CN116622684A - 一种增强活性的胆盐水解酶以及制备与方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种增强活性的胆盐水解酶以及制备与方法和应用。增强活性的胆盐水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，增强活性的胆盐水解酶是野生型酶的第80位的甘氨酸突变成异亮氨酸。本方案通过基因突变的手段，改变了分子表面的疏水性，解决了现有的胆盐水解酶的活性不高的技术问题。本方案的胆盐水解酶适用于工业大规模生产的胆盐水解酶，如将其应用于相关健康调节的药品或者保健品的生产中，对健康医疗事业的发展具有十分显著的意义。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种增强活性的胆盐水解酶以及制备与方法和应用。
背景技术
胆盐水解酶(bile salt hydrolase BSH)普遍存在于哺乳动物的胃肠道菌群中，能够水解结合型胆盐，使其生成氨基酸和游离态胆汁酸，从而降低血清中的胆固醇含量。在生物循环中，胆汁酸作为一种信号物质参与了机体脂质、胆固醇和糖的生化代谢及调节，改变胆汁酸的组成和流量可以作为一种治疗代谢综合症的新方向。
胆盐水解酶的制备方法通常为：通过基因工程的手段，制备含有胆盐水解酶基因的工程菌，使用工程菌表达获得胆盐水解酶。在现有技术中，工程菌的胆盐水解酶的表达量较低，获得的胆盐水解酶可溶性差，其活性和稳定性还不能同时满足工业生产的需求。因此，很有必要采用基因工程手段对酶进行改造，提升酶的活性，使其适应于工业化生产。亟需开发一种新的适用于工业大规模生产的胆盐水解酶，并将其应用于相关健康调节的药品或者保健品的生产中，这对健康医疗事业的发展将具有十分显著的意义。
发明内容
本发明意在提供一种增强活性的胆盐水解酶，以解决现有的胆盐水解酶的活性不满足应用需求的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种增强活性的胆盐水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本方案的原理及优点是：胆盐水解酶可溶性差，活性和稳定性低，不利于大规模生产，需要对其进行改造以适应工业应用的需求。本方案将该酶的第80位的甘氨酸进行突变，变成非极性更强的氨基酸，改变了分子表面的疏水性，使胆盐水解酶的酶活得到了提升。本方案具体在BSH酶(SEQ ID NO:5)的80位甘氨酸上进行了单氨基酸的突变，突变为异亮氨酸。氨基酸突变后获得的酶，其活性得到了很大的提升。在胆盐水解酶中，影响酶学性质的位点为野生型BSH的第2位氨基酸(半胱氨酸)。本方案通过突变非酶活中心的甘氨酸(变成异亮氨酸)，改变了分子表面的疏水性，使胆盐水解酶的酶活得到了提升。
虽然现有技术中有通过基因突变实现酶活性改变的操作，但是针对于本方案的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的胆盐水解酶(来源于长双歧杆菌Bifidobacterium longum)尚无有关于基因突变操作的报道。因为没有相关现有技术的参考，给酶的基因工程改造以及关键突变位点的选择带来了极大的困难。发明人通过大量研究筛选，针对于本方案的胆盐水解酶只有在第80位的甘氨酸上进行突变才能获得同时增加活性的效果。
综上所述，本方案采用基因工程手段对酶进行改造，获得了一种适用于工业大规模生产的胆盐水解酶，可将其应用于相关健康调节的药品或者保健品的生产中，这对健康医疗事业的发展具有十分显著的意义。
进一步，一种增强活性的胆盐水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。序列如SEQ ID NO:2的基因经过密码子改造，适合在大肠杆菌系统中复制以及表达。
进一步，一种增强活性的胆盐水解酶的制备方法，包括以下依次进行的步骤：
S1：获得核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的待表达基因；
S2：将所述待表达基因整合在空质粒上，获得表达载体；
S3：将表达载体转基因进入大肠杆菌感受态细胞，获得工程菌；
S4：诱导所述工程菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白，获得酶菌体；
S5：对酶菌体进行破碎处理，经离心获得上清液；过柱纯化所述上清液，获得胆盐水解酶。
采用上述技术方案，通过基因突变的手段获得核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因；再将基因整合在表达载体上，制备含有表达载体的工程菌；诱导工程菌表达目的蛋白，经纯化分离后即可获得高纯度的目的蛋白。
