＡ
を連結させ組換え体プラス旦ドｐＣＮＨ　２を得た。こ
の２．５ＫｂのＡｐａｌ−ＥｃｏＲＩ断片は種々の制限
酵素により特徴付けられた（第２図参照）。

次に上記２．５ＫｂのＡｐａｌ−ＥｃｏＲＩ断片約２／
ｌ／ｇをＡｃｃｌ（東洋紡製）０．５ユニントで３７゜
Ｃ、１時間制限的に反応させ、１．５ＫｂのＡｃｃｌ−
ＥｃｏＲＩ断片を切断し、上記Ｓｔｒｕｈｌ　Ｋ．の方
法によりＩ．　５　ＫｂのＡｃｃｌ−ＥｃｏＲＩ断片を
単離した。またプラスミトヘクターｐＵｃ１９（東洋紡
製）約１μｇをＡｃｃＩ及びＥｃｏＲ　Ｉ断片で切断し
て開環し、これに前記調製した１．５ＫｂのＡｃｃｌ−
ＥｃｏＲＩ断片約０．５μｇを混合し、Ｔ４−ＤＮＡリ
ガーゼ１ユニソトで１６゜Ｃ、１２時間反応させてＤＮ
Ａを連結させ、組換えプラスミドｐｃＮＩ＋５２１を得
た（第２図参照）。ｐｃＮＨ５２１は大腸菌中でランク
プロモーター（Ｌａｃ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の制御下、
生物学的活性のタレアチニン・アミドヒドロラーゼをコ
ードする。

一方１．５Ｋｂの八ｃｃＴ−ＥｃｏＲＩ断片を各種制限
酵素で切断してＭ１３ｍｐｌ８あるいはｍｐｌ９ファー
ジＤＮＡ（東洋紡製）に連結した後常法に従い一木鎮Ｄ
ＮＡを調製した。得られた一本鎖ＤＮＡについて、Ｍｌ
３シークエンシングキット　（旧３　Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇＫｉｔ東洋紡製）を用いて、塩基配列の決定を行な
った。

決定した塩基配列及びア≧ノ酸配列を第１図に示した。

（３）　　タレアチニン・ア旦ドヒドロラーゼをコー１
〜するＤＮＡを含む組換えプラスミトを含有する形質転
換体の調製 上記クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺
伝子を含有するＤＮＡ配列を有する組換えプラス砦ドで
あるｐｃＮＩＩ５２１を用い前記ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．ｃ
ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌｌａｒｂｏｒ，１９８２）記
載の方法によりＥ．ｃｏｌｉ　Ｊ旧０９；（東洋紡製）
　（Ｇｅｎｅ，Ｖｏ１．３３（１９８５）　１０３〜Ｉ
１９）を形質転換してＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐｃ
ＮＩＩ５２１）（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０７４８）を調製し
た。本形質転換体はラックプロモーターの誘導物質であ
るＩＰＴＣ；（イソプロビル−β−Ｄチオガラクトピラ
ノシド）（ナカライ・テスク製）２１ ２２ 存在下、菌体内可溶性タンパク質の約４０％までタレア
チニン・アミドヒドロラーゼを生産していた。

次に各菌株によるタレアチニン・アξドヒドロラーゼの
生産性について、以下の第１表に示す。

なお、第１表中、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐｃＮｌ
ｌ２）は、上記（２）で得られた２．５ＫｂのＡｐａ１
４ｃｏＲＩ断片を含む組換え体ブラスミトｐ　Ｃ　Ｎ　
１１２でＥ．ｃｏｌｉ　Ｊｌ’ｌｌ０９を形質転換する
ことにより得られた形質転換体である。

タレアチニン・アミドヒドロラーゼの活性測定は０．１
Ｎクレアチン溶液０．　９　ｍＱ．に酵素液０．　１　
ｍｌを加え、３７゜ＣでＩＯ分間反応の後Ｊａｆｆｅ反
応（ＣＩｉｎ．Ｃｈｅｍ．　１，　５５．　１９５３）
によりタレアチニンの生威量を測定した。酵素活性は３
７゜Ｃで１分間に１マイクロモルのクレアチニンを生戒
ずる酵素力価を１ユニントとした。また培養はシュー１
′モナス・ブチダＰＳ−７株は前記八ｍｉｎｏ　Ａｃｉ
ｄ；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ第３５巻３７　〜４６．
　１９７７記載の方法、Ｅ．ｃｏｌｉはＩ、■培地（ト
ノプトン１％、酵母エキス０．５％、食塩１％、アンピ
シリンＳｏμｇ／ｍ９．，　　ｐＨ７．４）にＩ　ＰＴ
Ｇを０．２ｍＭ添加あるいは無添加で３７゜Ｃ、１６時
間培養しで菌体内酵素活性を測定した。

上記データよりＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐｃＮＩＩ
５２１）においてタレアチニン・アミドヒドロラーゼは
、タレアチニンの誘導なしにランクプロモーターの制御
下高生産されていることが明らかである。

