KR20020097246A - Ｌ-리보오스 이소메라아제를 코드하는 ｄｎａ와 그 용도 - Google Patents

Abstract

L-리보오스로부터 L-리불로오스로의 이성화 반응 및 L-리불로오스로부터 L-리보오스로의 이성화 반응을 촉매하는 L-리보오스 이소메라아제를 코드하는 DNA와, 이 DNA를 사용하는 재조합 DNA 기술에 의한 폴리펩티드의 제조방법을 제공함으로써 해결한다.

Description

Ｌ-리보오스 이소메라아제를 코드하는 ＤＮＡ와 그 용도 {DNA ENCODING L-RIBOSE ISOMERASE AND USE THEREOF}

L-리보오스는 그 공업적 제조방법이 확립되어 있지 않은 희소 당질 중의 하나이다. 이 당질은 식품분야에 머무르지 않고 항바이러스제 및 항암제 등의 의약품의 제조원료로서도 유용성이 높은 것에 최근 주목이 집중되어 그 공업적 제조방법의 확립이 요망되고 있다.

이러한 요망에 따르고자 본 발명자들은 동일한 특허 출원인에 의한 일본국 특개 평10-155480호 공보에 L-리보오스의 공업적 제조에 유용한 신규 효소 L-리보오스 이소메라아제와 이 효소를 산생할 수 있는 미생물을 사용하는 이 효소의 제조방법 및 이 효소의 용도를 개시하였다.

상기한 바와 같이 L-리보오스의 공업적 제조에 관해서는 본 발명자들의 성과에 따라 하나의 길이 개척되었다고 할 수 있다. 그러나 본 발명자들이 L-리보오스 이소메라아제의 제조와 이용에 관하여 더욱 연구를 수행한 결과, L-리보오스에 대한 최근의 수요가 높은 것을 감안하면 L-리보오스를 생성하는 효소의 제조 효율 및이러한 효소의 성질에 있어서 더욱 개선해야 할 필요가 있음에 대하여 이러한 요망에 부응하고자 하는 연구는 아직까지 전혀 되어 있지 않았음을 발견하였다.

이러한 상황하에 L-리보오스를 생성하는 효소를 코드하는 DNA가 클론화되면, 최근 현저한 진보를 보이고 있는 재조합 DNA 기술을 여기에 적용함으로써 상기한 요망에 따를 수 있다 하겠다. 그러나 L-리보오스를 생성하는 효소를 코드하는 DNA가 클론화 되었다는 보고예는 아직 전혀 없다.

이러한 상황을 고려하여 본 발명의 과제는 L-리보오스의 공업적 제조에 이용할 수 있는 효소를 코드하는 DNA와 그 용도를 제공함에 있다.

본 발명은 신규한 DNA, 상세하게는 L-리보오스 이소메라아제(L-ribose isomerase)를 코드하는 DNA와 그 용도에 관한 것이다.

상기한 과제를 해결하고자 본 발명자들은 동일한 특허 출원인에 의한 일본국 특개 평10-155480호 공보에 개시된 L-리보오스 이소메라아제의 부분 아미노산 서열에 근거하여 이 효소를 산생할 수 있는 능력을 가진 미생물의 염색체 DNA를 널리 검색하였다. 그 결과, 아시네토박터(Acinetobacter) 속(屬)에 속하는 미생물로부터 상기한 부분 아미노산 서열을 가진 일련의 아미노산 서열을 코드하는 DNA의 클론화에 성공하였다. 그리고 클론화된 DNA를 사용하여 재조합형 폴리펩티드의 제조를 시도한 결과, L-리보오스 이소메라아제 활성을 가진 폴리펩티드를 효율적으로 제조할 수 있음이 확인되었다. 본 발명은 본 발명자들에 의한 상기한 연구성과에 근거하여 완성된 것이다.

즉, 본 발명은 상기한 제 1 과제를, L-리보오스로부터 L-리불로오스(L-ribulose)로의 이성화 반응 및 L-리불로오스로부터 L-리보오스로의 이성화 반응을촉매하는(이하, "L-리보오스 이소메라아제 활성"이라 할 경우, 이들 두가지 이성화 반응을 촉매하는 효소활성을 의미하는 것으로 함) L-리보오스 이소메라아제를 코드하는 DNA를 제공함으로써 해결하는 것이다.

더욱이 본 발명은 상기한 제 2 과제를, 폴리펩티드 제조에 있어서의 이 DNA의 용도, 즉 상기한 DNA를 인위적으로 발현시켜 L-리보오스 이소메라아제 활성을 가진 폴리펩티드를 생성시키는 공정과, 생성한 이 폴리펩티드를 채취하는 공정을 포함하는 폴리펩티드의 제조방법을 제공함으로써 해결하는 것이다.

본 발명은 L-리보오스 이소메라아제를 코드하는 DNA와 그 용도에 관한 것이다. 본 발명에서 말하는 L-리보오스 이소메라아제라 함은, L-리보오스 이소메라아제 활성, 즉 L-리보오스로부터 L-리불로오스로의 이성화 반응과 더불어 L-리불로오스로부터 L-리보오스로의 이성화 반응을 촉매하는 효소활성을 가진 효소를 의미한다. L-리보오스 이소메라아제 활성은 아래의 활성 측정법에 의해 확인할 수 있다. 먼저, 0.05 ml의 0.5 M 글리신-수산화 나트륨 완충액(pH 9.0), 0.05 ml의 0.05 M L-리보오스, 및 0.4 ml의 피험(被驗) 시료 용액(효소액)을 혼합하고, 이 혼합액을 30℃에서 10분간 유지하여 L-리보오스로부터 L-리불로오스로의 이성화 반응을 진행시킨다. 그리고 반응액을 끓여 이 반응을 정지시킨 후, 반응액을 시스테인ㆍ카르바졸법으로 처리하여 반응액 중에서 생성한 L-리불로오스를 정량한다. 본 발명에서 1 단위의 L-리보오스 이소메라아제 활성은 이 조건하에서 1분간에 1 μmol의 L-리불로오스를 생성하는 효소량으로 정의한다.

