CN113151377A - 一种从葡萄糖到氨基葡萄糖的酶法制备方法与酶用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从葡萄糖到氨基葡萄糖的酶法制备方法，属于生物工程技术领域。该方法以葡萄糖为底物来制备氨基葡萄糖，包括联用生物酶，或者表达所述联用生物酶的表达载体或克隆载体、或者表达所述联用生物酶的转基因细胞系、或者表达所述联用生物酶的基因工程菌；优选己糖激酶、6‑磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖6‑磷酸脱磷酶共四种生物酶联用。本发明还涉及酶的用途。本发明方法技术路线简洁，方法所涉及的底物来源充足，不受原材料限制，制备条件温和，环境污染小，且反应专一性高，体系中杂质少易于下游分离纯化，生产成本低。可以将葡萄糖逐步合成氨基葡萄糖，在氨基葡萄糖的制备中具有较大的工业应用潜力。

Description

一种从葡萄糖到氨基葡萄糖的酶法制备方法与酶用途

技术领域

本发明涉及一种从葡萄糖到氨基葡萄糖的酶法制备方法及该制备方法中所用生物酶的种类，属于生物工程技术领域；本发明还涉及酶的用途。

背景技术

氨基葡萄糖（Glucosamine, GlcN），即2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，又称葡萄糖胺、氨基葡糖或简称为葡糖胺、氨糖，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，又是一种重要的功能单糖。在自然界中，氨基葡萄糖大量存在于原核、真核、植物的细胞壁以及动物的骨骼之中。氨基葡萄糖为针状晶体，安全无毒，易溶于水，无特殊气味，是多种抗生素的组分，可在人体中合成，通常以N-乙酰基衍生物或胞壁酸的形式存在动物及微生物来源的多糖中。氨基葡萄糖的稳定性与pH有关，在室温环境下，其可在pH低于4.8的条件下稳定存在，随着pH的升高氨基葡萄糖的稳定性下降。目前市场上氨基葡萄糖主要以氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖硫酸盐及复合盐的形式存在，在室温下可稳定存在，且利于人体的吸收及药品的储存运输。

氨基葡萄糖是一种天然的水溶性单糖，是在人体中含量最丰富的单糖之一。研究表明，氨基葡萄糖具有一些特殊的生理活性功能，如消炎镇痛，修复软骨损伤，治疗风湿性关节炎；强化白细胞增值和分化，促进细胞因子分泌，改善免疫调节、抗肿瘤；恢复线粒体内酶表达，提高线粒体谷胱甘肽抗氧化能力，增强免疫功能；促进内质网相关蛋白讲解，强化蛋白酶活性，改善蛋白稳态水平，延长细胞寿命等。因此，其被广泛应用于医药、食品营养、健康保健及化妆品等领域。据报道，2019年全球氨基葡萄糖市场总额约为50亿美元。随着生活质量的进一步提高以及人口老龄化问题的加剧，氨基葡萄糖类的医药、食品营养保健品的全球需求会持续增加。预计在未来五年内，氨基葡萄糖的全球市场规模会以5%左右的复合年均增长率（Compound annual growth rate, CAGR）上升。

目前市场上氨基葡萄糖的生产方法主要是化学水解法和微生物发酵法。化学水解法生产氨基葡萄糖是以虾蟹壳或真菌细胞壁为原料利用强酸进行酸水解反应，以虾蟹壳中的甲壳素为底物，利用浓盐酸在高温条件下进行水解，经过浓盐酸的水解作用，甲壳素中的糖苷键断裂，酰胺键水解，反应过程中需加入活性炭进行脱色，多次加热溶解与减压蒸馏、结晶与重结晶、粉碎、烘干等步骤，制成成品氨基葡萄糖盐酸盐。在此基础上，利用硫酸钠制备氨基葡萄糖复盐。但利用化学水解法生产氨基葡萄糖需要使用大量强酸，易造成环境污染，反应需高温条件下进行，反应条件苛刻，生产过程中步骤复杂，技术要求高，生产效率低。且该方法的材料来源是虾蟹壳类物质，原料来源受限，用该方法生产出的氨基葡萄糖不适合对海鲜过敏的人群，因此使用范围受限制。

氨基葡萄糖还可以通过微生物发酵法生产，近年来，已经开发出利用经过代谢工程改造过的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及真菌进行氨基葡萄糖的生产。通过菌种的构建改良，对发酵过程进行优化与严格控制，对温度、溶氧、pH、补料等关键问题进行优化，来实现氨基葡萄糖的高效生产。目前，微生物发酵法与化学法相比过程简单，为可再生的生产方法，条件温和，原料来源丰富不受限制，但是发酵周期长，发酵过程控制严苛，终产物氨基葡萄糖浓度低，需结合酸解法转化N-乙酰氨基葡萄糖生产氨基葡萄糖，仍然存在生产效率低和环境污染的问题。

因此，急需开发一种低成本，低污染的生产氨基葡萄糖的新方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种从葡萄糖到氨基葡萄糖的酶法制备方法，它是以葡萄糖为起始底物制备氨基葡萄糖的多个体外生物酶联用的方法，该方法具有原料廉价、来源丰富、生产成本低、环境友好和对人体安全等优点。

本发明的另一个目的是提供了涉及上述方法中所用生物酶的用途。

实现本发明的目的技术方案如下：

本发明是一种从葡萄糖到氨基葡萄糖的酶法制备方法，包括联用生物酶，或者表达所述联用生物酶的表达载体或克隆载体、或者表达所述联用生物酶的转基因细胞系、或者表达所述联用生物酶的基因工程菌；所述联用生物酶的氨基酸序列含有：

1）SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；或者

2）在1）限定的氨基酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的活性的酶的氨基酸序列。

以上所述的本发明方法，其进一步优选的技术方案是：所述酶为己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶。

以上所述的本发明方法，其进一步优选的技术方案是：所述酶的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示的序列。

以上所述的本发明方法，其进一步优选的技术方案是：所述基因工程菌为重组大肠杆菌基因工程菌。

以上所述的本发明方法，其进一步优选的技术方案是：所述催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的方法，包括制备氨基葡萄糖的方法或者用于制备6-磷酸葡萄糖、氨糖-6-磷酸或者6-磷酸果糖的方法。

本发明所述的方法中，优选的氨基葡萄糖的合成反应方法是：

在反应器中，加入葡萄糖， pH7.0HEPES缓冲液，氯化镁，谷氨酰胺，EDTA，各原料的摩尔浓度比为，葡萄糖：HEPES缓冲液：氯化镁：谷氨酰胺：EDTA＝1： 90－110：9－11：13－17：2－3；对反应器进行加热，当反应器内温达到40℃时，控制加热速率，使得反应器内温在40℃-50℃之间，加入的适量的己糖激酶，反应过程中，补加葡萄糖，控制反应液中葡萄糖浓度，直到葡萄糖浓度不变为止；再加入适理的 6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶；直到反应液中产生的氨基葡萄糖没有变化为止；所加入的酶的单位比为：己糖激酶：6-磷酸葡萄糖异构酶：氨基葡萄糖合酶：氨糖-6-磷酸脱磷酶＝10：20－30：10－20：8－12。