进一步，在S1中，通过重叠PCR获得核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的待表达基因。
采用上述技术方案，通过重叠PCR可制备获得含有标的突变的基因，重叠PCR技术成熟且易于操作。本方案对野生型胆盐水解酶的基因密码子进行优化和定点突变，适宜于在大肠杆菌中表达。
进一步，所述重叠PCR的引物组合包括：序列如SEQ ID NO:11所示的引物、序列如SEQ ID NO:12所示的引物、序列如SEQ ID NO:13所示的引物和序列如SEQ ID NO:14所示的引物。使用上述引物组合可以合成具有标的突变的核苷酸片段。
进一步，在S2中，所述空质粒含有GST标签。GST亲和标签有助于提升大肠杆菌中表达的酶蛋白的可溶性。现有技术中，在大肠杆菌中表达选取的是pET系列的载体，His亲和标签，表达量低，可溶性差多为包涵体。更换标签之后，在蛋白前段加上了GST亲和标签，提高了酶蛋白的可溶性，也有助于蛋白的正确折叠，从而提高酶的产量和活性。
进一步，在S3中，所述大肠杆菌感受态细胞为BL21 DE3感受态细胞。BL21(DE3)感受态细胞为现有技术中用于表达目的蛋白的常规菌种，易于获取和实现产业化。
进一步，在S4中，使用IPTG诱导所述工程菌表达蛋白。IPTG诱导为现有技术中工程菌表达目的蛋白的常规诱导方式，技术成熟可靠，易于操作。
进一步，在S5中，使用超声或者高压将酶菌体破碎；使用GST亲和柱纯化所述上清液由于空质粒上含有GST标签，可以利用GST标签来对表达出的酶进行亲和纯化。
进一步，一种增强活性的胆盐水解酶在制备药品、保健品或者化妆品上的应用。
采用上述技术方案，本方案提供的胆盐水解酶在大肠杆菌工程菌中的表达量高，表达出的酶可溶性好，并且通过基因突变的方式可提升胆盐水解酶的活性，以利于工业化放大生产。本方案获得的胆盐水解酶可以应用在药品、保健品、食品或者化妆品的制备上，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明的实施例2的BSH(G80I)酶在BL21(DE3)中的诱导表达后的SDS-PAGE图。
图2为本发明的实施例2的BSH(G80A)酶在BL21(DE3)中的诱导表达后的SDS-PAGE图。
图3为本发明的实施例2的BSH(G80I)酶的可溶性检测结果图。
图4为本发明的实施例2的BSH(G80A)酶的可溶性检测结果图。
图5为本发明的实施例3的BSH(G80I)酶纯品(GST标签除去后)的SDS-PAGE图。
图6为本发明的实施例3的BSH(G80A)酶纯品(GST标签除去后)的SDS-PAGE图。
具体实施方式
实施例1：含有胆盐水解酶突变基因的表达载体的构建
对双歧杆菌胆盐水解酶的基因，在氨基酸序列不变的前提下，依照大肠杆菌的密码子偏好进行改造，获得胆盐水解酶基因BSH(氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)。通过overlapping PCR法(重叠PCR法)获取突变基因(即优化的胆盐水解酶基因)。优化的胆盐水解酶基因为BSH(G80I)(第80位的甘氨酸突变为异亮氨酸)，BSH(G80I)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。另一种优化的胆盐水解酶基因为BSH(G80A)(第80位的甘氨酸突变为丙氨酸)。BSH(G80A)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。并同时构建了BSH(G80Q)(第80位的甘氨酸突变为谷氨酰胺)和BSH(A77I)(第77位的丙氨酸突变为异亮氨酸)两种突变基因作为对比例。BSH(G80Q)的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；BSH(A77I)的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
现以BSH(G80I)和BSH(G80A)为例来说明表达载体的构建过程。将人工合成的BSH先用引物对(SEQ ID NO:11)和(SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15)通过PCR进行扩增(第一次PCR反应体系和条件见表1)，再用引物对(SEQ ID NO:12)和(SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16)通过PCR进行扩增(第二次PCR反应体系和条件见表2)，回收2次PCR产物，然后以2次PCR的产物为模板，用引物对(SEQ ID NO:11)和(SEQ ID NO:12)通过PCR进行扩增克隆(第三次PCR反应体系和条件见表3)。其中，BSH(G80I)和BSH(G80A)加入的酶切位点均为：BamHI和NotI。
获得BSH(G80I)基因的引物序列具体如下：