본 발명에서 말하는 L-리보오스 이소메라아제의 구체적인 예로서는 서열표의서열번호 1에 나온 아미노산 서열의 전부를 포함하는 효소를 들 수 있다. 이러한 아미노산 서열을 가진 L-리보오스 이소메라아제는, 통상, 이 효소를 산생할 수 있는 능력을 가진 미생물, 상세하게는 아시네토박터 속에 속하는 미생물로부터 단리할 수가 있다. 이러한 미생물로부터 단리되는 L-리보오스 이소메라아제는, 통상, 서열번호 1에 나온 아미노산 서열로 된 서브유닛이 4량체를 형성한 올리고머 효소로서 존재한다. 이 서열번호 1에 나온 아미노산 서열은 본 발명에서 말하는 L-리보오스 이소메라아제가 가진 아미노산 서열의 단순한 한가지 예인데, 그 공급원 및 조제방법에 따라서는 L-리보오스 이소메라아제는 이 아미노산 서열과 완전히 일치하지 않는 서열, 예컨대 서열번호 1의 아미노산 서열의 N 말단에 메티오닌이 부가된 서열, 혹은 이 아미노산 서열의 N 말단 및/또는 C 말단의 1개 또는 2개 이상의 아미노산이 결여된 서열을 포함할 경우가 있다. 따라서 본 발명에서 말하는 L-리보오스 이소메라아제는 서열번호 1에 나온 아미노산 서열의 전부를 가진 것에 한정되지 않고, 이 아미노산 서열의 일부를 가지고 또한 소기의 활성을 나타내는 것인 한, 포함된다. 서열번호 1에 나온 아미노산 서열의 일부를 가진 L-리보오스 이소메라아제는 2개의 아미노산 서열 사이에서 일치하는 아미노산의 수가 최대가 되도록 이 2개의 아미노산 서열을 정열하여 그 일치하는 아미노산의 수에 근거하여 상동성을 구하는 통상적인 방법에 의할 경우, 서열번호 1의 아미노산 서열과의 사이에서 통상, 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타낸다.

본 발명의 DNA는 상기한 바와 같이 정의되는 L-리보오스 이소메라아제를 코드하는 것이다. 본 발명의 DNA는 L-리보오스 이소메라아제를 코드하는 염기서열[이하, L-리보오스 이소메라아제를 코드하는 염기서열로 된 쇄(鎖)를 "센스 쇄(sense chain)"라 할 경우가 있음]을 가진 것인 한, 단일가닥 쇄(single strand nucleotide chain) 형태 또는 이중가닥 쇄(double strand nucleotide chain) 형태도 포함한다. 본 발명의 DNA의 구체예로서는 서열표에서의 서열번호 1에 나온 아미노산 서열을 코드하는, 예컨대 서열번호 2에 나온 염기서열의 전부를 가진 DNA를 들 수 있다. 이러한 아미노산 서열을 코드하는 DNA는, 통상, 이 효소를 산생할 수 있는 능력을 가진 미생물, 상세하게는 아시네토박터 속에 속하는 미생물의 염색체 DNA로부터 단리할 수가 있다. 이러한 미생물로부터 단리되는 DNA는, 통상, 서열번호 2의 염기서열과 더불어 그 5' 말단에 부가된 개시 코돈 및 3' 밀단에 부가된 종결 코돈을 포함한다. 이 서열번호 2에 나온 염기서열은 본 발명의 DNA가 가진 염기서열의 간단한 한가지 예이고, 본 발명의 DNA는 DNA의 공급원에 따라서는 서열번호 2의 염기서열과는 완전하게는 일치하지 않는 염기서열을 가질 경우가 있다. 그리고 일반적으로 특정의 염기서열의 DNA에 부위 특이적 변이 도입법 등의 관용적인 재조합 DNA 기술을 적용함으로써 이러한 DNA의 서열에 염기의 치환, 부가 및/또는 결실을 도입하여 이러한 DNA가 본래적으로 코드하는 아미노산 서열이 나타내는 활성을 소실하지 않는 범위에서 염기서열을 개변(改變)하는 것도 가능하다. 이러한 개변의 예로서는, 예컨대 특정의 염기서열의 소망의 위치에 대한, (His)₆-tag 등의 특정의 물질에 친화성을 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 염기서열의 부가 혹은 시그날펩티드 등을 코드하는 염기서열의 부가 등을 들 수 있다. 따라서 본 발명의 DNA는 서열번호 2에 나온 염기서열의 전부를 포함한 것에 한정되지 않고, 이 염기서열의 일부를 가지며 또한 소기의 L-리보오스 이소메라아제를 코드하는 것인 한, 포함된다. 서열번호 2에 나온 염기서열의 일부를 가진 이 DNA는 2개의 염기서열 사이에서 일치하는 염기의 수가 최대가 되도록 이 2개의 염기서열을 정열하여 그 일치하는 염기의 수에 근거하여 상동성을 구하는 통상적인 방법에 의할 경우, 서열번호 2의 염기서열과의 사이에서 통상, 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타낸다.