各原料的摩尔浓度比为进一步成选为，葡萄糖：HEPES缓冲液：氯化镁：谷氨酰胺：EDTA＝1： 100：10：15：2.5；所加入的酶的单位比为：己糖激酶：6-磷酸葡萄糖异构酶：氨基葡萄糖合酶：氨糖-6-磷酸脱磷酶＝10：25：16：10。

本发明还公开了一种葡萄糖合成或转化氨基葡萄糖的方法：合成或转化氨基葡萄糖的底物为葡萄糖；所述方法包括利用如下（1）至（6）中任意一组或多组的生物酶：

（1）己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶；

（2）编码己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的基因；

（3）含有所述己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的编码基因的蛋白；（4）含有所述己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的编码基因的表达载体或克隆载体；

（5）含有所述己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的编码基因的转基因细胞系；

（6）含有所述己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的编码基因的基因工程菌；

所述生物酶的氨基酸序列含有：

1）SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；或者

2）在1）限定的氨基酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的活性的酶的氨基酸序列。

在一种优选的实施方式中，所述合成/转化，是在含有底物葡萄糖的环境下，在pH为6-8，温度为30-50 °C的条件下进行合成/转化。所述合成/转化环境的最优pH为7.0，温度为45 °C。

本发明还公开了如以上制备方法技术方案中涉及的联用生物酶的用途：该用途为将联用生物酶用于催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的酶，所述联用生物酶的氨基酸序列含有：

1）SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；或者

2）在1）限定的氨基酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的活性的酶的氨基酸序列。

优选的本发明用途中：联用生物酶的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示的序列。

优选的本发明用途中：所述催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的方法，包括制备氨基葡萄糖的方法或者用于制备6-磷酸葡萄糖、氨糖-6-磷酸或者6-磷酸果糖的方法。

优选的本发明用途中：所述的联用生物酶选自下述（1）至（6）中任意一组或多组的生物酶：

（1）己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶；

（2）编码己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的基因；

（3）含有所述己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的编码基因的蛋白；（4）含有所述己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的编码基因的表达载体或克隆载体；

（5）含有所述己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的编码基因的转基因细胞系；

（6）含有所述己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的编码基因的基因工程菌。

本发明制备方法中，所述重组大肠杆菌基因工程菌，优选是以大肠杆菌BL21，DH5α或Top10为宿主构建得到的，进一步优选地，宿主为大肠杆菌BL21。表达载体优选pCold Ⅱ、pCold Ⅰ或pUC19。最优选的方案是：所述重组大肠杆菌基因工程菌，是以pCold Ⅱ构建重组表达载体、以大肠杆菌BL21为宿主而构建得到的。重组大肠杆菌基因工程菌的构建方法包括：

（1）通过NCBI（National Center for Biotechnology Information）数据库寻找己糖激酶（Hexokinase）、6-磷酸葡萄糖异构酶（6-phosphate glucose isomerase）、氨基葡萄糖合酶（Glucosamine synthase）和氨糖-6-磷酸脱磷酶（Glucosamine 6-phosphatedephosphorase）基因。 找到符合相对应底物的生物酶的基因后，交由生物公司进行基因合成，从而得到上述四种酶基因；

（2）选取大肠杆菌表达载体pCold Ⅱ，将扩增得到的上述四种基因分别连接到表达载体上，构建重组表达载体pCold Ⅱ-ota3，将重组表达质粒pCold Ⅱ-ota3转化大肠杆菌BL21，筛选阳性转化子并测序验证。

优选的一种利用重组菌生产酶的方法包括：将电转化线性化重组表达质粒pColdⅡ-ota3的阳性重组大肠杆菌BL21/ pCold Ⅱ-ota3在37°C、200rpm条件下培养至OD₆₀₀=0.4-0.6，随后转入15 °C培养并加入终浓度为0.4 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)，诱导表达24 h，转速200 rpm。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明方法利用生物酶法的制备方法，以葡萄糖为底物制备氨基葡萄糖。其中首次涉及到己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖6-磷酸脱磷酶共四种生物酶联用。该技术路线简洁，方法所涉及的底物来源充足，不受原材料限制，制备条件温和，环境污染小，且反应专一性高，体系中杂质少易于下游分离纯化，生产成本低。

2、本发明中，通过基因合成的方法对上述四种生物酶进行了基因序列合成，并构建于质粒pCold Ⅱ中，储存于大肠杆菌JM109中。利用大肠杆菌BL21成功高可溶性表达分别获得了上述四种生物酶蛋白，并对表达的四种生物酶蛋白进行了纯化。对所获得的四种重组酶进行了生物活性验证，发现依次通过上述四种生物酶，可以将葡萄糖逐步合成氨基葡萄糖。并通过数据表明上述四种重组生物酶联用具有很好地合成氨基葡萄糖的功能，并具有较大应用潜力。

具体实施方式

虽然本发明已以较佳实施例公开如下，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1 己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶基因的获得

首先通过NCBI（National Center for Biotechnology Information）数据库寻找己糖激酶（Hexokinase）、6-磷酸葡萄糖异构酶（6-phosphate glucose isomerase）、氨基葡萄糖合酶（Glucosamine synthase）和氨糖-6-磷酸脱磷酶（Glucosamine 6-phosphatedephosphorase）基因。 找到符合相对应底物的生物酶的基因后，交由生物公司进行基因合成。其中合成后的基因序列引入XhoI和 PstI限制性酶切位点（不带信号肽），酶切位点为保护碱基，有效序列为酶切位点后序列。

合成后的基因序列进行转化，即取10μl连接产物加入感受态细胞JM109中，置于冰上30min，42^oC热激90s后立即放在冰上，放置2min后，加入1ml不含抗生素的LB培养基，37^oC摇床培养1h，将转化的菌液涂于LB（Amp）蓝白板上，37^oC培养过夜。在平板上分别挑取多个菌落做PCR鉴定。

同时用到质粒提取，用omega公司的质粒抽提试剂盒提取PCR鉴定为阳性的克隆质粒。

实施例2 己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖6-磷酸脱磷酶四种酶基因的原核表达载体的构建，重组表达及其蛋白表达