（４）　　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９（ｐｃＮＩＩ５２
１）によるクレアチニン・アミドヒドロラーゼの生産及
び該酵素の精製 前記のＬ　Ｂ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５
％、食塩１％、ｐＨ７．４）６１を１０４２−ジャーフ
ァメンターに分注し、１２１゜Ｃ、１５分間オートク２
３ ２４ レーブを行い放冷後、５０ｍｇ／ｄアンピシリン（ナカ
ライ・テスク製）＋　　２００ｍＭ　　ＩＰＴＧを無菌
的に６　ｍｌ添加した。この培地に上記と同一組成の培
地で予め３７゜Ｃで１６時間振盪培養したＥ．ｃｏｌｔ
　ＪＭ１０９（ｐｃＮ１１５２１）の培養液６０ｍ｛を
接種し、３７゜Ｃで１６時間通気攪拌培養した。培養終
了後のタレアチニン・アミドヒドロラーゼ活性ば１５．
７Ｕ／ｍｐ．であった。培養液６ｌを遠心分離にて集菌
し、５０ｍＭ　Ｋ−　’Ｊン酸緩ｊＩｊ？ｆｆｌ　ｐＨ
７，５＋　２００ｍｆｆｉに懸濁し、常法により超音波
破砕した後、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し
てタレアチニン・アξドヒドロラーゼの粗酵素液を得た
。

このようにして得た粗酵素液にポリエチレンイミンを用
いて除核酸処理を施した後、硫酸アンモニウムを用いた
塩析分画を行なった。塩析沈澱物を５０雌の５０ｍＭ　
Ｋ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５に溶解し、５０ｍＭ　Ｋ
−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５にて平衡化したＤＥＡＥ−
セファロース　（ファノレマシア製）カラムクロマ１・
グラフィーに供し、０〜０，５Ｍの食塩濃度勾配｝岩出
ｌ去により０．　１〜０．３Ｍの食塩濃度範囲でタレア
チニン・アｓ　Ｆヒドロラーゼ活性画分を得た。このク
レアチニン・アミドヒトロラーゼ活性画分を限外濾過機
にて濃縮した後、５０ｍＭ　Ｋリン酸緩衝液、ｐＨ７．
５で平衡化したセファデックスＧ−２５（ファルマシア
製）にてゲル濾過した。

最終的に常法に従い凍結乾燥することにより、純化され
たタレアチニン・アくドヒドロラーゼ粉末４９０００ユ
ニントを得た。収率は５２％であった。

得られた酵素のｐＨ活性を第３図、至適温度を第４図、
ｐＨ安定性を第５図及び熱安定性を第６図に示す。これ
らクレアチニン・ア業ドヒトロラーゼの理化学的性質は
ＤＮＡ供与体であるシュードモナス・ブチダＰＳ−７株
の生産するタレアチニン・アミドヒドロラーゼの理化学
的性質と全く同じであった。

〔発明の効果〕

本発明の形質転換体は、クレアチン、タレアチニン等の
高価な物質を培地に添加する必要なしに極めて優れたク
レアチニン・アξドヒドロラーゼ生産性を示し、本発明
により効率的、経済的にク２５ ２６ レアヂニン・アミドヒトロラーゼを生産することが可能
となった。

【図面の簡単な説明】

第１図はシュードモナス・プチダＰＳ−７株のタレアチ
ニン・ア呉ドヒドロラーゼをコートする遺伝子のＤＮＡ
配列及び対応ずるア旦ノ酸配列を示す。 第２図はシュードモナス・プチダＰＳ−７株からの１．
５ＫｂＤＮＡ断片及びプラスミドｐｌｌｃ１９よりのｐ
ＣＮＩＩ５２１構造経過を示す。 第３図は実施例１のタレアチニン・アミドヒドロラーゼ
のｐＨ活性を示す。図中ｐ　Ｈ　５．　５は５０ｍＭ酢
酸緩衝液、ｐＨ　６．　０　〜８．　０は５０ｍＭ　Ｋ
−リン酸緩衝液、ｐＨ　８．　５　〜９．　０は５０ｍ
Ｍ炭酸緩衝液を用いて行なった。 第４図は実施例１のクレアチニン・アミドヒドロラーゼ
の至適温度を示す。 第５図は実施例１のタレアチニン・ア実ドヒドロラーゼ
のｐＨ安定性を示す。図中ｐ　Ｉ−１　６．　０〜８．
０は５０ｍＭ　Ｋ−リン酸緩衝液、　ｐＨ　８．　５　
〜９．　０は５０ＩＩＩＭ炭酸緩衝液を用いて行なった
。 第６図は実施例１のタレアチニン・アミドヒドロラーゼ
の熱安定性を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺
   伝子を有するＤＮＡ断片。 ２、クレアチニン・アミドヒドロラーゼをコードする遺
   伝子が、シュードモナス属に属する微生物由来のもので
   ある請求項１記載のＤＮＡ断片。 ３、以下のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有す
   る請求項１又は２記載のＤＮＡ断片。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ４、以下のＤＮＡ配列を有する請求項２記載のＤＮＡ断
   片。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ５、請求項１〜４いずれかの項記載のＤＮＡ断片を有す
   る組換えベクター。 ６、請求項５記載の組換えベクターを有する形質転換体
   。 ７、請求項６記載の形質転換体を培地に培養し、クレア
   チニン・アミドヒドロラーゼを蓄積せしめ、該クレアチ
   ニン・アミドヒドロラーゼを採取することを特徴とする
   クレアチニン・アミドヒドロラーゼの製造法。