본 발명의 DNA는 이상과 같이 정의되는 것이고, 특정의 조제방법으로 얻어지는 것에 한정되지 않는다. 본 발명의 DNA는, 예컨대 관용적인 유전자 클로닝법에 따라 아시네토박터 속에 속하는 미생물, 보다 상세하게는 아시네토박터 칼코아세티커스(Acinetobacter calcoaceticus) LR7C(FERM BP-5335) 및 그 변이주나 그람 양성세균, 그람 음성세균, 효모, 곰팡이 등의 기타의 미생물의 염색체 DNA를 본 발명이 개시하는 DNA의 염기서열 혹은 이 DNA가 코드하는 L-리보오스 이소메라아제의 아미노산 서열에 근거하여 검색함으로써 얻을 수 있다. 염색체 DNA의 검색에는 게노믹 라이브러리(genomic library)의 하이브리다이제이션법에 의한 검색, 염색체 DNA를 주형으로 하는 PCR법 및 이들의 변법(變法) 등을 적용할 수 있다. 이상과 같은 검색을 실시하자면, 본 발명의 DNA(단일가닥 쇄 형태 또는 이중가닥 쇄 형태를 포함함) 및 이 DNA에서의 센스 쇄에 대한 상보쇄(안티센스 쇄)로 된 단일가닥 DNA, 더욱이는 이들 DNA의 단편, 통상, 연속하는 10개 이상, 바람직하게는 12개 이상, 보다 바람직하게는 15개 이상, 더욱 바람직하게는 20개 이상의 염기로 된 단편 등을 가진 DNA를 유리하게 이용할 수 있다. 예컨대 게노믹 라이브러리의 검색에서는 상기한 바와 같은 DNA 혹은 그 단편을, 필요에 따라 방사성 물질, 효소, 디곡시게닌(digoxigenin) 등으로써 적당히 표지하여, 이것을 하이브리다이제이션 프로브로서 사용하고, 게노믹 라이브러리에 대해 하이브리다이제이션법을 실시하여 이 프로브와 현저한 하이브리다이제이션을 나타낸 게노믹 클론으로부터 DNA를 채취함으로써 본 발명의 DNA를 얻을 수가 있다. 그리고 PCR법을 실시할 경우에는 이상과 같은 DNA의 단편을 함유한 올리고뉴클레오티드를 PCR 프라이머(센스프라이머 및/또는 안티센스프라이머)로서 사용하여 통상적인 방법에 따라 PCR을 하여 현저하게 증폭된 DNA를 채취하면 본 발명의 DNA가 얻어진다. 더욱이 필요에 따라 이들 수법은 적절히 조합하여 실시할 수도 있다. 그리고 본 발명의 DNA는 본 발명이 개시하는 DNA의 염기서열에 따라 관용적인 화학 합성법을 실시함에 의해서도 얻을 수가 있다.

본 발명의 DNA는 폴리펩티드의 제조, 보다 상세하게는 L-리보오스 이소메라아제 활성을 가진 폴리펩티드의 재조합 DNA 기술에 의한 제조에서 유리하게 이용할 수 있어, 본 발명은 이러한 제조방법을 제공하는 것이기도 하다. 본 발명에 의한 폴리펩티드의 제조방법은, 본 발명의 DNA를 인위적으로 발현시켜 L-리보오스 이소메라아제 활성을 가진 폴리펩티드를 생성시키는 공정과, 생성한 이 폴리펩티드를 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 DNA를 인위적으로 발현시키자면, 예컨대 통상적인 방법에 의한 인 비트로에서의 DNA의 발현(인 비트로 전사 및 인 비트로 번역)을 이용하는 것도 가능하다 하더라도, 목적으로 하는 폴리펩티드의 공업적 제조를 전제로 할 경우, 본 발명의 DNA로써 숙주세포를 형질전환해서 되는 형질전환체의 배양에 의해 실시하는 것이 비교적 바람직하다.

본 발명의 제조방법에서 사용하는 형질전환체는, 통상, 본 발명의 DNA를 자율복제 가능한 벡터와 연결하여 재조합 DNA로 하고, 이 재조합 DNA를 적당한 숙주에 도입함으로써 얻을 수가 있다. 자율복제 가능한 벡터는 숙주의 종류에 따라 관용적인 것으로부터 적절히 선택할 수 있는데, 구체적으로는 pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), pUB110, pTZ4, pC194, pHV14, TRp7, YEp7, pBS7 등의 플라스미드 벡터, 혹은 λgtㆍλC, λgtㆍλB, ρ11, φ1, φ105 등의 파아지 벡터를 들 수 있다. 이 중에서 본 발명의 DNA를 대장균에서 발현시키자면, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBR322, Bluescript II SK(+), gtㆍλC 및 λgtㆍλB 등이 적합하다. 한편, 고초균에서 발현시키자면, pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, φ1 및 φ105가 적합하다. pHV14, TRp7, YEp7 및 pBS7은 재조합 DNA를 2종 이상의 숙주 내에서 복제시킬 경우에 유용하다. 이상과 같은 복제가능한 벡터는, 통상, 포로모우터, 인핸서, 복제 기점, 전사종결 부위, 선택서열 등의, 본 발명의 DNA가 개개의 숙주에서 발현하기 위한, 혹은 소기의 형질전환의 유무를 확인하기 위한 적당한 염기서열을 포함해서 된다. 이상과 같은 벡터와의 연결에는 이 분야에서의 관용의 방법을 적절히 채용할 수가 있다. 예컨대 링커(linker)의 부가나 PCR법 등에 의한 제한효소 인식서열의 부가, 제한효소 처리 및 리가아제 처리 등의 어느 것이라도 유용하다.