1、原核表达载体的构建

（1）引物设计：从信号肽之后的成熟肽序列开始起设计引物（如SEQ ID NO:4和SEQID NO:5所示）

（2）PCR反应，以克隆载体pMD-19T为模板，62^oC退火，35 cycles。

（3）XhoI和PstI双酶切的相应生物酶基因的PCR产物和质粒pCold Ⅱ。

表1 双酶切体系

37 ^oC酶切 2 hr

（4）如常规方法连接，转化，并进行双酶切鉴定。

对这个克隆抽提质粒，从AOX3和AOX5两端进行全长测序，进一步验证了插入的目的基因的正确性。

2、重组质粒在大肠杆菌BL21中的表达

1）转化大肠杆菌及阳性转化子的筛选

据大肠杆菌表达系统操作手册，取10μl连接产物加入感受态细胞DE3中，置于冰上30min，42^oC热激90s后立即放在冰上，放置2min后，加入1ml不含抗生素的LB培养基，37^oC摇床培养1h，将转化的菌液涂于LB（Amp）蓝白板上，37^oC培养过夜。在平板上分别挑取多个菌落做PCR鉴定。以空载体转化菌作对照，进一步验证了目的基因已经转入大肠杆菌BL21。

2）重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达

重组大肠杆菌在25-50 mL LB培养基 (250 mL三角瓶)中培养至OD为0.4-0.6，随后转入15 °C培养并加入终浓度为0.4 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)，诱导表达24 h，转速200 rpm。然后进行超声波破碎菌体并提取重组酶，同时进行培养液的SDS-PAGE和酶活测定。

实施例3：上述四种生物酶蛋白的纯化

重组酶的纯化及其SDS-PAGE凝胶电泳分析

蛋白质纯化参考GE Healthcare指南，SDS-PAGE分析按照《分子克隆实验指南》(第三版)，使用的凝胶浓度为12.5 %，上样量5-25 μL。蛋白质用考马斯亮蓝R-250 染色。

其中native-SDS-PAGE实验步骤：

A、在5-10 μl酶液中加入5-10 μl样品缓冲液[0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HC1），pH 6.8；2 %SDS（重量︰体积），10 ％甘油（体积︰体积），0.01 ％溴酚蓝（重量︰体积）]在37 ^oC水浴中放置5-10 min，再进行上样电泳分离。注：在提取样品时，样品提取液中不加巯基乙醇是为了在电泳过程中使蛋白酶适度变性，以便在电泳结束后能恢复这些蛋白酶的活性。β-巯基乙醇：用于打开二硫键的，使蛋白质的四级或三级结构被破坏。是一种具有特殊臭味的无色透明液体，易燃、易溶于水和醇、醚等多种有机溶剂。

B、制胶与电泳：在制备分离胶的过程中加入0.2 %的明胶，混合均匀后再进行灌胶，凝固后即为Gelatin-SDS-PAGE（底物胶）。“浓缩胶”的聚丙烯酰胺密度为5 %，“分离胶”中聚丙烯酰胺密度为12 %，厚度为1mm³。加样跑电泳。注：明胶因为是在制备凝胶时加入，所以已经交联在凝胶中，在电泳中不会在电场的作用下泳动。

C、去SDS：电泳完成后，将分离胶在复性缓冲液[2 % TritonX-100，50 mmol/LTris-HC1，pH 7.5]中浸洗2-3次，每次5-10 min。

D、复性：将分离胶置于缓冲液[50 mmol/L Tris-HC1，pH7.5]中在37 ^oC下放置进行酶反应3 h。

E、染色与脱色：用考马斯亮蓝染色30 min，然后数小时换一次脱色液（5 ％乙酸+10 ％甲醇），直至背景清晰。注：经染色和脱色处理的凝胶背景颜色为蓝黑色，蛋白酶反应部位颜色变浅。凝胶中呈现蛋白酶反应的区域大小和该部位的透光率与蛋白酶活性成正比。

实施例4：分别纯化后的四种生物酶的活性检测

1、己糖激酶的活性检测

取适量菌体上清液（或者纯化稀释酶液），加入500μL磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液（ 100mM，pH7.0）。其中底物为葡萄糖，生成产物为6-磷酸葡萄糖，己糖激酶活性测定根据己糖激酶活性检测试剂盒说明书。利用公式计算己糖激酶活性。

己糖激酶活性( mU/mg) = B/ ( △T × m) × D

B: 根据NADPH 标曲计算△T 内产生的NADPH; m: 蛋白质含量; D: 稀释倍数。

2、6-磷酸葡萄糖异构酶的活性检测

6-磷酸葡萄糖异构酶活力的测定原理：

由于6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应为可逆反应，即它不仅可以将6-磷酸葡萄糖催化生成6-磷酸果糖，也可以催化6-磷酸果糖生成6-磷酸葡萄糖。而且6-磷酸葡萄糖在NADP和葡萄糖酸脱氢酶的作用下可生成NADPH和內酯。同时，NADPH的特定吸收波长为340nm，因此，利用紫外分光光度计在340nm处测定NADPH的吸光度值的变化，即可相应测定6-磷酸葡萄糖异构酶的酶活力，以OD_340nm表示。

反应体系：

将33μL 20mmol/L的6-磷酸果糖，20μL 10mmol/L的NADP，35μL 100mmol/L的MgCl₂及15μL 0.1654mg/mL的磷酸葡萄糖脱氢酶溶解于375μL 0.1mol/L的Tris-Hcl（pH8.0），混匀后转移至0.5mL比色皿中，立即加入25μL酶液开始反应，在紫外分光光度计上每隔30s读取吸光度值，直至数值趋近于恒定。以时间为横坐标，OD_340nm为纵坐标，绘制曲线。

酶活力定义：

每分钟使OD_340nm读数升高1所需要的酶量为一个酶活力单位。

3、氨基葡萄糖合酶的活性检测

反应体系：

1mL反应体系中含有15mM的谷氨酰胺，20mM的果糖-6-磷酸，0.2 mL的氨基葡萄糖合酶，2.5mM的EDTA及100mM的不同pH值缓冲液（Na₂HPO₄-NaH₂PO₄, pH2.0-10.0），将以上反应体系放在1.5mL离心管中混匀，然后放入PCR中37℃下反应20min，反应结束后95℃下加热5min终止反应，离心取上清通过使用SBA检测谷氨酸产量，从而计算出氨基葡萄糖合酶酶活。

氨基葡萄糖合酶酶活计算公式：

U/L=（C_谷氨酸×10⁴÷147×V_总÷T）/V_酶

V_酶：反应添加的酶液体积（μL）

C_谷氨酸：谷氨酸浓度（mg/dL）

V_总：氨基葡萄糖合酶酶活测定反应体系的终体积（μL）

T：反应时间（min）

酶活力定义：

在最适反应温度37℃条件下，每分钟催化1μmol谷氨酰胺转化为谷氨酸所需的酶量定义为一个酶活单位，即1U。

4、氨糖6-磷酸脱磷酶的活性检测

在含有10mM氯化镁的100mM HEPES缓冲液（pH7.0）中，能够脱磷酸基团的酶，即氨糖-6-磷酸脱磷酶对底物氨糖6-磷酸的脱磷活性，从而生成最终底物氨基葡萄糖。