SEQ ID NO:11：5’-CGGGATCCCGATGTGCACCGGCGT-3’；
SEQ ID NO:12：5’-TTGCGGCCGCAATTAACGCGCCACGCT-3’；
SEQ ID NO:13：5’-AGCCCGGAAAGTTCAGGATGGCAATAGC-3’；
SEQ ID NO:14：5’-TGGCTATTGCCATCCTGAACTTTCCG-3’。
获得BSH(G80A)基因的重叠PCR引物组合为：
SEQ ID NO:11：5’-CGGGATCCCGATGTGCACCGGCGT-3’；
SEQ ID NO:12：5’-TTGCGGCCGCAATTAACGCGCCACGCT-3’；
SEQ ID NO:15：5’-AGCCCGGAAAGTTCAGAGCGGCAATAGC-3’；
SEQ ID NO:16：5’-TGGCTATTGCCGCTCTGAACTTTCCG-3’。
除了本方案的合成方式外，本方案的几种突变基因也可以通过其他现有技术的方式合成，还可以委托生物技术公司进行合成。
表1：第一次PCR反应体系和条件
第一次PCR反应条件：98℃预变性5分钟；35个循环，其中包括：98℃变性10秒，55℃退火5秒，72℃延伸5秒；反应结束后于72℃延伸10分钟。
表2：第二次PCR反应体系和条件
| 反应体系组成 | 体积(μL) |
| PrimeSTAR Max Premix 2X | 25 |
| 引物(SEQ ID NO:12) | 2 |
| 引物(SEQ ID NO:14或者SEQ ID NO:16) | 2 |
| DNA模板(SEQ ID NO:6) | 1 |
| 无菌水 | 20 |
| 总体积 | 50 |
第二次PCR反应条件：98℃预变性5分钟；35个循环，其中包括：98℃变性10秒，55℃退火5秒，72℃延伸5秒；反应结束后于72℃延伸10分钟。
表3：第三次PCR反应体系和条件
| 反应体系组成 | 体积(μL) |
| PrimeSTAR Max Premix 2X | 25 |
| 引物(SEQ ID NO:11) | 2 |
| 引物(SEQ ID NO:12) | 2 |
| DNA模板(第一次PCR产物) | 1 |
| DNA模板(第二次PCR产物) | 1 |
| 无菌水 | 19 |
| 总体积 | 50 |
第三次PCR反应条件：98℃预变性5分钟；35个循环，其中包括：98℃变性10秒，55℃退火5秒，72℃延伸10秒；反应结束后于72℃延伸10分钟。
然后进行酶切和连接反应，利用BamHI和NotI限制性内切酶分别对重叠PCR获得的BSH(G80I)突变体基因以及pGEX-6p-1载体进行双酶切，然后按照表4的体系和条件进行连接，16℃连接过夜，得到pGEX-6p-1-BSH(G80I)连接产物。按照同样方法，可以获得pGEX-6p-1-BSH(G80A)连接产物、pGEX-6p-1-BSH(G80Q)连接产物、pGEX-6p-1-BSH和pGEX-6p-1-BSH(A77I)连接产物。
表4：连接体系
| 反应体系组成 | 体积(μL) |
| 突变基因 | 6 |
| pGEX-6p-1 | 2 |
| T4 Ligase | 1 |
| 10×T4 Ligase buffer | 1 |
| 总体积 | 10 |
接下来将连接产物转化DH5α感受态细胞。取50μL感受态细胞E.coli DH5α放置冰上融化，将2μL连接产物pGEX-6p-1-BSH(G80I)加入融化的E.coli DH5α感受态中，冰上放置30分钟。42℃热激90s，冰浴3分钟。加入LB培养基450μL，摇床温度37℃，摇床摇速180rpm，时间45分钟。吸取200μL涂布Amp抗性LB平板培养基，37℃过夜培养。挑取单菌落，接种Amp+LB培养基中，摇床温度37℃，摇床摇速220rpm。OD600≈1.0时，12000rpm离心5分钟获取菌体用于质粒提取。提取质粒按天根质粒小提试剂盒说明书操作提取质粒，送测序。
实施例2：目的蛋白表达
将实施例1中获得的经测序检测验证正确的质粒转化BL21(DE3)感受态细胞。pGEX-6p-1-BSH(G80I)表达载体、pGEX-6p-1-BSH(G80A)表达载体、pGEX-6p-1-BSH(G80Q)表达载体、pGEX-6p-1-BSH表达载体和pGEX-6p-1-BSH(A77I)表达载体分别进行转化，获得含有pGEX-6p-1-BSH(G80I)表达载体的工程菌、含有pGEX-6p-1-BSH(G80A)表达载体的工程菌、含有pGEX-6p-1-BSH(G80Q)表达载体的工程菌、含有pGEX-6p-1-BSH表达载体的工程菌和含有pGEX-6p-1-BSH(A77I)表达载体的工程菌。