상기한 바와 같은 본 발명에 의한 DNA를 도입하는 숙주세포로서는, 형질전환세포의 작제시에 이 분야에서 관용되는 대장균, 고초균, 효모, 곰팡이 등의 적당한 미생물이나, 더욱이는 곤충 등의 무척추 동물, 식물, 척추동물 등의 세포는 어느 것이라도 사용할 수가 있다. 폴리펩티드를 보다 저렴하게 제공하기 위해서는 대장균이나 고초균 등의 미생물을 숙주로 하는 것이 비교적 바람직하다. 이상과 같은 숙주에 본 발명의 DNA를 도입하자면, 예컨대 인산 칼슘법, 일렉트로포레이션법, 바이러스 감염법, 더욱이는 필요에 따라 DEAE-덱스트란법, 리포펙션법, 마이크로-인젝션법 등을 적절히 적용하면 좋다. 이렇게 하여 생성되는 형질전환체로부터 소기의 클론을 선택하기 위해서는 도입된 DNA의 유무 및 폴리펩티드의 산생능을 지표로 하여 시험하면 좋다. 더욱이 이상 설명한 재조합 DNA 및 형질전환체에 관해서는 문헌[J. Sambrook et al, in the 2nd Edition of Molecular Cloning, a laboratory manual (Cold Spring Harbor Lab. 1989)]에 관용적인 재료 및 방법이 여러가지 상세히 설명되어 있다.

이상과 같이 하여 얻어지는 형질전환 세포는 숙주의 종류와 DNA의 도입시에 사용한 벡터의 구조에 따라, 필요시에 적당한 유도자극을 가하는 등의 조건하에서 배양하면 그 세포내 혹은 세포외에 L-리보오스 이소메라아제 활성을 가진 폴리펩티드를 산생한다. 배양에 사용하는 배지로서는 숙주세포나 벡터의 종류에도 따른다 하더라도, 통상, 탄소원, 질소원, 미네랄, 더욱이는 필요에 따라 아미노산이나 비타민 등의 미량 영양소를 보충한 통상 일반적인 배지를 사용할 수가 있다. 개개의 탄소원으로서는, 예컨대 전분, 전분 가수 분해물, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 트레할로오스 등의 당원(糖源)을 들 수 있고, 그리고 질소원으로서는, 예컨대 암모니아 내지 암모니아염, 요소, 질산염, 펩톤, 효모 엑스, 탈지 대두, 콘 스팁 리커, 육(肉) 엑스 등의 함질소 무기물 내지 유기물을 들 수 있다. 배양조건은 숙주세포나 벡터의 종류에도 따른다 하더라도, 통상, 온도 20 내지 60℃, pH 2 내지 10으로 유지하면서 통기교반 등에 의한 호기적 조건하에서 약 1 내지 6일 동안 배양하면 L-리보오스 이소메라아제 활성을 가진 폴리펩티드를 함유한 배양물이 얻어진다.

상기한 공정에서 산생된 폴리펩티드는 목적에 따라 그대로의 형태로 사용할 수도 있으나, 필요에 따라 정제하여 이용할 수도 있다. 정제로서는 염석, 투석, 여과, 농축, 분별침전, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 등전점 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 겔 전기영동, 등전점 전기영동 등, 단백질의 정제방법으로서 이 분야에서 관용의 방법이면 어느 것이라도 적절히 이용할 수 있다. 그리고 이상과 같은 정제방법에 의해 생성하는 획분을 폴리펩티드의 아미노산 서열이나 분자량, L-리보오스 이소메라아제 활성 등의 성질에 대해 시험하여 소기의 성질을 나타낸 획분을 채취하면 소망의 레벨까지 정제된 소기의 폴리펩티드가 얻어진다.

이렇게 하여 얻어지는 L-리보오스 이소메라아제 활성을 가진 폴리펩티드는 동일한 특허 출원인에 의한 일본국 특개 평10-155480호 공보에 개시된 L-리보오스 이소메라아제와 마찬가지로 L-리보오스 이소메라아제 활성을 가진 외에도, 통상, D-릭소오스(lyxose), D-탈로오스, D-만노오스, L-알로오스(allose) 및L-굴로오스(gulose) 등의 각종 알도오스의 이성화 반응을 촉매하는 활성을 겸비하고 있다. 더욱이 본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 폴리펩티드는 천연형의 효소의 제조, 즉 L-리보오스 이소메라아제를 산생할 수 있는 능력을 본래적으로 가진 미생물로부터 이 효소를 제조할 경우에 비하여 비교적 저렴하게 제공할 수 있다는 이점도 가지고 있다. 따라서 본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 폴리펩티드는 L-리보오스나 D-탈로오스 등의, 유용하면서도 이제까지 희소한 것으로 되어 있었던 당질을 공업적으로 제조함에 있어서 극히 유용하다.