检测条件：

采用高效液相色谱法(HPLC)定量分析氨基葡萄糖。所用色谱柱为氨基柱，流动相为80％乙腈水溶液，流速0.6mL/min，柱温40℃，所用检测器为示差折光检测器。氨基葡萄糖保留时间约为12.7分钟。氨基葡萄糖浓度与氨基葡萄糖的HPLC特征峰的响应强度成正比。

实施例5：氨基葡萄糖的合成反应体系

反应体系：

1mM 葡萄糖；100mM HEPES缓冲液（pH7.0）；10mM氯化镁；15mM谷氨酰胺；2.5mMEDTA；10U 己糖激酶；25U 6-磷酸葡萄糖异构酶；16U 氨基葡萄糖合酶；10U 氨糖-6-磷酸脱磷酶。利用这个反应体系总共反应1小时后检测。

检测条件：

采用高效液相色谱法(HPLC)定量分析氨基葡萄糖。所用色谱柱为氨基柱，流动相为80％乙腈水溶液，流速0.6mL/min，柱温40℃，所用检测器为示差折光检测器。氨基葡萄糖保留时间约为12.7分钟。氨基葡萄糖浓度与氨基葡萄糖的HPLC特征峰的响应强度成正比。

合成反应：

在反应器中，加入葡萄糖， HEPES缓冲液（pH7.0），氯化镁，谷氨酰胺，EDTA，使得葡萄糖浓度为1mM； HEPES缓冲液（pH7.0）浓度为100mM；氯化镁浓度为10mM；谷氨酰胺浓度为15mM；EDTA浓度为2.5mM 。对反应器进行加热，当反应器内温达到40℃时，控制加热速率，使得反应器内温在40℃-50℃之间，加入10U 己糖激酶，反应过程中，补加葡萄糖，控制反应液中葡萄糖浓度在1mM左右，直到葡萄糖浓度不变为止；再加入25U 6-磷酸葡萄糖异构酶；16U 氨基葡萄糖合酶；10U 氨糖-6-磷酸脱磷酶。直到反应液中产生的氨基葡萄糖没有变化为止。

反应液中加入盐酸使得反应液中氨基葡萄糖完全成盐，溶液过滤，除去不溶物，滤液减压浓缩，除去大部分的水，至溶液中出现大量结晶，冷却结晶。结晶完全后，过滤，固体为粗品盐酸氨基葡萄糖。

粗品盐酸氨基葡萄糖再经过，重结晶，干燥，得到成品盐酸氨基葡萄糖，成品收率80%（按照葡萄糖投料重量计算），所得盐酸氨基葡萄糖按照USP方法检测，含量达到98%，完全符合USP质量要求。

实施例6：该技术路线在其他产物合成中的应用

本发明不仅涉及利用葡萄糖合成氨基葡萄糖的生物酶法技术路线，还涉及该路线上的所有生物酶，因此具有多种应用。其中包括：

（1）6-磷酸葡萄糖的合成

利用该技术路线上的生物酶，不仅可以制备氨基葡萄糖，还可以制备6-磷酸葡萄糖。6-磷酸葡萄糖不仅作为重要的中间产物用来合成多种化合物，而且常作为生物制剂应用于酶学研究中，也在病理学研究中发挥着一定的作用。同时，NADPH的有效合成是利用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖和NADP而来，因此6-磷酸葡萄糖在NADPH的有效合成中也有着重要的应用。

（2）氨糖-6-磷酸和6-磷酸果糖的合成

利用该技术路线上的生物酶，不仅可以制备氨基葡萄糖，还可以制备6-磷酸果糖和氨糖-6-磷酸。这些都是其他重要化合物的关键中间体。

（3）N-乙酰氨基葡萄糖的合成

葡萄糖通过该技术路线所合成的氨基葡萄糖可以进一步合成N-乙酰氨基葡萄糖，即氨基葡萄糖可以是N-乙酰氨基葡萄糖的合成前体。而N-乙酰氨基葡萄糖是生物体内多糖透明质酸、肝素、硫酸角质素等组成的重要单体之一，同时也是母乳寡糖、神经氨酸、壳寡糖合成的前体物质，可以维持生物体正常的胜利功能。N-乙酰氨基葡萄糖广泛应用于食品、医疗保健、化妆品等领域，并且需求量逐年增加，市场应用前景广阔。更是在发达国家，N-乙酰氨基葡萄糖作为保健产品的重要组成成分，为人体提供必需的生物活性物质，因而被广泛应用。

该技术路线和技术路线中包含的四种生物酶成为了制备氨基葡萄糖和相关中间产物的重要合成路线和关键酶。该方法以葡萄糖为底物来制备氨基葡萄糖，包括联用生物酶，或者表达所述联用生物酶的表达载体或克隆载体、或者表达所述联用生物酶的转基因细胞系、或者表达所述联用生物酶的基因工程菌；优选己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖6-磷酸脱磷酶共四种生物酶联用；方法技术路线简洁，方法所涉及的底物来源充足，不受原材料限制，制备条件温和，环境污染小，且反应专一性高，体系中杂质少易于下游分离纯化，生产成本低。可以将葡萄糖逐步合成氨基葡萄糖，在氨基葡萄糖的制备中具有较大的工业应用潜力。

序列表

<110> 江苏澳新生物工程有限公司

<120> 一种从葡萄糖到氨基葡萄糖的酶法制备方法与酶用途

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 448

<212> PRT

<213> 己糖激酶(Hexokinase)