以含有pGEX-6p-1-BSH(G80I)表达载体的工程菌的制备为例，具体的转化感受态细胞的过程为：在-80℃中取出50μL BL21(DE3)感受态细胞冰上放置解冻，加入pGEX-6p-1-BSH(G80I)质粒1μL，冰上放置30分钟。42℃热激90秒，冰上放置3分钟。加入450μL LB培养基，37℃，180rpm，45分钟。吸取200μL培养基涂布于含氨苄的LB平板培养基，37℃过夜培养。
然后对获得的工程菌进行小剂量表达测试，具体过程为：挑选5个单克隆，分别接种至5mL含有氨苄的LB培养基中，37℃，220rpm，进行培养，OD值为0.6-1.0时，加入终浓度1mM IPTG诱导2h，SDS-PAGE检测表达量，选取表达量高的克隆，进行菌种保藏。
接下来对获得的工程菌进行大剂量表达培养，具体过程为：取20μL菌种接种至200mL氨苄抗性LB培养基中，180rpm，37℃过夜培养，OD值为2.5-4.0。取20mL培养液接种至1L氨苄抗性LB培养基培养中，120rpm，37℃，培养至OD值为0.8-1.2时，降温至16℃，加入终浓度0.5mM IPTG诱导过夜表达，3800rpm，15min收集菌体(称为BSH(G80I)菌体)；SDS-PAGE检测表达量。BSH(G80I)酶在BL21(DE3)中的诱导表达的SDS-PAGE图像如图1所示(箭头所指为目的蛋白条带，约58kD；泳道1为诱导后菌液，泳道2代表诱导前的菌液)。BSH(G80A)酶、BSH(G80Q)酶、BSH酶和BSH(A77I)酶使用同样的方法进行蛋白质表达。BSH(G80A)酶的SDS-PAGE图像如图2所示(箭头所指为目的蛋白条带，约58kD；泳道1为诱导前菌液，泳道2代表诱导后菌液)。
实施例3：目的蛋白纯化
称取20g BSH(G80I)菌体(又称为酶菌体)加200mL Lysis buffer(1×PBS)重悬菌体，超声破菌至菌液澄清。4℃，10000rpm，离心60min取上清液，进行可溶性检测(SDS-PAGE电泳检测)，结果如图3所示(T代表破碎后的总菌液，N代表破碎后菌液经离心的沉淀，S代表破碎后菌液经离心的上清)。上清液过GST亲和柱5ml，4℃，流速2ml/min，用100mL Lysisbuffer洗柱子至紫外检测仪示数不变，加入5ml的PreScission Protease酶切缓冲液内含PreScission Protease酶，4℃酶切过夜。酶切后，用20mL Lysis buffer洗脱目的酶蛋白，获得BSH(G80I)酶的酶蛋白液，-80℃保存。目的蛋白经酶切后(切去GST标签)进行SDS-PAGE电泳检测，鉴定其分子量大小及纯度、测试纯化蛋白的浓度，如图5所示，切去GST的目的蛋白为35kD左右。BSH(G80A)酶、BSH(G80Q)酶、BSH酶和BSH(A77I)酶使用同样的方法进行蛋白纯化。BSH(G80A)酶的可溶性检测SDS-PAGE电泳图如图4所示(T代表破碎后的总菌液，N代表破碎后菌液经离心的沉淀，S代表破碎后菌液经离心的上清，箭头代表目的蛋白)，切去GST的BSH(G80A)酶的电泳图如图6所示(箭头代表目的蛋白)。
实验例1：酶活测定
取10μL BSH(G80I)酶的酶蛋白液用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)稀释至90μL，加入10μL结合胆盐(200mM)混合，于37℃孵育30min，加入等体积的15％(w/v)三氯乙酸终止反应，离心后取10μL上清液与190μL茚三酮试剂(包括50μL 1％茚三酮(溶解于0.5M柠檬酸缓冲液(pH5.5)中)、120μL甘油和20μL 0.5M的柠檬酸缓冲液(pH5.5))混合，于100℃反应15min，冷却后于570nm处测定吸光值，标准曲线用甘氨酸或牛磺酸(本实验使用甘氨酸)进行计算，根据检测结果和标准曲线计算待测酶的比活力(U/mg)。比活力(U/mg)定义：在上述反应条件下，每毫克蛋白所含的酶活力单位数。
与此同时，按照上述相同的方法测定BSH酶、BSH(G80A)酶、BSH(G80Q)酶和BSH(A77I)酶的酶活，酶活测量结果参见表5。结果表明，4种突变体BSH(G80I)、BSH(G80A)、BSH(G80Q)和BSH(A77I)均能水解结合型胆盐，BSH(G80I)水解结合型胆盐的比活力是野生型BSH的3.6倍，BSH(G80A)水解结合型胆盐的的比活力是野生型BSH的1.7倍。BSH(G80I)酶和BSH(G80A)酶的酶活显著高于野生型BSH，而BSH(G80Q)酶和BSH(A77I)酶的酶活略低于野生型BSH。上述实验结果说明，本方案将野生型BSH的第80位氨基酸突变成为异亮氨酸或者丙氨酸，可以显著提高酶的酶活，而将该位点的氨基酸突变为其他类型的氨基酸则不能取得增加酶活的效果。另外，选取野生型BSH的非80位的氨基酸进行突变，也不能获得提升酶活的技术效果。这说明，突变位点的选择以及突变的目的氨基酸的确定对提升胆盐水解酶的活性非常重要。
表5：BSH与BSH(G80I)、BSH(G80A)、BSH(G80Q)和BSH(A77I)酶比活力比较(GST标签)