그런데 본 발명의 DNA나 이 DNA에서의 안티센스 쇄로 된 단일가닥 DNA 및 이들의 단편은 L-리보오스 이소메라아제와 구조상 관련이 있는 다른 효소의 검색에도 극히 유용하다. 즉 본 발명의 DNA의 입수를 위한 하이브리다이제이션법이나 PCR법에 준하여 각종 공급원으로부터 조제된 염색체 DNA를 검색함으로써 L-리보오스 이소메라아제와 구조적으로 유사한 한편, 이 효소와는 다른 활성을 가진 신규 효소를 코드하는 DNA가 얻어질 가능성이 있다. 이 경우, 하이브리다이제이션 프로브와 염색체 DNA의 하이브리다이제이션, 혹은 PCR 프라이머와 염색체 DNA의 어닐링을 일으키게 하는 조건[엄밀함, 스트린젠시(stringency)]을 적절히 조정하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 하이브리다이제이션 혹은 어닐링의 스트린젠시는 일반적으로 그 환경의 온도 및 이온강도에 의해 좌우된다. 문헌[J. Sambrook et al, in the 2nd Edition of Molecular Cloning, a laboratory manual (Cold Spring Harbor Lab. 1989)]에는 스트린젠시의 결정에 관한 이들 요인에 대해 상세히 설명되어 있다. 이러한 기재를 참조하여 스트린젠시가 상이한 여러가지 환경하에서 하이브리다이제이션 혹은 PCR법을 실시함으로써 L-리보오스 이소메라아제와의 구조상의 관련의 정도가 다른 여러가지 DNA를 얻을 수가 있다. 그리고 이상과 같은 검색의 결과 얻어지는 DNA를 관용적인 재조합 DNA 기술에 따라 발현시키고, 그 발현 산물의 활성을 조사함으로써 본 발명에 의한 것과는 다른 희소 당질의 제조에 이용할 수 있는 신규 효소가 얻어질 가능성이 있다. 그리고 본 발명의 개시에 근거한 L-리보오스 이소메라아제의 구조와 기능에 대한 해석 및 상기한 바와 같이 얻을 수 있는 신규 효소의 구조와 기능에 대한 해석을 조합함으로써 기질 특이성의 개변(改變) 및 효소학적 성질의 개선 등을 목적으로 한 분자설계를 달성할 수 있는 가능성도 있다. 따라서 본 발명의 DNA, 이 DNA에서의 안티센스 쇄로 된 단일가닥 DNA 및 이들 DNA의 단편은 L-리보오스 이소메라아제와 구조적으로 관련이 있는 신규 효소의 검색에서 현저한 유용성을 발휘한다고 할 수 있다.

이하, 실시예를 따라 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

실시예 1: L-리보오스 이소메라아제를 코드하는 DNA

실시예 1-1: 아시네토박터 칼코아세티커스 LR7C의 염색체 DNA 제조

문헌[T. Shimonishi et al, Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 81, 493-497 (1996)]에 기재된 방법에 따라 아시네토박터 칼코아세티커스 LR7C(FERM BP-5335)를, D-릭소오스 유일한 탄소원으로 함유하는 무기염 배지(D-릭소오스 무기염 배지) 중에서 28℃에서, 24 시간마다 신선한 동일 배지에 계속 접종하는 조작을 3회 반복하여 종(種)배양물을 얻었다. 이 종배양물을 0.5 w/v% 효모엑스, 0.5 w/v% 폴리펩톤, 0.5 w/v% 식염을 함유하는 효모 엑스 배지(pH 7.0) 100 ml에 접종하고, 28℃에서 하루밤 통기교반 배양하였다. 이 배양물을 원심분리하고, 이 미생물의 균체를 채취하였다. 채취한 균체를 통상적인 방법에 따라 리소자임 처리한 후, -80℃에서 동결시키고, 그 후 60℃에서 융해시킴으로써 균체를 파쇄하였다. 이 균체 파쇄물을 통상적인 페놀추출에 사용하여 생성한 물상(water phase)을 채취하였다. 이 물상을 통상적인 에탄올 침전에 사용하여 조(粗)염색체 DNA 획분을 침전으로서 얻었다. 얻어진 조염색체 DNA 획분을 통상적인 방법에 의해 리보뉴클레아제 및 프로티나아제(proteinase)로써 처리하였다. 이 처리물을 통상적인 클로로포름-이소아밀 알코올 추출에 사용하고, 이어서 에탄올 침전에 사용하여 염색체 DNA를 침전시켰다. 이 침전부를 멸균 증류수에 DNA 농도 1 mg/ml가 되도록 용해하여 아시네토박터속 미생물의 염색체 DNA의 정제 표품(標品)을 수용액으로 얻었다.

실시예 1-2:하이브리다이제이션 프로브

동일한 특허 출원인에 의한 일본국 특개 평10-155480호 공보에 개시된, 아시네토박터속 미생물로부터 단리한 L-리보오스 이소메라아제의 N 말단 아미노산 서열을 본 명세서의 서열표에서의 서열번호 4에 나타내었다. 이 아미노산 서열은 그 N 말단에 개시 코돈에 대응하는 메티오닌을 가지고 있지 않다. 따라서, 본 발명자들은 아시네토박터속 미생물의 L-리보오스 이소메라아제 유전자는, 서열번호 4에 나온 아미노산 서열의 N 말단에 메티오닌이 부가된 서열에 대응하는 염기서열을 그 코드 영역의 5' 말단부에 가지며, 그리고 아시네토박터속 미생물의 L-리보오스 이소메라아제는 이 유전자의 1차 발현 산물로부터 N 말단의 메티오닌이 제거된 폴리펩티드로 구성되는 것이라는 가설을 세웠다. 이 가설에 근거하여 PCR용의 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 설계하였다. 여기서 설계한 센스 프라이머의 염기서열은 서열표에서의 서열번호 5 및 6에 나온 바와 같고, 안티센스 프라이머의 염기서열은 서열표에서의 서열번호 7 및 8에 나온 바와 같다. 서열번호 5 및 6에 나온 5' 말단의 ATG가 상기한 가설에 의한 메티오닌에 대한 유전암호이다.