<400> 1

Met Val His Glu Leu Cys Gln Gln Leu Leu Leu Thr Asp Glu Gln Val

1 5 10 15

Gln Glu Leu Cys Tyr Arg Ile Leu His Glu Leu Arg Arg Gly Leu Ala

20 25 30

Lys Asp Thr His Pro Lys Ala Asn Val Lys Cys Phe Val Thr Tyr Val

35 40 45

Gln Asp Leu Pro Asn Gly Asn Glu Arg Gly Lys Phe Leu Ala Leu Asp

50 55 60

Leu Gly Gly Thr Asn Phe Arg Val Leu Leu Ile His Leu Gln Glu Asn

65 70 75 80

Asn Asp Phe Gln Met Glu Ser Arg Ile Tyr Ala Ile Pro Gln His Ile

85 90 95

Met Ile Gly Ser Gly Thr Gln Leu Phe Asp His Ile Ala Glu Cys Leu

100 105 110

Ser Asn Phe Met Ala Glu His Asn Val Tyr Lys Glu Arg Leu Pro Leu

115 120 125

Gly Phe Thr Phe Ser Phe Pro Leu Arg Gln Leu Gly Leu Thr Lys Gly

130 135 140

Leu Leu Glu Thr Trp Thr Lys Gly Phe Asn Cys Ala Gly Val Val Asn

145 150 155 160

Glu Asp Val Val Gln Leu Leu Lys Asp Ala Ile Ala Arg Arg Gly Asp

165 170 175

Val Gln Ile Asp Val Cys Ala Ile Leu Asn Asp Thr Thr Gly Thr Leu

180 185 190

Met Ser Cys Ala Trp Lys Asn His Asn Cys Lys Ile Gly Leu Ile Val

195 200 205

Gly Thr Gly Ala Asn Ala Cys Tyr Met Glu Arg Val Glu Glu Ala Glu

210 215 220

Leu Phe Ala Ala Glu Asp Pro Arg Lys Lys His Val Leu Ile Asn Thr

225 230 235 240

Glu Trp Gly Ala Phe Gly Asp Asn Gly Ala Leu Asp Phe Val Arg Thr

245 250 255

Glu Phe Asp Arg Asp Ile Asp Val His Ser Ile Asn Pro Gly Lys Gln

260 265 270

Thr Phe Glu Lys Met Ile Ser Gly Met Tyr Met Gly Glu Leu Val Arg

275 280 285

Leu Val Leu Val Lys Met Thr Gln Ala Gly Ile Leu Phe Asn Gly Gln

290 295 300

Asp Ser Glu Val Leu Asn Thr Arg Gly Leu Phe Phe Thr Lys Tyr Val

305 310 315 320

Ser Glu Ile Glu Ala Asp Glu Pro Gly Asn Phe Thr Asn Cys Arg Leu

325 330 335

Val Leu Glu Glu Leu Gly Leu Thr Asn Ala Thr Asp Gly Asp Cys Ala

340 345 350

Asn Val Arg Tyr Ile Cys Glu Cys Val Ser Lys Arg Ala Ala His Leu

355 360 365

Val Ser Ala Gly Ile Ala Thr Leu Ile Asn Lys Met Asp Glu Pro Thr

370 375 380

Val Thr Val Gly Val Asp Gly Ser Val Tyr Arg Phe His Pro Lys Phe

385 390 395 400

His Asn Leu Met Val Glu Lys Ile Ser Gln Leu Ile Lys Pro Gly Ile

405 410 415

Thr Phe Asp Leu Met Leu Ser Glu Asp Gly Ser Gly Arg Gly Ala Ala

420 425 430

Leu Val Ala Ala Val Ala Cys Arg Glu Asp Ile Leu Asn Gly Lys Lys

435 440 445

<210> 2

<211> 1478

<212> DNA

<213> 己糖激酶(Hexokinase)

<400> 2

aaccacaaat cttacaactc acagcccgca gcaaattgca ctcttatccg ctgcagagaa 60

aagtaagatg gtgcacgagt tatgtcagca gctgcttcta acggacgaac aggtgcagga 120

gctgtgctac cgcatcctgc acgagctgcg ccgcggcctg gccaaggata cacatcccaa 180

ggcgaatgtc aagtgcttcg taacgtatgt gcaggatctg cccaatggca atgagcgtgg 240

caagttcttg gccttggatc tgggtggcac caacttccgg gtgctgctca tccatctgca 300

ggagaacaac gattttcaaa tggagtcccg catctatgcc ataccgcagc acattatgat 360

tggatcgggt acacagctat tcgatcacat cgccgaatgt ctgtccaact ttatggccga 420

gcacaatgtg tacaaggagc gtttgccact cggtttcacc ttctcgttcc cgctgcgcca 480

attgggtctg accaagggcc tgctggagac ctggaccaag ggcttcaact gcgctggcgt 540

cgtcaacgag gatgttgtcc agttgctaaa ggatgccatc gcacggcgcg gcgatgtcca 600

gatcgatgtg tgtgccatac tcaatgacac cactggcacg ctgatgagct gcgcctggaa 660

gaatcacaac tgcaagatcg gtctgattgt cggcaccggt gcaaatgcct gctatatgga 720

gcgtgtggag gaggcggagc tcttcgccgc cgaggatccg cgcaagaagc acgtcctgat 780

caacacggaa tggggcgcat tcggcgacaa tggcgcactg gactttgtgc gcaccgaatt 840

cgatcgggac atcgatgtgc acagcatcaa tccgggcaag cagacgttcg agaagatgat 900

atcgggcatg tatatgggcg agctggtgcg tctggtgctg gtgaagatga cccaggcggg 960

tatactcttc aatggacagg attccgaagt gctaaacacc cgcggactgt tcttcaccaa 1020

gtatgtgagc gaaattgaag ctgacgagcc aggcaacttc accaattgcc gcctggtgct 1080

ggaggagctc ggtctgacca atgccaccga cggggactgc gccaatgtgc ggtacatctg 1140

cgagtgcgtc tcgaaacggg ctgcccacct ggtgtccgcc ggcattgcca cgctgatcaa 1200

caaaatggac gagccaacgg tgacggtggg cgtcgatggc agtgtgtacc gcttccatcc 1260

caagttccat aacctgatgg tcgagaagat ctcgcagctg atcaagccgg gcatcacctt 1320

cgatctgatg ctgtccgagg acggttccgg tcgtggagct gccctggtgg cggccgtcgc 1380

ctgtcgcgaa gacatactca atggcaagaa gtaggatgga tagggagctg gagctggatc 1440

aggaaccagg aggaggagcc gctggagcag ctggagca 1478

<210> 3

<211> 469

<212> PRT

<213> 6-磷酸葡萄糖异构酶(6-phosphate glucose isomerase)

<400> 3

Met Ala Asn Tyr Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Ser Met Thr Val Arg

1 5 10 15

Val Asp Leu Asn Gly Leu Leu Ala Ala Ala Val Gly Ala Gly Gly Leu

20 25 30

Ala Ala Glu Glu Leu Ala Gly Leu Glu Pro Glu Leu Ala Arg Val Arg

35 40 45

Asp Gln Leu Ala Ala Arg Arg Val Ala Gly Thr Leu Ala Phe Ala Glu

50 55 60

Leu Pro His Arg Leu Asp Asp Ala Arg His Val Leu Asp Val Ala Ala

65 70 75 80

Gly Val Gly Ala Asp Val Asp Thr Leu Val Val Leu Gly Ile Gly Gly

85 90 95

Ser Ala Leu Gly Ala Arg Ala Leu Val Ser Ala Leu Gly Glu Gly Pro

100 105 110

Gly Arg Arg Arg Val Ile Val Ala Asp Ser Ile Asp Pro Asp Ala Phe

115 120 125

Gly Ala Leu Leu Gly Arg Leu Asp Ala Arg Arg Thr Leu Phe Asn Val

130 135 140

Ile Ser Lys Ser Gly Glu Thr Ala Glu Thr Met Ala Gln Phe Leu Val

145 150 155 160

Val Arg Asp Arg Leu Leu His Glu Leu Gly Ala Val Asp Tyr Lys His

165 170 175

His Leu Val Val Thr Thr Gly Ala Glu Lys Gly Val Leu Arg Gln Ile

180 185 190

Val Asn Asp Glu Gly Phe Arg Asp Leu Val Val Pro Asp Gly Val Ser

195 200 205

Gly Arg Phe Ser Val Leu Thr Ser Val Gly Leu Phe Pro Ala Ala Val

210 215 220

Ala Gly Ile Asp Gly Glu Glu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Tyr Val Asp