实验例2：热稳定性测试
按照实施例1-3的方法制备酶样品(即实施例3获得的几种酶蛋白液，需要不加甘油)在50℃水浴放置20分钟，按照实验例1测定酶活的方法检测残余酶活，残余酶活的计算方式为：(水浴前酶活-水浴后酶活)/水浴前酶活×100％。结果如表6所示热处理20分钟后，野生型BSH酶活迅速下降，仅保留20％左右的酶活，而G80I仍保留70％以上的酶活，G80A仍保留80％以上的酶活。BSH(G80Q)酶和BSH(A77I)酶的热稳定性与野生型BSH没有显著差异。本实验表明相比野生型BSH，BSH(G80I)和BSH(G80A)具有更好的热稳定性，更适于工业应用。本方案将野生型BSH的第80位氨基酸突变成为异亮氨酸或者丙氨酸，可以显著提高酶的热稳定性，而将该位点的氨基酸突变为其他类型的氨基酸则不能取得增加酶的热稳定性的效果。另外，选取野生型BSH的非80位的氨基酸进行突变，也不能获得提升酶的热稳定性的技术效果。这说明，突变位点的选择以及突变的目的氨基酸的确定对提升胆盐水解酶的热稳定性非常重要。
表6：BSH与BSH(G80I)、BSH(G80A)、BSH(G80Q)和BSH(A77I)热稳定性比较(GST标签)
实验例3：
将实施例1-3的空质粒更换为pET28a，该质粒上带有his标签，参照实施例1-3的方法获得BSH酶、BSH(G80I)酶和BSH(G80A)酶的酶蛋白液(此时his标签已切除，但是该标签会通过影响蛋白的折叠和高级结构的形成来影响酶活)，按照实验例1的方法进行酶活测量，实验结果如表7所示。表7的数据与表5的数据相比，说明使用GST作为标签对维持BSH的酶活，减少包涵体的生成并促进蛋白的正确折叠起到了促进作用，而使用his标签达不到上述目的。
表7：野生型BSH与BSH(G80I)和BSH(G80A)酶活比较(his标签)
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种增强活性的胆盐水解酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种增强活性的胆盐水解酶，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种增强活性的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：包括以下依次进行的步骤：
S1：获得核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的待表达基因；
S2：将所述待表达基因整合在空质粒上，获得表达载体；
S3：将表达载体转基因进入大肠杆菌感受态细胞，获得工程菌；
S4：诱导所述工程菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白，获得酶菌体；
S5：对酶菌体进行破碎处理，经离心获得上清液；过柱纯化所述上清液，获得胆盐水解酶。
4.根据权利要求3所述的一种增强活性的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：在S1中，通过重叠PCR获得核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的待表达基因。
5.根据权利要求4所述的一种增强活性的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：所述重叠PCR的引物组合包括：序列如SEQ ID NO:11所示的引物、序列如SEQ ID NO:12所示的引物、序列如SEQ ID NO:13所示的引物和序列如SEQ ID NO:14所示的引物。
6.根据权利要求5所述的一种增强活性的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：在S2中，所述空质粒含有GST标签。
7.根据权利要求6所述的一种增强活性的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：在S3中，所述大肠杆菌感受态细胞为BL21 DE3感受态细胞。
8.根据权利要求7所述的一种增强活性的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：在S4中，使用IPTG诱导所述工程菌表达蛋白。
9.根据权利要求8所述的一种增强活性的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：在S5中，使用超声或者高压将酶菌体破碎；使用GST亲和柱纯化所述上清液。
10.根据权利要求1所述的一种增强活性的胆盐水解酶在制备药品、保健品或者化妆品上的应用。
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