상기한 설계에 따라 통상적인 화학 합성법에 의해 얻은 센스 및 안티센스 프라이머와 실시예 1-1에서 조제한 염색체 DNA의 정제 표품을 주형으로 사용하고, Taq DNA 폴리머라아제(일본국의 寶酎造주식회사 판매)를 사용하여 표준적인 PCR의 조건하에서 1개의 계(系)에서 PCR을 하였다. 그 결과, 약 70 bp의 쇄 길이(chain length)의 DNA의 증폭이 관찰되었다. 이 증폭된 DNA를 통상적인 방법에 의해 플라스미드 벡터 pUC119에 클론화하고 염기서열을 해독하였다. 그 결과, 증폭된 DNA는 아시네토박터속 미생물로부터 단리한 L-리보오스 이소메라아제의 N 말단 아미노산 서열(서열번호 4)과 좋은 대응을 나타내는 68 염기로 된 것이어서 목적으로 하는 유전자의 클로닝을 위한 프로브로서 사용할 수 있다고 판단하였다. 따라서, 이어서 디곡시게닌(일반적으로 "DIG"라고도 함)으로 표지한 데옥시-UTP (DIG-11-dUTP)를 DNA의 3' 말단에 부가하기 위한 시판의 키트(독일국의 Boehringer Mannheim사 판매)를 사용하여 이 PCR에 의한 68 염기로 된 DNA를 DIG 표지하여 하이브리다이제이션 프로브를 얻었다.

실시예 1-3: 아시네토박터속 미생물의 게노믹 라이브러리 제조

실시예 1-1에서 얻은 염색체 DNA의 정제 표품 약 1 ㎍을 통상적인 방법에 의해 제한효소 SacI로써 부분소화하였다. 이 부분 소화물을 0.7(w/v%) 아가로오스 겔을 사용하는 전기영동에 의해 분리하였다. 분리된 DNA 부분 소화물을 표준적인 서어든 블로팅 조건에 따라 나일론막에 전사한 후, 실시예 1-2에서 조제한 프로브를 사용하여 하이브리다이제이션법에 사용하였다. 이 하이브리다이제이션 조작 후에 프로브에 의한 하이브리다이제이션의 유무를 항(抗)DIG 항체를 사용하는 면역학적 수법으로 조사하였다. 그 결과, 쇄의 길이 약 1.2 kb에 상당하는 위치에서 프로브에 의한 특이적 하이브리다이제이션을 나타내는 현저한 시그날이 관찰되었다. 이 결과에 근거하여 아시네토박터속 미생물의 게노믹 라이브러리를 작성하였다. 즉, 먼저, 상기에 준하여 염색체 DNA를 부분 소화하고 아가로오스 겔 전기영동 처리하여 쇄 길이 약 1.2 kb에 상당하는 획분을 통상적인 방법에 의해 이 겔로부터 추출, 정제하였다. 이 획분의 DNA 단편을 통상적인 방법에 의해 플라스미드 벡터 pUC119 (ATCC 37461)의 클로닝 사이트에 삽입한 후, 대장균주 DH5(ATCC 53868)에 도입하여 목적으로 하는 게노믹 라이브러리를 얻었다.

실시예 1-4: 게노믹 라이브러리의 검색과 L-리보오스 이소메라아제를 코드하는 DNA의 클론화

실시예 1-3에서 얻은 아시네토박터속 미생물의 게노믹 라이브러리의 약 5000 클론을 100 mg/L 앰피실린을 함유한 L 한천배지에 접종하고, 37℃에서 하루밤 배양하였다. 이 배지 위에 생성한 콜로니를 통상적인 방법에 의해 나일론막 위에 전사하여 고정하였다. 이 나일론막을, 실시예 1-2에서 조제한 프로브를 사용하여 표준적인 조건하에서 콜로니 하이브리다이제이션법에 사용하여 프로브에 의한 하이브리다이제이션의 유무를 항DIG 항체를 사용하는 면역학적 수법에 의해 조사하였다. 그 결과, 검색의 대상으로 한 5000 클론 중에서 4 클론에 대해 프로브가 하이브리다이즈했음이 확인되었다. 이들 양성 클론을 채취하여 통상적인 방법에 의해 각각으로부터 플라스미드 DNA를 채취하여 개개의 플라스미드 DNA에서의 삽입 DNA의 염기서열을 디데옥시법에 의해 해독한 결과, 4개의 양성 클론에 대해서의 해독결과는 완전히 일치하였다. 이렇게 하여 해독된 염기서열을 서열표에서의 서열번호 3에 나타내었다. 서열번호 3에 병기한 바와 같이 이 해독된 염기서열은 메티오닌으로부터 시작하는 249개의 아미노산으로 된 서열을 코드하는 것이었다. 이 서열번호 3의 염기서열에 코드되는 아미노산 서열에서의 N 말단으로부터 제 2 내지 제 27의 아미노산으로 된 부분의 서열은 아시네토박터속 미생물로부터 단리한 L-리보오스 이소메라아제의 N 말단 아미노산(서열번호 4)과 완전히 일치하였다. 이 결과로부터 본 실시예에서 얻은 4개의 양성 클론을 아시네토박터속 미생물의 L-리보오스 이소메라아제를 코드하는 DNA의 클론(아시네토박터속 미생물의 L-리보오스 이소메라아제 유전자의 클론)인 것으로 확인하였다.