225 230 235 240

Glu Arg Ala Arg Ala Ala Ala Pro Leu Ala Asp Pro Ala Leu Ala Leu

245 250 255

Ala Gly Ala Leu Phe Leu Leu Thr Thr Arg His Ala Lys Pro Ile Leu

260 265 270

Val Phe Met Ala Tyr Cys Glu Arg Leu Ala Ala Thr Ala Asp Trp Phe

275 280 285

Cys Gln Leu Trp Ala Glu Ser Leu Gly Lys Ala Gln Asp Leu Thr Gly

290 295 300

Arg Thr Val Glu Trp Gly Gln Thr Pro Val Leu Ala Leu Gly Ala Ala

305 310 315 320

Asp Gln His Ser Gln Leu Gln Leu Tyr Val Glu Gly Pro Arg Asp Lys

325 330 335

Val Ile Leu Phe Ala Arg Val Glu Asp His Gly Ala Ala Val Asp Leu

340 345 350

Pro Thr Thr Tyr Gln Asp Leu Glu Gly Val Gly Tyr Leu Gly Gly His

355 360 365

Ser Leu Gly Glu Leu Leu Asn Ala Glu Gln Arg Ala Thr Glu Leu Ala

370 375 380

Leu Ala Lys Arg Gly Arg Pro Ser Ala Thr Leu Val Leu Pro Ala Val

385 390 395 400

Asn Pro Phe Thr Leu Gly Gln Leu Leu Tyr Leu Leu Glu Thr Ala Thr

405 410 415

Val Ala Val Gly Ala Leu Ala Gly Ile Asp Pro Phe Gly Gln Pro Gly

420 425 430

Val Glu Glu Gly Lys Arg Leu Ala Tyr Gly Leu Met Gly Arg Pro Gly

435 440 445

Phe Glu Ala Asn Arg Ala Glu Val Glu Ala Trp Leu Ala Arg Lys Asp

450 455 460

Ala Arg Phe Ile Leu

465

<210> 4

<211> 1410

<212> DNA

<213> 6-磷酸葡萄糖异构酶(6-phosphate glucose isomerase)

<400> 4

ctagagaatg aagcgcgcgt ccttgcgcgc cagccaggcc tccacctcgg cgcggttcgc 60

ctcgaagccg gggcgcccca tgagcccgta agcgagccgc tttccctcct cgaccccggg 120

ctgcccgaaa gggtcgatgc cggccagcgc gcccaccgcg acggtggccg tctcgaggag 180

gtagaggagc tgccccagcg tgaaggggtt cacggccggg aggacgagcg tcgcgctcgg 240

ccggccgcgc ttggcgagcg ccagctcggt cgcgcgctgc tcggcgttga gcagctcgcc 300

gagcgagtgg ccgccgagat agccgacgcc ctccaggtcc tggtaggtcg ttggcaggtc 360

gaccgcggcg ccgtggtcct cgacgcgcgc gaagaggatc accttgtcgc gcggcccctc 420

cacgtagagc tggagctgcg agtgctgatc ggcggcgccg agcgcgagca ccggcgtctg 480

gccccactcg acggtgcgac cggtgaggtc ctgcgccttg ccgaggctct ccgcccagag 540

ctggcagaac cagtcggcgg tcgccgccag gcgctcgcag tacgccatga agacgaggat 600

cggcttcgcg tgccgtgtgg tcaggaggaa gagcgccccc gccagcgcca acgccgggtc 660

ggcgagcggc gccgccgcgc gcgcccgctc gtccacgtag gccgcgcccg cgagcagctc 720

ctccccgtcg atgcccgcga ccgcggcggg aaagagcccg acggaagtga gcaccgagaa 780

gcgcccgctc acgccgtccg gcacgacgag gtcgcggaag ccctcgtcgt tgacgatctg 840

ccggagcacg cccttctcgg cgccggtggt gaccaccagg tggtgcttgt agtcgaccgc 900

gcccagctcg tgcagcagac ggtcgcgcac gaccaggaac tgcgccatgg tctcggcggt 960

ctcgcccgac ttgctgatca cattgaagag cgtccgtctc gcatcgagcc gcccgagcag 1020

cgcgccgaag gcgtccgggt cgatcgagtc ggcgacgatc acccgccgcc taccgggccc 1080

ctcgccgagc gcgctcacca gcgcgcgcgc gccgagcgcc gagccaccga tgccgagcac 1140

gaccagggta tcgacgtcgg cccccacgcc ggccgcgacg tcgagcacgt ggcgcgcgtc 1200

gtcgagccgg tgcggcagct cggcgaaggc gagcgtgcct gccacccggc gcgcggcgag 1260

ctggtcgcgc acgcgggcga gctcgggctc gagccccgcc agctcctcgg cggcgagccc 1320

gcccgccccc accgccgcgg cgaggagccc gttcaggtcg acccggaccg tcatgctctc 1380

ccgccagcga cggcgccggt agttcgccat 1410

<210> 5

<211> 611

<212> PRT

<213> 氨基葡萄糖合酶(Glucosamine synthase)

<400> 5

Met Cys Gly Ile Val Gly Gly Val Ser Lys Thr Asp Leu Val Pro Met

1 5 10 15

Ile Leu Glu Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala

20 25 30

Gly Leu Ala Ile Leu Gly Ala Asp Ala Asp Leu Leu Arg Val Arg Ser

35 40 45

Val Gly Arg Val Ala Glu Leu Thr Ala Ala Val Val Glu Arg Gly Leu

50 55 60

Gln Gly Gln Val Gly Ile Gly His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Gly

65 70 75 80

Val Arg Glu Cys Asn Ala His Pro Met Ile Ser His Glu Gln Ile Ala

85 90 95

Val Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn Phe His Ala Leu Arg Ala His

100 105 110

Leu Glu Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val

115 120 125

Ile Ala His Leu Val His His Tyr Arg Gln Thr Ala Pro Asp Leu Phe

130 135 140

Ala Ala Thr Arg Arg Ala Val Gly Asp Leu Arg Gly Ala Tyr Ala Ile

145 150 155 160

Ala Val Ile Ser Ser Gly Asp Pro Glu Thr Val Cys Val Ala Arg Met

165 170 175

Gly Cys Pro Leu Leu Leu Gly Val Ala Asp Asp Gly His Tyr Phe Ala

180 185 190

Ser Asp Val Ala Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Val Leu Tyr Leu