위에 나온 염기서열의 해독결과는 아시네토박터속 미생물의 L-리보오스 이소메라아제 유전자가 코드 영역의 염기서열로서 서열표에서의 서열번호 3에 나온 개시 코돈으로부터 종결 코돈에 이르는 750 염기로 된 서열을 가지므로 L-리보오스 이소메라아제 활성을 나타내는 아미노산 서열의 코드에는 서열번호 3의 염기서열의 전부는 반드시 필요하지는 않고, 이 염기서열로부터 개시 코돈 및 종결 코돈을 제거한 서열, 즉 서열번호 2에 나온 744 염기로 된 서열이 있으면 충분하다는 것을나타내고 있다. 그리고 본 실시예에 나온 결과는 아시네토박터속 미생물이 산생하는 L-리보오스 이소메라아제가, 통상, 서열표에서의 서열번호 2에 나온 염기서열에 코드되는 아미노산 서열, 즉 서열번호 1에 나온 아미노산 서열의 폴리펩티드를 가진 것을 나타내고 있어, 이로부터 실시예 1-2에 나온 본 발명자들에 의한 가설이 뒷받침되었다.

실시예 2: 재조합 DNA 기술에 의한 L-리보오스 이소메라아제 활성을 가진 폴리펩티드의 제조

실시예 2-1: 재조합 DNA 및 형질전환체의 조제

실시예 1-4에서 얻은 양성 클론 중의 하나로부터 통상적인 방법에 의해 플라스미드 DNA를 채취하였다. 이 플라스미드 DNA를 제한효소 EcoR I 및 Pst I로써 소화함으로써 이 플라스미드 DNA로부터 서열표의 서열번호 3에 나온 염기서열을 가진 삽입 DNA를 유리시켰다. 이어서 유리한 DNA와 제한효소 EcoR I 및 Pst I로써 소화해둔 플라스미드 벡터 pUC118(ATCC 37462)을 리가아제를 사용하여 연결하여 재조합 DNA를 얻었다("p8IR"로 명명하였음). 이 재조합 DNA "p8IR"를 대장균주 JM109 (ATCC 53323)에 도입하여 형질전환체를 얻었다.

실시예 2-2: 형질전환체에 의한 L-리보오스 이소메라아제 활성을 가진 폴리펩티드의 산생

실시예 2-1에서 얻은 재조합 DNA "p8IR"를 함유한 형질전환체를, 100 mg/L 앰피실린을 함유한 LB 브로드(broth) 2L에 접종하고, 37℃에서 교반배양하였다. 이 배양은 배양액의 탁도(파장 600 nm의 가시광의 셀폭 1 cm의 셀에서 구한 흡광도)를관찰하면서 실시하였다. 탁도가 0.7에 달한 시점에서 배양액에 5-브로모-4클로로-3-인돌릴-β-갈락토시드를 농도 1 mM이 되도록 첨가한 후에 배양을 약 5 시간 계속하였다.

상기한 배양물로부터 균체를 10,000 ×g에서 10 분간 원심분리에 의해 회수하였다. 이 균체를 글리신-수산화나트륨 완충액(pH 9.0)으로 2회 세정한 후, 산화 알루미늄 존재하에 유발(乳鉢)과 유봉(乳棒)을 사용하여 균체를 파쇄하였다. 이 파쇄물을 글리신-수산화나트륨 완충액(pH 9.0)에 현탁하고, 현탁물로부터 균체파편을 10,000 ×g에서 30 분간 원심분리에 의해 제거하였다. 이렇게 하여 얻은 균체 조(粗)추출물을 L-리보오스 이소메라아제 활성의 측정에 사용한 결과, 소기의 활성이 관찰되고, 상기한 배양물당으로 환산하면 약 1.5 단위/ml로 산출되었다. 한편, 재조합 DNA "p8IR"를 함유한 형질전환체 대신에, 플라스미드 벡터 pUC118로써 형질전환한 대장균주 JM109를 사용하여 본 실시예와 마찬가지로 배양 및 균체의 파쇄, 추출을 한 결과, L-리보오스 이소메라아제 활성은 검출되지 않았다. 이상의 결과는 실시예 1에서 클론화하여 염기서열을 결정한 DNA가 L-리보오스 이소메라아제를 코드하는 것임을 뒷받침하고 있다.

실시예 3: L-리보오스 이소메라아제 활성을 가진 폴리펩티드 제조

동일한 특허 출원인에 의한 일본국 특개 평10-155480호 공보에 기재된 방법에 준하여 실시예 2-3에서 얻은 균체 조추출물로부터 L-리보오스 이소메라아제 활성을 가진 폴리펩티드를 폴리에틸렌글리콜 분획, 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

상기한 정제 폴리펩티드를 통상적인 방법에 의해 SDS-PAGE에 사용한 결과, 분자량 약 28,000 달톤의 위치에서 단일의 단백질 밴드를 나타내었다. 이 결과는, 동일한 특허 출원인에 의한 일본국 특개 평10-155480호 공보에 개시된 아시네토박터속 미생물로부터 단리한 L-리보오스 이소메라아제의 SDS-PAGE에 의한 분자량 약 25,000 내지 약 35,000 달톤과 잘 일치하는 것이다.