195 200 205

Glu Asp Gly Asp Val Ala Met Leu Gln Arg Gln Thr Leu Arg Ile Thr

210 215 220

Asp Gln Ala Gly Ala Ser Arg Gln Arg Glu Glu His Trp Ser Gln Leu

225 230 235 240

Ser Ala Ala Ala Val Asp Leu Gly Pro Tyr Arg His Phe Met Gln Lys

245 250 255

Glu Ile His Glu Gln Pro Arg Ala Val Ala Asp Thr Leu Glu Gly Ala

260 265 270

Leu Asn Ser Gln Leu Asp Leu Thr Asp Leu Trp Gly Asp Gly Ala Ala

275 280 285

Ala Met Phe Arg Asp Val Asp Arg Val Leu Phe Leu Ala Ser Gly Thr

290 295 300

Ser His Tyr Ala Thr Leu Val Gly Arg Gln Trp Val Glu Ser Ile Val

305 310 315 320

Gly Ile Pro Ala Gln Ala Glu Leu Gly His Glu Tyr Arg Tyr Arg Asp

325 330 335

Ser Ile Pro Asp Pro Arg Gln Leu Val Val Thr Leu Ser Gln Ser Gly

340 345 350

Glu Thr Leu Asp Thr Phe Glu Ala Leu Arg Arg Ala Lys Asp Leu Gly

355 360 365

His Thr Arg Thr Leu Ala Ile Cys Asn Val Ala Glu Ser Ala Ile Pro

370 375 380

Arg Ala Ser Ala Leu Arg Phe Leu Thr Arg Ala Gly Pro Glu Ile Gly

385 390 395 400

Val Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Ala Ala Leu Tyr Leu

405 410 415

Leu Ala Leu Ser Leu Ala Lys Ala Pro Gly Ala Ser Glu Arg Cys Ala

420 425 430

Ala Gly Gly Ser Pro Gly Arg Leu Arg Gln Leu Pro Gly Ser Val Gln

435 440 445

His Ala Leu Asn Leu Glu Pro Gln Ile Gln Gly Trp Ala Ala Arg Phe

450 455 460

Ala Ser Lys Asp His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Leu His Tyr Pro

465 470 475 480

Ile Ala Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His

485 490 495

Ala Glu Ala Tyr Pro Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu

500 505 510

Val Asp Arg Asp Met Pro Val Val Val Ile Ala Pro Asn Asp Arg Leu

515 520 525

Leu Glu Lys Leu Ala Ala Asn Met Gln Glu Val His Ala Arg Gly Gly

530 535 540

Glu Leu Tyr Val Phe Ala Asp Ser Asp Ser His Phe Asn Ala Ser Ala

545 550 555 560

Gly Val His Val Met Arg Leu Pro Arg His Ala Gly Leu Leu Ser Pro

565 570 575

Ile Val His Ala Ile Pro Val Gln Leu Leu Ala Tyr His Ala Ala Leu

580 585 590

Val Lys Gly Thr Asp Val Asp Arg Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val

595 600 605

Thr Val Glu

610

<210> 6

<211> 1833

<212> DNA

<213> 氨基葡萄糖合酶(Glucosamine synthase)

<400> 6

atgtgcggta ttgtcggtgg ggtgagtaaa acagatctgg tcccgatgat tctggagggg 60

ttgcagcgcc tggagtatcg tggctacgac tctgccgggc tggcgatatt gggggccgat 120

gcggatttgc tgcgggtgcg cagcgtcggg cgggtcgccg agctgaccgc cgccgttgtc 180

gagcgtggct tgcagggtca ggtgggcatc ggccacacgc gctgggccac ccatggcggc 240

gtccgcgaat gcaatgcgca tcccatgatc tcccatgaac agatcgctgt ggtccataac 300

ggcatcatcg agaactttca tgccttgcgc gcccacctgg aagcagcggg gtacaccttc 360

acctccgaga ccgatacgga ggtcatcgcg catctggtgc accattatcg gcagaccgcg 420

ccggacctgt tcgcggcgac ccgccgggca gtgggcgatc tgcgcggcgc ctatgccatt 480

gcggtgatct ccagcggcga tccggagacc gtgtgcgtgg cacggatggg ctgcccgctg 540

ctgctgggcg ttgccgatga tgggcattac ttcgcctcgg acgtggcggc cctgctgccg 600

gtgacccgcc gcgtgttgta tctcgaagac ggcgatgtgg ccatgctgca gcggcagacc 660

ctgcggatta cggatcaggc cggagcgtcg cggcagcggg aagaacactg gagccagctc 720

agtgcggcgg ctgtcgatct ggggccttac cgccacttca tgcagaagga aatccacgaa 780

cagccccgcg cggttgccga taccctggaa ggtgcgctga acagtcaact ggatctgaca 840

gatctctggg gagacggtgc cgcggctatg tttcgcgatg tggaccgggt gctgttcctg 900

gcctccggca ctagccacta cgcgacattg gtgggacgcc aatgggtgga aagcattgtg 960

gggattccgg cgcaggccga gctggggcac gaatatcgct accgggactc catccccgac 1020

ccgcgccagt tggtggtgac cctttcgcaa tccggcgaaa cgctggatac tttcgaggcc 1080

ttgcgccgcg ccaaggatct cggtcatacc cgcacgctgg ccatctgcaa tgttgcggag 1140

agcgccattc cgcgggcgtc ggcgttgcgc ttcctgaccc gggccggccc agagatcgga 1200

gtggcctcga ccaaggcgtt caccacccag ttggcggcgc tctatctgct ggctctgtcc 1260

ctggccaagg cgccaggggc atctgaacga tgtgcagcag gcggatcacc tggacgcttg 1320

cggcaactgc cgggcagtgt ccagcatgcc ctgaacctgg agccgcagat tcagggttgg 1380

gcggcacgtt ttgccagcaa ggaccatgcg ctttttctgg ggcgcggcct gcactacccc 1440

attgcgctgg agggcgcgct gaagctcaag gaaatctcct atatccacgc cgaggcttat 1500

cccgcgggcg aattgaagca tggccccttg gccctggtgg accgcgacat gcccgtggtg 1560

gtgatcgcgc ccaatgaccg cctcctcgaa aagctggccg ccaacatgca ggaagtccac 1620

gcccgtggcg gtgagctcta tgtttttgcc gattcggaca gccactttaa cgccagtgcg 1680

ggcgtgcatg tgatgcgttt gccccgtcac gccggtctgc tctcccccat cgtccatgct 1740

atcccggtgc agttgctggc ctatcatgcg gcgctggtga agggcaccga tgtggatcga 1800

ccgcgtaacc tcgcgaagag cgtgacggtg gag 1833

<210> 7

<211> 282

<212> PRT

<213> 氨糖-6-磷酸脱磷酶(Glucosamine 6-phosphate dephosphorase)

<400> 7

Met Leu Leu Ser Lys Lys Ser Glu Tyr Lys Thr Leu Ser Thr Val Glu

1 5 10 15

His Pro Gln Tyr Ile Val Phe Cys Asp Phe Asp Glu Thr Tyr Phe Pro

20 25 30

His Thr Ile Asp Glu Gln Lys Gln Gln Asp Ile Tyr Glu Leu Glu Asp

35 40 45

Tyr Leu Glu Gln Lys Ser Lys Asp Gly Glu Leu Ile Ile Gly Trp Val

50 55 60

Thr Gly Ser Ser Ile Glu Ser Ile Ile Asp Lys Met Gly Arg Gly Lys

65 70 75 80

Phe Arg Tyr Phe Pro His Phe Ile Ala Ser Asp Leu Gly Thr Glu Ile

85 90 95

Thr Tyr Phe Ser Glu His Asn Phe Gly Gln Gln Asp Asn Lys Trp Asn

100 105 110

Ser Arg Ile Asn Glu Gly Phe Ser Lys Glu Lys Val Glu Lys Leu Val

115 120 125

Lys Gln Leu His Glu Asn His Asn Ile Leu Leu Asn Pro Gln Thr Gln

130 135 140

Leu Gly Lys Ser Arg Tyr Lys His Asn Phe Tyr Tyr Gln Glu Gln Asp

145 150 155 160

Glu Ile Asn Asp Lys Lys Asn Leu Leu Ala Ile Glu Lys Ile Cys Glu

165 170 175

Glu Tyr Gly Val Ser Val Asn Ile Asn Arg Cys Asn Pro Leu Ala Gly

180 185 190

Asp Pro Glu Asp Ser Tyr Asp Val Asp Phe Ile Pro Ile Gly Thr Gly

195 200 205

Lys Asn Glu Ile Val Thr Phe Met Leu Glu Lys Tyr Asn Leu Asn Thr

210 215 220

Glu Arg Ala Ile Ala Phe Gly Asp Ser Gly Asn Asp Val Arg Met Leu

225 230 235 240

Gln Thr Val Gly Asn Gly Tyr Leu Leu Lys Asn Ala Thr Gln Glu Ala

245 250 255

Lys Asn Leu His Asn His Ile Thr Asp Ser Glu Tyr Ser Lys Gly Ile

260 265 270

Thr Asn Thr Leu Lys Lys Leu Ile Gly Ser

275 280

<210> 8

<211> 846

<212> DNA

<213> 氨糖-6-磷酸脱磷酶(Glucosamine 6-phosphate dephosphorase)

<400> 8

tgatccaatt aattttttta aggtattagt aattcctttt gagtactcac tatcagttat 60

atggttgtgc aagtttttgg cttcctgtgt tgcatttttt agcagatatc cattccctac 120

tgtctgtaac atacgaacat catttccact atccccaaat gcgatagctc tttcggtatt 180

taggttgtat ttctctaaca taaacgttac aatttcattc tttcctgtcc ctatggggat 240

aaaatctaca tcatagctgt cttctggatc gcctgctaag ggattacacc gatttatatt 300

tactgaaacg ccatattcct cgcagatttt ttcaattgct aataggtttt tcttgtcgtt 360

tatttcatct tgttcctgat agtagaagtt atgcttatac cgtgactttc ctaattgagt 420

ttgaggattc aaaagaatgt tatgattttc atgcagctgt ttcacaagtt tttcaacctt 480

ttctttacta aacccttcat ttatgcgact gttccacttg ttatcttgct gaccgaagtt 540

atgctctgaa aagtacgtaa tttcagttcc aagatcacta gctataaaat gcggaaaata 600

tctaaatttt cctcgtccca ttttatcgat aatagattct atactgctcc cagtaaccca 660

tccgattatt agttccccat ctttactttt ttgttctagg tagtcttcga gttcataaat 720

gtcttgttgc ttttgttcgt cgattgtatg cggaaaatac gtttcatcaa aatcacaaaa 780

aacaatatac tgaggatgtt caaccgtgga taacgtttta tactccgatt tcttgcttaa 840

taacat 846

Claims (10)

1.一种从葡萄糖到氨基葡萄糖的酶法制备方法，其特征在于：包括联用生物酶，或者表达所述联用生物酶的表达载体或克隆载体、或者表达所述联用生物酶的转基因细胞系、或者表达所述联用生物酶的基因工程菌；所述联用生物酶的氨基酸序列含有：

1）SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；或者

2）在1）限定的氨基酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的活性的酶的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：联用的生物酶为己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶；其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示的序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌为重组大肠杆菌基因工程菌。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的方法，包括制备氨基葡萄糖的方法或者用于制备6-磷酸葡萄糖、氨糖-6-磷酸或者6-磷酸果糖的方法。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氨基葡萄糖的合成反应方法是：

在反应器中，加入葡萄糖， pH7.0HEPES缓冲液，氯化镁，谷氨酰胺，EDTA，各原料的摩尔浓度比为，葡萄糖：HEPES缓冲液：氯化镁：谷氨酰胺：EDTA＝1： 90－110：9－11：13－17：2－3；对反应器进行加热，当反应器内温达到40℃时，控制加热速率，使得反应器内温在40℃-50℃之间，加入的适量的己糖激酶，反应过程中，补加葡萄糖，控制反应液中葡萄糖浓度，直到葡萄糖浓度不变为止；再加入适理的 6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶；直到反应液中产生的氨基葡萄糖没有变化为止；所加入的酶的单位比为：己糖激酶：6-磷酸葡萄糖异构酶：氨基葡萄糖合酶：氨糖-6-磷酸脱磷酶＝10：20－30：10－20：8－12。

6.一种葡萄糖合成或转化氨基葡萄糖的方法，其特征在于，合成或转化氨基葡萄糖的底物为葡萄糖；所述方法包括利用如下（1）至（6）中任意一组或多组的生物酶：

（1）己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶；

（2）编码己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的基因；

（3）含有所述己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的编码基因的蛋白；（4）含有所述己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的编码基因的表达载体或克隆载体；

（5）含有所述己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的编码基因的转基因细胞系；

（6）含有所述己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的编码基因的基因工程菌；

所述生物酶的氨基酸序列含有：

1）SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；或者

2）在1）限定的氨基酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的活性的酶的氨基酸序列。

7.一种如权利要求1－5中所述的制备方法中涉及的联用生物酶的用途，其特征在于，该用途为将联用生物酶用于催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的酶，所述联用生物酶的氨基酸序列含有：

1）SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；或者

2）在1）限定的氨基酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的活性的酶的氨基酸序列。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：联用生物酶的核苷酸序列分别为SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示的序列。

9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述催化氨基由氨基供体化合物转移至氨基受体化合物的方法，包括制备氨基葡萄糖的方法或者用于制备6-磷酸葡萄糖、氨糖-6-磷酸或者6-磷酸果糖的方法。

10.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的联用生物酶选自下述（1）至（6）中任意一组或多组的生物酶：

（1）己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶；

（2）编码己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的基因；

（3）含有所述己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的编码基因的蛋白；（4）含有所述己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的编码基因的表达载体或克隆载体；

（5）含有所述己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的编码基因的转基因细胞系；

（6）含有所述己糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、氨基葡萄糖合酶和氨糖-6-磷酸脱磷酶的编码基因的基因工程菌。