상기한 정제 폴리펩티드의 효소학적 성질을 L-리보오스 이소메라아제 활성을 지표로 하여 그 활성 측정법에 준하여 조사하였다. 최적온도는 pH 9.0에서 10 분간 반응의 조건하에서 약 30℃이었다. 온도 안정성은 pH 9.0에서 10 분간 유지의 조건하에서 약 30℃ 이하에서 안정하였다. 최적 pH는 30℃에서 10 분간 반응의 조건하에서 pH 약 8 내지 9이었다. pH 안정성은 4℃에서 24 시간 유지의 조건하에서 pH 약 7 내지 약 9의 범위에서 안정하였다. 그리고 L-리보오스 이소메라아제 활성 측정법에 준하여 L-리보오스 대신에 D-릭소오스 및 D-만노오스에 상기한 정제 폴리펩티드를 작용시킨 결과, 각각으로부터 D-크실룰로오스(xylulose) 및 D-프룩토오스의 생성이 확인되었다. 이 결과는 본 실시예에 의한 폴리펩티드가 L-리보오스의 이성화 반응뿐만 아니라 D-릭소오스 및 D-만노오스의 이성화 반응을 촉매하는 것을 나타내고 있다. 이상의 결과도 동일한 특허 출원인에 의한 일본국 특개 평10-155480호 공보에 개시된 아시네토박터속 미생물로부터 단리한 L-리보오스 이소메라아제의 효소학적 성질과 잘 일치하는 것이다.

이상의 것은 본 발명의 DNA를 사용하여 얻어지는 폴리펩티드가 미생물이 본래적으로 산생하는 L-리보오스 이소메라아제와 마찬가지로 각종 희소 당질의 공업적 제조에 유리하게 이용할 수 있음을 뒷받침하고 있다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 L-리보오스 이소메라아제를 코드하는 신규한 DNA의 본 발명자들에 의한 클로닝에 근거하여 된 것이다. 본 발명의 DNA는 재조합 DNA 기술의 적용에 의하여 L-리보오스나, 더욱이는 D-탈로오스 등의 희소 당질의 공업적 제조에 유용한 효소를 종래보다 저렴하고도 일정한 품질로 제공하는 것을 가능하게 하는 것이다. 그리고 본 발명의 DNA 혹은 그 단편을 하이브리다이제이션 프로브 혹은 PCR 프라이머 등으로서 이용함으로써 각종 미생물을 비롯한 세포의 염색체를 검색하여 더욱 신규한 효소를 입수할 수 있는 가능성이 있다. 따라서 본 발명의 DNA 및 그 단편은 신규 당질관련 효소의 검색에 있어서도 특히 유용하다.

이렇게도 유용한 본 발명은 식품분야, 의약품 분야를 비롯한 여러가지 분야에서 공헌하는 바 실로 다대한 의의가 있는 발명이라 할 수 있다.

Claims (13)

1. L-리보오스로부터 L-리불로오스로의 이성화 반응 및 L-리불로오스로로부터 L-리보오스로의 이성화 반응을 촉매하는 L-리보오스 이소메라아제를 코드하는 DNA.
2. 제1항에 있어서, 상기 L-리보오스 이소메라아제가 서열표에서의 서열번호 1에 나온 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 것인 DNA.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열표에서의 서열번호 2에 나온 염기서열의 일부 또는 전부를 포함하는 DNA.
4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 아시네토박터속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있는 DNA.
5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 기재한 DNA의 단편으로서의 DNA, 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 기재한 DNA에서의 센스 쇄에 대한 상보쇄로 된 단일가닥 DNA 및 이 단일가닥 DNA의 단편으로서의 DNA로부터 선택되는 DNA.
6. 제5항에 기재한 DNA를 포함하는 하이브리다이제이션 프로브 또는 PCR 프라이머.
7. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 기재한 DNA를 포함하는 재조합 DNA.
8. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 기재한 DNA 또는 이 DNA를 포함하는 재조합 DNA로써 숙주세포를 형질전환하여 되는 형질전환체.
9. 제8항에 있어서, 숙주세포가 미생물인 형질전환체.
10. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 기재한 DNA를 인위적으로 발현시켜 L-리보오스로부터 L-리불로오스로의 이성화 반응 및 L-리불로오스로부터 L-리보오스로의 이성화 반응을 촉매하는 활성을 가진 폴리펩티드를 생성시키는 공정과, 생성한 이 폴리펩티드를 채취하는 공정을 포함하는 폴리펩티드의 제조방법.
11. 제10항에 있어서, 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 기재한 DNA 또는 이 DNA를 포함하는 재조합 DNA로써 숙주세포를 형질전환해서 되는 형질전환체를 배양하고, 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 기재한 DNA를 인위적으로 발현시키는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조방법.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 생성한 폴리펩티드를 투석, 염석, 여과, 농축, 분별침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동으로 된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 정제방법에 의해 채취하는 폴리펩티드의 제조방법.
13. 제10항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 기재한 폴리펩티드의 제조방법에 의하여 얻어지는 폴리펩티드.